Biogenese von Glyoxysomen und Woronin bodies in Neurospora crassa

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1 Biogenese von Glyoxysomen und Woronin bodies in Neurospora crassa Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie an der internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften der Ruhr-Universität Bochum angefertigt im Institut für Physiologische Chemie Abteilung Systembiochemie Fakultät für Medizin an der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Christian Würtz aus Dortmund Bochum Mai 2007

2 Biogenesis of glyoxysomes and Woronin bodies in Neurospora crassa Dissertation to obtain the degree Doctor Rerum Naturalium (Dr. rer. nat.) Fakultät für Biologie International graduate school biosciences Ruhr-Universität Bochum Institut für Physiologische Chemie Abteilung Systembiochemie Fakultät für Medizin Ruhr-Universität Bochum submitted by Christian Würtz from Dortmund Bochum, May 2007

3 Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbständig verfasst und bei keiner anderen Fakultät eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet habe. Es handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um fünf in Wort und Bild völlig übereinstimmende Exemplare. Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten und in keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde. Bochum, den Unterschrift Referent: PD Dr. Hanspeter Rottensteiner Korreferentin: Prof. Dr. Stefanie Pöggeler I

4 WIDMUNG Ich denke niemals an die Zukunft... Sie kommt früh genug... Albert Einstein dt.-amerikan. Physiker, 1921 Nobelpreis für Physik \Å ZxwxÇ~xÇ tç Åx ÇxÇ bñt? jxüçxü j Üàé II

5 DANKSAGUNG Zunächst möchte ich Herrn PD Dr. Hanspeter Rottensteiner für die Themenstellung danken. Obwohl Woronin bodies mittlerweile seid mehr als 140 Jahren bekannt sind, gelang es ihm aktuelle und interessante Fragestellungen aufzudecken. Ein ganz besonderes Dankeschön möchte ich Ihm für sein Vertrauen aussprechen, das er mir während der schwierigen Startphase dieser Arbeit geschenkt hat. Danken möchte ich Hanspeter auch für die fortwährende Unterstützung in Theorie und Praxis und für sein offenes Ohr für die großen und kleinen Probleme im Laboralltag. Nicht zuletzt möchte ich Hanspeter auch für die Unterstützung beim Verfassen dieser Arbeit danken, auch wenn der neue Job und die damit verbundene Entfernung dies schwieriger gestalteten. Frau PD Dr. Stefanie Pöggeler danke ganz herzlich ich für die Übernahme des Korreferates. Es freut mich persönlich ganz besonders, dass sie so an meiner weiteren wissenschaftlichen Entwicklung teilhaben konnte. Herrn Prof. Dr. Ralf Erdmann möchte ich für die Bereitstellung der Infrastruktur danken. Seine Denkanstöße in Seminaren lieferten wertvolle Beiträge zur Verfeinerung der durchgeführten Versuche. Bedanken möchte ich mich auch bei allen wissenschaftlichen und technischen Mitarbeitern der Abteilung für Systembiochemie für das gute Arbeitsklima und die gewährte Unterstützung, ohne die diese Arbeit in dieser Form nicht möglich gewesen wäre. Besonders bedanken möchte ich mich bei: André, für die gute Stimmung im Labor und seine stete Diskussions- und Hilfsbereitschaft bei privaten und wissenschaftlichen Themen. Außerdem natürlich noch dafür, dass er sich Zeit genommen hat über die Probleme anderer Nachzudenken, auch wenn er selber Stress hatte. Christine, für gute Stimmung, Unterstützung und die Versorgung mit exquisiten Baguettes. Robert, für grobes Foulspiel. Wolfgang Schliebs für die Diskussionen bei der Erstellung dieser Arbeit und Anregungen zu Experimenten. Natürlich auch für seine exzellenten Experimente zu den N. crassa Katalasen. David und Michael, für regen Gedankenaustausch und die Gespräche während der Medizinerpraktika. Geteiltes Leid ist halbes Leid, vor allem dort! Rainer, dafür, dass ich mir auch mal die Hände schmutzig machen durfte und neben der geistigen Tätigkeit auch mal körperlich gefordert wurde. Sevi, für Cheer-up s, Telefonate und ihre überaus wertvolle Unterstützung in allen Lebenslagen. Meiner Familie, meiner Freundin Tanja und meinen guten Freunden danke ich herzlich für die unerschöpfliche Geduld, viele kleine Aufmerksamkeiten und ihre kostbare Unterstützung. III

6 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS Abkürzung Abb....Abbildung A-Terminus... Amino-Terminus As... Aminosäure Bp... Basenpaar C-Terminus... Carboxy-Terminus DNA...Desoxyribonukleinsäure DsRed... rot fluoreszierendes Protein ER... Endoplasmatisches Retikulum EST...expressed sequence tag GFP...grün fluoreszierendes Protein IF...Immunfluoreszenz IgG... Immunglobulin G kda...kilodalton mpts... membrane peroxisomal targeting signal mrna... Botenribonukleinsäure OD...Optische Dichte ORF...offener Leserahmen PMP...peroxisomales Membranprotein PNS... post nuclear supernatant PTS... peroxisomal targeting signal Tab....Tabelle Allgemein gebräuchliche Abkürzungen sowie SI-Maßeinheiten sind nicht gesondert aufgeführt. Aminosäuren wurden nach dem One-Letter-Code abgekürzt. IV

7 PUBLIKATIONEN Teile dieser Arbeit wurden wie folgt veröffentlicht: Kongressbeiträge: interne Tagung des Sonderforschungsbereichs 480 Molekulare Biologie komplexer Leistungen von botanischen Systemen Posterpräsentation: Biogenesis of Glyoxysomes and Woronin bodies in Neurospora crassa Vortrag: Microbody biogenesis in Neurospora crassa VAAM-Symposium: Molecular Biology of Fungi Molekularbiologie der Pilze Posterpräsentation: Biogenesis of Glyoxysomes and Woronin bodies in Neurospora crassa Open European Peroxisome Meeting Posterpräsentation: Biogenesis of Microbodies in Neurospora crassa interne Tagung des Sonderforschungsbereichs 480 Molekulare Biologie komplexer Leistungen von botanischen Systemen Posterpräsentation: Biogenesis of Glyoxysomes and Woronin bodies in Neurospora crassa 1 Biogenesis of Glyoxysomes and Woronin bodies in Neurospora crassa Open European Peroxisome Meeting Posterpräsentation: Neurospora crassa: a eukaryote without catalasecontaining microbodies VAAM-Symposium: Biology of Yeast and Filamentous Fungi Posterpräsentation: Neurospora crassa: a eukaryote without catalasecontaining microbodies V

8 Publikationen in Journalen mit Fachgutachtersystem: Schliebs W *, Würtz C *, Kunau WH, Veenhuis M, and Rottensteiner H (2006) A Eukaryote without Catalase-Containing Microbodies: Neurospora crassa Exhibits a Unique Cellular Distribution of Its Four Catalases. Eukaryotic Cell 5: Engh I, Würtz C, Witzel-Schlömp K, Zhang HY, Hoff B, Nowrousian M, Rottensteiner H, and Kück U (2007) WW Domain Protein PRO40 Is Required for Fungal Fertility and Associates with Woronin bodies. Eukaryotic Cell 6: doi: /ec Accepted for publication 27 February 2007 Managadze D *, Würtz C *, Sichting M, Niehaus G, Veenhuis M, and Rottensteiner H (2007) The Peroxin PEX14 of Neurospora crassa is Essential for the Biogenesis of Both Glyoxysomes and Woronin Bodies. Traffic 8: doi: /j x Accepted for publication 23 February 2007 Manuskript in Vorbereitung: Würtz C, Schliebs W, Erdmann R, and Rottensteiner H (2007) Formation of giant Woronin bodies in Saccharomyces cerevisiae through heterologous expression of HEX-1 and its dependence on Dnm1p and Vps1p. * Diese Autoren trugen in gleichem Umfang zum Manuskript bei. VI

9 NOMENKLATUR Die Peroxine und PEX-Gene wurden in der vorliegenden Arbeit nach den Richtlinien der einheitlichen Nomenklatur für die peroxisomalen Biogenese-Faktoren bezeichnet (Distel et al. 1996). Auf Grund der sehr uneinheitlichen Nomenklaturen für Proteine und Gene der verschiedenen Organismen, wurden die für Neurospora crassa aufgestellten Richtlinien verwendet (Davis 2000), um für mehr Transparenz zu sorgen. Gene werden daher mit kursiven Kleinbuchstaben (z.b.: hex-1) und Proteine mit Großbuchstaben (z.b.: HEX-1) bezeichnet. Mutierte Gene und Proteine werden zusätzlich mit einem Δ (z.b.: hex-1δ oder HEX-1Δ) dargestellt. Zur Unterscheidung der einzelnen Organismen wurden gegebenenfalls die Initialen der Artbezeichnung vorangestellt. In speziellen Fällen wurde auf die für den Organismus spezifischen Schreibweise zurückgegriffen. Bei der Beschreibung allgemeingültiger Prozesse wurde auf diese Zuordnung verzichtet. VII

10 INHALTSVERZEICHNIS WIDMUNG... DANKSAGUNG... II III ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS... IV PUBLIKATIONEN... V NOMENKLATUR... VII 1. EINLEITUNG Woronin bodies Das HEX-1 Protein aus Neurospora crassa und seine Orthologen Peroxisomen Auswirkungen peroxisomaler Defekte Peroxine Peroxisomale Membranbiogenese Peroxisomaler Matrixproteinimport ZIELSETZUNG Subzelluläre Lokalisation der Neurospora crassa Katalasen Subzelluläre Lokalisation des PRO40 Proteins aus Sordaria macrospora Charakterisierung einer pex14 Deletionsmutante in Neurospora crassa Expression des Neurospora crassa HEX-1 Proteins in Saccharomyces cerevisiae ERGEBNISSE Übersicht über die Ergebnisse und Beschreibung der eigenen Anteile A Eukaryote without Catalase-Containing Microbodies: Neurospora crassa Exhibits a Unique Cellular Distribution of Its Four Catalases WW Domain Protein PRO40 Is Required for Fungal Fertility and Associates with Woronin bodies The Peroxin PEX14 of Neurospora crassa is Essential for the Biogenesis of Both Glyoxysomes and Woronin Bodies Role of Dnm1p and Vps1p in formation of giant Woronin bodies upon heterologous expression of NcHEX-1 in Saccharomyces cerevisiae DISKUSSION Subzelluläre Lokalisation der Neurospora crassa Katalasen Subzelluläre Lokalisation des PRO40 Proteins aus Sordaria macrospora Charakterisierung einer PEX14 Deletionsmutante in Neurospora crassa Expression des Neurospora crassa HEX-1 Proteins in Saccharomyces cerevisiae VIII

11 5. ZUSAMMENFASSUNG SUMMARY LITERATURVERZEICHNIS ANHANG LEBENSLAUF IX

12 1. Einleitung 1. EINLEITUNG Ein typisches Merkmal eukaryotischer Zellen ist ihre ausgeprägte Kompartimentierung. Dies ermöglicht es ihnen, abgeschlossene Reaktionsräume mit definierten Bedingungen zu schaffen und in diesen kontrollierte Reaktionen ablaufen zu lassen. Einige dieser Kompartimente werden in der Gruppe der Microbodies zusammengefasst. Dabei handelt es sich um bläschenförmige, von nur einer Membran umgebene subzelluläre Organellen, die zunächst nur auf Grund ihrer Struktur charakterisiert wurden. In diese Gruppe werden die Peroxisomen, Glyoxysomen, Glykosomen und Woronin bodies gezählt (Jedd und Chua 2000; Eckert und Erdmann 2003). Für die aufgelisteten vier Microbody-Typen wurde gezeigt, dass sie gefaltete Proteine und sogar Goldpartikel über eine eigene Importmaschinerie importieren können. Jedoch lassen sich auch diese vier Microbody-Subtypen untereinander abgrenzen. Peroxisomen enthalten typischerweise Katalase als Leitenzym, während Glyoxysomen zusätzlich die Enzyme des Glyoxylatzyklusses beinhalten (Breidenbach und Beevers 1967). Die Glykosomen wurden nur für Kinetoplastida beschrieben und weisen Teile der Glykolyse auf (Opperdoes und Borst 1977). Als ähnlich spezialisiert sind die Woronin bodies der Euascomyceten und Deuteromyceten zu betrachten. Für diese konnten bisher keine typischen enzymatischen Reaktionen beschrieben werden (Jedd und Chua 2000; Tenney et al. 2000). Die enge Verwandtschaft von Peroxisomen und Glyoxysomen zeigt sich besonders deutlich im Pflanzenreich. Dort existieren im Endosperm von Samen und in den Kotyledonen nur Glyoxysomen, in denen der Fettsäureabbau stattfindet und aus diesem stammendes Acetyl- CoA zu Succinat verknüpft wird. Dieses wird aus den Glyoxysomen ausgeschleust und für die Glukoseneogenese verwendet. Sobald sich erste grüne Blätter ausbilden, werden die Glyoxysomen in die Peroxisomen der Blätter umgewandelt. Dies geschieht ganz allmählich durch ein verändertes Expressionsmuster peroxisomaler/glyoxysomaler Proteine bei gleichzeitiger Degradation vorhandener Proteine. In den maturen Blattperoxisomen erfolgt die Oxidation von Glykolat aus den Reaktionen der Photorespiration. In seneszenten Blättern können die Peroxisomen wieder in Glyoxysomen umgewandelt werden. Weiterhin lassen sich in Pflanzen auch gewebeabhängige Peroxisomensubtypen unterscheiden. Neben den Peroxisomen der grünen Blätter lassen sich auch über die Pflanze verteilt undifferenzierte Peroxisomen und die Peroxisomen der Wurzelknötchen identifizieren. In diesen finden sich Ureat- und Xanthinoxidase als Markerenzyme wieder (Hayashi und Nishimura 2006). Woronin bodies unterscheiden sich in ihrer Struktur stark von den übrigen Microbodies, da sie einen großen kristallinen Kern enthalten. Bemerkenswert ist weiterhin, dass in den 1

13 1. Einleitung Kompartimenten der Euascomyceten nicht nur ein Mitglied der Microbody-Familie vorkommt, sondern gleichzeitig Glyoxysomen und Woronin bodies auftreten. Da eine Entstehung von Woronin bodies aus Glyoxysomen als nahezu gesichert betrachtet werden kann, wurden sie zu den Microbodies gerechnet (Allen 1976; Jedd und Chua 2000). Die Entstehung von Woronin bodies aus Glyoxysomen konnte bereits in Ansätzen in elektronenmikroskopischen Bildern festgestellt werden und wurde in den letzten Jahren auch mit weiteren Methoden, wie z. B. zeitauflösender Fluoreszenzmikroskopie untersucht (Tey et al. 2005). Jedoch konnten bisher weder glyoxysomale Proteine in Woronin bodies nachgewiesen werden, noch war es umgekehrt möglich, Woronin body-spezifische Proteine in Glyoxysomen zu identifizieren. Der genaue Wissensstand und die Entwicklung der Forschung zu diesem einzigartigen Organell sind in Kapitel 1.1 dargestellt. 1.1 Woronin bodies Zum ersten Mal wurden Woronin bodies 1864 in Ascobolus pulcherrimus von M. Woronin beschrieben. Dieser fand im Lichtmikroskop kleine Körnchen, deren Umrisse immer viel schärfer und dunkeler erschienen als bei den übrigen Plasmakörnchen; und dabei liegen in den meisten Fällen auf der einen Seite der Querwand zwei oder drei solcher Körnchen, während auf der anderen Seite sich bloß eines derselben befindet (Woronin 1864). Diese Körnchen, die scheinbar das Licht in der für Woronin bodies typischen Weise stark brachen, wurden 1933 durch Buller bestätigt und nach ihrem Entdecker Woronin bodies getauft (Buller 1933). Jedoch beruhten alle Beschreibungen von Woronin bodies lange Zeit nur auf Beobachtungen im Lichtmikroskop. Da jedoch auch andere Zellorganellen das Licht teilweise stark brechen können, ist davon auszugehen, dass einige dieser Beschreibungen nicht auf Woronin bodies zurück geführt werden können. Auch wurden zahlreiche unterschiedliche Bezeichnungen für hochgradig refraktile Strukturen in der Nähe von Septen eingeführt, bei denen es sich möglicherweise um Woronin bodies handeln könnte. Intensive elektronenmikroskopische Untersuchungen an unterschiedlichsten Ascomyceten und Deuteromyceten lieferten eine große Anzahl an stark elektronendichten Organellen, für die unterschiedlichste Begriffe geprägt wurden. So wurden neben dem Begriff Woronin body auch die Begriffe Woronin-like body (Camp 1971; Cutler und Erke 1971), lipids (Sachs et al. 1970), lipid bodies (Moore und McAlear 1962; Mitchell und McKeen 1970), lipoid granules (Zacharuk 1970), lipoidal inclusions (Zacharuk 1971), lysosomes (Wilson et al. 1970), spherosomes (Wilson et al. 1970; McCoy et al. 1971), crystal-containing microbodies (Maxwell et al. 1972) und granules (Dickson 1963) geprägt. Es ist davon 2

14 1. Einleitung auszugehen, dass es sich bei einer großen Zahl dieser Beobachtungen um Woronin bodies handelte. Eine klarere Definition eines Woronin bodies lieferten erst 1965 Reichle und Alexander, die in elektronenmikroskopischen Aufnahmen von verschiedenen Fusarium- Spezies sehr elektronendichte runde Organellen beobachten konnten, die mit Septen assoziiert vorlagen. Diese wurden von den Autoren als Woronin bodies bezeichnet (Reichle und Alexander 1965). Die aus ihren Aufnahmen erhaltenen Charakteristika, lieferten eine lange Zeit gültige Definition. Dickson lieferte 1963 die Beschreibung einer ersten Funktion für Woronin bodies. Zunächst wurden nur Vermutungen angestellt, dass die Woronin bodies zu einer Verstopfung der Septen nach Beschädigung der Hyphen oder in alterndem Myzel führen (Dickson 1963; Reichle und Alexander 1965). Eine Untersuchung an N. crassa zeigte dann aber den Verschluss beschädigter Hyphen durch Woronin bodies deutlich (Trinci und Collinge 1974). Exemplarische Aufnahmen von Woronin bodies zeigt Abbildung 1. Abb. 1: Aufnahmen von Woronin bodies (entnommen und verändert aus Reichle und Alexander 1965; Wergin 1973; Trinci und Collinge 1974). (A) Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Woronin bodies vor der Pore eines Septums von Fusarium solani in 40000facher Vergrößerung (Reichle und Alexander 1965). (B) Phasenkontrast-Aufnahme einer Hyphe von N. crassa, 22 Minuten nach einem osmotischen Schock. Ein Woronin body verschließt ein Septum (Trinci und Collinge 1974). (C) Abschnürung eines elektronendichten Woronin bodies von einem Microbody in 70000facher Vergrößerung (Wergin 1973). Wb = Woronin body; M = Microbody. Wenige Jahre später konnten erstmalig Hinweise auf die Entstehung der Woronin bodies gesammelt werden. In elektronenmikroskopischen Aufnahmen von Ascodesmis sphaerospora wurde 1968 gezeigt, wie sich elektronendichte Organellen, bei denen es sich vermutlich um Woronin bodies handelt, von anderen Membranstrukturen abschnüren (Brenner und Carroll 1968). Worum es sich bei diesen Membranstrukturen handelt, konnte damals nicht eindeutig geklärt werden. Brenner und Carroll (1968) vermuteten den Ursprung der beobachteten Membransäcke im endoplasmatischen Retikulum. Jedoch sollte man auch Microbodies, wie Glyoxysomen und Peroxisomen, nicht als Erklärung für diese Membransäcke ausschließen. 3

15 1. Einleitung Weiterhin gelang es ihnen durch den Vergleich von elektronenmikroskopischen und lichtmikrokopischen Aufnahmen die stark elektronendichten Organellen, wie sie z. B. Reichle und Alexander beschrieben, und die klassischen Woronin bodies der lichtmikroskopischen Aufnahmen, in Einklang zu bringen (Reichle und Alexander 1965). Auf Grundlage dieser Beobachtungen konnten Woronin bodies in elektronenmikroskopischen Aufnahmen vieler anderer filamentöser Ascomyceten und Deuteromyceten identifiziert werden. Eine Übersicht zeigt Tabelle A1 im Anhang. Die Abschnürung der Woronin bodies von Microbodies wurde von Wergin 1973 durch elektronenmikroskopische Untersuchungen an Fusarium oxysporum bestätigt (Abb. 1 C). Außerdem trug er dazu bei, die Klassifikationen von Woronin bodies, Microbodies und Sphärosomen, welche bis dato zum Teil durchmischt verwendet wurden, strikt zu trennen, indem er eindeutige Beschreibungen zu diesen Strukturen lieferte (Wergin 1973). Bereits 1961 wurden erste Untersuchungen zur Zusammensetzung der Woronin bodies angestellt (Tsuda und Tatum 1961). Aufgrund verschiedener Experimente wurde angenommen, dass es sich bei den Woronin bodies der Ascomyceten und insbesondere den hexagonalen Strukturen in N. crassa um Ergosterolkristalle handelt. Dies konnte 1974 durch Hoch und Maxwell widerlegt werden (Hoch und Maxwell 1974). In Untersuchungen an Whetzelinia sclerotiorum und N. crassa konnte eindeutig gezeigt werden, dass die hexagonalen Kristalle, die in diesen Organismen beobachtet und im gleichen Jahr zu den Woronin bodies gerechnet wurden, nicht aus Ergosterol gebildet werden. Für diese Kristalle konnte, genau wie auch für die klassischen Woronin bodies aus Fusarium solani, ein Abbau durch Proteasen gezeigt werden. Somit wurde anstelle von Ergosterolkristallen ein proteinogener Kern für Woronin bodies etabliert. Erst die Zuordnung der hexagonalen Organellen aus N. crassa zu den Woronin bodies führte zu einer Erweiterung der Definition für Woronin bodies. Für N. crassa und später auch für Sordaria brevicollis wurden, abhängig von der Schnittebene, deutlich hexagonale Strukturen beobachtet (Trinci und Collinge 1974; Markham und Collinge 1987). Somit wurde für die Pyrenomyceten eine Subklasse von Woronin bodies mit hexagonaler Struktur eingeführt. Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen, die eine Entstehung der Woronin bodies aus Microbodies nahe legen, veranlassten Edward Allen dazu, nach Enzymaktivitäten in Woronin bodies zu suchen (Allen 1976). Zunächst wurde nach einer Katalaseaktivität gesucht. Jedoch brachten DAB-Färbungen kein eindeutiges Resultat. Später konnten geringe Aktivitäten für Katalase und Uricase diesem Organell zugeordnet werden (Wanner und Theimer 1982; Veenhuis et al. 1984; Kionka und Kunau 1985; Valenciano et al. 1996; Tenney et al. 2000). Zwar deckten die Untersuchungen von Allen keine eindeutige enzymatische Aktivität für 4

16 1. Einleitung Woronin bodies auf, es ergaben sich jedoch weitere Hinweise auf den Entstehungsort dieser Organellen. So konnten im Apex der Hyphen verstärkt Microbodies assoziiert mit hexagonalen und elektronendichten Strukturen gefunden werden. In alten Hyphen schienen nur noch mature Woronin bodies vertreten zu sein. Collinge und Markham konnten diese Beobachtungen für verschiedene Aspergillus Spezies jedoch nicht bestätigen (Collinge und Markham 1982). Da Woronin bodies nur für Ascomyceten und Deuteromyceten beschrieben wurden, zog man ihr Vorkommen bald als Bestimmungsmerkmal heran (Markham und Collinge 1987; Larrondo und Calvo 1992; Alexopoulus et al. 1996). Eine Beteiligung der Woronin bodies an der Konidienbildung in Aspergillus nidulans wurde 1988 von Mims et al. ausgeschlossen, während Simon et al in Cymadothea trifolii zeigen konnten, dass die Septen zwischen Konidien und Konidiophoren durch Woronin bodies verschlossen werden (Mims et al. 1988; Simon et al. 2005). Der Verschluss dieser Septen wurde auch für weitere Ascomyceten beschrieben (Drechslera sorokiniana, Cole 1973; Erysiphe pisi, Martin und Gay 1983; Stemphylium herbarum, Beckett et al. 1974). Eine weitere Untersuchung zur Konidiogenese in Asochyta rabiei legte den Schluss nahe, dass die Bildung von Konidien über Phialiden ohne Woronin bodies auskommt (Singh et al. 1997), während ihre Entstehung aus undifferenzierten Hyphen vermutlich Woronin bodies erfordert. Durch Keller und Mitarbeiter konnte 1991 gezeigt werden, dass in der Matrix der Woronin bodies (hier als hexagonal crystals bezeichnet) von N. crassa Proteine mit einer peroxisomalen Signalsequenz vom Typ 1 (PTS1, siehe auch Kapitel 1.3.4) auftraten (Keller et al. 1991). Dies gelang über die Markierung von PTS1-Proteinen mit goldmarkierten Antikörpern gegen die typische PTS1-Sequenz SKL. Nachgewiesen werden konnte die Bindung der anti-pts1 Antikörper an Proteine innerhalb der Glyoxysomen und auch der Woronin bodies (Keller et al. 1991). Diese Ergebnisse bestätigten eindeutig die von Hoch und Maxwell gefundene Proteinmatrix der Woronin bodies (Hoch und Maxwell 1974). Durch Saccharosedichtegradientenzentrifugation intakter N. crassa Organellen konnten zwei Subpopulationen von Microbodies identifiziert werden. Die weniger dichten Organellen konnten als Glyoxysomen identifiziert werden, während die dichteren auf Grund einer Katalaseaktivität als Peroxisomen bezeichnet wurden (Wanner und Theimer 1982; Kionka und Kunau 1985). In Immunoblots der dichteren Fraktionen (1,26 g/cm³) des Dichtegradienten konnte mit Hilfe des Anti-PTS1-Antikörpers ein ca. 20 kda großes Protein identifiziert werden. Weitere Proteine konnten über diesen Antikörper nicht identifiziert werden. Ferner war dieses Protein in großer Menge vorhanden und wurde somit als die Hauptkomponente der hexagonalen Kristalle eingestuft (Keller et al. 1991). 5

17 1. Einleitung Erst im Jahre 2000 gelang es zwei Arbeitsgruppen nahezu zeitgleich das bereits von Schliebs und Kunau 1991 (Keller et al. 1991) entdeckte Protein als HEX-1 Protein zu identifizieren (Jedd und Chua 2000; Tenney et al. 2000). Jedd und Chua konnten weiterhin bestätigen, dass Woronin bodies die Septen bei Beschädigung der Hyphe verschließen (Jedd und Chua 2000). Eine von ihnen generierte HEX-1Δ Mutante wies keine erkennbaren Woronin bodies mehr auf und zeigte einen ausgeprägten Verlust von Zytoplasma, besonders unter Wachstumsbedingungen, die zu einem stark verzweigten Myzel führen. In Abbildung 2 ist der Vergleich zwischen Wildtyp und HEX-1Δ Mutante zu sehen. WT HEX-1Δ Abb. 2: Lichtmikroskopische Aufnahmen von N. crassa Wildtyp und HEX-1Δ Mutante (verändert nach Jedd und Chua 2000). Deutlich Erkennbar sind die orangefarbenen Zytoplasmatröpfchen in der HEX-1Δ Mutante, die im Wildtyp fehlen (Jedd und Chua 2000). Eine Beteiligung der Woronin bodies an der Bildung von Makrokonidien ähnlich der in Cymadothea trifolii war nicht zu beobachten, da die erzeugte HEX-1Δ Mutante in der Lage war Lufthyphen und Makrokonidien zu bilden. Tenney und Mitarbeiter generierten ebenfalls eine HEX-1Δ Mutante, bedienten sich dazu jedoch eines anderen Mechanismus (Tenney et al. 2000). Sie unterzogen diese Mutante einer weit genaueren Analyse, als Jedd und Chua dies getan hatten. Dabei stellten sie fest, dass zwar Makrokonidien gebildet werden, diese jedoch in weitaus geringerer Anzahl entstehen. Da der beobachtete Phänotyp dieser Mutante stark an einen so genannten osmotischen Phänotyp erinnerte, überprüften Tenney et al. das Wachstum auf Hochsalzmedium. Dabei zeigte sich kein Wachstumsdefekt. Diese Beobachtung spricht für eine intakte Zellwand, während der starke Verlust an Zytoplasma auf das Fehlen der Woronin bodies zurückgeführt werden kann. Wie schon in früheren Untersuchungen verschiedener Arbeitsgruppen konnten Tenney et al., den Woronin bodies aus N. crassa eine Katalaseaktivität zuordnen (Tenney et al. 2000). In Magnaporthe grisea zeigte sich 2004 eine Beteiligung von Woronin bodies an der Infektion von Pflanzen (Soundararajan et al. 2004). Eine effektive Infektion einer Wirtspflanze (z. B.: Oryza sativa) durch M. grisea konnte in einer MVP1-Mutante (N. crassa HEX-1-Ortholog) nicht mehr nachgewiesen werden, möglicherweise weil die Appressorien nicht mehr ihre ursprüngliche Form aufwiesen. Durch Komplementation mit dem mvp1 Gen, 6

18 1. Einleitung war es möglich, den Wildtypphänotyp wiederherzustellen. Weiterhin konnte ein Wachstumsdefekt unter Stickstoffmangelbedingungen gezeigt werden, unter dem die Hyphen von M. grisea verstärkt absterben. Ohne Woronin bodies ist ein effektives Abschotten dieser Myzelteile nicht mehr möglich, wodurch wird das gesamte Myzel extrem gestresst und in Mitleidenschaft gezogen wird. Ein Jahr später konnte über konfokale Laserscanning-Mikroskopie der Verschluss von Septen durch Woronin bodies eindeutig nachgewiesen werden. Durch Beobachtung eines DsRed-HEX-1 Fusionsproteins in Aspergillus oryzae bei gleichzeitiger GFP-Fluoreszenzmarkierung der Septen zeigte sich dieser Verschluss sehr deutlich. Außerdem konnte gezeigt werden, dass ein Fluorophor am N-Terminus des HEX-1 Proteins die Ausbildung des kristallinen Kerns der Woronin bodies nicht verhindert und die Funktionalität des Organells gewährleistet bleibt (Maruyama et al. 2005). Bisher konnten Woronin bodies in über 100 filamentösen Pilzen identifiziert werden (Tabelle A1 im Anhang). Obwohl die Definitionen für Woronin bodies zunächst nur sehr ungenau waren und für diese Strukturen zunächst auch noch eine große Anzahl verschiedenen Bezeichnungen gewählt wurden, konnte doch schließlich eine eindeutige Beschreibung dieser Organellen gefunden werden. Wenn man alle bekannten Daten zusammenfasst, so haben Woronin bodies folgende Eigenschaften: 1) Woronin bodies sind im Lichtmikroskop hoch refraktile Strukturen, die entweder in der unmittelbaren Nähe der Septen oder zumindest an der Plasmamembran lokalisiert sind. 2) Auch in der Elektronenmikroskopie erscheinen Woronin bodies als Septen-assoziierte Organellen. Zusätzlich sind Woronin bodies hier jedoch noch als von einer Membran umschlossene elektronendichte Organellen erkennbar. 3) Die Matrix der Woronin bodies besteht aus Proteinen. Bisher konnte nur das HEX-1 Protein aus N. crassa oder Orthologe davon identifiziert werden. Dieses scheint hoch konserviert zu sein und stellt somit ein weiteres eindeutiges Merkmal dar. 4) Die Ansiedlung von enzymatischen Aktivitäten in den Woronin bodies ist von einigen Autoren beschrieben worden, jedoch konnten die entsprechenden Enzyme nicht identifiziert werden. Durch andere Autoren konnten diese enzymatischen Aktivitäten nicht bestätigt werden. Als Identifizierungsmerkmale erscheinen diese Aktivitäten daher ungeeignet. 5) Bisher wurden Woronin bodies nur in filamentösen Ascomyceten oder Deuteromyceten, die vermutlich Ascomyceten ohne sexuelle Fortpflanzung darstellen, gefunden. Dies scheint so typisch zu sein, dass es als Bestimmungsmerkmal Einzug in die Literatur gefunden hat. 7

19 1. Einleitung Da bisher nur das HEX-1 Protein oder Orthologe davon als Bestandteil der Woronin bodies identifiziert werden konnte, soll dieses Protein im Folgenden näher beschrieben werden. 1.2 Das HEX-1 Protein aus Neurospora crassa und seine Orthologen Wie bereits erwähnt, wurde das HEX-1 Protein von zwei Arbeitsgruppen nahezu zeitgleich als Hauptkomponente der Woronin bodies in N. crassa identifiziert (Jedd und Chua 2000; Tenney et al. 2000). Dieses Protein hat in N. crassa eine Masse von ca. 19 Kilodalton. Für andere Organismen sind geringe Differenzen von dieser Größe beschrieben worden, die auf Grund einer geringen Abweichung in der Aminosäuresequenz bzw. unterschiedlicher Spleißformen der mrna entstehen (Jedd und Chua 2000; Asiegbu et al. 2004). Es konnte gezeigt werden, dass dieses Protein aus N. crassa sowohl in vivo, als auch in vitro spontan kristalline Strukturen ausbildet. Die Kristallstruktur ist dabei in Abbildung 3 dargestellt (Yuan et al. 2003). Ebenso gelang der Nachweis sehr kleiner Woronin bodies nach Expression von HEX-1 in S. cerevisiae. Diese hatten mit 100 nm jedoch nur ein Fünftel der Größe wie die Woronin bodies in N. crassa (Jedd und Chua 2000). Bei der Kristallisation des HEX-1 Proteins in vitro konnten ungefähr 5 µm große hexagonale Kristalle erzeugt werden. Durch die Sequenzierung des Proteins, bzw. des korrespondierenden Gens, konnte am extremen C-Terminus eine möglich peroxisomale Signalsequenz vom Typ 1 (PTS1) identifiziert werden. Die Lokalisierung eines GFP-HEX-1 Fusionsproteins zu Peroxisomen in S. cerevisiae ist vermutlich auf diese Abb. 3: Kristallstruktur des HEX-1 Proteins aus N. crassa (verändert aus Yuan et al. 2003). Die Sequenz zurückzuführen, da die Deletion Struktur aus (A) ist unter (B) um 90 gedreht. Deutlich erkennbar ist die Teilung des Proteins in des C-terminalen Leucins zu einer zwei Domänen. Die N-terminale Domäne wird aus zytosolischen Lokalisation führte. Spätere sechs β-strängen und einer Helix gebildet, während die C-terminale Domäne aus zwei Helices Arbeiten zu HEX-1 in N. crassa konnten und fünf β-strängen besteht. Die β-stränge beider Domänen bilden jeweils ein β- Barrel aus.(yuan die zeitweise Kolokalisation von HEX-1 et al. 2003) und eines artifiziellen peroxisomalen Markers (GFP-PTS1) zeigen (Tey et al. 2005). Dabei scheint das HEX-1 Protein zunächst in Glyoxysomen importiert zu werden. Die Anreicherung des Proteins führt dann zur Ausbildung eines ersten Kristalls, der dann weiter wächst und schließlich über einen 8

20 1. Einleitung unbekannten Mechanismus abgeschnürt wird. Diese Untersuchungen konnten auch die bereits 1976 von Allen gemachten Beobachtungen, dass Woronin bodies in der Nähe des Apex der Hyphen gebildet werden, bestätigen. Dabei scheint die Synthese des HEX-1 Proteins auf die ersten Kompartimente nach der Hyphenspitze beschränkt zu sein. Da ein Transport der maturen Woronin bodies zwischen den Kompartimenten auf Grund ihrer Funktion ausgeschlossen ist, erscheint diese Beobachtung durchaus sinnvoll. Die Bedeutung des HEX-1 Proteins für die Ausbildung und Gestalt der Woronin bodies konnte durch die Ermittlung der Struktur dieses Proteins weiter verdeutlicht werden (Yuan et al. 2003). Sequenzvergleiche des HEX-1 Proteins mit Proteindatenbanken lieferten neben den HEX-1 Orthologen anderer filamentöser Pilze nur noch eine weitere Familie von Proteinen. Das HEX-1 Protein weist eine schwache Sequenzähnlichkeit zu eukaryotischen Initiationsfaktoren des Typs 5A (eif-5a) auf. Die Ähnlichkeit dieser beiden Proteinfamilien zeigt sich jedoch wesentlich stärker, wenn man ihre Strukturen miteinander vergleicht. Das HEX-1 Protein aus N. crassa weist eine Struktur mit zwei deutlich getrennten Domänen auf. Die N-terminale Domäne wird aus sechs antiparallelen β-strängen gebildet. Zwischen den ersten beiden wird eine Helix ausgebildet. Die C-terminale Domäne ist ähnlich angelegt. Sie besteht aus fünf β-strängen und 2 Helices, wobei diese zwischen den β-strängen neun und zehn ausgebildet werden. Helix 2 ist eine α-helix, während Helix 3 wiederum eine Helix repräsentiert. Die Anordnung der beiden Domänen und viele ihrer sekundären Strukturelemente wird in den Proteinen der eif-5a Familie wieder gefunden (Yuan et al. 2003). Eine besondere Eigenschaft des HEX-1 Proteins ist die Fähigkeit spontan zu oligomerisieren. Diese Oligomerisierung wird über drei unterschiedliche Βereiche des Proteins vermittelt. Die Interaktionen, welche durch die Gruppe I vermittelt werden, dienen der Dimerisierung des Proteins. Mehrere Dimere werden über Interaktionen der Gruppe II zu einer Helix zusammengefügt. Dabei werden 12 Moleküle HEX-1 für eine volle Umdrehung der Spirale benötigt. Diese Spirale bildet einen Tunnel mit einem Durchmesser von 34 Å, in den die ersten 26 Aminosäuren des N-Terminus hineinragen. Jede dieser Helices kann mit sechs anderen Helices über Interaktionen der Gruppe III interagieren. Auf Grund dieser Interaktionen bildet sich in N. crassa ein deutlich hexagonaler kristalliner Kern der Woronin bodies aus (Yuan et al. 2003). Die Organisation der HEX-1-Moleküle in diesem Kristall ist in Abbildung 4 dargestellt. Mutationen in den drei Interaktionsbereichen können eine Oligomerisierung verhindern. Es konnte gezeigt werden, dass dann keine funktionalen Woronin bodies mehr gebildet werden. Die hohe strukturelle Ähnlichkeit zwischen den HEX- 1-orthologen Proteinen und den Proteinen der eif-5a Familie impliziert einen evolutionären Ursprung des HEX-1 Proteins in eben dieser Familie. Dieser evolutionäre Ursprung wird durch einige Hinweise gestützt. Auch für eif-5a konnte in vitro die Bildung von Dimeren, 9

21 1. Einleitung Tetrameren und Hexameren beobachtet werden (Chung et al. 1991). Diese Interaktionen sind zwar bei weitem nicht so stark, wie die des HEX-1 Proteins, könnten jedoch für die Ausbildung primitiver Woronin bodies bei einem frühen filamentösen Ascomyceten ausgereicht haben. Abb. 4: Organisation des HEX-1 Kristalls (verändert aus Yuan et al. 2003). (A) Seitenansicht einer HEX-1 Helix. Dargestellt sind die Interaktionen der Gruppe I und der Gruppe II (schwarze Pfeile). HEX-1 Moleküle sind abwechselnd in Blau oder Pink dargestellt. Für eine volle Umdrehung der Helix werden 12 HEX-1 Moleküle benötigt. (B) Aufsicht auf eine HEX-1 Helix. Grün dargestellt sind die Aminosäurereste, die sich für die Interaktionen der Gruppe III verantwortlich zeichnen. Der Tunnel im Inneren der Helix weist einen Durchmesser von ca. 34 Å auf und ist vermutlich durch den N-Terminus ausgefüllt. (C) Sieben HEX-1 Helices bilden über die Interaktionen der Gruppe III (grün) einen sechseckigen Kristall aus (Yuan et al. 2003). Dass das C-terminale PTS1 Motiv für einen glyoxysomalen Import des HEX-1 Proteins verantwortlich ist, erscheint im Licht der bisherigen Beobachtungen wahrscheinlich (Jedd und Chua 2000; Tey et al. 2005). Ob dann die Bildung eines kristallinen Kerns als Signal für die Abschnürung der Woronin bodies ausreicht und wie die sehr einheitliche Größe der Woronin bodies erreicht wird, bleibt jedoch weiter unklar. Weitere Untersuchungen zur direkten Beteiligung der glyoxysomalen Matrixproteinimportmaschinerie am HEX-1 Import könnten hier für mehr Klarheit sorgen. Im Folgenden soll daher die Biogenese der Peroxisomen (Glyoxysomen) näher betrachtet werden. 1.3 Peroxisomen Da sich die Biogenese von Peroxisomen und Glyoxysomen in ihrem zugrunde liegenden Mechanismus nicht unterscheidet, soll in diesem Kapitel der bisherige Stand der Forschung zu Peroxisomen erläutert werden. Der Unterschied zwischen Peroxisomen und Glyoxysomen entsteht einzig durch eine unterschiedliche Zusammensetzung ihrer Matrix, da Glyoxysomen zusätzlich die Enzyme des Glyoxylatzyklusses enthalten (Carson und Cooney 1990). Zuerst erwähnt wurden Peroxisomen 1954 durch Rhodin, der jedoch zunächst nur von spherical and oval microbodies sprach (Rhodin 1954). Ihren heutigen Namen erlangten 10

22 1. Einleitung diese Microbodies durch de Duve, der sie entsprechend einer ihrer Funktionen, dem Abbau von Peroxiden, benannte (de Duve und Baudhuin 1966). Peroxisomen weisen in Abhängigkeit von exogenen Faktoren, Zelltyp und Organismus eine große Bandbreite an unterschiedlichen Funktionen auf. Ferner variiert auch ihre Proteinzusammensetzung und sie unterliegen Schwankungen in Anzahl und Morphologie (Hruban und Rechcigl 1969). Für Peroxisomen konnten bisher ca. 50 unterschiedliche Enzyme in Säugerzellen beschrieben werden (Wanders und Waterham 2006a). Aber auch für Pilze konnten mehr als 30 Enzyme in Microbodies lokalisiert werden (Carson und Cooney 1990). In Säugern sind unter anderem Teile der Plasmalogen- und Gallensäurebiosynthese sowie des Prostaglandinstoffwechsels in Peroxisomen angesiedelt. Weiterhin findet der Abbau von Fettsäuren in diesen Organellen im Rahmen der β-oxidation statt (Poirier et al. 2006), wobei in humanen Peroxisomen nur sehr langkettige Fettsäuren (C 24), verzweigtkettige Fettsäuren (im Rahmen der α-oxidation) und Dicarbonsäuren abgebaut werden. Defekte in einigen dieser Stoffwechselwege bzw. in der Biogenese des Peroxisoms führen je nach Organismus zu mehr oder weniger starken Auswirkungen. Während S. cerevisiae nur beim Wachstum auf Medium mit Fettsäuren als einziger Kohlenstoffquelle Peroxisomen benötigt und sonst sehr gut ohne dieses Organell überleben kann (Erdmann et al. 1989), ist es für Säuger von essentieller Bedeutung (Wanders 2004), wie das folgende Kapitel verdeutlicht Auswirkungen peroxisomaler Defekte Für die Bäckerhefe stellt das Fehlen intakter Peroxisomen nur dann ein Problem dar, wenn ausschließlich Fettsäuren als Kohlenstoffquelle zur Verfügung stehen (Erdmann et al. 1989). Für filamentöse Ascomyceten scheinen die Auswirkungen peroxisomaler Defekte wesentlich bedeutender zu sein. In Magnaporthe grisea konnten zwei unterschiedliche Defekte charakterisiert werden. Zum einen wurde eine Mutation im Carnitin-abhängigen Acetyl-Transport (CrAT) untersucht, zum anderen eine Deletion des pex6-gens (Ramos-Pamplona und Naqvi 2006). Die Pathogenität von M. grisea ist bei beiden Defekten faktisch nicht mehr vorhanden. Die Ausbildung der Appressorien zur Infektion des pflanzlichen Gewebes scheint eine große Menge Energie zu benötigen, die durch den Abbau von Speicherlipiden in den Glyoxysomen bereitgestellt wird (Wang et al. 2003). In der pex6δ-mutante sind die Glyoxysomen in ihrer Biogenese gestört, während in einer CrAT-Mutante der Export von Acetyleinheiten nicht erfolgt. In beiden Fällen ist die Energieversorgung der Zelle gestört und es findet keine Infektion einer Wirtspflanze mehr statt. 11

23 1. Einleitung Drei weitere peroxisomale Defekte konnten für Podospora anserina beschrieben werden (Berteaux-Lecellier et al. 1995; Bonnet et al. 2006). Dort wurden Deletionen der Gene pex2, pex5 und pex7 untersucht. Ähnlich wie S. cerevisiae ist auch P. anserina nicht in der Lage auf Ölsäure zu wachsen, wenn PEX5 oder PEX2 fehlen. Der PEX7Δ Stamm weist dagegen ein geringes Restwachstum auf. Weiterhin ist die Melaninsynthese in den Ascosporen der PEX5Δ oder PEX7Δ Stämmen gestört. Beide Stämme sind nahezu steril, da die Ascosporen nur noch in sehr geringer Anzahl keimungsfähig sind. Mycelien ohne PEX5 weisen weitere Besonderheiten auf. So werden auf Standardmedium weniger Lufthyphen als im Wildtyp gebildet und außerdem scheinen die Zellkerne nicht mehr gleichmäßig verteilt zu werden, wobei auch die Form und Größe der Kerne variabel ist (Bonnet et al. 2006). Für die PEX2Δ Mutante konnte gezeigt werden, dass keine sexuelle Fortpflanzung mehr möglich ist, weil der Wechsel von Mitose zu Meiose nicht mehr vollzogen werden kann. Warum die Deletion eines peroxisomalen Proteins zu einem solchen Defekt führt, ist bisher nicht geklärt (Berteaux- Lecellier et al. 1995; Bonnet et al. 2006). Jedoch konnte auch für die PEX5Δ Mutante beobachtet werden, dass die Kernverteilung während der Ascosporenbildung gestört ist. Es konnte für diesen Stamm weiterhin eine weibliche Sterilität nachgewiesen werden. Die Stämme PEX5Δ und PEX7Δ wiesen außerdem in Experimenten eine verkürzte Lebensspanne auf. Ob diese auf Grund einer größeren Menge reaktiver Sauerstoffverbindungen (H 2 O 2 ) oder anderen Effekten fehlerhafter Glyoxysomen lag, war nicht Gegenstand der Untersuchungen (Bonnet et al. 2006). Die Auswirkungen von peroxisomalen Defekten auf Säugetiere sind am Besten untersucht. Einige menschliche Erbkrankheiten konnten auf, in Funktion oder Biogenese, gestörte Peroxisomen zurückgeführt werden. Bisher konnten 17 verschieden Krankheiten auf solche Schäden zurückgeführt werden. Diese Erkrankungen konnten in zwei unterschiedliche Gruppen aufgeteilt werden. Zur ersten Gruppe werden alle Erkrankungen gerechnet, die auf generellen Defekten der Peroxisomenbiogenese beruhen. Zu diesen werden unter anderem das Zellweger-Syndrom, die infantile Refsum sche Erkrankung und die neonatale Adrenoleukodystrophie gerechnet. Bei allen drei Erkrankungen lassen sich schwere neurologische und hepatische Dysfunktionen, craniofaciale Abnormitäten und ein generell niedriger Muskeltonus feststellen. Die Lebenserwartung von Patienten mit diesen Erkrankungen ist deutlich reduziert und reicht je nach Grad und Art der Erkrankung von wenigen Monaten bis zu über 20 Jahren (Wanders und Waterham 2005; 2006b; a). Die zweite Gruppe von peroxisomal bedingten Erkrankungen beruht auf Defekten einzelner Enzyme. Dazu gehören z. B. die X-chromosomale Adrenoleukodystrophie, die Hyperoxalurie 12

24 1. Einleitung des Typs 1, die Acatalasämie, sowie Defekte der peroxisomalen Thiolase und des trifunktionellen Enzyms (Wanders 2004). Es ist dabei äußerst bemerkenswert, dass identische Mutationen zu unterschiedlichen Krankheitsbildern führen können. Warum dies dar Fall ist, blieb bisher ungeklärt. Einen Schlüssel zum besseren Verständnis der Funktion und Biogenese der Peroxisomen stellt mit Sicherheit die Identifizierung von an der Biogenese beteiligten Proteinen dar. In den nächsten Kapiteln sollen einige der bisher bekannten Peroxine daher näher vorgestellt werden Peroxine Die Biogenese der Peroxisomen lässt sich generell in drei Schritte unterteilen: 1) Bereitstellung von Membranen 2) Import von Membranproteinen 3) Import von Matrixproteinen Die an diesen Prozessen beteiligten Proteine werden seit 1996 Peroxine genannt und die korrespondierenden Gene pex-gene (Distel et al. 1996). Peroxine werden an freien Ribosomen im Zytosol synthetisiert und dann posttranslational in Peroxisomen bzw. die peroxisomale Membran transportiert (Eckert und Erdmann 2003). In Tabelle 1 sind die bisher bekannten 32 Peroxine entsprechend ihrer Funktion sortiert aufgelistet. Tab. 1: Exemplarische Übersicht der bislang identifizierten Peroxine. Peroxin Lokalisation und Funktion Organismus/ Literatur (1) Membranbiogenese PEX3 PEX16 PEX19 peroxisomales Membranprotein, beteiligt am PMP-Import, interagiert mit PEX19 peroxisomales Membranprotein, beteiligt an Membranbiogenese oder PMP-Import vorwiegend zytosolisch lokalisiert, Importfaktor für PMP, farnesyliert Sc (Höhfeld et al. 1991), Hp (Baerends et al. 1996), Pp (Wiemer et al. 1996), Hs (Götte et al. 1998), Nc (Sichting et al. 2003) At (de Walque et al. 1999), Yl (Eitzen et al. 1997), Hs (South und Gould 1999), Nc (Sichting et al. 2003) Sc (Götte et al. 1998), Pp (Johnson et al. 2001), Hs (Fransen et al. 2001), Nc (Sichting et al. 2003) (2) Matrixprotein-Import (Ausfall führt zu partiellem Defekt) PEX5 PTS1-Rezeptor, bindet an den Dockingkomplex Sc (van der Leij et al. 1993), Yl (Eitzen et al. 1995), Hp (van der Klei et al. 1995), Pp (McCollum et al. 1993), At (Brickner und Olsen 1998), Hs (Dodt et al. 1995; Fransen et al. 1995), Nc (Sichting et al. 2003) PEX7 PTS2-Rezeptor, bindet an den Dockingkomplex Sc (Marzioch et al. 1994), Pp (Elgersma et al. 1998), Nc (Sichting et al. 2003), At (Schumann et al. 1999), Hs (Braverman et al. 1997; Motley et al. 1997) PEX18 vorwiegend zytosolisch lokalisiert, PTS2-spezifischer Sc (Purdue et al. 1998) Importfaktor PEX20 vorwiegend zytosolisch lokalisiert Yl (Titorenko und Rachubinski 1998), Nc (Sichting et al. 2003), Hp (Kiel et al. 2005b), Pp (Leon et al. 2006) PEX21 vorwiegend zytosolisch lokalisiert, PTS2-spezifischer Importfaktor Sc (Purdue et al. 1998) 13

25 1. Einleitung (3) Matrixprotein-Import (Ausfall führt zu generellem Defekt) PEX1 AAA-ATPase, interagiert mit PEX6 Sc (Erdmann et al. 1991), Pp (Faber et al. 1998), Hs (Portsteffen et al. 1997), Nc (Sichting et al. 2003) Peroxin Lokalisation und Funktion Organismus/ Literatur PEX2 RING-Fingerprotein, beteiligt am Matrixproteinimport Sc (Erdmann und Kunau 1992), Yl (Eitzen et al. 1996), Pp (Waterham et al. 1996), Hs (Shimozawa et al. 1992), Nc (Sichting et al. 2003) PEX4 PEX6 Ubiquitin-konjugierendes Enzym (E2), möglicherweise am Rezeptorrecycling beteiligt AAA-ATPase, beeinflusst PTS1-Rezeptorstabilität in humanen Fibroblasten, interagiert mit PEX1 Sc (Wiebel und Kunau 1992), Hp (Valenciano et al. 1998), Pp (Crane et al. 1994), Nc (Sichting et al. 2003) Sc (Voorn-Brouwer et al. 1993), Yl (Nuttley et al. 1994), Hp (de Walque et al. 1999), Pp (Faber et al. 1998), Hs (Yahraus et al. 1996), Nc (Sichting et al. 2003) PEX8 intraperoxisomales, peripheres Membranprotein Sc (Rehling et al. 2000), Yl (Smith et al. 1997), Hp (Waterham et al. 1994), Pp (Liu et al. 1995), Nc (Sichting et al. 2003) PEX9* peroxisomales Membranprotein Yl (Eitzen et al. 1995) PEX10 PEX12 PEX13 PEX14 RING-Fingerprotein, integrales Membranprotein, interagiert mit PEX12 und PEX5 RING-Fingerprotein, integrales Membranprotein, interagiert mit PEX10 SH3-Protein, integrales Membranprotein, Teil des Dockingkomplexes assoziiert mit peroxisomaler Membran, Teil des Dockingkomplexes Sc (Erdmann und Kunau 1992), Hp (Eitzen et al. 1995), Pp (Kalish et al. 1995), At (Schumann et al. 1999), Hs (Warren et al. 1998), Nc (Sichting et al. 2003) Sc (Albertini et al. 2001), Pp (Gould et al. 1996), Hs (Achanzar und Ward 1997), Nc (Sichting et al. 2003) Sc (Erdmann und Blobel 1996), Pp (Dodt et al. 1996), Hs (Dodt et al. 1996), Nc (Sichting et al. 2003) Sc (Albertini et al. 1997), Hp (Komori et al. 1997), Pp (Johnson et al. 2001), At (Hayashi et al. 2000), Hs (Fransen et al. 1998), Nc (Sichting et al. 2003) PEX15 peroxisomales Membranprotein, phosphoryliert Sc (Elgersma et al. 1997) PEX17 peripheres Membranprotein, Teil des Dockingkomplexes in S. cerevisiae Sc (Huhse et al. 1998), Pp (Johnson et al. 2001) PEX22 peroxisomales Membranprotein, interagiert mit PEX4, Pp (Koller et al. 1999) beteiligt am Matrixproteinimport in S. cerevisiae PEX23 peroxisomales Membranprotein, beteiligt am Matrixproteinimport in Y. lipolytica Yl (Brown et al. 2000), Nc (Sichting et al. 2003) PEX24 integrales Membranprotein Yl (Tam und Rachubinski 2002), Nc (Sichting et al. 2003) PEX26 peroxisomales Membranprotein, Membrananker für PEX6 Hs (Matsumoto et al. 2003) und PEX1 (4) Proliferation PEX11 peroxisomales Membranprotein, beteiligt an Peroxisomenteilung, bindet ARF ( ADP-ribosylation factor ) und Coatomer Sc (Erdmann und Blobel 1995), Hs (Abe und Fujiki 1998), Nc (Sichting et al. 2003) PEX25 peroxisomales Membranprotein, regulatorische Funktion in Sc (Li et al. 2002; Rottensteiner et al. 2003) Proliferation und Teilung PEX27 peroxisomales Membranprotein, regulatorische Funktion Sc (Rottensteiner et al. 2003) PEX28 peroxisomales Membranprotein, reguliert Verteilung, Größe Sc (Tam et al. 2003) und Anzahl der Peroxisomen PEX29 peroxisomales Membranprotein, reguliert Größe und Anzahl Sc (Tam et al. 2003) der Peroxisomen PEX30 peroxisomales Membranprotein, reguliert Größe und Anzahl Sc (Vizeacoumar et al. 2004) der Peroxisomen PEX31 peroxisomales Membranprotein, reguliert Größe und Anzahl Sc (Vizeacoumar et al. 2004) der Peroxisomen PEX32 peroxisomales Membranprotein, reguliert Größe und Anzahl Sc (Vizeacoumar et al. 2004) der Peroxisomen Abkürzungen: At, Arabidopsis thaliana; Hp, Hansenula polymorpha; Hs, Homo sapiens; Nc, Neurospora crassa Pp, Pichia pastoris; Sc, Saccharomyces cerevisiae; Yl, Yarrowia lipolytica. *Bei PEX9 handelt es sich wahrscheinlich um ein PEX26-Ortholog (Kiel et al. 2006). 14

26 1. Einleitung An der Biogenese peroxisomaler Membranen sind nur drei dieser Proteine beteiligt: PEX3, PEX16 und PEX19. Die Mitglieder der PEX11- und der PEX23-Familie regulieren die Proliferation und die Vererbung, während der Hauptteil der Peroxine für den Matrixproteinimport verantwortlich ist (Kiel et al. 2006). In N. crassa konnten einige dieser Peroxine über Homologievergleiche identifiziert werden (Sichting et al. 2003; Kiel et al. 2006) Peroxisomale Membranbiogenese Die genaue Herkunft peroxisomaler Membranen ist bis heute nicht eindeutig geklärt, obwohl sich die Hinweise auf das endoplasmatische Retikulum (ER) als Quelle der Ursprungsmembranen verdichten (Tam et al. 2005). Zunächst wurden Peroxisomen als eigenständige Organellen angesehen, die ähnlich wie Mitochondrien oder Chloroplasten aus Endosymbionten hervorgegangen sein sollten. Es konnte für Peroxisomen jedoch weder eine eigenes Erbgut (DNA), noch eine eigene Translationsmaschinerie nachgewiesen werden. Im Unterschied zu Mitochondrien und Chloroplasten sind Peroxisomen auch nur von einer einfachen Membran umgeben und nicht von zwei oder mehreren Membranen (Lazarow und Fujiki 1985). Lange Zeit galt das growth and division Modell von Lazarow und Fujiki als maßgebende Theorie für die Entstehung von Peroxisomen (Lazarow und Fujiki 1985). Dabei sollen sich Peroxisomen, sobald sie eine bestimmte Größe erreichen, in zwei Tochterorganellen teilen. Diese wachsen dann durch den Import von Matrix- und Membranproteinen wieder zu reifen Peroxisomen heran. Ungeklärt dabei bleibt jedoch, wie die peroxisomalen Membranen während der Wachstumsphasen erweitert werden. Die Entdeckung der de novo Synthese von Peroxisomen in Zellen, die keinerlei Peroxisomen oder peroxisomale Reststrukturen ( ghosts oder remnants ) mehr aufwiesen (Matsuzono et al. 1999; South und Gould 1999; Sacksteder et al. 2000), schien dieser Theorie zu widersprechen. In einer erweiterten Modellvorstellung geht man davon aus, dass sich die Peroxisomen wie beschrieben teilen können, jedoch eine de novo Synthese ausgehend vom ER möglich ist. Die Erweiterung der peroxisomalen Membran während der Wachstumsphasen kann ebenfalls durch ER-basierte Vesikel erklärt werden. Ein modifiziertes Modell zur peroxisomalen Biogenese ist in Abbildung 5 gezeigt. In Yarrowia lipolytica konnten peroxisomale Vorstufen isoliert werden, die fusionieren und so mature Peroxisomen bilden. Diese Vorstufen entstammen dem ER und sind bereits in der Lage bestimmte Peroxine zu importieren (Titorenko et al. 2000; Titorenko und Rachubinski 2001a; Titorenko und Rachubinski 2001b). Das growth and division Modell gelangte wieder in den Focus der Wissenschaftler, als Proteine identifiziert wurden, die für die Teilung der 15

27 1. Einleitung Peroxisomen verantwortlich sind. So konnten die Peroxine PEX11, PEX25 und PEX27 für die Elongation der Peroxisomen verantwortlich gemacht werden, während die Proteine VPS1, DNM1/FIS1 und RHO1 für die Teilung der Peroxisomen verantwortlich sind (Thoms und Erdmann 2005; Yan et al. 2005; Kuravi et al. 2006). Abb. 5: Modelle zur Biogenese von Peroxisomen (modifiziert nach Schäfer 2000). (A) Gezeigt ist das growth and division Modell von Lazarow und Fujiki, wonach neue Peroxisomen durch Teilung bereits existierender Peroxisomen, P, bei Erreichen einer kritischen Größe entstehen (Lazarow und Fujiki 1985). (B) Nach den neuesten Erkenntnissen reichert sich in S. cerevisiae PEX3 zunächst im endoplasmatischen Retikulum an (Hoepfner et al. 2005; Tam et al. 2005). Die Strukturen werden dann PEX19-abhängig abgeschnürt und entwickeln sich anschließend durch den Import peroxisomaler Membran- und Matrixproteine zu reifen Peroxisomen. (C) Nach dem Modell zur Vesikelfusion und Reifung von Peroxisomen (Titorenko et al. 2000; Titorenko und Rachubinski 2001b; Titorenko und Rachubinski 2001a) entstehen in Y. lipolytica vesikuläre Vorstufen (P1 und P2) durch Abschnürung vom ER, die dann anschließend zu P3 fusionieren. Durch den Import von Matrixproteinen entstehen nachfolgend P4, P5 und reife Peroxisomen (P6). (D) Für das humane System wurde von South und Gould (South und Gould 1999) ein Modell vorgeschlagen, bei dem vesikuläre Vorstufen (vv), die nicht dem ER entstammen, durch die Insertion des Membranproteins PEX16 zu präperoxisomalen Strukturen werden. Durch die nachfolgende Insertion weiterer früher peroxisomaler Membranproteine (PMPs) könnten diese Strukturen in importkompetente, frühe peroxisomale Strukturen transformiert werden. Dieses Modell wurde kürzlich erweitert, da gezeigt werden konnte, dass PEX16 in Peroxisomen und dem ER lokalisiert ist, allerdings nicht im Cytosol (Kim et al. 2006). Eine VPS1/DNM1-Doppeldeletion weist in S. cerevisiae nur noch ein einzelnes vergrößertes Peroxisom auf (Kuravi et al. 2006). Ob beide Modelle zutreffen, oder diese Modelle abhängig vom untersuchten Organismus sind, müssen weitergehende Analysen klären. Trotz aller Unterschiede haben diese Modellvorstellungen doch auch Gemeinsamkeiten. So wurden für alle Modelle die Peroxine PEX3, PEX16 und PEX19 für die Entstehung von Peroxisomen und den Import peroxisomaler Membranproteine (PMP) identifiziert (South und Gould 1999; Hettema et al. 2000). 16

28 1. Einleitung Bei PEX3 handelt es sich um ein integrales Membranprotein, wobei Topologie und Anzahl der Transmembrandomänen abhängig vom Organismus variieren (Soukupova et al. 1999; Ghaedi et al. 2000; Haan et al. 2002; Hunt und Trelease 2004). Wie PEX3 in die peroxisomale Membran gelangt ist unklar. Es konnte aber gezeigt werden, dass dieser Import PEX19-unabhängig vollzogen wird. Notwendig für die peroxisomale Lokalisierung ist ein N- terminales membrane peroxisomal targeting signal (mpts), das die Transmembrandomäne enthält (Baerends et al. 1996; Wiemer et al. 1996; Kammerer et al. 1998; Ghaedi et al. 2000). PEX3 spielt seinerseits eine entscheidende Rolle bei der Bindung von PEX19 an die peroxisomale Membran. Die dafür verantwortliche Domäne befindet sich im zytosolischen C- Terminus von PEX3 (Muntau et al. 2003). PEX3 könnte Membranstrukturen rekrutieren und somit das erste Protein in der Entstehung von Peroxisomen darstellen (Hoepfner et al. 2005). Das Peroxin PEX16 wurde bisher in Säugern, Arabidopsis thaliana, N. crassa und Y. lipolytica identifiziert (Eitzen et al. 1997; Honsho et al. 1998; Lin et al. 1999; Sichting et al. 2003). Anders als bei PEX3 scheint seine Funktion in den einzelnen Organismen signifikant voneinander abzuweichen. In Y. lipolytica zeigt PEX16 eine hauptsächlich peroxisomale Lokalisation, wobei ein kleiner Teil im ER gefunden wird (Eitzen et al. 1997; Titorenko und Rachubinski 1998). Es ist in Y. lipolytica ein peripheres Membranprotein und soll die Teilung unreifer peroxisomaler Vorläufer verhindern, um die Ausbildung maturer Peroxisomen zu ermöglichen (Guo et al. 2003). In A. thaliana scheint die Funktion von PEX16 zu Y. lipolytica konserviert zu sein (Lin et al. 1999; Lin et al. 2004; Karnik und Trelease 2005), sowohl was die Verteilung von PEX16 innerhalb der Zelle, als auch die Funktion in der Biogenese der Peroxisomen betrifft. Für menschliche Zellen zeigen sich signifikante Unterschiede in Lokalisation und Funktion von PEX16. In humanen Peroxisomen ist PEX16 ein integrales Membranprotein und in die frühen Schritte der Peroxisomenbiogenese involviert (Honsho et al. 1998). An welchen Schritten genau PEX16 beteiligt ist und welche exakten Funktionen es bei der Biogenese in humanen Zellen erfüllt ist bisher nicht eindeutig geklärt worden (Honsho et al. 2002; Brocard et al. 2005; Kim et al. 2006). Von den drei an der Entstehung von Peroxisomen beteiligten Proteinen ist PEX19 bisher am intensivsten untersucht worden. Es weist eine duale Verteilung innerhalb der Zellen auf und befindet sich zum überwiegenden Teil im Zytosol, während ein kleiner Teil mit Peroxisomen assoziiert vorliegt (Götte et al. 1998; Matsuzono et al. 1999; Sacksteder et al. 2000). Wie bereits erwähnt, wird PEX19 über den C-Terminus von PEX3 an der peroxisomalen Membran verankert. Neben der Bindung an PEX3 konnte auch eine breite Bindungsspezifität für peroxisomale Membranproteine (PMPs) gezeigt werden (Götte et al. 1998; Sacksteder et al. 2000; Fransen et al. 2001; Halbach et al. 2006). Eine Konsensussequenz für die Bindung 17

29 1. Einleitung von PEX19 an PMPs konnte über in vitro Bindungstudien soweit ermittelt werden, dass über bioinformatische Studien nun Vorhersagen für die Bindung von PEX19 an peroxisomale Membranproteine möglich sind (Rottensteiner et al. 2004). Die Funktion einer C-terminalen Farnesylierung bleibt bislang umstritten (Matsuzono et al. 2006; Vastiau et al. 2006). Es konnte nachgewiesen werden, dass PMPs im Zytosol durch die Bindung an PEX19 stabilisiert werden und ihre Halbwertszeit somit erhöht wird. Daraus ergab sich eine Chaperonfunktion für PEX19. Außerdem kann PEX19 aber über die Bindung an PEX3 PMPs an die peroxisomale Membran bringen und somit die Funktion eines zyklischen PMP-Rezeptors erfüllen (Hettema et al. 2000; Shibata et al. 2004). Weiterhin konnte auch gezeigt werden, dass PEX19 in die frühe Phase der Peroxisomenbiogenese involviert ist, da PEX3 ohne PEX19 das ER nicht verlassen kann (Hoepfner et al. 2005; Tam et al. 2005). Letztendlich kann PEX19 auch mit PMPs an der peroxisomalen Membran interagieren und so zur Assemblierung oder Stabilisierung von Membranproteinkomplexen beitragen (Snyder et al. 2000). Während die Entstehung von peroxisomalen Membranen und der Import von PMPs in diese noch teilweise unverstanden ist, ist der Import peroxisomaler Matrixproteine schon weitaus besser verstanden und wird im nächsten Kapitel näher beschrieben Matrixproteinimport Alle peroxisomalen Proteine werden an freien Ribosomen im Zytosol synthetisiert und müssen über einen spezialisierten Transportweg posttranslational in Peroxisomen importiert werden (Lazarow et al. 1982; Rachubinski et al. 1984). Im Unterschied zum Proteinimport anderer Organellen, wie z. B. Mitochondrien, können in Peroxisomen auch gefaltete und oligomere Proteine importiert werden (McNew und Goodman 1994; Walton et al. 1995). Der Import von Matrixproteinen kann in vier Schritte unterteilt werden: 1) Bindung der gefalteten Matrixproteine ( Cargo ) an lösliche Rezeptoren im Zytosol und Transport zur peroxisomalen Membran 2) Bindung des Rezeptor-Cargo-Komplexes an die Membran 3) Translokation über die Membran 4) Rezeptorfreisetzung ins Zytosol Um peroxisomale Matrixproteine für den Transport in Peroxisomen zu markieren, konnten bisher zwei verschiedene Signalsequenzen identifiziert werden. Die erste dieser Sequenzen, PTS1 ( peroxisomal targeting signal ), ist am extremen C-Terminus lokalisiert und besteht aus einem konservierten Tripeptid, das aus den letzten drei Aminosäuren und einer stromaufwärts gelegenen, weniger konservierten Region, gebildet wird (Lametschwandtner et 18

30 1. Einleitung al. 1998). Die Konsensussequenz für das C-terminale Tripeptid musste durch die Entdeckung immer neuer funktionaler PTS1-Sequenzen schrittweise erweitert werden und umfasst heute den Konsensus (S/A/C)(K/H/R)(L/M). Anzumerken ist, dass nicht alle Kombinationsmöglichkeiten den peroxisomalen Import ermöglichen und auch ansonsten funktionale Sequenzen nicht automatisch auf ein peroxisomales Protein schließen lassen. Wichtig für die PTS1-Sequenz ist natürlich die freie Zugänglichkeit für den Rezeptor (Subramani et al. 2000; Reumann 2004). Die Konsensussequenz ist speziesübergreifend konserviert, obwohl manche Kombinationsmöglichkeiten abhängig vom Organismus bevorzugt behandelt werden (Gould et al. 1990; Elgersma et al. 1996). Die weitaus meisten peroxisomalen Matrixproteine entsprechen dem PTS1-Typus. Mit der PTS2-Sequenz konnte eine weitere Möglichkeit identifiziert werden, mit der Matrixproteine zum Peroxisom geleitet werden (Swinkels et al. 1991). Diese Sequenz wird aus einem N-terminal lokalisierten Nonapeptid gebildet, für das die Konsensussequenz (R/K)(L/I/V)X 5 (H/Q)(L/A) ermittelt wurde (de Hoop und Ab 1992; Reumann 2004). Es wurden aber auch einige wenige peroxisomale Proteine identifiziert, die keine der bekannten PTS-Sequenzen tragen, aber trotzdem in Peroxisomen importiert werden (Small et al. 1988; Klein et al. 2002; Schäfer et al. 2004). Für diese Proteine stehen zwei mögliche Importwege zur Verfügung. Zum einen konnte für die Proteine FOX1 und CAT2 aus S. cerevisiae eine separate Bindestelle in einem der beiden Importrezeptoren identifiziert werden (Small et al. 1988; Schäfer et al. 2004). Die korrespondierende Sequenz in N. crassa FOX1 oder CAT2 konnte bisher nicht identifiziert werden. Spekulationen über eine dritte PTS-Sequenz können somit weder widerlegt noch bestätigt werden. Zum anderen wurde für die S. cerevisiae Proteine ECI1 und DCI1 gezeigt, dass beide als Komplex in Peroxisomen importiert werden können (Yang et al. 2001). Für diesen, als Huckepack bezeichneten Transportmechanismus, reicht es aus, wenn nur eines der Proteine ein PTS trägt. Ob dieser Mechanismus aber unter physiologischen Bedingungen auftritt, ist fraglich. Als lösliche Importrezeptoren konnten PEX5 für PTS1-Proteine (McCollum et al. 1993) und PEX7 für PTS2-Proteine identifiziert werden (Marzioch et al. 1994; Zhang und Lazarow 1996). Nach der Erkennung des PTS-Signals durch die entsprechenden Rezeptoren und die Rezeptor-Cargo-Bindung, gelangt dieser Komplex an die peroxisomale Membran. Die daraus zwingend resultierende duale Verteilung der Rezeptoren in der Zelle konnte auch experimentell bestätigt werden (Marzioch et al. 1994; Dodt et al. 1995; Terlecky et al. 1995; van der Klei et al. 1995). 19

31 1. Einleitung Während PEX5 seine Aufgabe als Rezeptor alleine erfüllt, benötigt PEX7 abhängig vom Organismus verschiedene Hilfsproteine. In S. cerevisiae erfüllen diese Funktion PEX18 und PEX21 (Purdue et al. 1998; Stein et al. 2002), in N. crassa und anderen Hefe wird diese Aufgabe von PEX20 erfüllt (Titorenko et al. 1998; Sichting et al. 2003; Otzen et al. 2005; Leon et al. 2006) und in Homo sapiens existiert eine Spleissisoform von PEX5 (PEX5L), die als Hilfsprotein dient (Braverman et al. 1998). Der Rezeptor-Cargo-Komplex bindet an der peroxisomalen Membran an die Proteine des Docking -Komplexes. Dieser besteht aus den Peroxinen PEX13 und PEX14 und in Hefen auch noch aus PEX17 (Snyder et al. 1999; Azevedo und Schliebs 2006; Girzalsky et al. 2006). Hauptpartner für die Interaktion mit dem Rezeptor PEX5 scheint dabei PEX14 zu sein. Die genaue Membrantopologie von PEX14 ist bis heute nicht eindeutig geklärt. Möglich ist zum einen PEX14 als integrales Membranprotein zu sehen, aber auch eine Ansiedlung von PEX14 als peripheres Membranprotein an der zytosolischen Seite der peroxisomalen Membran muss in Betracht gezogen werden (Azevedo und Schliebs 2006). In jedem Fall ist der C-Terminus in das Zytosol orientiert. Für PEX14 wird zudem in Betracht gezogen, dass es die für die Translokation des cargobeladenen PEX5 benötigte Pore in der Membran bildet (Azevedo und Schliebs 2006). Diese Fähigkeit wird nach dem Transient-Pore Modell, das in Abbildung 6 dargestellt ist, aber auch PEX5 zugestanden (Erdmann und Schliebs 2005). Es konnte gezeigt werden, dass PEX5 innerhalb eines Rezeptor-Cargo-Komplexes eine höhere Affinität zu PEX14 aufweist als PEX5 alleine (Urquhart et al. 2000). Daraus lässt sich die Funktion von PEX14 als Bindungspartner für beladenes PEX5 an der peroxisomalen Membran ableiten. Wie auch immer die Translokation von beladenem PEX5 über die Membran abläuft, in jedem Fall erfolgt danach die Freisetzung des Cargoproteins in die peroxisomale Matrix. Ob dabei PEX8 an der Innenseite der Membran eine Rolle spielt, ist Gegenstand kontroverser Diskussionen. PEX8 enthält sowohl ein PTS1 als auch ein PTS2, wird aber unabhängig davon in Peroxisomen importiert (Rehling et al. 2000). Mit diesen PTS- Sequenzen könnte es möglicherweise den Platz des Cargoproteins an der Bindestelle von PEX5 einnehmen (Smith und Rachubinski 2001). Weiterhin wurde die Organisation von Docking-Komplex und Ring-Finger-Komplex PEX8 zugeschrieben (Agne et al. 2003). Die drei Proteine des Ring-Finger-Komplexes PEX2, PEX10 und PEX12 besitzen ein Zinkbindendes RING -Motiv ( really interesting new gene ) (Freemont 1993) und werden in die späte Phase des peroxisomalen Matrixproteinimports eingeordnet (Chang et al. 1999; Collins et al. 2000). Möglicherweise spielen diese Proteine während des Exports von PEX5 zurück ins Zytosol eine Rolle. Ähnlich Proteinen, die über das ERAD-System ( endoplasmic 20

32 1. Einleitung reticulum associated degradation ) ins Zytosol transportiert werden, wird auch PEX5 monobzw. polyubiquitiniert (Platta et al. 2004; Kiel et al. 2005a; Kragt et al. 2005). Abb. 6: Das transient pore Modell (nach Erdmann und Schliebs 2005). Der Importrezeptor PEX5 erkennt und bindet die PTS1-Proteine im Zytosol und transportiert sie an die peroxisomale Membran. Dort erfolgt die Insertion in die Membran, wobei PEX14 als Anbindungspunkt genutzt werden könnte. PEX13 und/oder PEX14, letzteres in Assoziation mit PEX17, sind anschließend verantwortlich für die Assemblierung, Stabilität und Regulation der Translokationspore. Die Freisetzung des Cargoproteins wird über das intraperoxisomale PEX8 vermittelt. Die Deassemblierung der Translokationspore sowie die Freisetzung des Rezeptors erfolgt anschließend über eine Kette von Proteinen, die mit der ATP-getriebenen, PEX1- und PEX6-abhängigen Dislokation von PEX5 ins Zytosol endet. Die RING-Fingerperoxine PEX10, PEX12 und PEX2 sowie PEX4 und PEX22 könnten in der Ubiquitinierung von PEX5 eine Rolle spielen. Mono- und Diubiquitinierung des Rezeptors sind dabei reversible Schritte, die für ein effizientes Recycling von PEX5 benötigt werden, während eine Polyubiquitinierung für die Degradation durch das 26S-Proteasom verantwortlich wäre. Die Polyubiquitinierung markiert PEX5 vermutlich für den Abbau durch das 26S Proteasom und die Monoubiquitinierung führt zu einem Recycling von PEX5 ins Zytosol. Im Vergleich mit dem ERAD-System würden dann die RING-Finger-Peroxine die Rolle der E3- Adapterproteine erfüllen (Eckert und Erdmann 2003), während PEX4 das E2-Ubiquitinkonjugierende Enzym darstellt. PEX4 ist über PEX22 mit der Außenseite der peroxisomalen Membran assoziiert (Koller et al. 1999). Die Freisetzung von PEX5 ist ein ATP-abhängiger Prozess und wird durch die AAA-ATPasen PEX1 und PEX6 erreicht, die über PEX15 (S. cerevisiae) oder PEX26 (Säuger) in der Membran verankert werden (Birschmann et al. 2003; Matsumoto et al. 2003). Die Klasse der AAA-ATPasen kann unter ATP-Verbrauch Konfor-mationsänderungen durchführen und zieht so beim ERAD-System Proteine durch die Translokationspore (Kostova und Wolf 2003). Ein ähnlicher Mechanismus beim Recycling von PEX5 wäre denkbar. Im Falle des PTS2-Imports werden die Hilfsproteine PEX18 und PEX21 als Porenbildner diskutiert. Für PEX18 ergeben sich gewisse Parallelen zu PEX5, da auch für PEX18 21

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