Präparation von Pollen und Sporen für das Rasterelektronenmikroskop und Lichtmikroskop unter Verwendung von Rhodaniden

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1 Grana ISSN: (Print) (Online) Journal homepage: Präparation von Pollen und Sporen für das Rasterelektronenmikroskop und Lichtmikroskop unter Verwendung von Rhodaniden Siegfried Tatzreiter To cite this article: Siegfried Tatzreiter (1985) Präparation von Pollen und Sporen für das Rasterelektronenmikroskop und Lichtmikroskop unter Verwendung von Rhodaniden, Grana, 24:1, 33-43, DOI: / To link to this article: Published online: 01 Sep Submit your article to this journal Article views: 104 View related articles Citing articles: 8 View citing articles Full Terms & Conditions of access and use can be found at Download by: [ ] Date: 07 January 2016, At: 02:53

2 Gram 24: 3343, 1985 Praparation von Pollen und Sporen fur das Rasterelektronenmikroskop und Lichtmikroskop unter Vetwendung von Rhodaniden SIEGFRIED TATZREITER Downloaded by [ ] at 02:53 07 January 2016 Tatzreiter, S Priparation von Pollen und Sporen fur das Rasterelektronenmikroskop und Lichtmikroskop unter Verwendung von Rhodaniden. (Preparation of pollen and spores for the scanning electron and light microscopy by using rhodanides). - Grana 2k33-43, Uppsala 8 May ISSN A new technique which allows to prepare pollen and spores of high quality and cleanness mainly used for scanning electron microscopy is outlined. -The basic idea HBS to shorten the preparation time, to avoid the conventional acetolysis method and also critical point drying. It is also possible to use the-preparations for light microscopy. Durch Verwendung von Rhodaniden, Chloriden und Sulfaten in bestimmten Mischungsverhlltnissen, lasst sich der grosste Teil der Pollen und Sporen rein und stabil fur das SEM und LM gewinnen. Critical point - Trocknung und die konventionelle Azetolyse konnen damit vermieden und die Praparationsdauer. insbesonders fur das SEM, erheblich verkiirzt werden. Siegfried Tatzreiter, Institiit Jir Botonib der Universitiit Innsbriicb, Sterriwarrestrasse 15, Ad020 Innsbrirck, Austria. Zielsetzung der vorliegenden Methode war die Darstellung rezenter Pollen und Sporen, ohne ihren Zellinhalt, im SEM und LM. Als Grundbedingungen galten grodtrnogliche Reinheit und Stabilitat der Objekte, sowie eine einfache und schnelle Aufbereitung. Ebenso mu13 Schrumpfen, Quellen und Artefaktbildung vermieden werden. MATERIAL UND METHODEN Verwendung fand frisch gesammeltes, sowie Herbarmaterial von Kryptogamen und Phanerogamen. Insgesamt wurden 211 Arten aus 91 Familien getestet. Die hohere Pollenproduktion und grobere Reinheit des Materials von Windbliitlern gegeniiber insektenbliitigen Pnanzen wurde in der Auswhl beachtet. Als Begleit- und Testpollen, aufgrund ihrer Form oder beobachteten Instabilitat, wurden haufig Pinirs nigra, Pinirs sylvcstris, hipatiens balsamina, Carex sp. und Scirprrs sylvaticirs verwendet. Die SEM-Aufnahmen entstanden auf einem Leitz-AMR lo00 Rasterelektronenmikroskop. Die Dicke der Sputterung betrug Angstram und erfolgte mit einer Mischung aus Gold und Palladium irn Verhaltnis 80: 20. (Manuscript received 4 April revised version accepted 14 Jitly 1983) GERATE UND CHEMIKALIEN Geriire Glaseprouvetten. spitz, I5 ml Glasstabe, spitz ein Wasserbad Keramiksiebe mit 0.5 rnrn Porendurchmesser Fig. I (A) Selaginella selaginoides (L.) Link (Sela- ginellaceae). (B) Cryptorticria japonica (L. fil.) D. Don (Taxodiaceae). (C) Pinits syluestris L. (Pinaceae) -t Arfeniisia uirlgaris L. (Asteraceac). (D) Lark decidira Miller (Pinaceae). (E) Ahma plantogo-oqrratica L. (Alismalaceae). (F) Jirniperirs coniniunis L. (Cupressaceae). (G) Secale cereale L. (Poaceae). (H) Scherrclizeria palirstris L. (Scheuchzeriaceae). Fig. 2. (A) Listera owtn (L.) R. Br. (Orchidaceae) + Codiaeirtti ivlricgatirni Blume (Euphorbiaceae). (B) Cnrex sp. (Cyperaceae) + Myrica cerifera L. (Myricaceae). (C) Corylits awllana L. (Corylaceae). (D) Dicliorisnndra reginae Lind. et Rodig. (Cornmelinaceae). (E) Salk aciilifolia Willd. (Saticaceae) (F) Hurnirli~s lirpulus L. (Cannabaceae). (G) Silene alba (Miller) E. H. L. Krause (Caryophyllaceae). (H) Clietiopodirtm albrrni L. (Chenopodiaceae). 3-8S8361 Grana 24

3 Fig. 1.

4 Priipnratioti uoti Polleti litid Sporeti fi ir SEA1 ritid LA1 35

5 36 S. Tntzreiler Fig. 3.

6 Praparatioti volt Pollett irtid Sporeti fiir SEhf iirid LM 37 Downloaded by [ ] at 02:53 07 January 2016 Keramikschalen eine Glaspipette Zentrifuge 3 Kippipetten (= Kippautomnten) zu 2x 1 ml, 1 x5 ml mehrere Spritzflaschen. Clwniikalieti Chemikalien wurden in den hier angefiihrten Konzentrationen verwendet: HCI conc. 35% H2SOJ conc. 95,1-98,6% C3H603 conc. (Acidum lacticum) ca. 90% Athanol AlC13 pnct. wasserfrei, Gehalt ca. 97% Aluminiumphosphat basisch, Fa. Merck, keine Angaben, (deshalb 4AIP04~2AI(Ot1)3~9H20) KSCN (Kaliumthiocyanat, Kaliumrhodanid), Gehall 98.5% NaSCN (Natriumthiocyanat, Natriumrhodanid), Gehalt 98,s % K2Cr207 (Kaliumdichromat), Gehalt 99.5 % MgC12.6H20, Gehalt 98% MgS , Gehalt 99.5% Herstellirng der Losirngeti Ldsung A.-In 84,O ml einer 5% I1CI werden gelost: 10 g MgCI2.6H20, Gehalt 98% 8 g MgS04.7H20, Gehalt 99,5% 12 g AlC13 pnct. wasserfrei, Gegalt ca. 97% 1 g Aluminiumphosphat basisch, Fa. Merck. Die Gesamtmenge der LBsung betragt cn. 100 ml. und wird in den 5 ml-kippautomat gefullt. LBsung 8-60 g KSCN 98,5% oder 50 g NaSCN 98,5% werden im MeBylinder mit soviel Aqua dest. versetzt dab sich 100 ml Gesamtlosung ergibt. Diese Rhodanidlosung wird in einen I ml-kippautomat gefiillt. Beide Losungen sollen vor Gebrauch aufgeschiittelt werden. Ein Kippautomat zu I ml ist fur H2SOJ conc. vorgesehen. VORGANGSWEISE Maximal 0,5 g Trockengewicht an pollenhaltigem Material wird im Proberohrchen (15 ml Fassungsvermogen) mit 5 ml der Losung A und 1 ml der Losung B versetzt. Hierbei linden die Kippautomaten Verwendung. Dieser Vorgang sol1 unter dem Luftabzug erfolgen, da sich Rhodanwasserstoff bil- Fig. 3A-H. (A) Berberis viilgaris L. (Berberidaceae) + Morus olba L. (Moraceae). (B) Nyntphaea olba L. (Nymphaeaceae). (C) Ustrya carpinifoh Scop. (Corylaceae). (D) Hepatica nobilis Miller (Ranunculaceae). (E) Sarifraga aizoides L. (Saxifragaceae). (F) Brassica napus L. (Bmssicaceae). (G) Platanus hpbrida Brot. (Platanaceae). ( 1) Nepenrhes sp. (Nepenthaceae). det. Die Probe wird im kochenden Wasserbad unter hauligem Umriihren mit dem Glasstab ca. 20 Minuten lang erhitzt. Ein Iangeres Verbleiben der Eprouvette im Wasserbad, bringt keinen Nachteil. Sodann wird der Eprouvetteninhalt gesiebt (Keramiksiebe) und zentrifugiert. Mit einer 5%igen MgS04-Losung aus einer Spritzflasche wird der Riickstand mittels Glasstabes oder Schiittelgerats vermischt und zentnfugiert. Dasselbe erfolgt 1 ma1 mit Athanol. Die Eprouvette kann jeweils bis knapp unter den Rand aufgefiillt werden. Eine LM-Kontrolle zeigt bereits die hohe Konzentration an Pollen oder Sporen und deren Formbestandigkcit. Auf den im Proberohrchen verbleibenden Riickstand werden 3-5 Tropfen Milchsaure (Acidurn lact.) conc. ca. 90% aufgetropft. Dazu kommen 1 bis 2 ml HzSOJ conc. Nach Einstellen der Eprouvette in das kochende Wasserbad, erfolgt hauliges Umriihren des nun schaumenden Materials, das sich mit dem Milchsaure-Schwefelsauregemisch Fig. 4A-II. (A) Tetragonolobus tnarititniis (L.) Roth (Fabaceae). (B) Filipendiila rtlniaria (L.) Maxim. (Rosaceae) + Digifoh lurea L. (Scrophulariaceae). (C) Sanguisorba minor Scop. (Rosaceae). (D) Uxnlis ncetosello L. (Oxalidaceae) + AInris glufinosa (L.) Gaertner (Betulaceae). (E) Biixris sempervirens L. (Buxaceae) + Lamirim galeobdo- Ion (L.) Nathh. (Lamiaceae). (F) Merciirialis perennis L. (Euphorbiaceae). (G) Codinertrn uariegatrtm Blume (Euphorbiaceae). ( 1) IIex aqriifoliiim L. (Aquifoliaceae) + Artneria sp. (Plumbaginaceae). Fig. 5A-H. (A) Irnpnfiens glandulifera Royle (Balsaminaceae). (B) Acer plaranoides L. (Aceraceae). (C) Cisfits clusii Dunal (Cistaceae) + Spmphytrori ofjicinale L. (Bo-: raginaceae). (D) Aescrilirs pnrviyora Walter (Ilippocastanaceae). (E) Epiphyllum truncarum Haw. (Cactaceae) + Begonia socorrana Hooker fil. (Begoniaceae). (F) Viola odorata L. (Violaceae). (G) Pinielea ferruginea Labill. (Thymelaeaceae). (H) Carica papqn L. (Caricaceae). Fig. 6A-II. (A) Chaeropli~llrini tetnuliitn L. (Apiaceae). (B) IIippophae rhaninoides L. (Elaeagnaceae). (C) Ifedera helix L. (Araliaceae). (D) Uenorhera biennis L. (Onagraceae). (E) Lpsirnachia vulgaris L. (Primulaceae). (F) Syringa etnodi Wall. (Oleaceae). (G) Gentiana asclepindea L. (Gentianaceae). (H) Menyanthes trifoliata L. (Menyanthaceae). Fig. 7A-H. (A) Vincetoxicuni hirundinaria Medicus (Asclepiadaceae). (B) Cerinthe glabrn Miller (Boraginaceae). (C) Laniiurn galeobdolon (L.) Nathh. (Lamiaceae). (D) Salvia glutinosa L. (Lamiaceae). (E) Arropo bella-donno L. (Solanaceae). (F) Darura stratnoniuni L. (Solanaeeae) + Arreniisio viilgnris L. (Asteraceae). (G) Verbascuni nigrunt L. (Scrophulariaceae). ( 1) Plonrago media L. (Plantaginaceae) + Trifoliuni prafense L. (Fabaceae). Gram 24

7 38 S. Tntzrcitcr Fig. 4.

8 Priiparatioti uoti Polleti rrtid Sporeti fiir SEhI iirid Lhi 39 Fig

9 40 S. Tatzreiter Fig

10 Priiparotioti von Pollen irnd Sporen jiir SEM iind Llci 41 Fig. 7.

11 42 S. Tnlzreiter Fig

12 Praparation won Pollen titid Sporen fiir SEA1 iitid Lhf 43 Downloaded by [ ] at 02:53 07 January 2016 dunkelbraun bis schwarz farbt. Die Dauer der Fossilisation betragt erfahrungsgemar 15 Minuten, kann jedoch unbesorgt linger erfolgen. Zur nachfolgenden Keinigung des Materials mur die Eprouvette einige Sekunden lang in einem kalten Wasserbad abkuhlen; sodann spritzt man langsam Athanol auf, wobei Envarmung eintritt. Das Auswaschen, Durchriihren oder Schutteln und Zentrifugieren in Athanol geschieht 3 bis 4 mal. Nach dem letzten Auswaschvorgang mit Athano1 wird eine 3%ige Kaliumdichromatlosung (K2Cr207) aus einer Spritzflasche aufgespritzt und einige Minuten im kochenden Wasserbad erhitzt. Es hat sich gezeigt, dar eine Behandlung mit Kaliumdichromat zwar weder die Reinheit noch die Stabilitat der Pollen erhoht, jedoch den weiteren Auswaschvorgang mit Aqua dest. erheblich verkurzt und auch die Auflosung am SEM verbessert. Das Auswaschen mit Aqua dest. erfolgt 3 4 mal, wobei ein kurzes Einstellen in das heire Wasserbad den Vorgang beschleunigt. Je nach Pollenart hat sich das Konzentrat gelblich bis braun gefarbt. Nach griindlichem Zentrifugieren und Ableeren des Aqua dest. wird das Pollenkonzentrat mit dem Glasstab direkt auf den SEM-Objekttrager aufgebracht. Die Trocknung erfolgt im Warmeschrank bei 80-!N C, worauf sofort besputtert werden kann. Sporomorphen, die am LM venvendet werden sollen, werden mit Glycerin versetzt und im Trockenschrank bei 95 C 3 Stunden lang entwassert. Die Dauer des bei und iiblichen AufschluRes von gleichzeitig 12 Proben, kann bis zum Sputtern oder Entwassern fur das LM, mit 33 bis 4 Stunden beziffert werden. BE URTE I L U N G 211 Arten aus 91 Familien wurden zum Teil mehrfach getestet. Grundsatzlich kann gesagt werden, dar frisch gesammeltes Material den Prozentsatz der stabilen Pollen erhoht. Dies konnte vor allem bei Nymphaeaceae beobachtet werden. Bei den Diaden der Scheuchzeriaceae kollabiert haulig nur eine Halfte. Trotzdem ist auch hier die Anzahl der stabilen Pollen durchaus ausreichend. Die ubrigen Sporomorphen waren bis zu 100% stabil bei ausgezeichneter Reinheit. Juncaceae oder Musaceae, die als sehr zart und instabil bekannt sind, mussen erst eingehender untersucht werden. hfessiitrgeti mi Corybs auellatia 1. Am Lhl gemessen: a) Frisch gesammelter Pollen in trockenem Zustand: durchschnittlich 26,4 Iim. b) Azetolysierter Pollen, in Glyzeringelatine eingeschlossen: 29,7-36,3 pm. c) Nach oben publizierter Methode aufbereiteter und auf einem Objekttrager. getrockneter Pollen: 23,l-26,4 pm. d) Nach oben publizierter Methode aufbereiteter Pollen, in Glyzeringelatine eingeschlossen: ,4 Iim. 2. Am SEhl gemessen anhand der Iim-Balken- Iange: durchschnittlich 25 Iim. Die durchschnittliche GroRe des Pollens von Coryliis auellatia wird in Fagri and Iversen (1975) rnit 25 Iirn im Schnitt angegeben. LITERATUR Fxgri, K. & Iversen, J Textbook of pollen analysis, 3rd ed. by K. Fagri pp. Munksgaard, Copenhagen. Fig. 8A-fI. (A) Rondeletin sp. (Rubiaceae). (B) Snnibucus nigra L. (Caprifoliaceae). (C) Canipanula tracheli~i L. (Campanulaceae). (D) Petasites albirs (L.) Gaertner (Asteraceae). (E) Eagopogon pratensis L. (Cichoriaceae). (F) Eugopogon pratensis L. (Cichoriaceae). (G) Viris uinifera L. (Vitaceae) + Ligrrstnrni uirlgare L. (Oleaceae). (H) Sparganilrm erectrun L. (Sparganiaceae). Grana 24