Anleitung A2.31 Anwendung von DiI an post mortem-material

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1 2.2 Probengewinnung zur mikroskopischen Untersuchung und Präparation 77 2 Anleitung A2.31 Anwendung von DiI an post mortem-material 1. Die Inkubation der Fluoreszenzfarbstoffe in Fixierlösung (4% Paraformaldehyd) kann von 3 Tagen bis zu mehreren Monaten dauern. Dabei sollte das Präparat immer lichtgeschützt in einem gut verschlossenen Gefäß in genügend Fixativ liegen. Die Temperatur kann von 4 C bis 37 C gewählt werden, wobei höhere Temperaturen die Qualität des Gewebes evtl. beeinträchtigen 2. für die Aufarbeitung wird der Gewebeblock in abgekühltem Agar-Agar eingebettet, mit Sekundenkleber auf ein Holzblöckchen geklebt und am Vibratom in Na-PB µm dick geschnitten 3. die Schnitte werden mit einem Pinsel auf unbeschichtete Objektträger aufgetragen und noch nass mit einem wasserlöslichen, nicht fluoreszierenden Einbettmedium (z. B. Mowiol, Gelmount) eingedeckelt und im Kühlschrank lichtgeschützt bis zur weiter Verwendung gelagert 4. für eine Orientierung im Präparat empfiehlt sich jeweils einige Schnitte einer Serie für Nissl-Färbung zu verwenden oder einige Schnitte einer DAPI Färbung zu unterziehen Bemerkung: Um eine möglichst gute Feinstruktur an fixiertem Material zu erhalten, sollte die Zeit zwischen dem Beginn der Fixierung des Materials und der Farbstoffapplikation möglichst gering gehalten werden und bei etwa 2 Tagen liegen. lassen sie sich direkt oder nach Fixierung (Kap. 2.3) weiter verkleinern und für die direkte Beobachtung, für Färbungen und Lokalisationsstudien oder für die weitere Präparation (z. B. für die TEM) vorbereiten. Die Gewinnung von Proben für biochemische Untersuchungen kann die mikroskopische Beobachtung und Kontrolle erfordern. Dazu werden hier ebenfalls einige Techniken (Zellfraktionierung, Lasermikrodissektion) vorgestellt, auch wenn die Mikroskopie dabei zumeist nur eine (wichtige) Nebenrolle spielt Abstrichpräparate Von zugänglichen Epitheloberflächen lässt sich Material abnehmen und auf einem Objektträger abstreichen. Diese einfache, nicht-invasive Untersuchungsmethode hat enorme Bedeutung in der Präventivmedizin erlangt und repräsentiert die Grundlage der Cytodiagnostik. Die meisten Präparate werden wohl in der Gynäkologie vom Vaginalund Zervikalepithel (Epithel der Vagina, der Portio vaginalis cervicis und des Canalis cervicis uteri) angefertigt, doch auch Abstriche anderer Schleimhäute, wie Mundschleimhaut, Tonsillenoberfläche, Conjunctiva usw., sowie von Wundrändern exulzerierter Areale, sind üblich. 2.2 Probengewinnung zur mikroskopischen Untersuchung und Präparation Die meisten biologischen und medizinischen Untersuchungsobjekte sind zu groß und/oder zu dick, um sie direkt zu mikroskopieren. Normalerweise muss man die Zellen oder Gewebeteile, die von Interesse sind, zunächst aus ihrem Umfeld isolieren. Dabei sollen die morphologischen und biochemischen Eigenschaften möglichst erhalten bleiben. Zellen lassen sich direkt durch verschiedene Abstrichund Abtupfverfahren gewinnen oder durch Mazerationsmethoden aus einem Gewebeverband lösen. Aus Suspensionen können sie durch Filtration oder Zentrifugation angereichet werden. Ihre spezifischen Eigenschaften werden genutzt, um sie zu sortieren und in getrennten Fraktionen anzureichern. Organ- oder Gewebeproben werden mit feinen Scheren, speziellen Nadeln, Rasierklingen oder scharfem Skalpell entnommen. Durch verschiedene Schnitttechniken Endozervix Ektozervix endo Abb. 2.21: Vorgehensweise beim Zervikalabstrich endo ekto

2 Präparationsmethoden Die Abnahme des Zellmaterials, zusammen mit aufgelagertem Schleim, Detritus, Bakterien und anderem, erfolgt mit einem Wattetupfer oder einem Holz- oder Plastikspatel oder endoskopisch mit einer Bürste. Ist die Epitheloberfläche schon makroskopisch mit Schleim oder Belägen bedeckt, werden diese erst vorsichtig entfernt, bevor man das Zellmaterial für die eigentliche Untersuchung gewinnt. Dieses Material wird dann auf den Objektträger gebracht, indem man den Wattetupfer abrollt oder den feuchten Spatel abstreift (Abb. 2.21) Es ist entscheidend, die Ausstriche vor der Fixierung nicht eintrocknen zu lassen, um Schrumpfungen und Zerreißungen zu vermeiden. Üblich sind folgende Fixierungen: Sprayfixierung z. B. mit Merckofix (Abstand Sprayflasche zum Präparat: 30 cm) in eine Küvette mit 96 % Ethanol (oder 1:1verdünnt mit Ether) einstellen für mindestens 30 min bis maximal mehrere Tage. Alternative Fixanzien sind 99 % Isopropanol oder 90 % Aceton Durch Zusatz von Eisessig (bis 3 %) kann man bei stark bluthaltigen Abstrichen die Erythrocyten hämolysieren und so den Überblick verbessern. Gefärbt wird nach Papanicolaou (A107) Ausstrichpräparate Ausstriche von Zellsuspensionen Zellsuspensionen werden zur mikroskopischen Untersuchung ausgestrichen. Dazu kann man einfach mit einer Platinöse einen Tropfen der Suspension aufnehmen und auf einem Objektträger durch Hin- und Herbewegen der Öse oder durch kreisende Bewegung verteilen. Punktatflüssigkeiten, Harnsediment oder Sperma kann in dieser Weise aufgebracht werden, die Verteilung der zellulären Elemente ist allerdings oft recht unregelmäßig. Eine gleichmäßige Verteilung der suspendierten Partikel erzielt man dagegen durch den Objektträgerausstrich, wie er als Blutausstrich (Abb. 2.22) beschrieben ist (A2.32). Die gleichmäßige Verteilung ist Voraussetzung für quantitative Auswertungen. Nach dem Lufttrocknen eines Ausstriches folgt meist eine Fixierung in Methanol (z. B. vor einer Giemsa-Färbung, A3.103). Will man mit der May-Grünwald-Lösung (A3.104) zuerst färben, so ist die Fixierung mit Methanol nicht nötig, da die Farbstofflösung selbst Methanol enthält. Der getrocknete Ausstrich kann aber auch in Ethanol oder in gleichen Teilen Ethanol und Ether fixiert werden. In allen Fällen stellt man die trockenen Objektträger für 10 min in eine Küvette mit dem Fixiermittel, zieht sie dann heraus und stellt sie schräg auf einen Streifen Filterpapier, wo sie wieder trocknen. Zur Hitzefixierung von Ausstrichen fasst man den Objektträger mit einer Pinzette und zieht ihn 2 3-mal durch die Flamme eines Bunsenbrenners (Reduktionsflamme). Die Dauer der Hitzeeinwirkung wird bei dieser Vorgehensweise allein durch die Erfahrung bestimmt. Zur Fixierung noch feuchter Ausstriche verwendet man Formoldämpfe oder Osmiumdämpfe (Kap. 2.3). Dazu werden die frisch hergestellten Ausstriche in eine feuchte Kammer gebracht, die das gewählte Fixiermittel enthält. Anleitung A2.32 Blutausstrich Material: unbeschichtete, fettfreie Objektträger Man legt die Objektträger in eine Ether-Ethanolmischung und reibt sie vor Gebrauch mit einem sauberen Leinenlappen ab. Die Ausstrichfläche niemals mit dem Finger berühren! Durchführung (Abb. 2.22): 1. Bluttropfen (oder einen Tropfen der Zellsuspension) auf einen Objektträger A (etwa 1,5 cm von dessen Ende entfernt) geben 2. zweiten Objektträger B schräg auf die Mitte von A setzen 3. Objektträger B an den Tropfen heranziehen, bis er ihn berührt 4. warten, bis sich die Flüssigkeit durch die Kapillarwirkung in der Kante zwischen Objektträger A und B gleichmäßig auseinanderzieht 5. Objektträger B in unverändert schräger Stellung über den Objektträger A schieben, so dass die Flüssigkeit im Winkel zwischen A und B auf dem Objektträger A ausgestrichen wird. Die Bewegung muss gleichmäßig und nicht zu rasch, aber doch zügig erfolgen. Nach dem Ausstreichen nimmt man Objektträger A auf und sorgt durch Hin- und Herbewegen für rasche Lufttrocknung. Folgendes ist zu beachten: Die Dicke des Ausstrichs hängt vom Winkel (in Abb mit a bezeichnet) zwischen den Objektträgern A und B ab. Je kleiner dieser Winkel ist, desto dünner wird der Ausstrich. Ein Winkel von etwa 45 bringt gute Resultate. Lässt man auf dem getrockneten Ausstrich Licht reflektieren, so sollte er grünlich aufleuchten. Erscheint der Ausstrich dagegen rot, so ist er zu dick geraten. Das Volumen des aufgesetzten Bluttropfens soll so bemessen sein, dass die Flüssigkeit noch vor dem Absetzen des vorgeschobenen Objektträgers B aufgebraucht ist. War das Volumen zu groß, bleibt ein dicker, nur langsam antrocknender Rand am Ende des Ausstrichs stehen. War das Volumen zu gering, wird der Ausstrich zu kurz. Fortsetzung

3 2.2 Probengewinnung zur mikroskopischen Untersuchung und Präparation 79 2 Fortsetzung Erfolgt das Vorschieben des Objektträgers B zu hastig oder ruckartig, kann der Flüssigkeitsfilm abreißen. Der Ausstrich wird umso dicker, je langsamer der Vorschub erfolgt. Erfolgt das Vorschieben des Objektträgers B nicht gleichmäßig und zügig, wird der Ausstrich unterschiedlich dick. Der Objektträger B zum Ausziehen des Tropfens sollte möglichst geschliffene Kanten besitzen. Nach dem Aufsetzen des Bluttropfens muss sofort ausgestrichen werden. Bei einem gelungenen Ausstrich bedecken die Blutkörperchen in dünner Schicht und voneinander separiert die Oberfläche. Übereinanderliegen und Verkleben der Blutkörperchen ist meist eine Folge zu großer Bluttropfen. Deformierte Blutkörperchen oder zerquetschte Leukozyten weisen auf falsche Bewegung des ausstreichenden Objektträgers hin. Stechapfelformen der Erythrozyten treten bei langsamem Trocknen des Ausstrichs auf. Dies ist wiederum eine Folge von zu dickem Ausstreichen und/oder zu großem Bluttropfen. Benetzt der Flüssigkeitsfilm den Objektträger nicht gleichmäßig, so waren auf der Oberfläche noch Fettspuren vorhanden. Schubrichtung Abb. 2.22: Blutausstrich Warten a a Schubrichtung Tupf- oder Abklatschpräparate Tupft man die frische Schnittfläche eines unfixierten Organs auf die Oberfläche eines gut gereinigten Objektträgers, so bleibt eine Anzahl isolierter Zellen auf der Glasoberfläche haften. Bei weichen Geweben, wie z. B. Milz, Lymphknoten oder Knochenmark, genügt es, das Material aufzutupfen; im Fall von konsistenteren Geweben streift man mit der Oberfläche unter mildem Druck über den Objektträger. Meist lässt man das Präparat lufttrocknen und färbt mit der Lösung nach May-Grünwald (A3.104). Diese äußerst einfache und schnelle Untersuchungsmethode kann als Ersatz oder zur Ergänzung der Schnellschnittdiagnostik Verwendung finden Isolationspräparate (Zupfpräparate) Kleine Gewebeproben können durch Zerzupfen mit Präpariernadeln in einem Tropfen von 0,75 % Kochsalzlösung so weit zerteilt werden, dass die entstehenden Fragmente, Zellgruppen und Einzelzellen nach Auflegen eines Deckglases mikroskopiert werden können. Der Grad des Zerzupfens hängt von der Struktur des zu untersuchenden Organs ab. Von Organen mit einfach zu isolierenden Elementen, (z. B. Thymus, Lymphknoten, Milz) hat man bereits nach kurzer Zeit ausreichend viele zelluläre Elemente isoliert, wie die Trübung des Flüssigkeitstropfens, in dem man arbeitet, anzeigt. Konsistentere und kohärente Organe dagegen muss man ausdauernd zerzupfen, geordnete Strukturen, wie z. B. Skelettmuskel, zerreißt man nicht planlos, sondern zieht immer senkrecht zur Längsrichtung der Fasern. Nach dem Zerzupfen des Gewebes wird sofort ein Deckglas aufgelegt. Ein Andrücken des Deckglases muss auf jeden Fall vermieden werden, da es sonst zum Quetschen und damit zur Formveränderung empfindlicher Strukturen kommt. Sicherheitshalber bringt man an den Ecken der Deckgläser Wachsfüßchen an. Ist zu wenig Flüssigkeit unter dem Deckglas, lässt man vom Rand her etwas Kochsalzlösung zufließen Organausstriche Zur Herstellung von Organausstrichen streicht man mit der Kante eines Objektträgers über eine frische Schnittfläche des zu untersuchenden Organs und stellt dann aus dem so gewonnenen Medium ein Ausstrichpräparat her, wie es für Blut beschrieben wurde. Die noch feuchten Ausstriche werden beliebig für 10 min fixiert, zum Studium des hämatopoetischen Systems am günstigsten nach Helly oder Maximow (Kap. 2.3) Isolation von Zellen Entnahme von adhärenten Zellen aus Zellkulturen Zellmonolayer werden mit einem Kunststoffspatel vorsichtig von der Unterlage gekratzt. Adhärente Zellen aus Kulturschalen können durch eine kurze (3 5 min) Inkubation (37 C) mit Trypsin-EDTA-

4 Präparationsmethoden Lösung (z. B. 0,05 % Trypsin, 0,02 % EDTA in Ca 2+ - und Mg 2+ -freiem PBS, ph 7,8) abgelöst und isoliert werden Anreicherung von Suspensionszellen Suspensionszellen werden durch sanfte Zentrifugation angereichert. Zur Aufkonzentrierung von Protozoen o. ä. ist schonend zu zentrifugieren (ca U/min). Gut geeignet sind z. B. Cytozentrifugationskammern zur Anreicherung. Der Überstand wird dekantiert. Alternativ kann die Suspension durch einen Polycarbonatfilter entsprechender Maschenweite (5,0 µm, Nucleopore) filtriert werden. Einzellige, aktiv schwimmende Organismen können auch aufkonzentriert werden, indem man ausnutzt, dass sie bestimmte Bedingungen ihrer Umgebung meiden oder bevorzugen. Paramecium (Ciliat) beispielsweise wird angereichert, indem man die Kultur in einen Kolben mit englumigem Flaschenhals gibt (Abb. 2.23). Der Kolben wird bis etwa zur Mitte des Halses gefüllt. Darauf wird ein lockerer Wattebausch gelegt, darüber bis zum Rand frisches Medium gegeben (Abb. 2.23a). Die Zellen schwimmen entlang des Sauerstoffgradienten nach oben und sammeln sich nach einigen Stunden über der Watte; Detritus und Bakterien bleiben in dem Kolben zurück (Abb. 2.23b). Weitere Möglichkeiten der Anreicherung von Einzellern sind in Kapitel 5 beschrieben. Frisches Medium Wattestopfen Zuerst wird die Oberfläche mit gekühlter 0,9 % (w/v) Kochsalzlösung gewaschen. Dazu verwendet man eine Injektionsspritze mit feiner Kanüle. Der relativ scharfe Flüssigkeitsstrahl entfaltet genügend mechanische Kraft, um auch fest anhaftende Schleimsubstanzen grob abzulösen. Anschließend bringt man die Oberflächen in die Isolationsmedien. Hohlorgane werden mit den Medien gefüllt und abgeklemmt (z. B. Darmsegmente). Während die Isolationsmedien einwirken, kann man die Oberflächen von Zeit zu Zeit deformieren, z. B. ein gefülltes Hohlorgan zwischen Daumen und Zeigefinger sanft kneten. Man behandelt min. bei 37 C und spült dann mit 0,9 % gekühlter Kochsalzlösung. Hohlorgane werden mehrmals gefüllt und entleert, Oberflächen werden wie beim Reinigen mit Kochsalzlösung abgespritzt. Die gesammelten Wasch- und Inkubationslösungen mit den darin enthaltenen Zellen werden zentrifugiert und der Bodensatz in einer geeigneten Lösung resuspendiert. Beim Ansetzen des Isolationsmediums geht man von einem Basismedium (Tab. 2.8) aus, in dem dann verschiedene Enzyme gelöst werden können. Isolationsmedium im Basismedium werden gelöst: 0,15% Hyaluronidase (Sigma, Typ II) oder 0,33 % Dispase (Protease aus Bacillus polymyxa, Boehringer) oder 0,33 % Pronase (Sigma) Ein anderes, nur durch Calciumentzug wirksames Medium wurde von Harrison und Webster (1969) angegeben (Tab. 2.9). Die Wirksamkeit aller genannten Medien ist durchaus vergleichbar. Das Ablösen von Zellen kann noch mecha Kulturmedium mit Zellen a b Tabelle 2.8: Basismedium zur Herstellung von Zellsuspensionen nach Towler et al ,0 mm NaCl 18,0 mm KH 2 PO 4, Abb. 2.23: Methode der schonenden Aufkonzentrierung von Paramecien. a) Direkt nach Einfüllen der Kultur. b) Ansammlung der Zellen in frischem Medium nach acht Stunden 50,0 mm Na-Citrat 5,6 mm Na 2 HP0 4 1,5 mm KCl 0,25 % BSA (Rinderserumalbumin) ph 7, Zellsuspensionen von Epithelien Mit Hilfe von Calciumentzug und durch milde Behandlung mit proteolytischen Enzymen lassen sich Epithelien rasch ablösen und bis zu Einzelzellsuspensionen aufbereiten. Besonders einfach gestaltet sich die Prozedur bei Hohlorganen, die mit der zur Isolation verwendeten Lösung gefüllt werden können. Tabelle 2.9: EDTA-Medium nach Harrison und Webster ,0 mm NaCl 8,0 mm KH 2 PO 4 5,6 mm Na 2 HPO 4 1,5 mm KC1 10,0 mm EDTA (Ethylendiamintetraacetat) ph 6,8

5 2.2 Probengewinnung zur mikroskopischen Untersuchung und Präparation 81 2 nisch durch vorsichtiges Schaben der Oberflächen (bei geeignetem Relief) mit einem Gummistempel unterstützt werden. Sind in der erzielten Zellsuspension noch größere Zellverbände, und wünscht man auch diese zu trennen, bringt man sie nochmals in eine der erwähnten Isolierflüssigkeiten. Man saugt die Suspension mit einer Pasteurpipette mehrmals hoch und spritzt sie wieder aus Mazerationsmethoden von Zellverbänden Mazerationsmethoden zielen darauf ab, in ihrer Form fixierte Einzelzellen aus dem Verband zu lösen, um sie morphologisch studieren zu können. Während die isolierten lebenden Zellen drastische Änderungen ihrer äußeren Form zeigen, sobald sie aus dem Epithelverband gelöst sind, ist dies nach Mazeration durch die gleichzeitig erfolgte Fixierung nicht der Fall. Mazerationsmethoden zählen zu den klassischen Untersuchungstechniken der Histologie, wie sie vor der Einführung der Mikrotome angewandt wurden. Unfixierte Epithelfetzen oder kleine Stücke epithelial ausgekleideter Organe (z. B. Trachea, Harnblase) werden bei 37 C in die Mazerationsflüssigkeit eingelegt. Dabei soll die Flüssigkeitsmenge etwa dem Volumen des Gewebestücks entsprechen, höchstens aber das Dreifache betragen. Verwendet man mehr Flüssigkeit, so wirkt die Lösung zu stark fixierend. Nach einer gewissen Zeit (gewöhnlich 2 3 Stunden) können die Epithelzellen durch Schütteln, Klopfen oder Zupfen isoliert werden. Man untersucht in der Mazerationsflüssigkeit, in Wasser oder in Glycerin. Farbstoffe können der Untersuchungsflüssigkeit zugesetzt werden (Eosin, Pikrokarmin, Hämalaun). Das gebräuchlichste Mazerationsmittel für humanes Gewebe ist 30 % Ethanol. Kleine Stücke der epithelbedeckten Gewebe werden in wenig Lösung bis zu 12 Stunden eingelegt. Epithelzellen und Zellverbände können dann einfach durch Schütteln, Abstreifen mit einem Messer oder Beklopfen der Oberfläche gelöst und abgespült werden. Weitere Isolation erzielt man durch Zerzupfen größerer Epithelbezirke, oder man füllt die Zellsuspension in ein Probenröhrchen, verschließt es mit einem Stopfen und schüttelt sehr kräftig. Die Zellsuspension kann durch Zentrifugieren angereichert werden. Die gewünschte Färbung wird durchgeführt, indem man zwischen den einzelnen Arbeitsgängen immer wieder zentrifugiert. Ein anderes Verfahren sieht vor, die konzentrierte erste Zellsuspension auf einem Objektträger auszustreichen und den noch feuchten Ausstrich eine halbe Stunde in Bouinsche Flüssigkeit (Tab. 2.10) zu stellen, um ihn dann wie ein Schnittpräparat zu behandeln (Auswaschen in 50 % Ethanol, Wässern, Färben, Entwässern und Eindecken). Andere Mazerationsflüssigkeiten sind stark verdünntes wässriges Osmiumtetroxid (1 %; Mazerationsdauer 24 h), wässrige Chromsäurelösung (1 % bis 0,1 %; Mazerationsdauer 24 h) oder verdünnte Müllersche Flüssigkeit (1:100) (Tab 2.10). Die stark verdünnten Lösungen lässt man über Wochen einwirken, es ist dann ein Zusatz von Thymol nötig. Am raschesten mazeriert l 2 % wässrige Natriumfluoridlösung. Zur Mazeration von Pflanzengewebe werden die Zellwandbestandteile aufgelöst. Sie erfordert andere Lösungen und Enzyme und eine andere Vorgehensweise. Ein Beispiel dafür ist in Kapitel 5 beschrieben Isolation von Gewebeteilen Gewebe- oder Organproben werden zur direkten mikroskopischen Untersuchung oder zur licht- oder elektronenmikroskopischen Präparation entnommen. Die Probenentnahme von lebenden Patienten erfordert besonders schonende Verfahren, bei denen nur geringe Verletzungen verursacht werden. Häufig muss man sich hier mit wenig Probenmaterial begnügen. Hier wird man eine Biopsie vornehmen. Proben für pathologische oder biologische Untersuchungen werden häufig von vorfixiertem Material (Kap. 2.3) entnommen. Kleine Tiere (Arthropoden, Mollusken, etc.) werden nach Betäubung oder Abtöten direkt in den Fixierungslösungen geöffnet und entsprechend zerteilt (Kap ). Wirbeltiere können nach Betäubung mit Fixierlösung perfundiert werden, um schwer zugängliche Organe optimal zu erhalten. Die anfixierten Präparate werden anschließend mit einem scharfen Skalpell oder Rasiermesser zugetrimmt und weiter fixiert. Anleitung A2.33 Feinnadelpunktion Durchführung (Abb ): 1. Die Punktionsnadel (12er- bis16er-kanüle) wird in den zu untersuchenden Gewebebereich eingeführt (a) 2. durch Zurückziehen des Spritzenstempels erzeugt man Unterdruck (b) 3. die Nadel wird mehrmals rasch vor- und zurück geschoben. Dabei schwenkt man sie leicht fächerförmig (c) 4. durch langsames Vorgleitenlassen des Spritzenstempels wird der Unterdruck ausgeglichen (d) 5. die Punktionsnadel wird herausgezogen (e) 6. die Nadel wird von der Spritze entfernt (f) 7. der Spritzenstempel wird zurück gezogen, um Luft einzusaugen 8. das Zellmaterial in der Kanüle wird auf einen vorher beschrifteten Objektträger gespritzt (g) 9. ausstreichen ohne Druck, nicht zu dick, mit einem zweiten Objektträger (Abb. 2.25). Fixieren des Zellausstrichs innerhalb von Sekunden durch Eintauchen in eine Küvette mit 96 % Ethanol oder durch Sprayfixierung (Kap. 2.1). Fortsetzung

6 Präparationsmethoden Fortsetzung Abb. 2.24: Feinnadelpunktion a b c d e f g Abb. 2.25: Ausstrich des punktierten Materials a b c Biopsie Je nach Gewebetyp und -lage werden zur Entnahme unterschiedliche Biopsienadeln und -stanzen und unterschiedliche Techniken verwendet. Die durch die Punktion von Zysten gewonnene Zystenflüssigkeit wird zur Fixierung in ein mit 96 % Ethanol teilgefülltes Gefäß gespritzt (Verhältnis Punktat : Ethanol ca. 1:1) Native Schnitte Schnitte von unbehandeltem Gewebe benötigt man insbesondere für Lebenduntersuchungen und physiologische Experimente. Sie sind darüber hinaus geeignet, um Enzymaktivitäten oder Antigene zu lokalisieren Freihandschnitte Handschnitte zur Mikroskopie von lebendem Gewebe sind von Pflanzenmaterial normalerweise relativ einfach (Kap. 5), von tierischem oder humanem Material zumeist schwieriger anzufertigen. Historische Hinweise zum Herstellen von Rasiermesserschnitten von Humangewebe sind bei Romeis (1968, 135, 136) nachzulesen. Wichtig für den Erfolg ist die Auswahl geeigneter Rasierklingen. Es sollten nur extrem dünne Qualitätsklingen verwendet werden. Man arbeitet unter der Stereolupe und benützt Kork oder eine mit Dentalwachs oder Silikon ausgegossene Petrischale als Unterlage. Stets sollte ziehend geschnitten werden und ohne mit der Schneide auf das Gewebe zu drücken. Um die Gewebe schneidbar zu machen und um Konsistenzunterschiede in den Geweben auszugleichen, kann man die Objekte tief frieren, man sollte dann aber konsequenterweise die Schnitte auch gleich mit einem Kryostaten (Kap. 2.7) anfertigen Herstellung von Schnitten mit Hilfe des Handmikrotoms Handmikrotome werden fast ausschließlich für die Bearbeitung von pflanzlichem Material eingesetzt. Es lassen sich damit gleichmäßig dicke Schnitte von relativ festen und nicht zu dünnen Gewebeteilen (Spross, Stängel, Wurzel) herstellen. Die Schnitte können direkt mikroskopiert oder für die hochauflösende Mikroskopie (TEM, REM) präpariert werden. Die Technik der Handmikrotomie wird in Kapitel 5 beschrieben.

7 2.2 Probengewinnung zur mikroskopischen Untersuchung und Präparation Herstellung von Schnitten mit Hilfe des Vibratoms Mit dem Vibratom können unfixierte wie auch fixierte Materialien in Schnittdicken von µm und mehr sehr schonend geschnitten werden. Die Technik basiert darauf, dass das auf einem Blöckchen befestigte Gewebe in der mit Puffer gefüllten Vibratomwanne unter einer sehr dünnen, horizontal schwingenden (vibrierenden) Klinge hindurchgeführt wird. Sowohl das Gewebe als auch das Messer sind dabei in Flüssigkeit eingetaucht. Zartes Material (Nerven, Netzhaut) bettet man vor dem Schneiden in Agar (2 4 % in Puffer) ein, der mitgeschnitten wird (Abb. 2.26). Der Anwendungsbereich für Vibratomschnitte ist sehr groß. Vibratomschnitte werden für Standardfärbungen und in der Immunhistochemie eingesetzt, sowie in der in vitro- Hirnschnittpräparation. Ein detailliertes Vorgehen zum Schneiden von Frischpräparaten mit dem Vibratom ist in A2.19 beschrieben. Schwer penetrierbare Proben (z. B. kleine Arthropoden, Pflanzenmaterial) können manchmal mit Hilfe des Vibratoms für die Fixierung vorbereitet werden. Vibratomschnitte von frischem oder fixiertem Hirn (A2.19) oder Nervengewebe dienen häufig als Ausgangsmaterial für Immunmarkierungen nach der preembedding-technik (Kap. 9). Vibratomschnitte werden aber auch gern von fixiertem Gewebe gemacht, vor allem dann, wenn Gefrierschnitte oder Kryostatschnitte nicht eingesetzt werden können. Bei der Aufarbeitung von Gehirngewebe für die Elektronenmikroskopie wird das durch Perfusion fixierte Gehirn (A2.27) erst an einem Vibratom in ca. 100 µm dicke Scheiben geschnitten, um dann von diesen Schnitten anhand einer leichten Toluidinfärbung im Puffer die gewünschten Regionen identifizieren und herausstanzen zu können. Diese 100 µm dicken Gewebestückchen werden dann für die Flacheinbettung (Kap ) verwendet und in entsprechende Kunstharze eingebettet, von denen dann Ultradünnschnitte angefertigt werden können. Müssen beim Schneiden von Frischpräparaten, deren Vitalität zu erhalten im Vordergrund steht, diverse Vorkehrungen getroffen werden (A2.19), so ist die Handhabung von fixiertem Material am Vibratom recht einfach. Abb. 2.26: a) Vibratom (Leica VT 1000S), b) Vibratomschnitte von in Agar eingebettetem Pflanzenmaterial (Gerstenblatt) a b Anleitung A2.34 Herstellung von Vibratomschnitten von fixiertem Gehirngewebe Material: feiner Pinsel Mikrotiterplatten (netwells) Sekundenkleber (Roticoll, Roth) fusselfreie Papiertücher (z. B. Kimwipes) Rasierklingen Vibratom Lösungen: PBS oder Phosphatpuffer nach Sörensen, ph 7,4 (siehe Puffertabelle im Anhang) Durchführung: 1. Halter (Plattform) zum Aufblocken des Gehirns (oder Gehirnteils) aus der Schneidewanne nehmen und die Pufferlösung für die Wanne bereitstellen. Die Titerplatten zum Auffangen der Vibratomschnitte werden mit Puffer gefüllt 2. Gehirngewebe aus der Fixierlösung nehmen und die überschüssige Flüssigkeit mit Kimwipes leicht abtupfen. Dann das Gewebe mit einer Rasierklinge entsprechend der Schnittebene (z. B. transversal oder sagittal) zuschneiden Fortsetzung

8 Präparationsmethoden Fortsetzung 3. Gehirnstück mit der soeben gemachten Schnittfläche vorsichtig in einen großen Tropfen Sekundenkleber auf dem Halter aufsetzen. Dann den Halter in die Schneidewanne einspannen und vorsichtig Puffer in die Schneidewanne gießen. Gießt man zu früh oder zu schnell, dann kann Sekundenkleber von der Basis der Plattform hochsteigen, was beim Schneiden hinderlich ist. Wartet man zu lange, leidet die Struktur 4. die Klinge wird in den Messerhalter des Vibratoms gespannt. Vor dem ersten Schneidevorgang wird der Messerhalter so hoch gedreht, dass es über dem zu schneidenden Gehirn steht. Die Schnittdicke, die je nach weiterer Anwendung zwischen 20 und 100 µm liegen kann, wird am Gerät eingestellt, sowie auch die Frequenz des Messerschwingens und die Geschwindigkeit für den Vorschub 5. zu Beginn des Schneidens wählt man eine hohe Geschwindigkeit. Je nach Güte der Fixierung verändert man die Parameter. Im Allgemeinen ist die Frequenz immer auf sehr hoher Stufe, die Geschwindigkeit wird eher niedrig gehalten, um das Gewebe möglichst schonungsvoll zu schneiden 6. nach jedem Schneidevorgang wird der Schnitt mit dem Pinsel vom Messer abgenommen und in eine Titerplatte überführt. Am Ende des Schneidens nimmt man den Probehalter aus der Wanne heraus und kratzt die Reste und den Kleber sauber ab. Das Messer wird herausgenommen, gereinigt und verstaut, der Puffer aus der Wanne entfernt. Die Vibratomschnitte können jetzt weiter verarbeitet werden (z. B. für die Elektronenmikroskopie) oder auf Objektträger aufgezogen werden. Für in vitro-hirnschnittpräparate werden sehr dicke Vibratomschnitte ( µm) benötigt, da möglichst viel intaktes Frischgewebe für die weiteren im allgemeinen elektrophysiologischen Untersuchungen erhalten bleiben soll Herstellung von Schnitten mit Hilfe des Kryostaten Mit Hilfe des Kryostaten können Schnitte bis etwa 50 µm Dicke von gefrorenen (vorfixierten oder nativen) Proben angefertigt werden. Wird natives Material verwendet, sind die Schnitte insbesondere für Immunmarkierungen, Enzymnachweise und in situ-hybridisierungen sowie für biochemische Aufbereitungen nach der Lasermikrodissektion geeignet. Kryostatschnitte von vorfixierten Proben sind u. a. für die TEM-Präparation verwendbar. Die Anfertigung von Kryostatschnitten wird in Kapitel 2.7 beschrieben Isolation von Zellkompartimenten und Organellen Durch Zellfraktionierung können aus einem Zellverband bestimmte Zellkompartimente (z. B. Golgi-Apparat), Organellen (z. B. Mitochondrien) oder Strukturelemente (z. B. Mikrotubuli) isoliert und untersucht werden (Alexander and Griffiths 1993, Dashek 2000, Robinson and Hinz 2001). In aufeinander folgenden Schritten wird das Gewebe zunächst homogenisiert, die Zellverbände und Zellen schonend aufgebrochen, und die Bestandteile dann durch Gelfiltration oder Zentrifugationsverfahren sortiert. Man erhält verschiedene Fraktionen, deren Zusammensetzung und Reinheitsgrad auch elektronenmikroskopisch kontrolliert werden sollte. Dazu werden Proben der Fraktionen fixiert und nach Negativkontrastierung (Kap. 2.6) oder Schnittpräparation (Kap ) im TEM untersucht Trennen und Sortieren von Zellen Durchflusscytometrie Die Durchflusscytometrie (FACS = fluorescence activated cell sorting) ermöglicht das Zählen und die Analyse von physikalischen und molekularen Eigenschaften von Partikeln (z. B. Zellen) in einem Flüssigkeitsstrom. Eine Hauptanwendung besteht darin, mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffmarkierten Proben (Antikörper, Rezeptoren, Streptavidin, usw.) bestimmte Eigenschaften von Zellen oder Zellpopulationen auf Einzelzellebene zu dokumentieren. Mit Hilfe von RNA/DNA-Farbstoffen lassen sich Zellzyklus-Analysen und Apoptoseassays durchführen. Außerdem gibt es Fluoreszenzfarbstoffe, die eine Analyse des intrazellulären ph- Wertes und des Ionenflusses an Zellmembranen erlauben. In der Medizin wird die Durchflusscytometrie meist für die Untersuchung von Zellen des Blutes oder Knochenmarks eingesetzt. Die dabei gewonnenen Informationen dienen vor allem der Diagnose und Verlaufsbeobachtung von Leukämien (Blutkrebs) und Immunschwächekrankheiten (HIV-Infektion). Mit einigen FACS-Geräten (z. B. FACStarPlus oder FACSAria, BD Biosciences) ist es möglich, fluoreszenzmarkierte Zellen nicht nur zu charakterisieren, sondern auch zu trennen. Diese FACS-Durchflusscytometer umhüllen die Zellen nach dem Gang durch den Laserstrahl in einen Flüssigkeitsfilm, der mit einer positiven oder negativen Ladung versehen ist. Die geladenen Tropfen lenkt ein elektrisches Feld ab und leitet sie in Auffanggefäße. Es lassen sich Zellsubpopulationen aber auch Einzelzellen in diverse

9 2.2 Probengewinnung zur mikroskopischen Untersuchung und Präparation 85 2 Vibrator Hüllflüssigkeit Magnetisches Bead Streptavidin Probe Biotin Antikörper/ Lektin Zelle Messeinheit Laser 488 nm Detektor Bindung der Beads an die Zelle Antigen Sammeleinheit Ladungselektrode (+/0/ ) Abb. 2.28: Prinzip der Bindung paramagnetischer beads an eine Zelle Ablenkplatten Sammelgefäße Abb. 2.27: Cell-Sorting im Durchflusscytometer Probengefäße und Kulturplatten steril sortieren. Moderne, leistungsfähige Instrumente erlauben standardmäßig die Analyse und Sortierung von 5000 Partikeln pro Sekunde. Die Geschwindigkeit kann unter Umständen mit Zusatzausstattung auf Partikel pro Sekunde und mehr gesteigert werden. Dennoch ist das Verfahren aufwendiger und benötigt mehr Zeit als die Isolationsmethode mit paramagnetischen Kügelchen (beads) Zelltrennung mit Hilfe paramagnetischer Kügelchen (beads) Zur Isolation von Zellen mit spezifischen Oberflächeneigenschaften von anderen Zellen, partikulären Verunreinigungen oder aus Medien kann man paramagnetische beads (z. B. Dynabeads von InVitrogen) benutzen, die mit entsprechenden Bindeproteinen (Antikörpern, Lektinen, Enzymen, etc.) beschichtet sind. Bei der positiven Selektion verwendet man beads, die z. B. mit Antikörpern gegen ein bestimmtes Oberflächenprotein der gesuchten Zellen beschichtet sind. Die beads werden mit dem Zellgemisch inkubiert und dann mit den daran hängenden Zellen mittels eines Magneten herausgetrennt. Magneten sind bei Herstellern der beads erhältlich; ebenso sind NdFeB-Magneten (Neodym-Magnet) aus dem Fachhandel einsetzbar. Steht für die gesuchten Zellen kein geeignetes spezifisches Bindeprotein zur Verfügung, dann kann man gegebenenfalls eine negative Selektion (depletion) vornehmen, indem man mit entsprechend beschichteten beads alle anderen Zellen/Partikel aus dem Medium entfernt. Die gewünschten Zellen bleiben in der Lösung zurück und können durch Zentrifugation konzentriert werden Lasermikrodissektion Die Lasermikrodissektion dient dazu, unter mikroskopischer Kontrolle bestimmte Areale aus histologischen Schnitten auszuschneiden, um sie insbesondere für molekulare oder biochemische Untersuchungen zu verwenden. Die Methode eignet sich dafür, DNA, RNA oder Proteine aus bestimmten Gewebe- oder Zellarealen zu gewinnen bzw. anzureichern. Ausgangsmaterial sind meist entparaffinierte und gefärbte Schnitte; je nach Fragestellung und Anbieter können sich darüber hinaus lebende Zellkulturen, Handschnitte von Pflanzengewebe, Kryostatschnitte oder sogar Kunstharzschnitte eignen. Die Präparate müssen auf speziellen

10 Präparationsmethoden Histologische Probe vom Membranträger Pflanzenforschung Neurologie Zellbiologie Cytospin vom Glasobjektträger Cytospin Chromosomen vom Membranträger Pathologie Zytogenetik Onkologie Lebende Zellen aus der Kulturschale Zellkulturen DNA RNA Abb. 2.29: Anwendungen der Lasermikrodissektion. Bild: Palm Laser Technologies Pipettieren Inkubieren Abzentrifugieren Proteine Abb. 2.30: Mikroskopische Aufnahme des Mikrodissektionsprozesses. a) Gefärbter Schnitt eines Löwenzahnblattes auf der Objektträgermembran. b) Nach dem Einsatz des La- sers erscheint eine helle Lücke um das umfahrene Gewebe. c) Schnitt, nachdem der umfahrene Bereich herauskatapultiert wurde. d) Herauskatapultierter Gewebeteil im Sammelgefäß. Aufnahme: Palm Laser Technologies a c b d

11 2.3 Fixierungen für Licht- und Elektronenmikroskopie 87 2 Folien liegen, die als Petrischalenboden oder Objektträger dienen. Die Anlage von Palm (Palm Laser Technologies) kann auch auf Glasobjektträgern liegende Schnitte behandeln (Abb. 2.29). Eine Lasermikrodissektionsanlage besteht aus einem motorisierten Lichtmikroskop und einem eingekoppelten, computergesteuerten Laser. Im Lichtmikroskop wählt man die zu isolierenden Areale (Organellen, Zellen, Zellgruppen) aus. Sie werden dann mit dem Laserstrahl, der durch das Objektiv auf das Präparat trifft, mitsamt der Folie ausgeschnitten (Abb. 2.30) und in sterile Gefäße (Reaktionsgefäße) transferiert. Das Arcturus XT von Molecular Devices kombiniert die Infrarot-Laser-capture-Mikrodissektion (LCM) mit dem UV-Laser-Schneiden. Das Material wird von unten aufgefangen (Leica), mit dem Deckel abgetupft (Olympus) oder berührungsfrei in den Deckel katapultiert (Palm). Nachdem man genügend Material gesammelt hat, wird das Gefäß geschlossen, aus der Halterung am Mikroskop entfernt, und man kann mit der Probenaufbereitung beginnen. Dafür sind Kits im Handel erhältlich (z. B. von Quiagen oder AmpTec). 2.3 Fixierungen für Licht- und Elektronenmikroskopie Viele mikroskopische Verfahren (z. B. REM, TEM), histologische Färbungen und Nachweise eignen sich nicht für Lebendmaterial. Daher steht am Anfang vieler Präparationsgänge das Abtöten der Zellfunktionen bei gleichzeitiger Erhaltung der -strukturen, die sogenannte Fixierung. Fixierte Proben können, je nach Eignung und Fragestellung, geschnitten, gefärbt und mikroskopiert werden. Sie können für das REM getrocknet und beschichtet werden (Kap. 2.5). Oder Sie werden in Paraffin bzw. Kunststoff eingebettet und für licht- oder elektronenmikroskopische Untersuchungen geschnitten (Kap. 2.4) Theorie der Fixierung Durch die Fixierung möchte man Zellen und Gewebe für die Untersuchung in ihrem natürlichen, momentanen Zustand erhalten. Alle Bestandteile sollen in Größe und Form unverändert und in ihrem normalen Umfeld bleiben. Die Fixierung soll Moleküleigenschaften, Färbbarkeit, Antigenität und Enzymaktivitäten nicht verändern. Und sie soll auf die weitere Präparation vorbereiten, also das Gewebe festigen und schneidbar machen und nicht brüchig oder aufgeweicht. Die Fixierung ist damit einer der wesentlichen Schritte in der Präparation von biologischem Material für die licht- oder elektronenmikroskopische Untersuchung Ziel der Fixierung Es gibt keine Fixierungsweise, die gleichmäßig alle der oben genannten Kriterien erfüllt. Die größte Annäherung erhält man sicherlich durch eine Kryopräparation, die jedoch einen hohen Aufwand an Gerätetechnik und Erfahrung erfordert (Kap. 2.7). Für die meisten Anwendungen, insbesondere für die lichtmikroskopische Untersuchung, wird eine solche optimale Fixierung gar nicht benötigt. Man sollte sich daher vor der Präparation klar darüber sein, welches Ziel man verfolgt, um dafür den einfachsten, preiswertesten oder schnellsten Weg bei guten Ergebnissen zu wählen. Strukturerhaltung Die verschiedenen Komponenten von Zellen und Geweben haben unterschiedliche Eigenschaften und reagieren daher auch unterschiedlich auf eine Fixierung. Zum Beispiel sind ph-wert, Wassergehalt und Osmolarität in Kompartimenten, Organellen und im Cytoplasma nicht gleich. Folglich reagieren sie in verschiedener Weise auf die Fixierungsbedingungen und die nachfolgende Präparation. Fixierungen für eine generell befriedigende Strukturerhaltung sind also nicht optimal für alle Strukturen. Will man eine bestimmte Struktur möglichst lebensnah erhalten, wird man eine auf diese angepasste Fixierung wählen. Histologische, cytologische oder ultrastrukturelle Untersuchungen stellen unterschiedliche Anforderungen an die Fixierungstechnik. Je höher die erforderliche Auflösung ist, mit der das Präparat betrachtet werden soll, desto besser müssen die Strukturen erhalten und desto genauer müssen die Bedingungen der Fixierung (Osmolarität, ph-wert, Temperatur, Fixanzien) auf das Präparat abgestimmt werden. Nachweise Nicht alle Bestandteile eines biologischen Präparates werden durch die chemische Fixierung stabilisiert. Während viele größere Proteine durch Fällung oder Vernetzung erhalten bleiben, werden Lipide mehr oder weniger stark extrahiert. Polysaccharide werden nur indirekt (durch stabilisierende Proteine) fixiert. Kleine Moleküle (Zucker, Peptide, Ionen) gehen bei einer chemischen Fixierung zumeist verloren. Nachweise von Zellkomponenten, die im Schnittpräparat nicht oder nur sehr aufwendig mit Hilfe von Kryotechniken erhalten werden können, gelingen häufig besser am lebenden Objekt mit Hilfe von spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen. Mitochondrien, Golgi-Vesikel oder ER sind mit Hilfe von Fluoreszenzmarkern bereits im Lebendpräparat erkennbar (Kap ). Für eine Immunmarkierung (Kap. 9) müssen die Zugänglichkeit und die Antigenität des zu lokalisierenden Moleküls erhalten werden. Gleichzeitig soll das Antigen am natürlichen Platz bleiben. Die Strukturen müssen so fixiert werden, dass sie im Licht- oder Elektronenmikroskop noch erkannt und zugeordnet werden können.

12 Präparationsmethoden Nachweise von Enzymaktivität (Kap. 8) erfordern ebenfalls sanfte Fixierungen, die Proteinstruktur und funktion erhalten, die Enzyme jedoch gleichzeitig in ihrer natürlichen Umgebung festhalten. Langkettige Nucleinsäuren lassen sich durch Fällung (z. B. durch Wasserentzug) und Vernetzung mit anliegenden Proteinen stabilisieren. Für in situ-hybridisierungen (Kap. 10) darf die Vernetzung nicht zu stark sein, um den Zugang der Sonde zu ermöglichen. Dies wird in der Regel durch möglichst kurze Fixierungszeiten erreicht. Wichtig ist außerdem, während der Präparation die Aktivität fremder und zelleigener DNasen bzw. RNasen zu unterbinden Fixierungsverfahren Eine Fixierung kann durch physikalische Einwirkungen oder chemische Substanzen erreicht werden. Physikalische Fixierung Trocknung: Durch Wasserentzug werden Proteine denaturiert und wasserunlöslich gemacht. Biologisches Material kann daher durch Trocknung fixiert werden. Vorteilhaft dabei ist, dass keine Substanzen verloren gehen. Die einfache Lufttrocknung führt jedoch zu ungleichmäßigen Schrumpfungen und zum Kollabieren der Zellen. Je dicker das Material ist, desto größer sind die morphologischen Schäden. Die Methode eignet sich deshalb nur zur Fixierung von dünnen Schnitten (z. B. Kryostatschnitte) oder sehr dünnen Präparaten (z. B. Blutausstrich) für die Lichtmikroskopie. Eine bessere Strukturerhaltung bekommt man durch Gefriertrocknung oder Kritische-Punkt-Trocknung (Kap. 2.5). Hitzefixierung: Eine Erhitzung von biologischem Material auf über 55 C führt u. a. zu einer Denaturierung und damit Ausfällung der meisten Proteine und zu einem schnellen Erlöschen aller Lebensfunktionen. Hitzebehandlung ist daher ein mögliches Verfahren, Zellen oder Gewebe für die Mikroskopie zu fixieren. Bakterienabstriche zum Beispiel werden zur Fixierung häufig auf dem Objektträger über einer Flamme erhitzt. Für eine gute Strukturerhaltung sollte die Hitze allerdings kontrolliert und gleichmäßig einwirken. Gasbläschen, wie sie beim Kochen entstehen, können erheblichen Schaden anrichten. Behandlung in der Mikrowelle: In der Praxis kann man zur Hitzefixierung ein Mikrowellengerät verwenden. Wichtig sind eine genaue Temperaturkontrolle und -regulation im Inneren des Präparates, die mit haushaltsüblichen Mikrowellengeräten nicht erreicht werden. Entsprechend ausgestattete Mikrowellenöfen für den Laborbedarf sind sehr teuer. Sie sind allerdings in der histologischen Präparation vielseitig einsetzbar: Die Mikrowellenbehandlung in Kombination mit einer chemischen Fixierung beschleunigt und erleichtert das Eindringen der Lösungen und die Wirkung der Fixanzien auf die Zellkomponenten. Entwässerung und Einbettung biologischer Proben werden durch Mikrowellenbehandlung stark beschleunigt. Mikrowellenbehandlungen können Färbungen und Immunmarkierungen erleichtern. Ausführliche Anleitungen zum Einsatz von Mikrowellengeräten in der licht- und elektronenmikroskopischen Präparation findet man in der Fachliteratur (z. B. Giberson and Demaree 2001). Gefrierfixierung: Schnelles Abkühlen auf tiefe Temperaturen beendet abrupt die Stoffwechselvorgänge und fixiert Moleküle und Strukturen in lebensnaher Konformation und Lokalisation. Die Kryofixation verlangt ebenfalls kontrollierte Bedingungen, damit es nicht zu zerstörerischer Eiskristallbildung in den Proben kommt. In Kombination mit einer Reihe weiterer Kryotechniken (Kap. 2.7) gehört sie zu den Verfahren, mit denen man ein nahezu realistisches Bild der Zelle zum Zeitpunkt der Fixierung erreichen kann. Chemische Fixierung Die am meisten verbreitete Methode der Fixierung beruht auf der Wechselwirkung chemischer Substanzen mit den Komponenten von Zellen und Geweben. Je nachdem, wie das biologische Material mit den Fixanzien zusammen gebracht wird, unterscheidet man verschiedene Vorgehensweisen. Immersionsfixierung: Die Zellen oder Gewebestückchen werden in die Fixierungsflüssigkeit eingetaucht. Die Fixanzien dringen mehr oder weniger schnell von außen nach innen in die Proben ein. Bei ihrem Eindringen verändern sie ihre Umgebung: Manche Substanzen wandern mit der eindringenden Front mit, manche werden ausgeschwemmt, andere vernetzt. Nachfolgende Fixanzien finden veränderte Bedingungen vor. Ihnen wird der Weg ins Innere der Probe erschwert. Daher ist bei der Immersionsfixierung die Gefahr von Artefaktbildung (z. B. Quellung, Schrumpfung, Substanzflucht) sehr groß. Sie kann begrenzt werden durch die sorgfältige Auswahl der Proben und die bestmögliche Zusammenstellung eines Fixierungsgemisches, bei dem nachteilige Wirkungen eines Fixativs durch andere ausgeglichen werden, und das zu dem Probenmaterial passt. Wichtig ist weiterhin, dass die Proben in eine ausreichende Menge von Fixierungslösung gelangen und von dieser von allen Seiten umspült werden. Injektion von Fixanzien: Das gleichmäßige Eindringen der Fixanzien wird verbessert, wenn das Fixans nicht (nur) von außen sondern auch von innen appliziert wird. Man injiziert mit Hilfe einer feinen Kanüle,

13 2.3 Fixierungen für Licht- und Elektronenmikroskopie 89 2 die in das Gewebe eingeführt wird, und lässt eisgekühlte Fixierungslösung aus einer Spritze mit wenig Druck einsickern. Sehr dichte Gewebeteile kann man damit zusätzlich zur Immersionsfixierung behandeln. Kleine Organismen mit einem festen Chitinpanzer (Insekten, Krebse) oder anderen schwer durchdringbaren Hüllen werden nach Betäubung in vivo behandelt und damit im Inneren besser erhalten. Die Fixierungslösung kann auch in situ in Organe injiziert werden. Postmortale Schäden durch die Organentnahme werden damit weitgehend vermieden. Man legt das zu fixierende Organ am betäubten Tier frei und führt die Nadel in zuführende Blutgefäße oder mittig in das Organ selbst ein. Nachdem die kalte Lösung 5 20 min eingewirkt hat, wird das Organ entnommen, zerkleinert und in frisches Fixans gelegt. Auftropfen von Fixanzien: Die Präparate werden in situ mit Fixierlösung überspült und nach der Entnahme durch Immersionsfixierung nachbehandelt. Damit wird Schädigungen beim Heraustrennen von Geweben entgegen gewirkt. Perfusionsfixierung: Das Fixans wird im narkotisierten Tier über die Gefäße in die Organe transportiert. Das Verfahren gibt ausgezeichnete Resultate, kann aber naturgemäß in vielen Fällen nicht angewendet werden. Man durchspült isolierte Organe vom präparierten Hilus, ganze Versuchstiere vom linken Herzventrikel aus. Dabei kann man den großen vom kleinen Kreislauf trennen oder die obere Körperhälfte isoliert durch Abklemmen der Aorta descendens durchspülen. Stets ist auch für den freien Abfluss des Fixiermittels zu sorgen; also z. B. das rechte Herzohr abschneiden oder die entsprechenden Hohlvenen eröffnen. Nach Minuten Perfusion kann man die Organe entnehmen, zerkleinern und in Fixans einlegen. Als Fixiermittel eignen sich z. B. 5 % Formaldehydlösung, Formol-Alkohol nach Schaffer (Tab. 2.10) und Kaformacet (Tab. 2.11). Für Semidünnschnitte und für elektronenmikroskopische Präparate fixiert man mit 2 % Glutaraldehyd in 0,2 M Pufferlösungen. Beispielhaft ist eine Perfusionsfixierung in Kapitel 2.1 beschrieben. Ausführliche Anleitungen zur Perfusionsfixierung finden sich z. B. bei Hayat (1989) Mechanismen der chemischen Fixierung Fixanzien wirken auf unterschiedliche Weise stabilisierend auf die Zellkomponenten: Sie entziehen Molekülen ihre Hydrathülle und fällen sie damit aus dem Cytoplasma aus. Derart koagulierend wirken zum Beispiel konzentrierte Lösungsmittel (Alkohole, Aceton) und Salze (Ammoniumsulfat). Ausschließlich durch Koagulation fixierte Präparate zeigen eine schlechte Strukturerhaltung. Färbbarkeit und Antigenität sind dagegen meistens gut. Sie denaturieren die Proteine, verändern also ihre Tertiär- und Quartärstruktur, und ermöglichen damit neue Bindungen und Vernetzungen untereinander. Dabei können Enzymaktivität oder Antigenität verloren gehen. Denaturierend wirken z. B. starke Säuren (Essigsäure) oder Hitze. Sie verbinden sich mit Proteinen oder Lipiden und bilden dabei Brücken zwischen den Molekülen. Je stärker die Moleküle untereinander vernetzt werden, desto besser bleibt die Struktur erhalten, desto geringer werden jedoch auch Enzymaktivität und Antigenität. Vernetzende Fixanzien (Aldehyde, Osmiumtetroxid, Kaliumpermanganat, Rutheniumrot) werden bei der Fixierungsreaktion verbraucht. Um eine gute Fixierung zu erhalten, muss daher eine ausreichende Menge an Fixanzien eingesetzt und die Lösung während der Fixierungsperiode mehrmals durch frische ersetzt werden. Saure Fixanzien zerstören manche Zellkomponenten, insbesondere Mitochondrien. Sie fällen Kernproteine und trennen Bindungen zwischen Proteinen und Nucleinsäuren. Das Cytoplasma erscheint netzartig; Spindel und Chromosomen bleiben erhalten. Im Gegensatz dazu erhalten basische Fixanzien die Mitochondrien, während viele andere cytoplasmatische Bestandteile verloren gehen. Häufig verwendet man Fixierungsgemische, bei denen sich die Vor- und Nachteile der Einzelkomponenten ausgleichen Fixanzien für die Licht- und Elektronenmikroskopie Für lichtmikroskopische Untersuchungen werden normalerweise andere Fixanzien eingesetzt als für die Elektronenmikroskopie. Wegen der wesentlich geringeren Auflösung des Lichtmikroskops steht hier weniger die optimale Strukturerhaltung der Präparate als die Färbbarkeit im Vordergrund. Da in der Regel größere Proben präpariert werden, sind ebenfalls Penetrationsgeschwindigkeit und tiefe wichtig bei der Auswahl der Fixanzien. Nicht zuletzt spielt auch der Preis eine Rolle Fixanzien für die Histologie Für histologische Zwecke finden eine Vielzahl von Fixanzien Verwendung. Lösungen, die für fast alle Organe eingesetzt werden können und daher vielfach eingesetzt werden, sind in Tabelle 2.10 aufgeführt. Weitere e findet man in Tabelle 2.11.

14 Präparationsmethoden Tabelle 2.10: Gebräuchliche Fixierungen für die Histologie Name Zusammensetzung Anwendung Eignung BOUINsches 15 ml gesättigte wässrige Pikrinsäure 5 ml 40 % Formalin 1 ml Eisessig direkt vor Gebrauch mischen 2-24 h fixieren in % Ethanol mehrmals waschen entwässern und einbetten Übersichtspräparate Cytologische Präparate Protozoen Embryonen in situ-hybridisierung Immunmarkierung CARNOYsches 600 ml 99,9 % Ethanol 300 ml Chloroform 100 ml Eisessig direkt vor Gebrauch mischen je nach Größe 1 4 h fixieren Glykogennachweis Darstellung von Kernstrukturen Formol nach LILLIE 100 ml 36 % Formol 4 g NaH 2 PO 4 x H 2 O 6,5 g Na 2 HPO ml H 2 O ph 7,0 direkt vor Gebrauch mischen je nach Größe 1 3 Tage bei 4 C fixieren Histologische Färbungen Formol-Calcium nach BAKER 10 ml 36 % Formol 1 g CaCl 2 90 ml H 2 O zur Neutralisation einige Stücke CaCO 3 hinzufügen in dunkler Flasche aufbewahren Hartgewebe Formol-Alkohol nach BURKHARD 324 ml 36 % Formol 540 ml Ethanol oder Methanol (absolut) 130 ml Barbital-Natrium- Puffer, ph 7,4 6 g Glucose Aufbewahrung in dunkler Flasche Hartgewebe Ethanol-Essigsäure- nach WOLMAN und BEHER 950 ml 99,9 % Ethanol 50 ml Eisessig bis 1 cm Größe: 4 h fixieren bei 6 8 C Nachbehandlung: über Nacht in 99,9 % Ethanol bei RT 2 20 min in reinem Benzol Paraffineinbettung Nachweise: alkalische Phosphatase Lipase Phosamidase Cholinesterase MAXIMOWsches 100 ml Müllersche Flüssigkeit 5 g HgCl 2 10 ml Formol 10 ml 2 % OsO 4 in H 2 O direkt vor Gebrauch mischen 1 6 h fixieren auswaschen in Leitungswasser Blut, Blutbildungsorgane Fett MÜLLERsche Flüssigkeit 2,5 g Kaliumdichromat 1 g Natriumsulfat 100 ml H 2 O Pikrinsublimat nach RABL 100 ml gesättigte, wässrige Pikrinsäure 100 ml gesättigte, wässrige Sublimatlösung (HgCl 2 ) 200 ml H 2 O direkt vor Gebrauch mischen 12 h fixieren Nachbehandlung: Übertragen in niedrig konzentriertes Ethanol aufsteigende Ethanol-Reihe Zusatz von Iodtinktur und Lithiumcarbonat in 99,9 % Ethanol ältere Embryonen Keimscheiben ROSSMANNsche Lösung 90 ml gesättigte, ethanolische Pikrinsäure 10 ml 40 % Formalin direkt vor Gebrauch mischen 3 8 h fixieren in 99,9 % Ethanol übertragen Kohlehydrate Glykogennachweis SCHAFFERsches 100 ml 36 % Formalin (neutralisiert mit CaCO 3 ) 200 ml 80 % Ethanol ph 7,2 7,4 (evtl. mit 1 N NaOH einstellen) 1 2 Tage fixieren in 80 % Ethanol überführen Darstellung von Schleimen bei rascher Weiterbehandlung: dotterreiche Embryonen Hartgewebe fluorochrommarkierte Gewebe

15 2.3 Fixierungen für Licht- und Elektronenmikroskopie 91 2 Tabelle 2.10: Fortsetzung Name Zusammensetzung Anwendung Eignung STIEVEs Fixativ 76 ml gesättigte wässrige HgCl 2 -Lösung 20 ml Formol 4 ml Eisessig vor Gebrauch mischen 3 6 h fixieren in 80 % Ethanol übertragen große Präparate Sublimatalkohol nach APATHY 3 4 g HgCl 2 0,5 g NaCl 100 ml 50 % Ethanol vor Gebrauch mischen h fixieren in 70 % Ethanol übertragen Sublimat-Formol nach HEIDEN- HAIN 4,5 g HgCl 2 0,5 g NaCl 80 ml H 2 O 20 ml 40 % Formalin vor Gebrauch mischen 2 24 h fixieren in 70 % Ethanol übertragen bindegewebsreiche Organe Sublimat-Essigsäure nach LANG 100 ml gesättigte, wässrige Sublimatlösung (HgCl 2 ) 5 10 ml Eisessig vor Gebrauch mischen 0,5 6 h fixieren in 70 % Ethanol übertragen Zellkernstruktur embryonales Gewebe bindegewebsarme Organe SUSA- nach HAIDEN- HAIN Lösung A: 4,5 g HgCl 2 0,5 g NaCl 70 ml H 2 O Lösung B: 10 ml 20 % Trichloressigsäure Lösung C: 20 ml Formol Lösung D: 4 ml Eisessig Lösungen A, B, C, D vor Gebrauch mischen 1 24 h fixieren in 96 % Ethanol übertragen und mehrmals wechseln Muskelgewebe kollagenes Bindegewebe ZENKERsches 100 ml Müllersche Flüssigkeit 5 g Sublimat 0,5 5 ml Eisessig 5 ml 40 % Formalin vor Gebrauch mischen 1 6 h fixieren 24 h in fließendem Leitungswasser waschen hämatologische Untersuchung Übersichtspräparate Formalin und formalinhaltige Lösungen Formalin bzw. Formol ist eine kommerziell erhältliche, % wässrige Formaldehydlösung, die Zusätze zur Stabilisierung (zumeist 10 % Methanol) aber auch Ameisensäure und zu einem hohen Prozentsatz Formaldehyd- Polymere enthält. Für histologische Zwecke wird 40 % Formalin ( mind. 37 % ) von Merck empfohlen, das verdünnt werden kann. Kommerziell erhältlich ist für die Routinefixierung gepuffertes 4,5 % Formalin (z. B. Roth). Formalin konserviert Form, Farbe und Struktur der Präparate sehr gut und durchdringt auch größere Präparate. Fette und Lipoide bleiben gut erhalten. Darüber hinaus eignet sich Formalin sehr gut zur Aufbewahrung des fixierten Materials, ohne die Färbbarkeit zu beeinflussen. Es ist daher eines der gebräuchlichsten Fixierungsmittel und in vielen Fixierungsgemischen enthalten (Tab und 2.11). Formalinfixierte Präparate können mit fast allen anderen Fixierungsgemischen nachfixiert werden. Formalin als Zusatz sollte erst direkt vor Gebrauch zu anderen Fixanzien gegeben werden. Formol ist gut verschlossen (gesundheitsschädigend!) und lichtgeschützt aufzubewahren. Unter Lichteinwirkung bildet sich Ameisensäure. Ein geringer Anteil Säure ist bei den meisten Anwendungen tolerabel, jedoch nicht, wenn das Material für Silbermethoden verwendet werden soll. Säurefreies Formol erhält man, wenn man das Formalin über einer 1 2 cm dicken Schicht von gepulvertem Calciumcarbonat aufbewahrt Ethanol und ethanolhaltige Lösungen Ethanol dringt sehr schnell in Gewebe ein. Da die Entwässerung das Material stark härtet, darf die Fixierung nicht lange durchgeführt werden. Die Präparate schrumpfen sehr

16 Präparationsmethoden stark. Dennoch wird die Ethanolfixierung für spezielle Fragestellungen gern eingesetzt, da sie Substanzen erhält, die mit anderen Mitteln nicht erhalten werden können. Dazu gehören: Schleime, Glykogen, Harnsäure, Eisen, Calcium. Gelöst werden dagegen: Fette und fetthaltige Substanzen, Cholesterinverbindungen, chromaffine Substanzen und viele Enzyme. Zur Fixierung dient normalerweise 99,9 % Ethanol (Ethanol absolut). Die Fixierungsdauer beträgt je nach Größe der Proben 15 min bis 4 h. Die Nachteile der Ethanolfixierung können durch Mischung mit anderen Fixanzien z. T. ausgeglichen werden (Tab und 2.11) Fixierung in kalten Lösungsmitteln Abstriche, Ausstriche, adhärente Zellkulturen oder Aufwuchsorganismen und Kryostatschnitte, die für Immunlokalisationen oder in situ-hybridisierungen vorgesehen sind, können in kalten Lösungsmitteln fixiert werden. Geeignet sind 99,9 % Ethanol, Methanol oder Aceton. Die noch feuchten Präparate auf Objektträgern werden in eine Küvette mit den vorgekühlten ( 20 C) Lösungsmitteln gestellt und im Gefrierschrank für einige Stunden bis zu mehreren Wochen aufbewahrt. Vor der Verwendung werden die Präparate auf 4 C oder Raumtemperatur erwärmt und in einer absteigenden Lösungsmittelreihe rehydriert Pikrinsäure und pikrinsäurehaltige Lösungen Pikrinsäure dient als Zusatz in einigen Fixierungsgemischen. Es fördert das Eindringen von Formaldehyd, erhält die Färbbarkeit der Präparate und die Antigenität für Immunmarkierungen. Die Säure wirkt allerdings entkalkend. Verwendet wird Pikrinsäure als wässrige oder alkoholische gesättigte Lösung. Bei der Aufbewahrung sollte darauf geachtet werden, dass sich im Deckel (insbesondere im Schliffstopfen) keine Kristalle absetzen. Pikrinsäure ist explosiv; die Kristalle können durch Funken entzündet werden. Anleitung A2.35 Herstellung wässriger, gesättigter Pikrinsäurelösung g Pikrinsäure in 1 2 l-flasche einwiegen 2. mit 500 ml heißem H 2 O übergießen und schütteln Lösung erkalten lassen Anleitung A2.36 Herstellung alkoholischer, gesättigter Pikrinsäurelösung g Pikrinsäure in 100 ml 99,9 % Ethanol geben 2. häufig schütteln Quecksilberchlorid (Sublimat) und sublimathaltige Lösungen Quecksilberchlorid (Achtung: stark giftig!) wird als Zusatz zu einigen Fixierungsgemischen verwendet (Tab und 2.11). Man benötigt eine gesättigte, wässrige Lösung. Anleitung A2.37 Herstellung einer gesättigten, wässrigen Sublimatlösung ml H 2 O in 2 l-glaskolben bis zum Kochen erhitzen g Sublimat hinzugeben (Achtung: starkes Aufwallen!) 3. Lösung erkalten lassen Bei der Fixierung mit Sublimat bildet sich in den Präparaten häufig ein sogenannter Sublimatniederschlag. Die Entfernung des Niederschlages wird unter A 2.41 beschrieben. Histologische Untersuchungen erfordern manchmal besonders geeignete Fixierungsgemische (Tab. 2.12). Für nachfolgende Immunmarkierungen muss bei der Fixierung darauf geachtet werden, dass die Antigene dabei nicht zerstört, extrahiert oder ihre Epitope verändert werden. Wie für die in situ-hybridisierung eignen sich dazu nur bestimmte Fixanzien (Tab. 2.13), insbesondere gepufferte Formaldehydlösungen. Speziell adaptierte Fixierungsgemische sind auch kommerziell erhältlich (z. B. ImmunoChem Fix von BBC) Die HOPE-Fixierung Die HOPE-Fixierung (DCS Innovative Diagnostik-Systeme, Hamburg) eignet sich insbesondere zur schonenden Konservierung von Gewebe, das zur Lokalisation von Nucleinsäuren oder Proteinen vorgesehen ist. Sie ermöglicht nach Herstellerangaben die Immunhistochemie am Paraffinschnitt ohne Antigen-Demaskierung, Enzymnachweise, verbesserte RNA- und DNA-in situ-hybridisierungen und hervorragende Nucleinsäure-Erhaltung für PCR und RT-PCR. Nicht geeignet ist sie für nachfolgende Kunstharzeinbettungen.

17 2.3 Fixierungen für Licht- und Elektronenmikroskopie 93 2 Tabelle : Weitere Fixierungsgemische für lichtmikroskopische Anwendungen Name Zusammensetzung Anwendung Eigenschaften Eignung cajalsches Brom-Formol- 15 ml Formalin 2 g Ammoniumbromid 85 ml H 2 O vor Gebrauch mischen 2 25 Tage fixieren gründlich wässern Glia-Imprägnation cajalsche Neurofibrillen- Färbung 40 ml Pyridin 30 ml 96 % Ethanol direkt vor Gebrauch mischen 24 h fixieren unter fließendem Leitungswasser waschen Neurofibrillen Ciaccosches 80 ml 5 % Kaliumbichromat 20 ml Formol 5 ml Eisessig direkt vor Gebrauch mischen 24 h fixieren unter fließendem Leitungswasser waschen Fette, Lipide Ethanol- Eisessig I 95 ml 96 % Ethanol 5 ml Eisessig direkt vor Gebrauch mischen mindestens 4 h fixieren (Kühlschrank oder Eisfach) in 96 % Ethanol überführen und einbetten rasches Eindringen Enzymhistochemie Immunmarkierung in situ-hybridisierung Ethanol- Eisessig II 3 Teile Ethanol 1 Teil Eisessig vor Gebrauch mischen Zellen darin bis zum Gebrauch aufbewahren (für längere Zeit bei 20 C) Chromosomendarstellung und Färbung (FISH) FLEMMINGsches 15 ml 1 % (w/v) Chromsäure in H 2 O 4 ml 2 % (w/v) OsO 4 in H 2 O 1 ml Eisessig Zusatz von 5 % Harnstoff verbessert das Eindringen vor Gebrauch ansetzen Gewebe 1 3 mm: mindestens 24 h in mindestens 5 Volumen der Probe fixieren (kann darin lagern) 24 h unter fließendem Wasser auswaschen dringt langsam ein Histologie Fixierung von Zellen (Blut) Formaldehyd- Propionsäure- Ethanol (FPA) 50 ml 96 % Ethanol 5 ml Propionsäure 10 ml Formol 30 ml H 2 O vor Gebrauch ansetzen Gewebe: h bei RT fixieren (Aufbewahrung darin möglich) dringt langsam ein Schrumpfung Übersichtpräparate (auch Pflanzen) HELLYsches 100 ml 2,5 3 % (w/v) Kaliumdichromat in H 2 O 5 g Sublimat 5 ml Formalin Zusatz von 2 % OsO 4 fixiert auch Lipide Gewebe bis 4 mm Dicke: 1 6 h fixieren auswaschen in fließendem Wasser Histologie, insbesondere Knochen für Hämatologie 10 ml Formol verwenden Heptan- Formaldehyd Lösung A: 0,08 M EGTA 5 % (w/v) Formaldehyd 10 % DMSO in PBS + 1 % (v/v) Tween 20 Lösung B: Heptan Lösungen A und B direkt vor Gebrauch 1:1 mischen kräftig schütteln und auf das Gewebe geben min fixieren (Fixans mehrmals durch frisch geschütteltes ersetzen) mit Methanol und Ethanol auswaschen sehr gutes Eindringen Fixierung von Gewebe oder Organismen mit wasserundurchdinglichen Deckschichten Immunmarkierung in situ-hybridisierung

18 Präparationsmethoden Tabelle 2.11: Fortsetzung Name Zusammensetzung Anwendung Eigenschaften Eignung Kaformacet 85 ml 3 % (w/v) Kaliumdichromat in H 2 O 10 ml Formol 5 ml Eisessig direkt vor Gebrauch mischen Gewebe bis 1 cm Dicke 6 24 h fixieren in 5 % (w/v) Li- oder Na-Sulfatlösung (in H 2 O) mehrmals waschen 24 h unter fließendem Wasser waschen durch Sulfatlösung bleibt Quellung gering und Färbbarkeit sehr gut Histologie Kaliumdichromat-Essigsäure 100 ml 3 % (w/v) Kaliumdichromat in H 2 O 5 ml Eisessig vor Gebrauch mischen 1 2 Tage fixieren 1 Tag mit fließendem Wasser waschen dringt schnell ein fixiert Cytoplasma, Kerne, Bindegewebe KOENIKs Fixans 5 Teile Glycerin 2 Teile Eisessig 3 Teile H 2 O Evertebraten (Kapitel 5) LILLIEsche Fixierung 8 g Bleinitrat 80 ml 96 % Ethanol 10 ml 4 % Formalin 10 ml H 2 O 24 h fixieren Mastzellen Mucopolysaccharide LISON-VOKAERsche Glykogenfixierung 85 ml in 96 % Ethanol gesättigte Pikrinsäure 10 ml Formalin 5 ml Eisessig 5 10 h bei 4 C oder 20 C fixieren in 96 % Ethanol überführen nahezu quantitative Erfassung des Glykogens zur Darstellung von Glykogen Methanol-Essigsäure 3 Teile Methanol 2 Teile Eisessig vor Gebrauch mischen Zellen darin bis Gebrauch aufbewahren Chromosomendarstellung und Färbung (FISH) Muskelfixans 5 % Formalin 5 % (w/v) TCA 1 % (w/v) Platinchlorid in H 2 O Gewebe einige Stunden in feuchte Kammer (Muskel möglichst auf Hölzchen spannen) 24 h in frischer Mischung fixieren in 96 % Ethanol überführen, mehrmals wechseln Histologie (Muskel) ORTHsches (modifiziert) 9 Teile 2,5 % (w/v) Kaliumdichromat in H 2 O 1 Teil Formol vor Gebrauch mischen 1 2 Tage im Dunkeln fixieren 1 Tag mit fließendem Wasser waschen Histologie Gefrierschnitte SANNOMIYAsches Lösung A: 3 g Sulfosalicylsäure 100 ml 96 % Ethanol Lösung B: 5 ml Eisessig Lösungen A und B direkt vor Gebrauch mischen 2 4 mm Gewebestücke 2 3 h fixieren in 96 % Ethanol überführen und einbetten gute Erhaltung von Schleimen und Sekreten Verlust von Färbbarkeit der Kerne Histologie SCHILLERsches Lösung A: 1 ml gesättigtes wässriges Uranylacetat 1 ml gesättigte wässrige Sublimatlösung 73 ml H 2 O Lösung B: 2 g Kaliumdichromat 1 g Magnesiumacetat 25 ml H 2 O Lösungen A und B direkt vor Gebrauch mischen h fixieren 2 3 h unter fließendem Wasser waschen entwässern und einbetten fixiert ohne Härtung Histologie

19 2.3 Fixierungen für Licht- und Elektronenmikroskopie 95 2 Tabelle 2.11: Fortsetzung Name Zusammensetzung Anwendung Eigenschaften Eignung STEEDMANs Fixans Stammlösung: 100 ml Propylenphenoxetol 500 ml Propylenglykol 500 ml Formalin Anwendung: 110 ml Stammlösung in 890 ml H 2 O STEEDMAN- Konservierung: Stamm: 50 ml Propylenphenoxetol, 500 ml Propylenglykol Verwendung: 10 ml der Stammlösung in 890 ml A. dest. Evertebraten (Kapitel 5) TCA-Sublimat Formol 25 ml gesättigte wässrige Lösung von Sublimat 20 ml 5 % (w/v) TCA (Trichloressigsäure) 15 ml Formol vor Gebrauch mischen je nach Größe 1 24 h fixieren in 80 oder 90 % Ethanol übertragen, mehrmals wechseln sehr gute Formerhaltung auch bei stark wasserhaltigem Gewebe ZIRKLEs 2,5 g Kaliumdichromat 2,5 g Ammoniumdichromat 2 g Kupfersulfat 400 ml H 2 O Gewebe h fixieren mit H 2 O waschen entwässern und einbetten gute Erhaltung von Mitochondrien, Chromatin und Spindelfasern cytologische Präparate Tabelle 2.12: Histologische Untersuchungsziele und Fixanzien Präparat / Untersuchungsziel beste Fixierung mögliche Fixierungen Aorta, Gefäße Sannomiya Lillie Maximow Blutausstrich Methanol Blutbildungsorgane Maximow Helly cytologische Präparate Helly Zenker Flemming Darm Schaffer Susa Drüsen Kaliumbichromat Fixanzien mit HgCl 2 Glykogen Lison-Vokaer Carnoy Ethanol Harnsäure 96 % Ethanol Hartgewebe (allgemein) Formol nach Lillie Formol-Calcium nach Baker Schaffersche Lösung Formol-Alkohol nach Burkhard Ethanol Hoden Carnoy Bouin Hypophyse Bouin Knochen Helly Formalin Susa Tabelle 2.12: Fortsetzung Präparat / Untersuchungsziel beste Fixierung mögliche Fixierungen Knorpel Helly Lillie Formalin Mitochondrien Flemming Zenker Formol Lillie Muskulatur Susa Muskelfixans Sannomiya Myofibrillen Sannomiya Susa Nervensystem Cajal (Brom-Phenol) Formalin Nebenniere K-bichromathaltige Fixanzien Neurofibrillen Cajal (Pyridin) Niere Orth Plasmastruktur Helly Maximow Zenker Punktate Ethanol Ether Lipide OsO 4 Ciaccio Sulfosalicylsäure Mucopolysaccharide Übersichtspräparate Formalin Bouin Zenker Schaffer

20 Präparationsmethoden Tabelle 2.13: Fixanzien für Immunmarkierungen Fixans geeignet für Konzentration und Zusammensetzung Bemerkungen Formaldehyd (FA) TEM und LM 2 4 % (w/v) frisch aus Paraformaldehyd herstellen gepuffert verwenden bei 4 C möglichst kurz fixieren Glutaraldehyd (GA) TEM und LM 0,1 1 % (v/v) nicht für alle Antigene geeignet niedrig konzentriert kombinieren mit FA möglichst kurz fixieren gepuffert verwenden nach Fixierung quenchen (1 % NaBH 4 ) Aceton (-20 C) LM 100 % geeignet für Zellmonolayer oder Schnitte bis 50 µm Dicke Formaldehyd-Ethanol- Essigsäure (FAA) Formaldehyd-Pikrinsäure LM TEM und LM TEM = Transmissionselektronenmikroskopie LM = Lichtmikroskopie 2 % FA + 0,2 % Pikrinsäure in 0,1 M PP (ph 7,3) (siehe Tabelle im Anhang) penetriert schneller als konventionelle Fixative FA frisch aus Paraformaldehyd herstellen HOPE ist abgeleitet von Hepes-Glutamic acid buffer mediated organic solvent protection effect. Bei dieser Methode wird das Untersuchungsmaterial zuerst in einer formaldehydfreien Lösung inkubiert und dann durch Acetonentwässerung konserviert. Da die HOPE Fixierung auch in der pathologischen Routine eingesetzt werden kann, ist sie eine echte Alternative zum Formaldehyd. Weitere Vorteile sind ein geringerer Verbrauch und eine bessere Verträglichkeit für den Anwender Gängige Fixanzien für die Elektronenmikroskopie Für die Elektronenmikroskopie werden normalerweise vernetzende Fixanzien verwendet, die eine gute bis sehr gute Strukturerhaltung ergeben (Tab. 2.14) Glutaraldehyd (GA) Glutaraldehyd (chemisch korrekt: Glutardialdehyd) reagiert insbesondere mit Aminogruppen. Es entstehen innerhalb von Sekunden bis Minuten irreversible Quervernetzungen der zellulären Proteine. Da bei der Reaktion Protonen frei werden, sinkt der ph-wert. Um dies zu vermeiden, wird GA in entsprechendem Puffer (zumeist Na-Cacodylat) verwendet. Üblich zur Fixierung sind Konzentrationen von 2,5 3,5 % GA allein oder 1 2 % GA in Kombination mit anderen Fixanzien. Nach der Fixierung kann das Material in 1,5 % GA für Wochen aufbewahrt werden. Niedrigere Konzentrationen (0,1 0,25 %) in Kombination mit Formaldehyd setzt man ein, um Material zu fixieren, an dem Immunmarkierungen durchgeführt werden sollen. Die Fixierung mit Glutaraldehyd bewirkt eine sehr gute Erhaltung der Feinstruktur. Sie wird normalerweise nicht für histologische Präparate verwendet. O C H CH 2 CH CH O C 2 2 H O H C H O H 2 C CH C H O O Os O O O O Ru O O O O Mn O O Glutaraldehyd Formaldehyd Acrolein Osmiumtetroxid Rutheniumrot Permanganat Abb. 2.31: Strukturformeln gängiger Fixanzien für die Elektronenmikroskopie

21 2.3 Fixierungen für Licht- und Elektronenmikroskopie 97 2 Tabelle 2.14: Fixierungsgemische für die Elektronenmikroskopie Name Zusammensetzung Anwendung Eignung Formaldehyd- Glutaraldehyd- Pikrinsäure (FGP) 1,25 % Formaldehyd 2,5 % Glutaraldehyd 0,03 % Pikrinsäure in 0,1 M Cacodylatpuffer (ph 7,2) 1. Gewebe: 1 2 h bei RT. Im Fixans in 1 2 mm große Stücke zerteilen Zellen: min bei RT 2. waschen und Postfixierung mit z. B. OsO 4 Vorfixierung für gute Ultrastrukturerhaltung Glutaraldehyd- Osmiumtetroxid 2,5 % Glutaraldehyd 1 % OsO 4 in 0,1 M Cacodylatpuffer (ph 7,2) Mischung direkt vor Gebrauch ansetzen (aus vorgekühlten Komponenten) für 1 h im Eisbad fixieren Zellkulturen (Tiere, Pflanzen) Einzeller (Protozoen) Spermidinphosphat- Glutaraldehyd 0,2 M Spermidinphosphat 0,25 M Glutaraldehyd in 0,05 M Collidinpuffer, ph 7,8 1. Zellen 10 min bei RT fixieren 2. Nachfixierung für 20 min in 2,5 % GA in 0,05 M Collidinpuffer 3. waschen in Collidinpuffer 4. Nachfixierung mit 2 % OsO 4 Erhaltung von Actinfilamenten (Hauser 1978) Osmiumtetroxid nach DALTON 25 ml 5 % (w/v) Kaliumdichromat + 25 ml 3,4 % NaCl + 50 ml H 2 O mit 1 N NaOH auf ph 7.4 einstellen 1 g OsO 4 darin lösen filtrieren Postfixierung nach Aldehydfixierung bei RT für 1 h kontrastreiche Darstellung von Mikrotubuli und akzessorischen Proteinen Osmiumtetroxid- Kaliumferrocyanid 1 % OsO 4 1,5 % Kaliumferrocyanid in H 2 O Vorfixierung mit Aldehyd und waschen 1h bei RT im Dunkeln inkubieren Nachfixierung und Kontrastierung Periodat-Lysin- Formaldehyd 1. 1,827 g DL-Lysine (Sigma L-6001) in 50 ml H 2 O lösen 2. mit 0,1 M Na 2 HPO 4 (etwa. 10 ml) auf ph 7,4 einstellen 3. mit 0,1 M NaPP auf 100 ml auffüllen Bei 4 C für ca. 2 Wochen haltbar min fixieren 2. mehrfach in NaPP waschen Immunmarkierung bei relativ guter Strukturerhaltung Rutheniumrot- Glutaraldehyd 0,1 % (w/v) Ruthenium- Rot (RR) 2,5 % (v/v) GA in 0,1 M Na-Cacodylatpuffer, ph 7,4 1. für 1 h bei RT fixieren min in Puffer waschen 3. Nachfixieren mit 1 % (w/v) OsO 4 mit 0,1 % RR in 0,1 M Na-Cacodylatpuffer, ph 7,4, für 1 h bei RT Kontrastierungsfixierung zur Darstellung von Zuckerresten (Mucopolysaccharide etc.) Tannin-Uranylacetat A: 1% (w/v) Tannin in Maleatpuffer B: 1% (w/v) Uranylacetat in Maleatpuffer alle Schritte auf Eis durchführen: min in A inkubieren 2. 2 in Maleatpuffer waschen min im Dunkeln in B inkubieren 4. 2 in Maleatpuffer waschen Nachfixierung (z. B. nach Formaldehyd) für Immunogoldmarkierung bei gutem Kontrast Zusammensetzung der Puffer: siehe Puffertabelle im Anhang RT = Raumtemperatur

22 Präparationsmethoden Formaldehyd (FA) Formaldehyd ist ein wasserlösliches Gas. In Lösung bilden sich sehr schnell Polymere, so dass die Konzentration der Formaldehydmonomere kontinuierlich sinkt. Reproduzierbare Ergebnisse erhält man daher nur, wenn frische Lösung verwendet wird. Für Enzymnachweise, Immunmarkierungen, in situ-hybridisierungen und Ultrastrukturuntersuchungen sollte man sich frische Formaldehydlösungen aus Paraformaldehyd ansetzen. Diese Lösungen sind bei 20 C ca. 6 Monate haltbar. Die monomeren Formaldehydmoleküle dringen rasch in das Gewebe ein. Die Vernetzung der Proteine erfolgt allerdings recht langsam und ist locker. Darüber hinaus ist sie reversibel; nach der Fixierung sollten die Proben daher nicht zu lange in Wasser oder Puffer verweilen. Die Ultrastrukturerhaltung nach reiner Formaldehydfixierung ist nicht besonders gut. Antigenität und Enzymaktivität vieler Proteine bleiben jedoch erhalten. Anleitung A2.38 Herstellung von 4 % Formaldehyd aus Paraformaldehyd 1. 1g Paraformaldehyd in 15 ml Wasser geben 2. auf 60 C erhitzen und rühren 3. mit einigen Tropfen 1 N NaOH Lösung klären (Tropfen einzeln hinzu geben, jeweils warten; bei ph 7 klärt sich die Lösung rasch) 4. mit H 2 O auf 25 ml auffüllen 5. abkühlen lassen 6. gegebenenfalls filtrieren (z. B. durch Faltenfilter) 7. direkt verbrauchen oder Aliquots einfrieren Formaldehyd sollte gepuffert verwendet werden, da sonst der ph-wert bei der Fixierung sinkt Fixierungsgemische mit Glutaraldehyd und Formaldehyd e aus FA und GA sind besonders geeignet für die Elektronenmikroskopie. Sie dringen gut ein und ergeben eine sehr gute Strukturerhaltung. Karnovsky (1965) empfahl eine gepufferte Mischung aus 4 % GA und 6 % FA. Diese Mischung hat eine sehr hohe Osmolarität. Für die meisten Anwendungen werden niedrigere Konzentrationen (1 2 % FA mit 1 2,5 % GA) eingesetzt. Dabei kombiniert man häufig mit 0,03 % Pikrinsäure Osmiumtetroxid Osmiumtetroxid (Osmium) reagiert mit ungesättigten Fettsäuren und Amino- und Sulphhydryl-Gruppen anderer Zellkomponenten. Damit stabilisiert es Lipide und Zellmembranen. Proteine werden durch Osmium angegriffen. Es eignet sich daher nur eingeschränkt für Präparate, an denen Immunmarkierungen oder Enzymnachweise geplant sind. Auch für Paraffineinbettungen wird es nicht empfohlen. Gepuffertes, 0,5 2 % Osmiumtetroxid wird in der Elektronenmikroskopie regelmäßig als zweites Fixans nach Fixierung mit Aldehyden eingesetzt. Für kurze Fixierungszeiten (im Eis bis 1 Stunde) kann man auch GA (1 2 %) und Osmium (1 %) als verwenden. Anleitung A2.39 Fixierung in Osmiumdämpfen Zellen können fixiert werden, indem man sie für min Osmiumdämpfen aussetzt. Man legt einige Osmiumtetroxidkristalle in eine kleine Glasschale, die man in einer größeren Glaspetrischale platziert. Die größere Schale wird als feuchte Kammer mit einem wassergetränkten Streifen Filterpapier ausgestattet. Über die Ränder der kleinen Schale legt man den Objektträger mit den Zellen nach unten ( hängender Tropfen ). Die große Schale wird mit einem Deckel geschlossen. Für die Rasterelektronenmikroskopie können Osmiumdämpfe verwendet werden, um die Leitfähigkeit stark zerklüfteter Präparate zu verbessern. Die Dämpfe lässt man dafür über mehrere Tage oder Wochen einwirken. Anleitung A2.40 Ansetzen von Osmiumlösungen Osmiumtetroxid wird zumeist in fester Form (0,25 1 g) in Glasampullen geliefert. Die Kristalle lösen sich nur langsam; die Lösung sollte daher spätestens 1 Tag vor Gebrauch angesetzt werden. Im Notfall lässt sich der Vorgang mit Hilfe von Ultraschall beschleunigen. Die Ampulle wird mit Handschuhen angefasst und zunächst gründlich mit Aceton und H 2 O von Etikettresten befreit. Man arbeitet unter dem Abzug und mit Schutzbrille und legt die Ampulle auf ein sauberes Stück Alufolie. Mit einer Ampullensäge wird das Glas angeritzt, dann in die Folie eingeschlagen und vorsichtig gebrochen. Glas und Osmiumkristalle werden in ein sauberes und gut verschließbares Glasgefäß gegeben. Mit H 2 O setzt man eine 1 4 % Stammlösung an. Das Gefäß wird im Abzug lichtgeschützt aufbewahrt, bis die Kristalle gelöst sind. Die Lösung wird dann in Reaktionsgefäße aliquotiert. Diese bewahrt man bis zu Gebrauch in einem gut verschlossenen Behälter bei 20 C auf.

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