Monoclonal Mouse Anti-Human Progesterone Receptor Clone PgR Code M3568. Intended use For In Vitro Diagnostic Use.

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1 Monoclonal Mouse Anti-Human Progesterone Receptor Clone PgR 1294 Code M3568 Intended use For In Vitro Diagnostic Use. Monoclonal Mouse Anti-Human Progesterone Receptor, clone PgR 1294 (Anti-PR, PgR 1294) is intended for laboratory use for the semiquantitative detection of progesterone receptor (PR) by light microscopy in routinely processed normal and pathological human paraffinembedded tissue. This antibody is indicated for use as an aid in the management, prognosis and prediction of outcome of breast cancer. Positive results aid in the classification of normal and abnormal cells/tissues and serve as an adjunct to conventional histopathology. The clinical interpretation of any positive staining or its absence should be complemented by morphological and histological studies with proper controls. Evaluations should be made within the context of the patient's clinical history and other diagnostic tests by a qualified individual. Summary and explanation The role of steroid hormone receptors in breast cancer is well-known (2,3). The absence of estrogen receptors (ER) and PR predicts early recurrence and poor survival of breast cancer patients (4-7). Also, the presence of ER and PR in tumors predicts the potential for benefit from tamoxifen and other endocrine-related therapies. Measurement of ER and PR can be determined semi-quantitatively using IHC or quantitatively using Dextran Coated Charcoal (DCC) assay or EIA. Correlation between the semi-quantitative and quantitative evaluations of PR have ranged from 73 to 91% depending on the laboratory and antibody used (8-10). Refer to Dako s General Instructions for Immunohistochemical Staining or the detection system instructions of IHC procedures for: 1) Principle of Procedure, 2) Materials Required, Not Supplied, 3) Storage, 4) Specimen Preparation, 5) Staining Procedure, 6) Quality Control, 7) Troubleshooting, 8) Interpretation of Staining, 9) General Limitations. Reagent provided Anti-PR, PgR 1294 is available as a mouse anti-human monoclonal antibody tissue culture supernatant in 0.05 mol/l Tris/HCl, ph 7.2, containing mol/l NaN 3 and stabilizing protein. Clone: PgR 1294 (1). Isotype: IgG 1, kappa Mouse lgg concentration mg/l: See label on vial. When performing IHC with the EnVision + detection system, use a 1:50 dilution in a 10- to 30-minute incubation with the diluted Anti-PR, PgR These are guidelines only. Optimal antibody concentrations may vary depending on specimen and preparation method, and should be determined by each individual laboratory. Immunogen Formalin-fixed recombinant full-length A-form of human progesterone receptor (1). Specificity Anti-PR, PgR 1294 has been demonstrated to react with the PR-A and PR-B forms by Western blot of whole cell extracts and reacts with both free and hormone-bound PR (1). The epitope has been mapped to the amino terminal domain shared by PR-A and PR-B. Materials required, but not supplied Refer to Dako s General Instructions for Immunohistochemical Staining and/or the detection system instructions. The following negative control is recommended for IHC procedures: Mouse IgG 1 (code X0931) Precautions 1. For professional users. 2. This product contains sodium azide (NaN 3), a chemical highly toxic in pure form. At product concentrations, though not classified as hazardous, NaN 3 may react with lead and copper plumbing to form highly explosive build-ups of metal azides. Upon disposal, flush with large volumes of water to prevent metal azide build-up in plumbing. 3. As with any product derived from biological sources, proper handling procedures should be used. 4. Wear appropriate Personal Protective Equipment to avoid contact with eyes and skin. 5. Unused reagents should be disposed of according to local, State, and Federal regulations. Storage Store at 2 8 C. Do not use after expiration date s tamped on vial. If reagents are stored under any conditions other than those specified, the conditions must be verified by the user. There are no obvious signs to indicate instability of this product. Therefore, positive and negative controls should be run simultaneously with patient specimens. If unexpected staining is observed which cannot be explained by variations in laboratory procedures and a problem with the antibody is suspected, contact Dako Technical Support. ( ) EFG_003_M3568/ p. 1/8

2 Specimen preparation Anti-PR, PgR 1294 can be used on biopsy specimens fixed in neutral buffered formalin, methacarn or Carnoy's fixative prior to paraffin embedding. The deparaffinized tissue sections must be treated with heat prior to the IHC staining procedure (10). The recommended target retrieval involves immersion of tissue sections in a pre-heated buffer solution and maintaining heat in a pressure cooker (121 C) for 10 minutes. For greater adherence of tissue sections to glass slides, the use of Silanized Slides (code S3003) is recommended. Target Retrieval Solution (code S1700) or 10x Concentrate (code S1699) is recommended. Staining procedure Follow the procedure for the detection system selected. Staining interpretation The cellular staining pattern for anti-pr, PgR 1294 is nuclear. A positive immunostaining result is defined as more than 10% of cells with positively stained nuclei of any intensity. Performance characteristics Normal Tissues Distribution of PgR throughout normal tissue has been reported in a variety of studies. The nuclei of uterine gland cells were found to be strongly immunoreactive. Weaker immunostaining was observed in the nuclei of endometrial and prostatic stromal cells. Immunoreactivity in a panel of normal tissues was assessed and the results are summarized in Table 1. All tissues were formalin-fixed and paraffin-embedded and stained with Anti-PR, PgR 1294 according to the instructions in the package insert using the EnVision+ detection system (code K4007). Table 1. Evaluation of Normal Tissue Staining by Dako PgR 1294 Tissue Type (# tested) Staining Intensity Tissue Type (# tested) Staining Intensity Tissue Element Stained Tissue Element Stained Adrenal (3) None Parathyroid (3) None Bone Marrow (3) None Peripheral Nerve (3) None Breast (3) Ductal epithelial cells Pituitary (3) Pituicytes 1+ * Brain/Cerebellum (3) None Prostate (3) Stromal cells 2+ (2/3) Brain/Cerebrum (3) None Salivary Gland (3) None Cervix (3) Basal epithelium None Skeletal Muscle (3) None Stromal cells 2+ Colon (3) None Skin (3) None Esophagus (3) None Small Intestine (3) Muscularis propria 2+(1/3) Heart (3) None Spleen (3) None Kidney (3) None Stomach (3) None Liver (3) None Testis (3) None Lung (3) None Thymus (3) None Mesothelial Cells (3) None Thyroid (3) None Ovary (3) Surface epithelium Stromal cells (2/3) (2/3) Tonsil (3) None Pancreas (3) Islet cells* (2/3) Nuclear staining *Nuclear and cytoplasmic staining. Uterus (3) Endometrial glands Endometrial stroma Myometrium A second survey of normal tissues demonstrated positivity in endometrium and weak positivity in prostate after heat-induced epitope retrieval using the LSAB+ detection system. Negative tissues included esophagus, testes, breast, liver, kidney, skeletal muscle, placenta, adrenal, tonsil, lung, colon, skin, pancreas, spleen, thyroid, stomach and cardiac muscle (1). Abnormal Tissues Immunoreactivity in carcinomas was assessed in several studies. In one study, 31 breast carcinomas previously tested with the DCC assay were stained using the LSAB+ detection system, comparing staining by clone PgR 1294 to staining by clone PgR 636. Positive staining was reported for 23/23 previously determined positive tumors by the DCC assay, while 8/8 remained negative (100% sensitivity and 100% specificity) (1). Comparison of the IHC staining result by clone PgR 1294 to the DCC assay results was also performed on these specimens. Positive staining was reported for 21/23 previously determined positive tumors, while 7/8 remained negative (91.3% sensitivity and 87.5% specificity) (1). Anti-PR, PgR 1294 with LSAB+ detection system was used to immunostain 60 different tumor types. Breast cancer (5/11), uterine (2/2), ovarian (2/6) and endometrial (2/2) carcinomas stained strongly. Medullary carcinoma of the thyroid (1/2) and testicular yolk sac tumor were positive. Other tumors including melanoma, lymphoma and neuroendocrine and neural tumors were negative for PR expression (1). * ( ) EFG_003_M3568/ p. 2/8

3 The sensitivity of mouse monoclonal anti-pr clone PgR 1294 was compared by immunohistochemistry to anti-pr clone PgR 636 and to the results of the quantitative DCC assay results on 30 breast carcinoma tissue specimens. In this study, clone PgR 1294 was demonstrated to be a highly sensitive antibody and to exhibit 100% concordance to clone PgR 636 in IHC and 95% concordance to the DCC assay. Reproducibility Eight serial sections from each of three different formalin-fixed, paraffin-embedded blocks of breast carcinoma were collected for testing. Testing was performed as follows: Intra-run Reproducibility Following the standard EnVision+ Peroxidase detection system protocol (code K4007), three slides from each tissue block were stained in randomized order with ready-to-use Mouse Anti-Human Progesterone Receptor, clone PgR 1294 (from ER/PR pharmdx kit, code K1903). Concurrently, one slide from each block was stained with the negative control reagent. Inter-run Reproducibility Staining one slide from each tissue block, the above procedure was repeated on two additional days with another technician staining on the third staining procedure. Concurrently, one slide from each block was stained with the negative control reagent. Consistent test conditions were maintained throughout the study and reagents were stored at 2 8 C bet ween test runs. Reproducibility experiments with anti-pr, PgR 1294 yielded consistent results with intra-run and inter-run testing. FRANÇAIS Réf. M3568 Utilisation prévue Pour utilisation diagnostique in vitro. L'anticorps Monoclonal Mouse Anti-Human Progesterone Receptor, clone PgR 1294 (anti-pr, PgR 1294) est destiné à être utilisé en laboratoire en vue de la détection semi-quantitative du récepteur de la progestérone (PR) par microscopie optique dans des tissus humains sains et pathologiques traités en routine et inclus en paraffine. L'utilisation de cet anticorps est recommandée pour faciliter la prise en charge, le pronostic et la prévision des résultats de cancer du sein. Des résultats positifs facilitent la classification des cellules et/ou tissus normaux et anormaux et accompagnent l'histopathologie traditionnelle. L'interprétation clinique de toute coloration positive ou de son absence doit être associée à des études morphologiques et histologiques utilisant les contrôles adéquats. Les évaluations doivent tenir compte des antécédents cliniques du patient et d'autres tests diagnostiques réalisés par une personne qualifiée. Résumé et explication Le rôle des récepteurs d'hormones stéroïdiennes dans le cancer du sein est bien connu (2,3). L'absence de récepteurs de l'œstrogène (ER) et de PR indique une récurrence précoce et un taux de survie réduit des patientes atteintes d'un cancer du sein (4-7). De même, la présence d'er et de PR dans les tumeurs indique l'éventuel bénéfice d'un traitement au tamoxifène ou d'autres thérapies endocriniennes. La mesure des ER et du PR peut être déterminée semi-quantitativement en utilisant une méthode IHC ou quantitativement à l'aide d'une méthode charbon dextran ("dextran-coated charcoal - DCC") ou immunoenzymatique (EIA). La corrélation entre les évaluations semi-quantitatives et quantitatives du PR allait de 73 à 91% en fonction du laboratoire et de l'anticorps utilisé (8-10). Consulter le document General Instructions for Immunohistochemical Staining (Instructions générales de coloration immunohistochimique) de Dako ou les instructions du kit de détection pour les procédures IHC : 1) Principe de la procédure, 2) Matériel requis mais non fourni, 3) Conservation, 4) Préparation des échantillons, 5) Procédure de coloration, 6) Contrôle de qualité, 7) Dépannage, 8) Interprétation de la coloration, 9) Limites générales. Réactif fourni L'anti-PR, PgR 1294 est disponible sous forme de surnageant de culture tissulaire dans un tampon Tris-HCl à 0,05 mol/l, de ph 7,2, contenant une protéine stabilisante et de l'azide de sodium (NaN 3) à 0,015 mol/l. Clone : PgR 1294 (1). Isotype : IgG 1, kappa Concentration en IgG de souris en mg/l : Voir l'étiquette sur le flacon. Lors de la réalisation d'une procédure IHC à l'aide du système de détection EnVision+, utiliser une dilution au 1/50 avec une incubation de 10 à 30 minutes avec l'anticorps anti-pr, PgR 1294 dilué. Il ne s'agit là que de conseils. Les concentrations d'anticorps optimales peuvent varier en fonction de l'échantillon et de la méthode de préparation et doivent être déterminées par chaque laboratoire de manière indépendante. Immunogène Forme A pleine longueur recombinante fixée au formol du récepteur de la progestérone humaine (1). Spécificité Il a également été prouvé par Western blot d'extraits cellulaires totaux que l'anti-pr, PgR 1294 réagit aux formes PR-A et PR-B et qu'il réagit à la fois au PR libre et au PR lié à l'hormone (1). L'épitope a été cartographié dans le domaine amino-terminal partagé par PR-A et PR-B. Matériels requis mais non fournis Se référer au document General Instructions for Immunohistochemical Staining (Instructions générales de coloration immunohistochimique) de Dako ou aux instructions du système de détection. Le contrôle négatif suivant est recommandé pour les procédures IHC : Mouse IgG 1 (IgG1 de souris) (réf. X0931) ( ) EFG_003_M3568/ p. 3/8

4 Précautions d'emploi 1. Pour utilisateurs professionnels. 2. Ce produit contient de l'azide de sodium (NaN 3), produit chimique hautement toxique sous sa forme pure. Aux concentrations du produit, bien que non classé comme dangereux, le NaN 3 peut réagir avec le cuivre et le plomb des canalisations pour former des azides métalliques hautement explosifs. Lors de l'élimination, rincer abondamment à l'eau pour éviter toute accumulation d'azide métallique dans les canalisations. 3. Comme avec tout produit d'origine biologique, des procédures de manipulation appropriées doivent être respectées. 4. Porter un équipement de protection individuelle approprié pour éviter tout contact avec les yeux et la peau. 5. Les réactifs non utilisés doivent être éliminés conformément aux réglementations locales et nationales. Conservation Conserver entre 2 et 8 C. Ne pas utiliser après la date de péremption imprimée sur le flacon. Si les réactifs sont conservés dans des conditions autres que celles indiquées, celles-ci doivent être validées par l'utilisateur. Il n'existe pas de signe particulier pour indiquer l'instabilité de ce produit. Par conséquent, des contrôles positifs et négatifs doivent être testés en même temps que les échantillons de patient. Si une coloration inattendue est observée, qui ne peut être expliquée par des différences dans les procédures du laboratoire et qu'un problème lié à l'anticorps est suspecté, contacter l'assistance technique de Dako. Préparation des échantillons L'anticorps anti-pr, PgR 1294 peut être utilisé sur des échantillons de biopsie fixés au formol neutre tamponné, au methacarn ou au fixateur de Carnoy avant d'être inclus en paraffine. Les coupes de tissus déparaffinées doivent être traitées à la chaleur avant d'appliquer la procédure de coloration IHC (10). La restauration des cibles recommandée implique l'immersion des coupes de tissus dans une solution tampon préchauffée et le maintien de la chaleur dans un autocuiseur (121 C) pendant 10 minutes. Pour une meilleure adhérence des coupes de tissus sur les lames de verre, il est recommandé d'utiliser des lames silanisées, Silanized Slides (réf. S3003). La Target Retrieval Solution (Solution de restauration des cibles) (réf. S1700) ou le 10x Concentrate (Concentré 10x) (réf. S1699) sont recommandés. Procédure de coloration Suivre la procédure pour le système de détection sélectionné. Interprétation de la coloration Le motif de coloration cellulaire pour l'anti-pr, PgR 1294 est nucléaire. Un résultat de coloration immunologique est positif si plus de 10% des cellules présentent une coloration nucléaire positive, quelle que soit l'intensité. Performances Tissus sains La répartition du PgR dans les tissus sains a été observée dans diverses études. Les noyaux des cellules glandulaires de l'utérus se sont avérés très immunoréactifs. Une coloration immunologique plus faible a été observée dans les noyaux des cellules stromales endométriales et prostatiques. L'immunoréactivité a été évaluée dans un panel de tissus sains et les résultats sont récapitulés dans le tableau 1. Tous les tissus ont été fixés au formol et inclus en paraffine puis colorés à l'anti-pr, PgR 1294 conformément aux instructions de la notice, à l'aide du système de détection EnVision+ (réf. K4007). Tableau 1 : Évaluation de la coloration de tissus sains à l'aide du PgR 1294 de Dako Type de tissu (nombre testé) Intensité de coloration Type de tissu (nombre testé) Intensité de coloration Élément tissulaire coloré Élément tissulaire coloré Surrénale (3) Aucune Parathyroïde (3) Aucune Moelle osseuse (3) Aucune Nerf périphérique (3) Aucune Sein (3) Cellules épithéliales canalaires Hypophyse (3) Pituicytes 1+ * Cerveau/Cervelet (3) Aucune Prostate (3) Cellules stromales 2+ (2/3) Cerveau/Cerebrum (3) Aucune Glande salivaire (3) Aucune Col de l'utérus (3) Épithélium basal Aucune Muscle squelettique (3) Aucune Cellules stromales 2+ Côlon (3) Aucune Peau (3) Aucune Œsophage (3) Aucune Intestin grêle (3) Muscularis propria 2+(1/3) Cœur (3) Aucune Rate (3) Aucune Rein (3) Aucune Estomac (3) Aucune Foie (3) Aucune Testicule (3) Aucune Poumon (3) Aucune Thymus (3) Aucune Cellules mésothéliales (3) Aucune Thyroïde (3) Aucune Ovaire (3) Épithélium de surface Cellules stromales (2/3) (2/3) Amygdale (3) Aucune Pancréas (3) Cellules des îlots pancréatiques* (2/3) Coloration nucléaire *Coloration nucléaire et cytoplasmique. Utérus (3) Glandes endométriales Stroma endométrial Myomètre ( ) EFG_003_M3568/ p. 4/8 *

5 Une deuxième étude sur des tissus sains a mis en évidence une positivité au niveau de l'endomètre et une faible positivité au niveau de la prostate après une restauration d'épitope induite par la chaleur (HIER) en utilisant le système de détection LSAB+. Les tissus négatifs incluent l'œsophage, le testicule, le sein, le foie, le rein, le muscle squelettique, le placenta, la glande surrénale, l'amygdale, le poumon, le côlon, la peau, le pancréas, la rate, la thyroïde, l'estomac et le muscle cardiaque (1). Tissus anormaux Plusieurs études ont évalué l'immunoréactivité dans les carcinomes. Dans une étude, 31 carcinomes du sein précédemment testés par un dosage DCC ont été colorés en utilisant le système de détection LSAB+, afin de comparer la coloration obtenue avec le clone PgR 1294 et celle obtenue avec le clone PgR 636. Une coloration positive a été notée pour 23 cas sur 23 de tumeurs précédemment déterminées comme étant positives par un dosage DCC, alors que 8 tumeurs sur 8 demeuraient négatives (sensibilité de 100% et spécificité de 100%) (1). Une comparaison des résultats de coloration IHC obtenus avec le clone PgR 1294 par rapport aux résultats du dosage DCC a également été réalisée sur ces échantillons. Une coloration positive a été notée pour 21 cas sur 23 de tumeurs précédemment déterminées comme étant positives, alors que 7 tumeurs sur 8 demeuraient négatives (sensibilité de 91,3% et spécificité de 87,5%) (1). L'anti-PR, PgR 1294 associé à un système de détection LSAB+ a été utilisé pour colorer 60 différents types de tumeurs. Les cancers du sein (5/11), de l'utérus (2/2), de l'ovaire (2/6) et les carcinomes de l'endomètre (2/2) ont été fortement colorés. Le carcinome médullaire de la thyroïde (1/2) et la tumeur du sac vitellin testiculaire étaient positifs. D'autres tumeurs incluant le mélanome, le lymphome et les tumeurs neuroendocrines et neurales étaient négatives pour l'expression du PR (1). La sensibilité de l'anticorps monoclonal de souris anti-pr clone PgR 1294 a été comparée par immunohistochimie à l'anticorps anti-pr clone PgR 636 et aux résultats du dosage DCC quantitatif sur 30 échantillons de carcinomes du sein. Dans cette étude, il a été démontré que le clone PgR 1294 était un anticorps hautement sensible et qu'il affichait une concordance de 100% par rapport au clone PgR 636 lors d'une coloration IHC et de 95% par rapport au dosage DCC. Reproductibilité Huit coupes en série ont été prélevées pour évaluation sur chacun des trois blocs de carcinome du sein différents fixés au formol et inclus en paraffine. L'analyse a été réalisée comme suit : Reproductibilité intra-cycle Selon le protocole standard du système de détection EnVision+ Peroxidase (réf. K4007), trois lames issues de chacun des blocs de tissus ont été colorées dans un ordre aléatoire à l'aide de l'anticorps prêt à l'emploi Mouse Anti-Human Progesterone Receptor, clone PgR 1294 (du kit ER/PR pharmdx, réf. K1903). Simultanément, une lame provenant de chaque bloc a été colorée à l'aide du réactif de contrôle négatif. Reproductibilité inter-cycles En colorant une lame provenant de chaque bloc de tissu, la procédure ci-dessus a été répétée sur deux jours supplémentaires avec un autre technicien effectuant la coloration pour la troisième procédure de coloration. Simultanément, une lame provenant de chaque bloc a été colorée à l'aide du réactif de contrôle négatif. Les mêmes conditions d'analyse ont été conservées tout au long de l'étude et les réactifs ont été conservés entre 2 et 8 ºC entre les cycles de test. Les expériences de reproductibilité avec l'anti-pr, PgR 1294 ont donné des résultats cohérents avec les analyses inter-cycles et intra-cycle. DEUTSCH Code-Nr. M3568 Verwendungszweck Zur In-vitro-Diagnostik. Monoclonal Mouse Anti-Human Progesterone Receptor, Clone PgR 1294 (Anti-PR, PgR 1294) ist zum Laborgebrauch für den semiquantitativen Nachweis des Progesteronrezeptors (PR) mittels Lichtmikroskopie in routinemäßig aufbereiteten, paraffineingebetteten gesunden und pathologischen humanen Geweben bestimmt. Dieser Antikörper ist zur Unterstützung bei der Behandlung, Prognose und Ergebnisvoraussage bei Brustkrebs vorgesehen. Positive Ergebnisse unterstützen die Klassifizierung normaler und anormaler Zellen/Gewebe und ergänzen die konventionelle Histopathologie. Die klinische Auswertung vorhandener oder fehlender Färbungen sollte durch morphologische und histologische Untersuchungen mit entsprechenden Kontrollen ergänzt werden. Auswertungen müssen von einer qualifizierten Person unter Berücksichtigung der klinischen Anamnese des Patienten und weiterer diagnostischer Tests vorgenommen werden. Zusammenfassung und Erklärung Die Funktion der Steroidhormonrezeptoren bei Brustkrebs ist bekannt (2,3). Das Fehlen von Östrogenrezeptoren (ER) bzw. Progesteronrezeptoren (PR) deutet auf frühe Rezidive und schlechte Überlebenschancen für Brustkrebspatientinnen (4-7) hin. Dagegen erlaubt das Vorliegen von Östrogen und Progesteron in Tumoren die Prognose des potenziellen Nutzens einer Behandlung mit Antiöstrogenen (z. B. Tamoxifen) oder anderen endokrin wirksamen Behandlungen. ER- und PR-Bestimmungen können semi-quantitativ durch IHC oder quantitativ mittels DCC-Assay (Dextran Coated Charcoal) oder EIA erfolgen. Die Korrelation zwischen semi-quantitativen und quantitativen PR-Auswertungen lag je nach Labor und verwendetem Antikörper zwischen 73 und 91% (8-10). Folgende Angaben bitte den General Instructions for Immunohistochemical Staining (Allgemeine Richtlinien zur immunhistochemischen Färbung) von Dako bzw. den Anweisungen des Detektionssystems für IHC-Verfahren entnehmen: 1) Verfahrensprinzipien, 2) Erforderliche, aber nicht mitgelieferte Materialien, 3) Lagerung, 4) Gewebevorbereitung, 5) Färbeverfahren, 6) Qualitätskontrolle, 7) Fehlerbehandlung, 8) Auswertung der Färbung, 9) Allgemeine Beschränkungen. ( ) EFG_003_M3568/ p. 5/8

6 Geliefertes Reagenz Anti-PR, PgR 636 ist als Gewebekulturüberstand eines monoklonalen Maus-Anti-Human-Antikörpers in 0,05 mol/l Tris/HCI, ph 7,2, mit 0,015 mol/l NaN 3 und Stabilisierungsprotein verfügbar. Klon: PgR 1294 (1). Isotyp: IgG 1, Kappa Konzentration Maus-IgG mg/l: Siehe Behälteretikett. In der IHC mit dem EnVision + Detektionssystem eine 1:50-Lösung bei einer Inkubation von 10 bis 30 Minuten mit dem verdünnten Anti-PR, PgR 1294 verwenden. Diese Angaben sind nur Richtlinien. Optimale Antikörperkonzentrationen können je nach Probe und Vorbereitungsmethode unterschiedlich sein und sollten von jedem Labor selbst bestimmt werden. Immunogen Formalinfixierte rekombinante A-Form (vollständig) des humanen Progesteronrezeptors (1). Spezifität Anti-PR, PgR 1294, hat im Western-Blotting an Ganzzell-Extrakten nachweislich mit den A- und B-Formen des Progesteronrezeptors reagiert. Es reagiert ebenfalls mit freien und hormongebundenen Progesteronrezeptoren (1). Das Epitop wurde am Amino-Ende in derselben Molekülregion kartiert, in der auch PR-A und PR-B liegen. Erforderliche, aber nicht mitgelieferte Materialien Siehe General Instructions for Immunohistochemical Staining (Allgemeine Richtlinien zur immunhistochemischen Färbung) von Dako bzw. Anweisungen des Detektionssystems. Folgende Negativkontrolle wird für IHC-Verfahren empfohlen: Maus-IgG 1 (Code-Nr. X0931) Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen 1. Für geschultes Fachpersonal. 2. Dieses Produkt enthält Natriumazid (NaN 3), eine in reiner Form äußerst giftige Chemikalie. Bei den in diesem Produkt verwendeten Konzentrationen kann NaN 3, obwohl nicht als gefährlich klassifiziert, mit in Wasserleitungen vorhandenem Blei oder Kupfer reagieren und zur Bildung von hochexplosiven Metall-Azid-Anreicherungen führen. Nach der Entsorgung muss mit reichlich Wasser nachgespült werden, um Metall-Azid-Anreicherungen in den Leitungen zu vermeiden. 3. Wie bei allen aus biologischen Materialien gewonnenen Produkten müssen die ordnungsgemäßen Handhabungsverfahren eingehalten werden. 4. Entsprechende persönliche Schutzausrüstung (PSA) tragen, um Augen- und Hautkontakt zu vermeiden. 5. Nicht verwendete Reagenzien sind entsprechend örtlichen, staatlichen und EU-rechtlichen Bestimmungen zu entsorgen. Lagerung Bei 2-8 C aufbewahren. Nach Ablauf des auf dem Beh älter aufgedruckten Verfallsdatums nicht mehr verwenden. Werden die Reagenzien unter anderen als den angegebenen Bedingungen aufbewahrt, müssen diese Bedingungen vom Benutzer überprüft werden. Es gibt keine offensichtlichen Anhaltspunkte für die mögliche Instabilität dieses Produkts. Es sollten daher die Positiv- und Negativkontrollen gleichzeitig mit den Patientengewebeproben mitgeführt werden. Wenn eine unerwartete Anfärbung beobachtet wird, welche durch Änderungen in den Labormethoden nicht erklärt werden kann, und falls Verdacht auf ein Problem mit dem Antikörper besteht, ist Kontakt mit dem technischen Kundendienst von Dako aufzunehmen. Gewebevorbereitung Anti-PR, PgR 1294 kann bei Biopsieproben, die in neutral gepuffertem Formalin, Methacarn oder Carnoy-Fixativ fixiert sind, vor Einbettung in Paraffin verwendet werden. Vor dem IHC-Färbeverfahren müssen die entparaffinierten Gewebeschnitte mit Wärme behandelt werden (10). Das empfohlene Demaskierungsverfahren besteht aus dem Eintauchen der Gewebeschnitte in eine vorgewärmte Pufferlösung und Wärmeerhaltung in einem Dampfdrucktopf (121 ºC) für 10 Minuten. Zur besseren Haftung der Gewebeschnitte an den Glasobjektträger wird die Verwendung von Silanized Slides (Code-Nr. S3003) empfohlen. Es wird die Verwendung von Target Retrieval Solution (Code-Nr. S1700) oder 10x Concentrate (Code-Nr. S1699) empfohlen. Färbeverfahren Das für das ausgewählte Detektionssystem beschriebene Verfahren befolgen. Auswertung der Färbung Das zelluläre Färbemuster für Anti-PR, PgR 1294 ist nuklear. Ein positives Immunfärbungsergebnis liegt vor, wenn mehr als 10% der Zellkerne eine positive Färbung beliebiger Intensität aufweisen. Leistungseigenschaften Normale Gewebe Die Verteilung von PgR in gesundem Gewebe ist in zahlreichen Studien beschrieben worden. Eine starke Immunreaktivität wurde bei den Zellkernen von Gebärmutterdrüsenzellen beobachtet. An den Zellkernen der Stromazellen aus Endometrium und Prostata war die Immunfärbung schwächer. Die Immunreaktivität wurde in einem Panel von normalem Gewebe getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Alle Gewebe waren formalinfixiert, paraffineingebettet und mit Anti-PR, PgR 1294 gemäß den Anweisungen der Packungsbeilage mit dem EnVision+ Detektionssystem (Code-Nr. K4007) eingefärbt. ( ) EFG_003_M3568/ p. 6/8

7 Tabelle 1. Auswertung der Färbung von Normalgeweben durch Dako PgR 1294 Gewebetyp (Anz. getestet) Färbungsintensität Gewebetyp (Anz. getestet) Färbungsintensität Eingefärbtes Gewebeelement Eingefärbtes Gewebeelement Nebenniere (3) Keine Nebenschilddrüse (3) Keine Knochenmark (3) Keine Peripherer Nerv (3) Keine Brust (3) Duktale Epithelzellen Hypophyse (3) Pituizyten 1+ * Gehirn/Kleinhirn (3) Keine Prostata (3) Stromazellen 2+ (2/3) Gehirn/Großhirn (3) Keine Speicheldrüsen (3) Keine Zervix (3) Basalepithel Keine Skelettmuskulatur (3) Keine Stromazellen 2+ Dickdarm (3) Keine Haut (3) Keine Speiseröhre (3) Keine Dünndarm (3) Muscularis propria 2+(1/3) Herz (3) Keine Milz (3) Keine Niere (3) Keine Magen (3) Keine Leber (3) Keine Hoden (3) Keine Lunge (3) Keine Thymus (3) Keine Mesothelzellen (3) Keine Schilddrüse (3) Keine Eierstöcke (3) Oberflächenepithel Stromazellen (2/3) (2/3) Mandeln (3) Keine Pankreas (3) Inselzellen* (2/3) Nukleare Färbung *Färbung von Kern und Zytoplasma Uterus (3) Endometriale Drüsen Endometriales Stroma Myometrium Eine weitere Studie an normalen Geweben ergab Positivität im Endometrium und schwache Positivität in der Prostata nach hitzeinduzierter Epitopdemaskierung mit einem LSAB+ Detektionssystem. Negative Gewebe waren Speiseröhre, Hoden, Brust, Leber, Nieren, Skelettmuskulatur, Plazenta, Nebennieren, Mandeln, Lunge, Dickdarm, Haut, Pankreas, Milz, Schilddrüse, Magen und Herzmuskel (1). Anormale Gewebe Die Immunreaktivität in Karzinomen wurde in mehreren Studien untersucht. In einer Studie wurden 31 Mammakarzinome, die zuvor mit dem DCC-Assay getestet worden waren, mittels LSAB+ Detektionssystem gefärbt und die Färbung durch Klon PgR 1294 mit der Färbung durch Klon PgR 636 verglichen. Eine positive Färbung wurde bei 23/23 zuvor mit dem DCC-Assay bestimmten positiven Tumoren beschrieben, während 8/8 negativ blieben (Empfindlichkeit 100% und Spezifität 100%) (1). Der Vergleich des IHC-Färbeergebnisses durch Klon PgR 1294 mit den DCC-Assay-Ergebnissen wurde ebenfalls an diesen Gewebeproben durchgeführt. Eine positive Färbung wurde für 21/23 zuvor bestimmten positiven Tumoren beschrieben, während 7/8 negativ blieben (Empfindlichkeit 91,3% und Spezifität 87,5%) (1). Anti-PR, PgR 1294 mit einem LSAB+-Detektionssystem wurde zur Immunfärbung von 60 verschiedenen Tumortypen verwendet. Beim Brustkrebs (5/11), Uterus- (2/2), Eierstock- (2/6) und Endometriumkarzinom (2/2) trat eine starke Färbung auf. Auch das medulläre Karzinom der Schilddrüse (1/2) und der testikuläre Dottersacktumor waren positiv. Andere Tumore wie Melanom, Lymphom und neuroendokrine bzw. neurale Tumore wiesen keine PR-Expression auf (1). Die Empfindlichkeit des monoklonalen Maus-Anti-PR-Klons PgR 1294 wurde mittels Immunhistochemie mit dem Anti-PR-Klon PgR 636 sowie mit den Ergebnissen des quantitativen DCC-Assays bei 30 Brustkarzinom-Gewebeproben verglichen. In dieser Studie hat sich Klon PgR 1294 als hochempfindlicher Antikörper erwiesen, der eine 100%-ige Übereinstimmung mit dem Klon PgR 636 in IHC und eine 95%-ige Übereinstimmung mit dem DCC-Assay aufweist. Reproduzierbarkeit Für den Test wurden acht serielle Schnitte von jedem von drei verschiedenen formalinfixierten, paraffineingebetteten Brustkarzinom- Gewebeblöcken entnommen. Die Tests wurden wie folgt vorgenommen: Reproduzierbarkeit innerhalb eines Durchlaufs Gemäß dem Standardprotokoll des EnVision+ Peroxidase Detektionssystems (Code-Nr. K4007) wurden drei Objektträger aus jedem Gewebeblock in zufälliger Reihenfolge mit gebrauchsfertigem Mouse Anti-Human Progesterone Receptor, Clone PgR 1294 (aus ER/PR pharmdx Kit, Code-Nr. K1903) eingefärbt. Gleichzeitig wurde wieder ein Objektträger aus jedem Block mit dem Negativkontrollreagenz eingefärbt. Reproduzierbarkeit bei verschiedenen Durchläufen Das obige Verfahren der Färbung eines Objektträgers aus jedem Gewebeblock wurde an zwei weiteren Tagen wiederholt, wobei ein anderer Techniker für die Durchführung der dritten Färbeprozedur zuständig war. Gleichzeitig wurde wieder ein Objektträger aus jedem Block mit dem Negativkontrollreagenz eingefärbt. Während der gesamten Studie wurden gleichbleibende Versuchsbedingungen beibehalten; die Reagenzien wurden zwischen den Durchläufen bei 2-8 C aufbewahrt. Versuche zur Rep roduzierbarkeit mit Anti-PR, PgR 1294 ergaben sowohl bei Versuchen innerhalb eines Durchlaufs als auch in verschiedenen Durchläufen übereinstimmende Ergebnisse. ( ) EFG_003_M3568/ p. 7/8 *

8 References / Bibliographie / Literaturnachweis 1. Press M, Spaulding B, Groshen S, Kaminsky D, Hagerty M, Sherman L, Christensen K, Edwards DP. Comparison of different antibodies for detection of progesterone receptor in breast cancer. Steroids 2002; 67: Henderson C. Breast cancer. In: Harrison s principles of internal medicine, 12th edition, Wilson JD, Braunwald E, Isselbacher KJ, Petersdorf RG, Martin JB, Fauci AS, Root RK (eds). McGraw-Hill, Inc. New York, Fuqua SAW. Estrogen and progesterone receptors and breast cancer. In: Diseases of the Breast, Harris et al, eds. Lippincott-Raven, p McGuire WL, Clark GM. The prognostic role of progesterone receptors in human breast cancer. Sem Oncol 1983; 10(4):2 5. Clark GM, McGuire WL, Hubay CA, Pearson OH, Marshall JS. Progesterone receptors as prognostic factor in stage II breast cancer. N Engl J Med 1983; 39: Ravdin PM, Green S, Dorr TM, McGuire WL, Fabian C, Puch RP, Carter RD, Rivkin SE, Borst JR, Belt RJ, Metch B, Osborne CK. Prognostic significance of progesterone receptor levels in estrogen receptor-positive patients with metastatic breast cancer treated with tamoxifen: Results of a prospective Southwest Oncology Group study. J Clin Ooncol 1992; 10(8): Chevallier B, Heintzmann F, Mosseri V, Dauce JP, Bastit P, Graic Y, Brunelle P, Basuyay JP, Comoz M, Asselain B. Prognostic value of estrogen and progesterone receptors in operable breast cancer: Results of a univariate and multivariate analysis. Cancer 1988; 62: Page DL, Jensen RA, Simpson JF. Routinely available indicators of prognosis in breast cancer. Breast Can Res Treat 1998; 51: Allred DC, Harvey JM, Berardo M, Clark GM. Prognostic and predictive factors in breast cancer by immunohistochemical analysis. Mod Pathol 1998; 11: Fitzgibbons PL, Page DL, Weaver D, Thor AD, Allred DC, Clark GM, Ruby SG, O Malley F, Simpson JF, Connolly JL, Hayes DF, Edge SB, Lichter A, Schnitt SJ. Prognostic factors in breast cancer. College of American Pathologists consensus statement. Arch Pathol Lab Med 2000; 124:966 Edition / Édition / Ausgabe 03/14 ( ) EFG_003_M3568/ p. 8/8