Vergleichende Untersuchung der Zellapoptose mononukleärer Zellen aus Leukozytapheresen und Leukozyten-Reduktion-System-Kammern

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1 Vergleichende Untersuchung der Zellapoptose mononukleärer Zellen aus Leukozytapheresen und Leukozyten-Reduktion-System-Kammern Der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. med. vorgelegt von Bettina Ziehe aus Ingolstadt

2 Als Dissertation genehmigt von der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. med. Dr. h. c. J. Schüttler Gutachter: Prof. Dr. Erwin Strasser Gutachter: Prof. Dr. Reinhold Eckstein Tag der mündlichen Prüfung: 12. Januar 2015

3 In Liebe und Dankbarkeit für meine Familie und in Gedenken an meinen Vater

4 Inhaltsverzeichnis Seite 1. Zusammenfassung und Abstract Zusammenfassung Hintergrund und Ziele Methoden Ergebnisse und Beobachtungen Praktische Schlussfolgerung Summary Background and Objectives Materials and Methods Results Conclusion 4 2. Einleitung Tumorvakzinen aus mononukleären Zellen Die Rolle mononukleärer Zellen im Immunsystem Die Bedeutung des Immunsystems Funktion der Immunzellen Die Entwicklung der Immunzellen Mononukleäre Zellen und ihre Funktion Lymphozyten Monozyten und antigenpräsentierende Zellen Die Apoptose Die Bedeutung der Apoptose Die Stadien der Apoptose Nachweismethoden der Frühapoptose Veränderung des mitochondrialen Potentials Veränderung an der Plasmamembran Nachweismethoden der Spätapoptose Fragestellung Material und Methoden Materialien Geräte 14

5 4.1.2 Einmalmaterialien Lösungen und Reagenzien Antikörper Studienbeschreibung Gewinnung der Leukozytenkonzentrate Leukozytapherese mittels COM.TEC Zellseparator Thrombozytapherese mittels Trima Accel Zellseparator Aufbereitung der Aphereseprodukte Methoden Grundlagen der FACS Messung Apoptosedetektion mittels Annexin V und 7AAD Messeinstellung für die Annexin V-7AAD Methode Apoptosedetektion mittels JC 1 Markierung Messeinstellung für die JC 1 Methode Apoptosedetektion mittels Apo-BrdU Markierung Messeinstellung für die Apo-BrdU Methode Statistische Auswertung Ergebnisse Spenderdaten Daten des Aphereselaufs Produktspezifische Daten Blutzellen vor der Spende Blutzellen in den Aphereseprodukten Vergleich von Spenderdaten und Produktdaten Blutzellen vor der Spende und in LRS-Kammern Blutzellen vor der Spende und in Leukozytenkonzentraten Annexin V-7AAD-Messung von Tregs JC 1 Messung von Lymphozyten und Monozyten BrdU Messung von mononukleären Zellen Darstellung mittels unterschiedlicher Analysen Annexin V-7AAD positive Tregs JC 1 detektierte Lymphozyten und Monozyten BrdU detektierte mononukleäre Zellen Einfluss der Kurzzeitlagerung Annexin V-7AAD positive Zellen im Aphereseprodukt JC 1 markierte Zellen im Aphereseprodukt BrdU markierte Zellen im Aphereseprodukt 65

6 6.9 Biochemische Parameter in den Aphereseprodukten Glukoseverbrauch Laktatanstieg Diskussion Literaturverzeichnis Anlage 89

7 1 1. Zusammenfassung und Abstract 1.1 Zusammenfassung Hintergrund und Ziele Der Einsatz mononukleärer Zellen in Immuntherapien zur Behandlung von Krebsund Autoimmunerkrankungen hat dazu geführt, diese Zellen in hoher Ausbeute und maximaler Reinheit gewinnen zu wollen. Als Mittel der Wahl hat sich die Leukozytapherese erwiesen, doch auch den Leukozyten-Reduktion-System-Kammern, in denen Leukozyten während der Thrombozytapherese angereichert werden, kommt immer größere Bedeutung zu. Ziel dieser Arbeit war es, die Zellqualität mononukleärer Zellen aus Leukozytapheresaten und Leukozyten-Reduktion-System- Kammern mittels drei verschiedener Apoptose-Methoden während einer Kurzzeitlagerung von 48 Stunden vergleichend zu untersuchen Methoden Von zehn Spendern wurden jeweils 10 ml Blut, das bei der Leukozytapherese und aus Leukozyten-Reduktion-System-Kammern gewonnen wurde, in Beutelsysteme aus CO 2 und O 2 durchlässigem Fluorethylenpropylen Teflon überführt und gelagert. Die Messungen erfolgten innerhalb von drei Stunden nach Gewinnung, sowie nach sechs Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden Lagerung. Das Apoptoseverhalten der mononukleären Zellen wurde mittels Annexin V und 7-Aminoactinomycin D (7AAD), 5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanin Jodid (JC 1) und 5- Bromo-deoxyuridin (BrdU) analysiert. Zusätzlich wurden die biochemischen Parameter Glukose und Laktat bestimmt Ergebnisse und Beobachtungen Die Leukozytenkonzentration liegt in den LRS-Kammern signifikant höher als in den Leukozytapheresaten. Bedingt durch das höhere Produktvolumen der Leukozytapheresate weisen diese aber insgesamt mehr Leukozyten auf als die LRS- Kammern. Während in den Leukozytaphereseprodukten die Verunreinigung mit residualen Thrombozyten sehr hoch war, zeigten die LRS-Kammern eine signifikant höhere Verunreinigung mit Erythrozyten. Der Anteil apoptotischer und nekrotischer mononukleärer Zellen lag in den Leukozytapheresaten signifikant höher als in den

8 2 LRS-Kammern. In beiden Leukozytenprodukten konnte ein starker Apoptoseanstieg nach 24 Stunden nachgewiesen werden. Ebenfalls wurde eine starke Korrelation zwischen dem Anstieg an apoptotischen mononukleären Zellen und der Zunahme der Laktatkonzentration nachgewiesen Praktische Schlussfolgerungen Die Apoptose-Methoden zeigten für die LRS-Kammern eine höhere Zellviabilität als die Leukozytapheresate. Es wird vermutet, dass bei der Gewinnung mononukleärer Zellen der oxidative Stress bei der Zellanreicherung in den LRS-Kammern deutlich geringer ist als bei der Leukozytapherese. Beide Leukozytenprodukte weisen teilweise noch eine hohe Verunreinigung mit unerwünschten Blutzellen auf. Sollte eine weitere Reduktion dieser Zellen bei gleichzeitig hoher Leukozytenausbeute möglich sein, könnte dies die Zellqualität weiterhin verbessern. Ebenso spielt die metabolische Aktivität der Zellen für die Qualität eine große Rolle. So konnte ein deutlicher Zusammenhang zwischen Laktatkonzentration und der Apoptoserate nachgewiesen werden.

9 3 1.2 Summary Background and Objectives The use of mononuclear cells in immunotherapy for the treatment of cancer and autoimmune diseases has led to want to gain these cells in high yield and maximum purity. As method of choice, the leukapheresis has proven, but also the leukocyte reduction system chambers in which leukocytes are accumulated during plateletpheresis becomes more and more important. The aim of this study was to compare the quality of mononuclear cells of leukapheresis and leukocyte reduction system chambers using three different apoptosis methods during a short-term storage of 48 hours Materials and Methods 10 ml of blood of ten blood donors, which was obtained from leukapheresis products and leukocyte reduction system chambers was transferred and stored into bag systems of CO2 and O2 permeable Fluorethylenpropylen Teflon. Measurements were made within three hours after collection, and after six hours, 24 hours and 48 hours of storage. The apoptosis of the mononuclear cells was analyzed by Annexin V and 7-Aminoactinomycin D (7AAD), 5,5,6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide (JC 1) and 5-Bromo-deoxyuridine (BrdU). In addition, the biochemical parameters Glukose and lactate were measured Results The leucocyte concentration in the LRS chambers was significantly higher than in the leukapheresis products. Due to the higher product volume of leukocyte apheresis products have leukocytes were obtained from it compared to the LRS chambers. While in leukapheresis products the contamination with residual platelets was very high, LRS chambers showed a significantly higher contamination with residual red blood cells. The proportion of apoptotic and necrotic mononuclear cells was significantly higher in leukapheresis products than in the LRS chambers. In both leukocyte products a strong increase of apoptosis could be detected after 24 hours. In addition, a strong correlation between the increase of apoptotic mononuclear cells and the increase in lactate concentration could be detected.

10 Conclusion By use of three apoptosis methods leucocytes obtained from LRS chambers showed higher cell viability than for the leukapheresis products. It is assumed that in the recovery of mononuclear cells the oxidative stress in cell accumulation is in the LRS chambers significantly lower than in the leukapheresis. Both leukocyte products contain residual blood cells. If a further reduction of the residual cells should be possible without leucocyte loss, this could still improve cell quality. The metabolic activities of cells also play a major role for the quality. Thus, a significant correlation between the lactate concentration and the rate of apoptosis could be detected.

11 5 2. Einleitung 2.1 Tumorvakzinen aus mononukleären Zellen Die intensive Forschung zur Krebsbehandlung in den letzten Jahren führte dazu, dass den mononukleären Zellen heute eine bedeutende Rolle zukommt. Es wurden bereits einige Vakzinen für die Tumortherapie hergestellt, deren immunologische Grundlage auf mononukleären Zellen basieren. Nach Applikation autologer Tumorzellen oder daraus gewonnener Oligopeptide zur spezifischen Immunisierung, soll es nach Bindung an potente antigenpräsentierende Zellen wie den dendritischen Zellen zu einer T-Zell Antwort kommen [9; 60]. Im Jahr 2010 wurde in der USA Sipuleucel-T zugelassen, eine autologe therapeutische Tumorvakzine aus aktivierten mononukleären Zellen des peripheren Blutes, welche zur Behandlung des hormonresistenen Prostatakarzinoms im metastasierten Stadiums eingesetzt wird [9]. Weitere Tumorvakzinen aus mononukleären Zellen, die zur Immuntherapie bei Malignem Melanom und Nierenzellkarzinom eingesetzt werden sollen, werden derzeit in klinischen Studien erprobt. Man verspricht sich davon, dem Patienten Abwehrzellen, die in vitro mit Tumorantigenen beladen wurden zu retransfundieren, um damit das Immunsystem auf die noch nicht erkannten Krebszellen aufmerksam zu machen. Auch monoklonale Antikörper, die aus einem B-Lymphozytenklon generiert werden, werden heute in der Behandlung von Krebs und Autoimmunerkrankungen eingesetzt [9]. Daher ist es von großer Bedeutung, eine maximale Ausbeute dieser Zellen mit hoher Reinheit zu erhalten. Es gibt daher eine Reihe von Untersuchungen zu verschiedenen Zellseparatoren, die sich mit der Optimierung der Geräteeinstellung zur Verbesserung des Leukozytaphereseproduktes beschäftigen [34; 77]. Es zeigte sich, dass nicht nur im Rahmen von Leukozytapheresen eine hohe Zellausbeute an mononukleären Zellen erzielt werden kann, sondern dass eine hohe Zellkonzentration an mononukleären Zellen bei Thrombozytapheresen in den Leukozyten- Reduktion-System-Kammern (LRSC, leucoreduction system chamber) angereichert werden und somit als Leukozytenquelle zur Verfügung stehen [54]. 2.2 Die Rolle mononukleärer Zellen im Immunsystem Die Bedeutung des Immunsystems Das Immunsystem spielt eine bedeutende Rolle in der Entwicklung der Lebewesen. Die Homöostase zwischen Zellerneuerung und Zellapoptose ist dabei von entscheidender Bedeutung. Ohne Immunsystem gäbe es keine Schutzfunktion zum Erhalt

12 6 unseres körperlichen Wohlergehens. Menschen, mit schweren angeborenen oder erworbenen Immundefekten, zeigen eine hohe Anfälligkeit gegenüber pathogenen Keimen. Da das Immunsystem hier nicht in der Lage ist adäquat zu reagieren, erkranken diese Menschen an opportunistischen Infektionen, die häufig auch zum Tode führen. Der Schutz des Immunsystems beschränkt sich aber nicht nur auf körperfremde pathogene Keime, es bewahrt uns auch vor körpereigenen Prozessen, die unter Umständen tödlich verlaufen könnten. So entstehen tagtäglich im gesunden Organismus Tumorzellen, die allerdings in der Regel sofort erkannt und eliminiert werden. Ebenso besitzt unser Immunsystem Mechanismen, um uns vor autoimmunen Prozessen zu bewahren. Dies lässt darauf schließen, dass Menschen, die an Tumorerkrankungen oder Autoimmunerkrankungen leiden, eine Fehlfunktion im Immunsystem aufweisen [33] Funktion der Immunzellen Im Immunsystem besteht eine enge Beziehung zwischen zellulären und humoralen Bestandteilen sowie zu den lymphatischen Organen. Es lassen sich sowohl eine angeborene als auch eine erworbene Immunabwehr unterscheiden. Die angeborene Immunabwehr agiert innerhalb von Stunden nach Aktivierung. Die Zellen der angeborenen Immunabwehr, die Granulozyten, Natürlichen Killerzellen, Monozyten und Makrophagen erkennen mit speziellen Rezeptoren für pathogene Strukturen die krankheitsverursachende molekulare Struktur, das sogenannte PAMP der Erreger [68]. Zusätzlich werden humorale Abwehrmechanismen, wie das Komplementsystem, Lysozyme und Interferone aktiviert. Im Gegensatz zur angeborenen Abwehr muss sich die erworbene Immunabwehr erst entwickeln. Sie wird erst nach Tagen aktiv. Hierbei spielen zwei Zelltypen eine große Rolle. Die T-Lymphozyten für die zelluläre Immunantwort und die B-Lymphozyten für die humorale Immunantwort. Beide Zelltypen erkennen spezielle Proteinstrukturen, die Antigene auf Krankheitserregern. Aktivierte B-Lymphozyten produzieren nach Antigenkontakt Antikörper, während die T-Lymphozyten mittels einer Subpopulation selbst in der Lage sind die infizierte Zelle abzutöten [55].

13 7 Abb.1: Übersicht über die Abwehrmechanismen Abwehrmechanismus Angeborene Abwehr Adaptive Abwehr Unspezifische Erkennung Selektive Erkennung von von Krankheitserreger Krankheitserregern humoral zellulär humoral zellulär Komplement Granulozyten B-Lymphozyten T-Lymphozyten Interferone Makrophagen Lysozyme Natürliche Killerzellen Modifiziert nach Abb aus [55] Die Entwicklung der Immunzellen Die spezialisierten Zellen des Immunsystems entstehen im Knochenmark aus pluripotenten Stammzellen. Abb.2: Hämatopoetischer Stammbaum B-Lymphozyt Lymphoide Vorläuferzelle T-Lymphozyt Pluripotente NK-Zellen Stammzelle Megakaryozyten Thrombozyten Myeloische Vorläuferzelle Erythropoetische Erythrozyten Vorläuferzelle Eosinophile Vorläuferzelle Basophile Granulozytäre und Neutrophile Granulozyten Vorläuferzelle Monozytäre Vorläuferzelle Monozyten Eosinophile Granulozyten Basophile Granulozyten

14 8 Aus den lymphoiden Vorläuferzellen entstehen die für die erworbene Immunabwehr wichtigen T- und B-Lymphozyten sowie die Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen). Aus den myeloischen Vorläuferzellen differenzieren sich über weitere Vorläuferzellen die Granulozyten, Monozyten, Thrombozyten und Erythrozyten. Lymphozyten und Monozyten zählen zu den mononukleären Zellen, deren Bedeutung in der Tumortherapie bereits erläutert wurde. Die Hämatopoese wird über unterschiedliche Wachstumsfaktoren wie die Interleukine reguliert. Die Zufuhr dieser Faktoren ermöglicht es, die Entwicklung der differenzierten Zellen, Vorläuferzellen und Stammzellen in der Peripherie zu induzieren, um sie mittels Leukozytapherese zu gewinnen [62] Mononukleäre Zellen und ihre Funktion Lymphozyten Die Lymphozyten entstehen im Knochenmark aus Lymphoblasten. Während B- Lymphozyten im Knochenmark ausreifen, wandern T-Vorläuferzellen in den Thymus aus, wo sie durch Zytokine proliferieren. Der Proliferation der Vorläuferzellen folgt die Entwicklung von Antigenrezeptoren und anschließend die Selektion, damit körpereigene Proteine nicht angegriffen werden. Durch die Aktivierung durch antigenpräsentierende Zellen differenzieren sich aus den naiven T-Lymphozyten CD 4 positive T-Helferzellen, zytotoxische CD 8 positive T-Lymphozyten und regulatorische T- Lymphozyten. Die Helferzellen aktivieren bevorzugt zytotoxische T-Zellen und Makrophagen. Zytotoxische T-Zellen phagozytieren Krankheitserreger. Die B-Lymphozyten produzieren nach Aktivierung Antikörper und Gedächtniszellen [64]. Etwa 5-10% der CD4 positiven T-Zellen beinhalten einen Teil regulatorischer T-Zellen (Tregs), die sich entweder im Thymus ausbilden oder in der Peripherie aus naiven CD4 positiven CD25 positiven T-Zellen durch den Transkriptionsfaktor Foxp3 induziert werden [14]. Regulatorische T-Zellen (Treg) schützen durch ihren supprimierende Eigenschaft auf das Immunsystem vor autoimmunen Prozessen. Eine gestörte Immunabwehr könnte so ausufern, dass auf pathogene Keime mit einer verstärkten Entzündungsreaktion reagiert wird, woraus sich weitere Erkrankungen entwickeln könnten [44]. Deshalb verhindern die CD4 positiven CD25 positiven Tregs durch die Sekretion von Interleukin 10 und TGF β die Zytokinausschüttung von CD4 positiven und CD8 positiven T-Zellen und unterdrücken deren Proliferation [10]. Sie wirken aber nicht nur auf Zellen, die sich gegen den eigenen Körper richten. Auf natürliche Killerzellen und zytotoxische T-Zellen können sie ebenfalls einen supprimierenden Effekt haben, wodurch ein Tumorwachstum gefördert werden kann. Da-

15 9 her haben sie einen hohen Stellenwert als Verlaufsmarker in der immunmodulierenden Tumortherapie, wobei eine hohe Anzahl an regulatorischen T-Zellen eine schlechtere Prognose bedeuten kann [26]. Diverse Studien beschäftigen sich auch im Rahmen der bei Transplantationen auftretenden Graft-versus-Host-Disease mit dem Einsatz von regulatorischen T-Zellen. Die Tregs sollen die Immunantwort gegenüber den fremden Spenderantigenen unterdrücken, so dass eine lebenslange medikamentöse Immunsuppression nicht mehr erforderlich ist [31; 42; 47] Monozyten und antigenpräsentierende Zellen Monozyten sind die größten Immunzellen im Blut. Sie entstehen im Knochenmark aus Monoblasten und zirkulieren nur wenige Tage im Blut, bevor sie ins Gewebe auswandern. Ungefähr zwei bis acht Prozent der Blutzellen stellen Monozyten dar. Sie fungieren als antigenpräsentierende Zellen, betreiben Phagozytose und sezernieren Zytokine. Die in ihrer Granula enthaltenen sauren Hydrolasen und Peroxidasen sind für die intrazelluläre Fragmentierung von pathogenen Keimen notwendig. Die Erkennung der antigenen Eigenschaften erfolgt dabei über spezifische Rezeptoren. Nach Auswanderung ins Gewebe differenzieren sie sich zu Makrophagen. Auch von den Monozyten existieren mehrere Subpopulationen, deren gemeinsamer Oberflächenmarker CD 14 ist. Zu dem Monozyten-Makrophagen-System zählen auch noch andere antigenpräsentierende Zellen wie die Dendritischen Zellen, die aus Monozyten generiert werden können. Wie die Monozyten und Makrophagen sind sie auf die Aktivierung durch Zytokine aus infizierten Zellen angewiesen. Ihre Aufgabe besteht darin, körperfremde Moleküle auf zu nehmen, zu phagozytieren und anschließend die auf ihrer Oberfläche exprimierten Antigenfragmente T-Zellen zu präsentieren. Dadurch kommt es zur Proliferation der T-Zellen und letztlich zur spezifischen zellulären Immunantwort [37]. 2.3 Die Apoptose Die Bedeutung der Apoptose Die Apoptose, auch programmierter Zelltod genannt, stellt einen komplexen Mechanismus der Zelle dar kontrolliert abzusterben, um in ihrem Erbgut geschädigte Zellen gezielt zu eliminieren. Dieser Vorgang ist physiologisch und für die Gewebehomöostase von großer Bedeutung, da sich Zellproliferation und Zelltod im Gleichgewicht halten [84]. Im Gegensatz zur Nekrose, bei der die Zelle eine Schädigung

16 10 aufweist und daraufhin zugrunde geht, findet hier keine Entzündungsreaktion statt. Die Apoptose ist für die Ausbildung von Körperstrukturen wichtig und sorgt dafür, dass Zellzahl und Gewebegröße ausbalanciert bleiben [30]. Bedeutsam ist sie auch für die Eliminierung von kanzerogenen Zellen und von T-Zellen mit fehlerhafter Differenzierung oder solchen, die sich gegen körpereigene Strukturen richten [40]. Störungen dieses Prozesses begünstigen die Entstehung maligner Neoplasien, da fehlgesteuerte Zellen überleben können Die Stadien der Apoptose Eine apoptotische Zelle durchläuft verschiedene Phasen während ihres Absterbens. Zunächst kommt es durch Dehydrierung zur Schrumpfung der Zelle (2). Abb. 3: Stadien der Apoptose [64] Durch Veränderungen im Kalzium- und ph-haushalt der Zelle kommt es zur Veränderung des mitochondrialen Potentials. Die daraus resultierende Abflachung des negativen Gradienten des mitochondrialen Potentials kann durchflußzytometrisch bestimmt werden. Auf molekularer Ebene kommt es zur Chromatinkondensierung (2) mit folgender Fragmentierung des Chromatins (3). Durch die Zelldehydrierung kommt es auch zur Kondensation des Zytoplasmas und einer Umverteilung der Phospholipide an der Plasmamembran. Beendet wird der apoptotische Prozess mit der Bildung sogenannter apoptotic bodies (4), membranumhüllte kleine Restteilstücke, die letztendlich durch Phagozytose abgebaut werden [19; 33]. Sowohl die Veränderung der Plasmamembran als auch die DNA-Fragmentierung sind durchflußzytometrisch analysierbar.

17 Nachweismethoden der Frühapoptose Veränderungen der mitochondrialen Funktion Wie bereits erwähnt durchlaufen apoptotische Zellen verschiedene Stadien mit charakteristischen Veränderungen. Ein sehr früher Prozess während der Apoptose ist die Depolarisation des mitochondrialen Membranpotentials. Poren in der Außenseite der Mitochondrienmembran ermöglichen mitochondrialen Proteinen den Austritt ins Zytosol. Während der Apoptose kommt es zur Öffnung dieser Poren, so dass Protonen einem negativen Gradienten folgend ausströmen und somit eine Aufhebung der asymmetrischen Verteilung bedingen. Sichtbar wird dieser Prozess durch die Veränderung des mitochondrialen Membranpotentials. In nicht apoptotischen Zellen können durch den negativen Gradienten kationische lipophile Fluorochrome wie JC1 oder Rhodamin 123 im Mitochondrium akkumulieren. Durch die Depolarisation der Mitochondrienmembran ist die Zelle dazu allerdings nicht mehr in der Lage. Der Verlust der Akkumulationsfähigkeit ist mittels Durchflußzytometrie durch Abnahme der Fluorochromintensität nachweisbar [19; 85] Veränderungen an der Plasmamembran Relativ früh im apoptotischen Prozess transloziert Phosphatidylserin von der Innenseite der Plasmamembran auf die Außenseite. Zu Beginn bleibt die Membranintegrität noch erhalten während der Verlust der Integrität ein Zeichen für Nekrose darstellt. Proteine wie Annexin V, die eine hohe Affinität zu Phospholipiden und insbesonder Phosphatidylserin haben, eignen sich daher besonders zum Nachweis. Da der alleinige Nachweis mit Annexin V nicht beweisend für eine apoptotische Zelle ist, wird mit 7AAD (7-Amino-Actinomycin D) oder anderen Kernfärbungen gegengefärbt. 7AAD ist nur bei Verlust der Membranintegrität in der Lage zwischen Guanin und Cytosin in der DNA zu interkalieren und beweist somit einen nekrotischen Prozess. Durch Markierung von Annexin V mit Phycoerythrin (PE) oder Fluoresceinisothiocyanat (FITC) lässt sich der apoptotische Vorgang durchflußzytometrisch darstellen [19; 86] Nachweismethoden der Spätapoptose Am Ende der Apoptose kommt es durch die Endonukleaseaktivität von Effektorcaspasen zur Spaltung der DNA. Hierbei entstehen sowohl doppelsträngige, nie-

18 12 dermolekulare Fragmente als auch einzelsträngige, hochmolekulare DNA-Fragmente. Das entstehende 3`-Hydroxy-Ende dieser Fragmente kann mittels modifizierter markierter Nukleotide in einer enzymatisch katalysierten Reaktion detektiert werden. Als Enzym eignet sich TdT (terminal desoxynucleotidyl-transferase), das zu einer matrizenunabhängigen Bindung von bromierten Deoxyuridintriphosphat (BrdUTP) an das 3 -Hydroxy-Ende der Strangbrüche führt. Durch Zellfärbung mit markiertem Antikörper gegen das bromierte dutp erfolgt der Apoptosenachweis mittels Durchflußzytometer [19; 30].

19 13 3. Fragestellung Ziel der Arbeit war es, mononukleäre Zellen, die entweder durch Leukozytapherese gewonnen, oder durch Thrombozytapherese in LRS-Kammern angereichert wurden, hinsichtlich verschiedener Apoptose-Methoden, mit Annexin V/7-AAD, JC1 und BrdUTP, während einer Kurzzeitlagerung von 48 Stunden zu analysieren. Diese analytischen Methoden wurden am Durchflusszytometer durchgeführt. Zusätzlich sollte die Qualität der Zellen und biochemische Parameter miteinander vergleichen werden. Ebenso sollte der Zellverlust durch die Kurzzeitlagerung von 48 Stunden im Lagerbeutel ermittelt werden. Auf Grundlage dieser Zielstellungen ergab sich folgende Fragestellung: 1. Wie unterscheiden sich die Spenderdaten bei Leukozytapherese und Thrombozytapherese? 2. Welche Unterschiede zeigen die Leukozytenprodukte aus den jeweiligen Spendearten, Leukozyt- und Thrombozytapherese? 3. Welche Unterschiede zeigen sich in der Zellqualität hinsichtlich lebender, apoptotischer und nekrotischer Zellen, die konkret mit folgenden Methoden ermittelt wurden: a. Annexin V- und 7AAD- positive regulatorische T-Zellen b. JC1 Nachweis bei der Lymphozyten- und Monozytenpopulation c. Strangbrüche bei mononukleären Zellen mit der BrdU Methode 4. Welchen Einfluss hat die Kurzzeitlagerung auf die Zellqualität im jeweiligen Aphereseprodukt, die mit den oben genannten Methoden ermittelt wurden? 5. Welchen Aussagewert haben die einzelnen Analysemethoden? 6. Wie unterscheiden sich die beiden Aphereseprodukte im Glukoseverbrauch und in der Laktatkonzentration (biochemische Parameter) voneinander? Besteht ein Zusammenhang zwischen Apoptoserate und Laktatanstieg? Ist es vorstellbar, dass die Massenspektrometrie als zusätzliche Analysemethode für eine weitergehende Analyse spezifischer Moleküle (z.b.: Aminosäuren) während der Zelllagerung sinnvoll ist?

20 14 4. Material und Methoden 4.1 Materialien Geräte Zur Probenmessung wurde ein automatisiertes Multicolor Durchflußzytometer (FACS Calibur, BD Biosciences, Heidelberg) verwendet, welches sowohl zur Zellanalyse als auch zur Zelldifferenzierung fähig ist. Für die Datenerfassung und Datenanalyse wurde als Software Cellquest pro (BD Biosciences, Heidelberg) verwendet. Diese Software speichert formell alle Parametermessungen und Instrument Settings automatisch in einem FCS (Flow Cytometry Standard) data file auf einem Macintosh Computer ab. Die Blutbildbestimmung wurde an einem automatischen Analysiergerät (Sysmex KX-21 N, Sysmex, Norderstedt) durchgeführt, welches 17 verschiedene hämatologische Parameter aus Vollblut mit einer Durchsatzrate von 60 Proben pro Stunde bestimmen kann. Reagenzien wurden im Kühlschrank bei 4 C (Kirsch, Offenburg) oder im Tiefkühlschrank bei -70 C (Heraeus, Hanau) aufbewahrt. Die Proben für den APO-BrdU Test lagerten bis zur Messung im -30 C Tiefkühlschrank (Kirsch, Offenburg). Weiterhin wurden für die Probenaufbereitungen ein 37 C warmes Wasserbad (GFL, Burgwedel), eine Zentrifuge (Hettich, Tuttlingen) sowie eine Biofuge Fresco (Heraeus, Hanau) verwendet Einmalmaterialien Die Blutprodukte wurden in 25 ml und 7 ml Beutelsystemen (CellGenix, Gaithersburg, USA), welche aus CO 2 und O 2 durchlässigem Fluorethylenpropylen (FEP) Teflon bestehen und Gasaustausch im geschlossenen Beutel durch die FEP- Teflonfolie vollziehen, gelagert. Zur Bestimmung der Glukose- und Laktatwerte wurden 1,3 ml fassende Natrium-Fluorid Röhrchen (Sarstedt, Nümbrecht) verwendet. Für die durchflußzytometrische Messung waren 5 ml Polystyrene Round-Bottom Gefäße und Falcon Röhrchen (BD Biosciences, Heidelberg) notwendig. Ebenso kamen Eppendorf Gefäße (Eppendorf, Hamburg) zum Einsatz Lösungen und Reagenzien Zur Zelllyse wurde zehnfach konzentrierte Pharm Lyse (BD Biosciences, Heidelberg), ein Lysereagenz auf Ammoniumchlorid Basis, verwendet, die vor Gebrauch

21 15 mit Aqua dest. verdünnt wurde. Als Waschpuffer wurde PBS verwendet, der 140 mm NaCl, 2,7 mm KCl, 10 mm Na2HPO4 und 1,8 mm KH2PO4 enthält. Der JC1 Antikörper (Lyophilisat) wurde in 100% DMSO-Lösung aufgelöst und aliquotiert bei -30 C bis zu sechs Monate gelagert. Zur Zellfixierung wird 10% Formaldehyd, das in der Apotheke bezogen und verdünnt wurde. Zur Aufbewahrung der Zellen wurden diese mit 70% Ethanol fixiert. Zur Messung und Reinigung des Durchflußzytometers wurden die von BD Biosciences empfohlenen FACS Flow, FACS Rinse und FACS Clean Reagenzien verwendet. Die verwendeten Kits Annexin V Apoptosis Detection Kit I, BD Mitoscreen Kit, sowie APO-BRDU Kit wurden alle von BD Biosciences, Heidelberg bezogen [Anlage 1] Antikörper Gemäß Herstellerangaben stammt der CD 4 APC Antikörper Klon SK3 (BD Biosciences, Heidelberg) aus der Hybridisierung von Maus NS-1 Myelomzellen mit Zellen von der Milz von BALB/c Mäusen immunisiert mit menschlichen T- Lymphozyten aus dem peripheren Blut. Der CD 25 PE Antikörper Klon CE (BD Biosciences, Heidelberg) stammt ebenfalls aus der Hybridisierung von Maus NS-1 Myelomzellen mit Zellen von der Milz von BALB/c Mäusen immunisiert jedoch mit PHA-aktivierten menschlichen T-Lymphozyten. Der 7-AAD (7-Amino-Actinomycin D) Antikörper (BD Biosciences, Heidelberg) dient der DNS Färbung. 4.2 Studienbeschreibung Es wurden zehn Patienten (zwei Frauen, acht Männer) untersucht, die sowohl Monozytenspender als auch Thrombozytenspender sind. Der Zeitraum der Messungen erstreckte sich von Januar 2011 bis Juli Für die Studie wurden mononukleäre Zellen aus Leukozytenkonzentraten analysiert, welche durch Leukapherese gewonnen wurden. Als Zellseparator wurde COM.TEC (Fresenius, Bad Homburg) eingesetzt. Jeweils 10 ml des Konzentrates wurden steril in 25 ml Beutelsysteme abgefüllt. Von denselben Spendern wurden auch LRS-Kammern, die bei der Separation von Thrombozytenkonzentraten als Nebenprodukt entstanden sind, hinsichtlich der mononukleären Zellen untersucht. Für die Thrombozytapherese wurde der Zellseparator Trima Accel verwendet. Die Abfüllung des Inhalts der LRS-Kammern von 10 ml erfolgte in jeweils zwei 7 ml Beutelsysteme. Die Proben wurden von den Blutspendern der Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen Abteilung der Uni-

22 16 versität Erlangen zur Verfügung gestellt. Die Probanden waren über die Studie aufgeklärt und mit der Untersuchung der Blutproben einverstanden. Die Probandenaufklärung ist Bestandteil des Ethikvotums Nr vom 9.Mai 2006 mit dem Titel Evaluierung von Testsystemen für die Apoptosemessung von mononukleären Zellen in gelagerten Leukozytenkonzentraten Gewinnung der Leukozytenkonzentrate Leukozytapherese mittels COM.TEC Zellseparator Die Leukozytapherese wurde mit dem COM.TEC Zellseparator (Fresenius Hemocare GmbH) mit dem Programm automnc durchgeführt. Ein Zweinadel-Verfahren ermöglicht die kontinuierliche Blutentnahme aus dem arteriellen Schenkel und Blutrückführung über den venösen Schenkel des Apheresesets. Nachdem das ACD-A zu Vollblut (Acid citrate dextrose Formula A) im Verhältnis eins zu zehn eingestellt wurde, erfolgt die Auftrennung in thrombozytenreiches Plasma und Blutzellen in der PL1-Separationskammer mittels Differentialzentrifugation bei einer Zentrifugendrehzahl von 1500 Umdrehungen pro Minute. Die Auftrennung der Blutzellen ist durch unterschiedliche Größen-, Dichte- und Sedimentationseigenschaften der Zellen möglich [17]. In der sogenannten Sammelphase und in der Verdichtungsphase ist eine automatische Trenngrenzenregelung aktiv. Als Trenngrenzenregler fungieren acht optische Ports, die die Phasengrenze zwischen thrombozytenreichem Plasma und Zellphase der Leukozyten und Erythrozyten konstant bei einem Wert von sieben zu eins halten. Dadurch wird die Stabilität der abzusammelnden Zellschicht in der sogenannten Sammelphase gewährleistet. Aufrechterhalten wird dieser Wert durch eine Software-kontrollierte Plasmapumpe. Sieben optische Ports registrieren dabei die Zellphase, während der achte Port das thrombozytenreiche Plasma erfasst. In den nachfolgenden Phasen (Spillover-Phase und Buffy-Coat-Phase) ist die Trenngrenzenregelung deaktiviert. Der Blutfluss beträgt hier 15 ml pro Minute im Gegensatz zur Sammelphase mit 50 ml pro Minute. Die Plasmapumpe ermöglicht die Retransfusion des Plasmas zusammen mit dem Restblut an den Spender. Währenddessen entsteht in der Separationskammer zwischen der Erythrozyten- und Plasmaschicht der sogenannte Buffy Coat, der die Leukozyten beinhaltet. Unter einer reduzierten Blutflussrate von 15 ml pro min wird der Buffy Coat in der Separationskammer verdichtet. Anschließend erfolgt der Transport des Buffy Coats mittels Plasma- und Zellenpumpe in einen Produktbeutel. Nach Abschluss der Zellapherese werden aus diesem Buffy Coat mononukleäre Zellen isoliert. Beim automnc

23 17 Programm arbeitet die Plasmapumpe mit einem optischen Sensor, dem sogenannten Spillover-Sensor, der die durch das thrombozytenreiche Plasma entstehende Trübung, misst. Durch diesen Sensor, der eine Spillover-Klemme kontrolliert, wird automatisch das Spillover-Volumen, das Volumen, das von der Plasmapumpe benötigt wird, um den Buffy Coat aus der Separationskammer zu befördern, kontrolliert. Nach Erreichen der voreingestellten 15 Sammelzyklen wird die Zellapherese nach Rückführung des Restblutes an den Spender automatisch beendet [77; 79] Thrombozytapherese mittels Trima Accel Zellseparator Die Gewinnung von Leukozyten aus LRS-Kammern erfolgte im Rahmen der Thrombozytenherstellung mit dem Trima Accel Zellseparator (Gambro BCT, Lakewood, USA). Diese Leukozytengewinnung aus LRS-Kammern gelingt nur mit Hilfe des Trima Accel Zellseparators, da gezeigt werden konnte, dass die LRS-Kammern der Cobe Spectra nur einen verschwindend geringen Anteil an Leukozyten enthalten [78]. Bei dem verwendeten Zellseparator erfolgt die Blutentnahme und Blutrückgabe mittels Ein-Nadel-System. Die Separation der Erythrozyten, Leukozyten, Thrombozyten und des Plasmas nach spezifischem Gewicht erfolgt ebenfalls durch Zentrifugation. Die Erythrozyten werden durch den kontinuierlichen Blutfluss wieder aus der Separationskammer befördert. Innerhalb der Zentrifuge befindet sich die konisch geformte ungefähr 10 ml fassende LRS-Kammer, in der sich die Trennung von Thrombozyten und Leukozyten vollzieht. Die LRS-Kammer dient hierbei der Abreicherung der Leukozyten im Thrombozytenprodukt. Die Leukozyten verbleiben in der Kammer, da sie über eine höhere Dichte als die Thrombozyten verfügen, während die Thrombozyten in den Beutel für das Thrombozytenkonzentrat abgesammelt werden. Das technische Prinzip hierbei beruht darauf, dass die Restleukozyten bei der Thrombozytenseparation in dieser Kammer mittels Flußbettfiltration abgefangen werden. Der überwiegende Anteil der in der Kammer verbleibenden Zellen sind mononukleäre Zellen [54]. Im Vergleich zur Leukozytapherese verbleibt in den LRS- Kammern nur ein kleiner Teil der Leukozyten, während der Großteil dieser Zellen dem Spender wieder zugeführt wird. Wie hoch die Ausbeute an mononukleären Zellen ausfällt, hängt von den Separatoreinstellungen wie Zitratbeimengung zur Antikoagulation und Blutflussgeschwindigkeit und der Verfahrensdauer ab [13; 54]. Da die Zellen der LRS-Kammer als Nebenprodukt bei der Thrombozytapherese gewonnen werden, unterscheidet sich vor allem ihr Volumenanteil von dem der Leukozytenkonzentrate, während die Zellkonzentration pro Volumeneinheit teilweise sogar höher liegt [78].

24 Aufbereitung der Aphereseprodukte Zur Bestimmung der Leukozytenzahl wurde das Blutbild an einem Sysmex Analysengerät bestimmt. Vor der durchflußzytometrischen Messung wurden sowohl die Leukozytenkonzentrate als auch das LRS-Kammern Material auf Leukozyten pro µl Blut eingestellt, wobei die Verdünnung mit PBS erfolgte. Die Lagerung der abgefüllten Beutelsysteme erfolgte bei Raumtemperatur zwischen 22 C und 26 C. Jedes Konzentrat und LRS-Kammern Material wurde in einem Zeitraum von drei, sechs, 24 und 48 Stunden nach Gewinnung am FACS gemessen. Zur jeweils ersten Messung aus dem Leukozytenkonzentrat wurde parallel ein vom Spender stammendes EDTA-Blutröhrchen, welches vor der Leukozytenspende gewonnen wurde, untersucht. Zusätzlich wurde das EDTA-Blut zusammen mit dem Konzentrat hinsichtlich des Gehalts an Leukozyten, CD14 positiven Monozyten, Erythrozyten, Thrombozyten und des Hämatokrits analysiert. Der Leukozytenanteil sowohl in den Leukozytenkonzentraten als auch im EDTA-Blut wurde auf 100% gesetzt. Da die CD14 positiven Zellen eine Subpopulation der Leukozyten sind, wurden sie als prozentualer Anteil bezogen auf die Leukozyten angegeben. Die Leukozytenzahlen vor der Spende aller Probanden lagen im für die Spende erlaubten Bereich zwischen 3000 und Leukozyten pro µl, so dass eine Verdünnung des EDTA-Blutes nicht notwendig war. Jedes verwendete Untersuchungsmaterial wurde nach demselben Protokoll aufbereitet und analysiert. Zur Bestimmung der biochemischen Parameter Glukose und Laktat wurden zu Beginn einer jeden Messung aus den unverdünnten Untersuchungsmaterialien 500 µl Blut in ein Natriumfluorid Röhrchen pipettiert. Die Fluoridröhrchen wurden bei 3800xg für 10 min zentrifugiert und das Plasma bis zum Ende einer Messreihe, längstens bis zu zwei Wochen bei minus 70 C eingefroren. Anschließend erfolgte der Transport zur Kinderklinik der Universität Erlangen, die die Bestimmung der Glukose- und Laktatwerte durchführten. 4.3 Methoden Grundlagen der FACS Messung Die Abkürzung FACS steht für Fluorescence Analysing Cell Sorting. Das Durchflußzytometer besteht aus einem Flüssigkeitssystem zum Transport und Fokussierung der Zellen, sowie einer Optik zur Detektierung der Lichtsignale und Elektronik, wobei die optischen in elektronische Signale umgewandelt werden. Die Durchflußzytometrie am FACS Gerät ermöglicht es Zellen quantitativ anhand ihrer Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaften zu analysieren. Die Methode beruht auf der Messung

25 19 und Analyse von Signalen, die dadurch zustande kommen, dass Zellen in einer Suspension, die eine Glaskapillare durchströmen, einen Laser passieren. Das Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter FSC) steht in Relation zur Beugung des Lichts, wodurch die Zellen nach ihrer relativen Größe differenziert werden können. Das Vorwärtsstreulicht wird entlang der Achse des einfallenden Lichtes gemessen. Abb. 4: Darstellung der Vorwärtsstreulichtmessung Große Zellen erzeugen ein großes Vorwärtsstreulichtsignal Laserstrahl Vorwärtsstreulichtdetektor Probenfluß Das Seitwärtsstreulicht (Sidewards Scatter SSC) korreliert mit der Brechung und Reflexion des Lichts und differenziert dadurch die Zellen anhand ihrer relativen Granularität oder internen Komplexität. Es wird in einem 90 -Winkel zum einfallenden Licht gemessen. Dabei gilt je größer eine Zelle ist, desto stärker ist das Signal des Vorwärtsstreulichts bzw. je granulierter eine Zelle, desto größer das Seitwärtsstreulichtsignal [8].

26 20 Abb. 5: Darstellung der Seitwärtsstreulichtmessung Seitwärtsstreulichtdetektor Laserstrahl Granulierte Zellen erzeugen ein großes Seitwärtsstreulichtsignal Probenfluß Die Markierung der Zellen mit Fluoreszenzmolekül gekoppelten Antikörpern ermöglicht eine weitere Differenzierung. Als Fluoreszenzmoleküle werden häufig FITC (Fluoreszein-Isothiocyanat), welches grün fluoresziert und Phycoerythrin (PE), welches gelbrot fluoresziert, verwendet. Die am Durchflußzytometer ermittelten Daten werden graphisch als Dot Plot dargestellt. Das sog. Gaten, die Eingrenzung der Zellpopulation, ermöglicht es spezielle Zellpopulationen einer genaueren Betrachtung zu unterziehen. Abb. 6: Beispiel für einen Dot Plot (rot: Lymphozyten; grün: Monozyten; schwarz: Granulozyten)

27 Apoptosedetektion mittels Annexin V und 7-AAD Mit der Annexin V Färbung, welches bevorzugt an negativ geladene Phospholipide wie Phosphatidylserin bindet, kann eine Frühphase der Apoptose aufgezeigt werden [24; 40]. Konjugiert mit dem Fluoreszenzmolekül PE oder FITC kann es als sensitiver Apoptosemarker durchflußzytometrisch nachgewiesen werden. Die Plasmamembran in lebenden Zellen zeigt eine asymmetrische Phospholipid Verteilung. Phosphatidylcholin und Sphingomyelin befinden sich auf der Außenseite während Phosphatidylserin auf der Innenseite lokalisiert ist. Durch Verlust dieser Asymmetrie wird das Phosphytidylserin nach außen transloziert, so dass das Annexin V daran binden kann. Eine Differenzierung zu nekrotischen Zellen ist durch die Verknüpfung der Annexin V Färbung mit dem kationischen Farbstoff 7-Amino-Actinomycin-D (7AAD) möglich, da 7AAD nur in die Zelle dringen kann, wenn die Zellintegrität verloren geht [19]. 7-AAD weist spezifisch DNA nach, so dass es in Zellen mit noch intakter Plasmamembran nicht eindringen kann. Demnach zeigen sich apoptotische Zellen Annexin V positiv und 7AAD negativ, während nekrotische Zellen Annexin V positiv und 7AAD positiv sind [84]. Gegenstand der vorliegenden Untersuchungsreihe war der Apoptosenachweis in regulatorischen T-Zellen (Tregs), weshalb initial die Leukozytenkonzentrate mit CD4 und CD25 Antikörpern versetzt wurden, um zwischen CD4 positiven CD25 positiven Tregs und CD4 positiven CD25 negativen Tregs differenzieren zu können. Die prozentualen Anteile an CD25 positiven und negativen Zellen in den beiden unterschiedlichen Leukozytenprodukten beziehen sich auf den Anteil an T-Helferzellen. Das heißt der T-Helferzellenanteil wurde 100% gleichgesetzt. Davon wird der prozentuale Anteil an CD4 und CD25 positiven T-Zellen angegeben, während der prozentuale Anteil an CD4 positiven und CD25 negativen T-Zellen sich aus der Differenz zu 100% errechnet. Zunächst werden 50 µl des Leukozytenkonzentrats mit 10 µl CD25 PE und 2,5 µl CD4 APC versetzt und eine Viertelstunde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Das Leukozytenkonzentrat wurde zuvor mit PBS auf Leukozyten pro µl Blut verdünnt. Anschließend erfolgt die zehnminütige Zelllyse mit 2 ml Pharm Lyse (BD Biosciences) im Dunkeln. Vor Verwendung wird eine einfachkonzentrierte Pharm Lyse mit Aqua dest. hergestellt. Nach Zentrifugation (5 min, 500 x g, 20 C) wird der Überstand verworfen, das Zellpellet mit 2 ml PBS gewaschen und wiederum zentrifugiert (5 min, 500 x g, 20 C), mit anschließendem Dekantieren des Überstandes. Es folgt die Apoptosefärbung mit 2,5 µl FITC Annexin V, 10 µl 7-AAD und 100 µl Annexin Puffer. Der zehnfach konzentrierte Puffer muss vor Gebrauch mit Aqua dest. zu einem einfach konzentrierten Puffer verdünnt werden. Es wird

28 22 eine Viertelstunde bei Raumtemperatur unter Lichtabschluss inkubiert. Nach anschließendem Zufügen von 400 µl einfachkonzentrierten Annexin Puffer wird die Färbereaktion gestoppt, so dass die Probe durchflußzytometrisch gemessen werden kann Messeinstellung für die Annexin V/ 7-AAD Methode Zur optimalen Darstellung der einzelnen Zellpopulationen waren einige Einstellungen am FACS Gerät notwendig. AMPS definiert die Spannungs- und Verstärkereinstellungen, welche sowohl vom FACS Typ als auch von der Art der Zellen und Probenvorbereitung abhängig sind. Um die Lymphozyten optimal zwischen 400 und 600 im Dot Plot darzustellen, so dass auch die Monozyten- und Granulozytenpopulation noch gut sichtbar sind, wurde AMPS im Vorwärtsscatter (FSC) auf 1,0 gestellt. Im Seitwärtsscatter (SSC) wurden die Lymphozyten ebenfalls zur optimalen Darstellung so eingestellt, dass sie im Bereich zwischen 100 und 200 liegen. Dies wurde durch eine Voltageeinstellung im SSC Parameter auf 389 erreicht. Die Fluoreszenzintensitäten von Annexin V (FL-1) wurden in der Spannungseinstellung auf 638, von CD25 PE (FL-2) auf 692, von 7AAD (FL-3) auf 813 und CD4 APC (FL-4) auf 675 eingestellt (siehe Tab. 1). Tab.1: Darstellung der Instrumenteinstellungen ( Instrument-Settings ) Parameter Voltage AMPS Mode FSC E Lin SSC Lin FL Log FL Log FL Log FL1-A 1.00 Lin FL Log Da mehr als eine Fluoreszenz simultan gemessen wird, ist auch eine Einstellung der Kompensation erforderlich, um eine spektrale Überlappung auszugleichen. Die Fluoreszenzintensität wird mit FL abgekürzt.

29 23 Eingestellte Kompensation: Tab.2: Darstellung der Compensation FL1 FL2 FL2 FL3 FL3 FL4 3.1% FL2 16.1% FL1 6.0% FL3 20.0% FL2 4.5% FL4 3.7% FL3 Zum besseren Vergleich der Ergebnisse wurden pro Messung kernhaltige Zellen (Leukozyten) gemäß FSC-SSC-Blot gezählt. Sowohl das Messfile als auch das Auswertefile wurde von der Firma BD Biosciences eingerichtet. Die Werte für T- Helferzellen und apoptotische Zellen wurden prozentual angegeben. Zellen, die sich in der Frühphase der Apoptose befinden, stellen sich Annexin V positiv und 7-AAD negativ dar. Apoptotische Zellen oder bereits tote Zellen sind sowohl Annexin V als auch 7-AAD positiv. Abb. 7: Beispiel Dot Plot Leukozytenkonzentrat Erläuterung zur Abbildung: Unten links: lebende Zellen, unten rechts: apoptotische Zellen, oben rechts: nekrotische Zellen

30 Fluoreszenzsignal Apoptosedetektion mittels JC-1 Markierung Das Fluorochrom JC 1 ist ein lipophiles kationisches Fluorochrom, welches fähig ist in Zellen zu penetrieren und durch seine Fluoreszenz das mitochondriale Potential darzustellen. JC 1 liegt abhängig vom mitochondrialen Potential in zwei unterschiedlichen Zustandsformen vor. Als Monomer oder Aggregat, die ein unterschiedliches Emissionsspektrum aufweisen. Abb.8: Emissionsspektrum von JC1 bei Bestrahlung mit Licht von einer Wellenlänge von 488nm Wellenlänge (nm) Die Monomere emittieren Licht bei einer Wellenlänge von 527 nm (grüner Spektralbereich), die Aggregate bei einer Wellenlänge von 590 nm (roter Spektralbereich). JC1 dringt als Monomer in die Plasmamembran ein. Die Aufnahme in die Mitochondrien ist Potential abhängig. Das Fluorochrom JC1 ist in der Lage in Zellen mit polarisiertem mitochondrialem Potential einzudringen und dort sogenannte J-Aggregate zu bilden, die rot fluoreszieren. Im apoptotischen Prozess kommt es zur Depolarisation, so dass das mitochondriale Potential zusammenbricht. Das JC1 ist nicht mehr zur Aggregatbildung befähigt und verbleibt als Monomer im Zytosol, welches sich in einer Zunahme des grünen Fluoreszenzsignals zeigt [2; 43; 58]. Allerdings führen nicht nur apoptotische Prozesse zur Depolarisation der Mitochondrienmembran [15; 16]. Das lyophilisierte JC 1 muss vor der Benutzung mit 125 µl hundertprozentigem DMSO aufgelöst werden. Es erfolgte eine Aliquotierung zu je 20 µl und Aufbewahrung bei -30 C. Der zehnprozentige Assay Puffer wird zusammen mit Aqua dest. im Wasserbad auf 37 C erwärmt. Vor Benutzung muss der Assay Puffer mit dem Aqua dest. zu einem einfach konzentrierten Assay Puffer verdünnt werden. Auch hier muss das Leukozytenkonzentrat mit PBS auf Leukozyten pro µl Blut einge-

31 25 stellt werden.100 µl verdünntes Konzentrat werden mit 2 ml Pharm Lyse 10 min bei Raumtemperatur zum Lysieren der Erythrozyten inkubiert. Anschließend wird zentrifugiert (400 x g, 5 min, 20 C) und das durch dekantieren des Überstandes erhaltene Zellpellet mit 2 ml PBS gewaschen. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt und Dekantieren wird das Pellet mit 20 µl CD4 Antikörper resuspendiert und für 15 min bei Raumtemperatur unter Lichtabschluss inkubiert. Es erfolgt eine Zugabe von 1 ml PBS gefolgt von einer weiteren Zentrifugation. Anschließend wird eine einfach konzentrierte JC 1 Arbeitslösung hergestellt, indem das in DMSO gelöste JC 1 mit dem hergestellten Assay Puffer verdünnt wird. Für eine Probe werden 5 µl gelöstes JC 1 und 495 µl einfach konzentrierter Assay Puffer benötigt, die zusammen in ein Eppendorf Gefäß pipettiert werden. Die Arbeitslösung wird dann in einer Microfuge zentrifugiert (13000 x g, 3 min, 20 C). Verwendet wird nur der Überstand. Das Zellpellet wird mit 500 µl Überstand der JC 1 Arbeitslösung resuspendiert und im 37 C warmen Wasserbad 15 min inkubiert. Nach Zugabe von 2 ml verdünntem Assay Puffer erfolgt ein Zentrifugationsschritt (400 x g, 5 min, 20 C) und Verwerfung des Überstandes. Es erfolgt noch ein Waschschritt mit 1ml verdünntem Assay Puffer und Zentrifugation. Anschließend wird das Pellet mit 500 µl verdünntem Assay Puffer gut resuspendiert und am Durchflußzytometer gemessen Messeinstellung für die JC 1 Methode Auch hier waren zur optimalen Ergebnisdarstellung Einstellungen am FACS Gerät notwendig. Unter anderem wurden die Verstärkereinstellungen (AMPS) für den Vorwärtsscatter wie bereits bei der Annexin V/ 7AAD Messung auf 1,0 gesetzt, um die Lymphozytenpopulation optimal im Dot Plot darzustellen. FL-2 (JC 1 orange) wurde auf 530 gesetzt, damit die Population der lebenden Zellen noch gut sichtbar ist und gleichzeitig die apoptotischen Zellen, die eine geringere orange Fluoreszenz aufweisen, gut detektieren zu können. Tab.3: Eingestellte Instrument Settings der JC1 Messung Parameter Voltage AMPS Mode FSC E Lin SSC Lin FL Log FL Log FL Log FL1-A 1.00 Lin FL Log

32 26 Die JC 1 Messung benötigte auch eine Änderung der Treshold Einstellungen im FSC-H Parameter auf 150. Treshold definiert den Schwellenwert, eine untere Signalgrenze, die vom entsprechenden Signal der Zelle überschritten werden muss, damit die Zelldaten dargestellt werden können. Tab.4: Treshold Einstellungen der JC1 Messung Prim.Param. Sec.Param. 150 FSC-H FSC-H 52 SSC-H SSC-H 52 FL 1-H FL 1-H 52 FL 2-H FL 2-H 52 FL 3-H FL 3-H 52 FL 4-H JC 1 Monomer emittiert bei 527 nm, nach Anregung bei 490 nm. Die Aggregate emittieren bei 590 nm. Das Fluoreszenzspektrum beider JC 1 Zustandsformen liegt im grünen Farbskalenbereich, der im FL-1 Kanal des Durchflußzytometers gemessen wird. J-Aggregate bewirken eine reversible Verschiebung des Farbspektrums von grün nach orange, die im FL-2 Kanal gemessen wird. Monomere sind nicht in der Lage diese orange Fluoreszenz zu zeigen. Das Fluoreszenzsignal im FL-2 Kanal ist deshalb sehr gering. Da sich die Aggregate nur bilden, wenn die Mitochondrienmembran polarisiert ist, kommt es bei Depolarisation zur Umwandlung in Monomere. Da die Depolarisation mit dem Apoptoseprozess in Verbindung steht, nimmt in apoptotischen Zellen die orange Fluoreszenz ab. Zum Vergleich der Leukozytenkonzentrate wurden pro Messung Ereignisse gezählt.

33 27 Abb. 9: JC1 Darstellung von T-Helferzellen Abb. 10: JC1 Darstellung von Monozyten Apoptosedetektion mittels Apo-BrdU Markierung Die DNA-Strangbruch Markierung mittels BrdU (5-Bromo-2 -deoxyuridin), die sogenannte TUNEL-Methode, stellt ein weiteres Verfahren zur Apoptosedetektion dar. Am Ende des apoptotischen Prozesses kommt es durch die Aktivität von Nukleasen zur Fragmentierung der DNA [1]. Das hierbei entstehende 3 -Hydroxyl-Ende der DNA kann indirekt durch die Kopplung eines Fluorochroms identifiziert werden. Das 3 -Hydroxyl-Ende dient als Primer für die durch das Enzym terminale Deoxynukleotidyltransferase (TdT) katalysierte Bindung des Thymidin-Analogons BrdUTP (bromolated deoxyuridine triphosphat) an das 3 -Hydroxyl Ende der Doppel- und Einzel-

34 28 strang-dna. Diese Bindung kann durch einen Anti-BrdU Antikörper, der mit dem Fluorochrom FITC (Fluoreszein Isothiocyanat) gekoppelt ist, kenntlich gemacht werden [18]. Voraussetzung ist eine Fixierung der fragmentierten DNA mit Formaldehyd und die Erhöhung der Zellpermeabilität mittels Ethanol. Wieder wird zu Beginn das Leukozytenkonzentrat auf Leukozyten pro µl Blut verdünnt. In einem ersten Schritt erfolgt die Fixierung der Zellen. Zu 300 µl Leukozytenkonzentrat wird 3 ml Pharm Lyse gegeben, um die Erythrozyten zu lysieren. Nach einer zehnminütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird zentrifugiert (500 x g, 5 min, 20 C) und der Überstand verworfen. Es erfolgt ein Waschschritt mit 5 ml PBS und anschließender Zentrifugation. Die zehnprozentige Formaldehydlösung wird mit PBS verdünnt, um eine einprozentige Lösung zu erhalten. Vor Zugabe von 1 ml Formaldehydlösung (1%) muss das durch Zentrifugation erhaltene Zellpellet gut gevortext werden. Inkubiert wird für 30 min auf einem Eisblock im 4 C Kühlschrank. Anschließend wird zentrifugiert (500 x g, 5 min, 20 C) und der Überstand verworfen. Das Zellpellet wird mit 5 ml PBS gewaschen und noch einmal zentrifugiert. Dann erfolgt das Aufträufeln von 1 ml kalten 70% Ethanol, wobei bereits vor und während des Aufträufelns das Pellet gut gevortext werden muss. Die Proben werden so bei -20 C aufbewahrt und gesammelt. Im zweiten Schritt erfolgt die Markierung und Färbung der Zellen. Die gesammelten Proben werden zusammen mit jeweils 1 ml der positiven und negativen Kontrollzellen zentrifugiert (300 x g, 5 min, 20 C) und der Überstand zur Ethanolentfernung abpipettiert. Das Pellet wird anschließend mit 1 ml Wash Buffer resuspendiert und wieder zentrifugiert. Dieser Waschschritt wird ein zweites Mal durchgeführt. Dabei kann der Überstand durch Dekantieren entfernt werden. Jedes Zellpellet wird mit 50 µl DNA Labeling Solution resuspendiert und für 60 min im 37 C warmen Wasserbad inkubiert. Die DNA Labeling Solution für eine Probe enthält 10 µl Reaction Buffer, 0,75 µl TdT Enzyme, 8 µl Brd-UTP und 32,25 µl Aqua dest. Alle 15 min werden die Zellen im Wasserbad kurz aufgeschüttelt. Am Ende der Inkubationszeit wird jeder Probe 1 ml Rinse Buffer zugefügt und zentrifugiert. Der Überstand wird abpipettiert und das Pellet wiederum mit 1 ml Rinse Buffer resuspendiert. Anschließend muss noch einmal zentrifugiert und der Überstand abpipettiert werden. Das Zellpellet wird jetzt in 0,1 ml Antibody Staining Solution aufgenommen und 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Antibody Staining Solution besteht pro Probe aus 5 µl FITC-labeled Anti-BrdU und 95 µl Rinsing Buffer. Anschließend wird jeder Probe 500 µl PI/RNase Staining Buffer zugefügt, 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert und gemessen.

35 Messeinstellung für die Apo-BrdU Sowohl für die Kontrollzellen, als auch für die Leukozytenkonzentrate bzw. LRSC Proben und die vor der Leukozytapherese gewonnene EDTA-Blut Probe waren unterschiedliche Einstellungen am FACS Gerät nötig. Tab.5: Eingestellte Instrument Settings der Apo-BrdU Messung von Kontrollzellen Parameter Voltage AMPS Mode FSC E Lin SSC Lin FL Log FL Log FL Lin FL2-A 1.00 Lin FL2-W 7.04 Lin Die Kontrollzellen benötigten zur guten Darstellung eine Verstärkereinstellung im FSC Parameter auf 7,21. FL2-W wurde auf 7,04 gestellt, um die Zellen in den Bereich zwischen 150 und 250 bestmöglich darzustellen. Dadurch können die Zellen so gegatet werden, dass nur nicht verklumpte Zellen und keine DNA- Dupletten erfasst werden. Abb. 11: Nicht verklumpte Zellen werden gegatet Apoptotische Zellen weisen ein hohes FITC Fluoreszenzsignal auf und lebende Zellen kaum.

36 30 Abb. 12: Gate R1 zeigt lebende Zellen, Gate R2 apoptotische Zellen Für die Leukozytenkonzentrate reichte eine Verstärkereinstellung des FSC Parameters auf 1,33, um die Zellen optimal darzustellen. FL-2 wurde wie bei den Kontrollzellen auf 7,04 eingestellt. Tab.6: Eingestellte Instrument Settings von Leukozytenkonzentraten Parameter Voltage AMPS Mode FSC E Lin SSC Lin FL Log FL Log FL Lin FL2-A 1.00 Lin FL2-W 7.04 Lin Von den Kontrollzellen wurden jeweils 5000 Ereignisse, von den Leukozytenkonzentraten jeweils Ereignisse gezählt. Die Ergebnisdarstellung der Lymphozyten und Monozyten erfolgte sowohl im Dot Plot als auch im Histogramm.

37 31 Abb. 13: Dot Plot Darstellung eines Leukozytenkonzentrates Gate R1 lebende Zellen im Leukozytenkonzentrat, Gate R2 apoptotische Zellen im Konzentrat Abb.14: Histogramm eines Leukozytenkonzentrates M1: lebende Zellen; M2: apoptotische Zellen

38 32 5. Statistische Auswertung Zur Auswertung der Daten wurde das Statistikprogramm SPSS Version 19 für Windows benutzt. Zunächst wurden mittels deskriptiver Analyse die Mittelwerte und Standardabweichungen der einzelnen Datensätze errechnet. Anschließend folgte die Überprüfung der Daten auf Normalverteilung. Da eine kleine Spenderfallzahl (n kleiner 50) vorlag, wurde zur Prüfung auf Normalverteilung der Shapiro-Wilks-Test angewandt. Kam es zu einer Abweichung von der Normalverteilung mit einem Signifikanzniveau von über 5%, d.h. der p-wert ist kleiner als 0,05, lag keine Normalverteilung der Werte vor. Anschließend wurden die Daten, je nachdem ob Normalverteilung vorlag oder nicht, mit unterschiedlichen nicht-parametrischen Tests statistisch ausgewertet. Um die Mittelwerte zweier unterschiedlicher Stichproben zu vergleichen, kam bei Normalverteilung der T-Test für zwei unabhängige Stichproben zur Anwendung. Lag keine Normalverteilung vor, wurde der U-Test nach Wilcoxon- Mann-Whitney für zwei unabhängige Stichproben verwendet. Signifikante Unterschiede wurden bei p-werten kleiner als 0,05 und hochsignifikante Unterschiede bei p-werten kleiner als 0,01 angenommen. Die statistische Auswertung erforderte auch den Vergleich mehrerer Messzeitpunkte bei denselben Probanden. Auch hier wurde zuerst auf Normalverteilung mit dem Shapiro-Wilks-Test geprüft. Bei Normalverteilung wurde zum Mittelwertvergleich die einfaktorielle Varianzanalyse mit Messwiederholung für abhängige Werte verwendet. Dieser Test zeigt auf, ob sich Mittelwerte einer Gruppe im Laufe der Zeit verändern. Die Verwendung der Varianzanalyse mit Messwiederholung setzt Sphärizität voraus. Unter Spärizität versteht man die Homogenität der Varianzen der einzelnen Messzeitpunkte und Homogenität der Kovarianzen der Zusammenhänge zwischen den Messzeitpunkten. Dies wird mit dem Mauchly Test überprüft. Der Mauchly Test wird unter der Annahme durchgeführt, dass die Varianz der Messzeitpunkte gleich ist und die Kovarianz einen Wert von 0 aufweist. Bei einem nichtsignifikanten p-wert von 0,05, kann diese Annahme beibehalten werden. Der Mauchly Test auf Sphärizität hat bei einer kleinen Fallzahl nur eine begrenzte Aussagekraft, da die Sphärizität verletzt werden kann ohne signifikante Werte anzuzeigen. Im Gegensatz dazu zeigt er bei großen Fallzahlen oft signifikante Werte auf, obwohl die Sphärizität nicht verletzt wurde. Um eine möglichst genaue Auswertung zu erhalten und da es sich um eine kleine Fallzahl handelte, wurde deshalb der Signifikanzwert im Test auf Innersubjekteffekte immer unter Annahme der Greenhouse-Geisser Korrektur angegeben. Unter Test auf Innersubjekteffekte versteht man einen Test für Messwiederholungsfaktoren und ihre Interaktionen, d.h. beispielsweise der Einfluss der Lagerungszeit auf die Apoptose der Zellen. Lag keine Normalverteilung vor, kam die Friedman Zweifach-Rang-

39 33 varianzenanalyse für abhängige Stichproben zur Anwendung. Auch hier wurde ein signifikanter Unterschied bei einem p-wert kleiner als 0,05 und ein hochsignifikanter Unterschied bei einem p-wert kleiner als 0,01 angenommen. Zur Überprüfung eines Zusammenhangs zwischen zwei Variablen, wurde der Korrelationskoeffizient bestimmt. Bei Normalverteilung wurde die Korrelation nach Pearson berechnet, während bei nicht-normalverteilten Werten die Korrelation nach Kendall-Tau und Spearman-Rho verwendet wurde. Bei Werten nahe 0 bestand kein Zusammenhang zwischen den Variablen, nahe ± 1 bestand ein starker Zusammenhang [11; 23; 57; 61; 65].

40 34 6.Ergebnisse 6.1 Spenderdaten In die statistische Auswertung ging eine Spenderfallzahl von zehn ein, wovon acht Spender männlich und zwei Spender weiblich waren. Das durchschnittliche Alter lag bei 36 Jahren, wobei der jüngste Spender 22 Jahre und der älteste Spender 59 Jahre alt war. Das Körpergewicht betrug im Durchschnitt 76±11 kg. Das totale Blutvolumen der Spender lag durchschnittlich bei 5037±798 ml. Für die Blutspende werden nur qualifizierte Blutspender der Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen Abteilung herangezogen [83]. 6.2 Daten des Aphereselaufs Bedingt durch die unterschiedliche Herstellung wurde bei den Leukozytenkonzentraten durchschnittlich 4831 ml Blutvolumen prozessiert, während bei den Thrombozytenkonzentraten im Durchschnitt 2965 ml Blutvolumen prozessiert wurde. Als Antikoagulans wurde sowohl bei der Leukozytenspende, als auch der Thrombozytenspende ACD-A ( acid citrate dextrose ) verwendet. Der ACD-A-Verbrauch bei den Thrombozytenspenden lag im Durchschnitt bei 322 ml, während der Verbrauch bei den Leukozytenspenden um ungefähr 200 ml höher war. Die Spendezeit bei der Leukozytenapherese dauerte doppelt so lange wie bei der Thrombozytapherese. Tab.7: Daten der beiden Spendearten Mittelwerte und Standardabweichung Prozessiertes Blutvolumen [ml] ACD-A im Thrombozytenkonz [ml] ACD-A Zufuhr an Spender [ml] ACD-A im Plasma [ml] Leukozytenkonzentrate 4831± ±720 Thrombozytenkonzentrate - 45,50±15, ,8±74, ,50±23,79 - p-werte 0,001 ACD-A-Verbrauch [ml] 521,8±21,8 321,8±73,2 0,001 Separationsdauer [min] 121±4 50,9±16,1 T-Test Mann-Whitney-U-Test 0,001

41 Produktspezifische Daten Für die Thrombozytenspende wichtige Produktdaten waren der Thrombozytengehalt im Konzentrat, der durchschnittlich 4,05 x10 11 betrug und der Leukozytenrestgehalt, der bei durchschnittlich 0,013x10 6 im Thrombozytenprodukt lag. Der Mindestwert für den Thrombozytengehalt im Produkt darf 2 x10 11 nicht unterschreiten und der maximale Restleukozytengehalt 10 6 Leukozyten nicht übersteigen. Das gesammelte Plasmavolumen lag bei den Leukozytenapheresen bei 175 ml und somit um 39% unter dem Durchschnittswert des gesammelten Plasmavolumens der Thrombozytapheresen. Tab 8: Produktdaten im Leukozytenkonzentrat und Thrombozytenkonzentrat Mittelwerte und Standardabweichung Leukozytenkonzentrate Konzentratvolumen[ml] 124,6±28,8 319±113 Thrombozytenkonzentrate p-wert 0,001 Plasmavolumen[ml] 175± ±144 0,08 Thrombozytengehalt im 11 Produkt *10-4,05±1,24 - Leukozytenrestgehalt im TK *10 6-0,013±0,018 - T-Test Mann-Whitney-U-Test 6.4 Blutzellen vor der Spende Im EDTA-Blut vor der Leukozytapherese konnte im Vergleich zum EDTA-Blut vor der Thrombozytapherese keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich des Gehalts an Blutzellen eruiert werden. Vor der Leukozytapherese zeigten sich Leukozytenwerte von minimal 3,8 x10³ Leukozyten pro µl Blut und maximal 6,0 x10³ Leukozyten pro µl Blut. Im EDTA-Blut vor der Thrombozytapherese bewegte sich der Bereich zwischen 3,5x10³ bis 6,7x10³ Leukozyten pro µl Blut. Die Thrombozytenwerte lagen sowohl vor der Leukozytapherese als auch der Thrombozytapherese bei minimal 170 x10³ pro µl und erreichten maximal 247 x10³ pro µl (Leukozytapherese) und 272 x10³ pro µl (Thrombozytapherese). Bei gleicher Spannweite der Erythrozytenwerte von 0,98 x10 6 pro µl konnten im EDTA-Blut vor der Leukozytenkonzentrat Gewinnung Werte zwischen 4,38 x10 6 pro µl und 5,36 x10 6 pro µl und im EDTA-Blut vor Thrombozytapherese Erythrozytenwerte zwischen 4,29 x10 6 pro µl und 5,27 x10 6 pro µl ermittelt werden. Der Hämatokrit lag im EDTA-Blut vor Leukozytapherese geringfügig höher bei durchschnittlich 43,5±2,52% als im Spenderblut vor Thrombozytapherese mit durchschnittlich 42,6±2,4%.

42 36 Abb.15: Hämatokrit im EDTA-Blut vor der Apherese Tab 9: Blutzellen im EDTA-Blut vor der Apherese Mittelwerte und EDTA-Blut vor der EDTA-Blut vor der p-wert Standardabweichung Leukozytapherese Thrombozytapherese Leukozyten x10³/µl 5,28±0,71 4,94±1,03 0,399 Thrombozyten x10 3 /µl 217±25 223±30 0,620 Erythrozyten x10 6 /µl 4,91±0,33 4,78±0,32 0,371 Hämatokrit [%] 43,5±2,5 42,6±2,4 0,430 T-Test Mann-Whitney-U-Test 6.5 Blutzellen in den Aphereseprodukten Die Zellkonzentration pro Volumeneinheit lag in den LRS-Kammern teilweise höher als in den Leukozytenkonzentraten. Es zeigte sich eine fast doppelt so hohe Leukozytenkonzentration in den LRS-Kammern im Gegensatz zu den Leukozytenkonzentraten. Der Zellgehalt, berechnet nach der Formel Zellkonzentration in Zellen pro ml x Produktvolumen in ml, lag allerdings in den Leukozytenkonzentraten bei 5,58 x10 9 im Gegensatz zu den LRS-Kammern mit 0,89 x10 9, da die LRS-Kammern lediglich ein Volumen von 10 ml enthalten, während die Leukozytenkonzentrationen

43 37 im Durchschnitt ein Volumen von knapp 125 ml aufweisen. Bei achtfach höherer Erythrozytenkonzentration lag in den LRS-Kammern auch ein wesentlich höherer Hämatokritwert vor. Der residuale Thrombozytenanteil lag mit gemittelten 2936±368 x10³ Zellen pro µl in den LRS-Kammern unter dem Wert der Leukozytenkonzentrate mit durchschnittlich 4358±983 x10³ Zellen pro µl. Tab 10: Zelluläre Bestandteile in den beiden Produkten Mittelwerte und Standardabweichung Leukozytenkonzentrate LRS-Kammern p-wert Leukozyten x10³/µl 44,81±8,22 89,08±43,07 0,010 Erythrozyten x10 6 /µl 0,81±0,34 5,77±1,07 Thrombozyten x10³/µl 4358± ±921 Hämatokrit [%] 6,54±2,66 52,0±10,6 T-Test Mann-Whitney-U-Test 0,001 0,001 0, Vergleich von Spenderdaten und Produktdaten Blutzellen vor der Spende und in LRS-Kammern Vor der Thrombozytenapherese wurde den Spendern ein EDTA-Blutröhrchen zur Bestimmung der Blutbildparameter abgenommen. Es zeigten sich Werte im Normbereich für die zellulären Blutbestandteile mit durchschnittlich 4,94 x10³ Leukozyten pro µl, 4,83 x10 6 Erythrozyten pro µl und 223 x10³ Thrombozyten pro µl. In den LRS- Kammern waren deutlich mehr Leukozyten zu finden, ebenso mehr Thrombozyten. Der Leukozytenwert im EDTA-Blut korrelierte schwach, aber hochsignifikant (r=0,655; p= 0,001) mit dem Wert in den LRS-Kammern. Der Erythrozytenanteil zeigte zwar prozentual kaum einen Unterschied, die Erythrozyten in den LRS- Kammern korrelierten aber nicht mit den Werten vor der Spende (r=-0,249). Tab 11: Zelluläre Blutbestandteile im EDTA-Blut und in den LRS-Kammern Mittelwerte und EDTA-Blut vor der Spende LRS-Kammern Standardabweichung Leukozyten x10³/µl 4,94±1,03 89,08±43,07 Erythrozyten x10 6 /µl 4,83±0,34 5,77±1,07 Thrombozyten x10³/µl 223± ±921 Hämatokrit [%] 42,9±3,0 52,0±10,6 T-Test Mann-Whitney-U-Test p-werte 0,001 0,019 0,001 0,022

44 Blutzellen vor der Spende und in Leukozytenkonzentraten Es zeigte sich, dass die Leukozyten achteinhalbfach konzentrierter im Konzentrat vorlagen als im EDTA-Blut. Daraus resultiert ein wesentlich höherer prozentualer Anteil an CD14 positiven Zellen im Konzentrat als im EDTA-Blut. Es ließ sich kein Zusammenhang feststellen zwischen Leukozytenzahl und Anteil der CD14 positiven Zellen (r=0,120 (Spende), r=-0,083 (Konzentrat)). Wie aus Diagramm 1 ersichtlich waren im EDTA-Blut durchschnittlich 10,99% von den durchschnittlich 5,28 x 10³ Leukozyten pro µl CD14 positive Monozyten und in den Leukozytenkonzentraten waren es durchschnittlich 25,32% von durchschnittlich 44,81 x 10³ Leukozyten pro µl. Diagramm 1: Prozentualer Anteil der CD14 positiven Zellen an Leukozyten 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% 10,99%±5,20% EDTA-Blut CD14 positive Zellen 25,32%±6,61% Leukozytenkonzentrat Leukozyten Der Thrombozytengehalt im Konzentrat lag 20-fach konzentrierter vor als im Blut vor der Spende. Der Anteil an Erythrozyten und folglich auch des Hämatokrits, der den Anteil der Erythrozyten am Gesamtblutplasma in Prozent angibt, war durch die Apherese im Konzentrat stark vermindert.

45 39 Tab 12: Zelluläre Blutbestandteile im EDTA-Blut und in den Leukozytenkonzentraten Mittelwerte und Standardabweichung EDTA-Blut vor der Spende Leukozytenkonzentrate p-werte Leukozyten x10³/µl 5,28±0,71 44,81±8,22 0,001 CD14+ Zellen [%] 10,99±5,20 25,32±6,61 0,001 Thrombozyten x10³/µl 217,1±25,3 4358±983 0,001 Erythrozyten x10 6 /µl 4,91±0,33 0,81±0,34 0,001 Hämatokrit [%] 43,51±2,52 6,54±2,66 0,001 T-Test Mann-Whitney-U-Test Annexin V- 7AAD Messung von Tregs Der prozentuale Anteil der T-Helferzellen bezogen auf die ausgezählten kernhaltigen Zellen betrug im EDTA-Blut gemittelt 41,32% und im Monozytenkonzentrat durchschnittlich 43,69% und zeigte somit keinen signifikanten Unterschied, korrelieren dabei aber stark miteinander (r=0,879). Es zeigte sich, dass prozentual nahezu gleich viele CD25 positive Zellen in den Leukozytenkonzentraten mit minimal 38,60% und maximal 63,61% und im EDTA-Blut mit minimal 33,69% und maximal 96,11% (Extremwert) vorlagen. Abb. 16: Boxplot der CD25 positiven T-Zellen

46 40 Tab 12: Annexin V/7AAD markierte Helferzellen und Tregs zum initialen Zeitpunkt Mittelwerte und Standardabweichung EDTA-Blut vor der Spende Leukozytenkonzentrate p-werte T-Helferzellen [%] 41,32±6,03 43,69±5,87 0,384 0,315 T-Helferzellen abs 6639± ±4613 0,022 CD25 pos [%] 52,49±18,10 49,42±9,07 CD25 neg [%] 47,15±18,10 50,38±9,19 0,639 0,971 0,661 1,000 CD25pos abs 3371± ±2655 0,061 CD25neg abs 3273± ±2483 0,037 T-Test Mann-Whitney-U-Test Der prozentuale Anteil an Annexin V positiven 7AAD negativen (frühapoptotischen) CD25 positiven T-Zellen wies keinen signifikanten Unterschiede auf, ebenso zeigte sich bei den apoptotischen CD25 negativen T-Zellen keine signifikante Abweichung der Werte mit minimal 0,67% und maximal 15,26% im EDTA-Blut und 1,92% bis 11,33% in den Leukozytenkonzentraten. Abb.17: CD25 negative apoptotische Zellen

47 41 Im EDTA-Blut ließen sich signifikant mehr CD25 positive Annexin V positive 7AAD positive (nekrotische) Zellen nachweisen als in den Leukozytenkonzentraten. Es zeigte sich hierbei eine deutlich breitere Spannweite dieser Werte von 0,62% als in den Leukozytenkonzentraten mit einer Spannweite von 0,25%. Der prozentuale Anteil CD25 negativer nekrotischer Zellen fiel im EDTA-Blut mit durchschnittlich 0,24% ebenfalls geringfügig höher aus als in den Leukozytenkonzentraten mit durchschnittlich 0,16%. Es bestand dennoch ein signifikanter Unterschied, da in den Leukozytenkonzentraten ein Extremwert von 0,60% vorlag, der den Mittelwert anhob. Unter Ausschluss dieses Extremwertes ließen sich durchschnittlich 0,06% nekrotische CD25 negative Zellen in den Konzentraten nachweisen. Abb. 18: CD25 negative nekrotische Zellen

48 42 Tab 13: Annexin V/7AAD markierte Tregs zum initialen Zeitpunkt Mittelwerte und Standardabweichung EDTA-Blut vor der Spende Leukozytenkonzentrate p-werte CD25 pos 9,39±3,59 10,09±2,33 0,611 apoptotisch [%] CD25 neg 6,38±4,19 5,22±3,05 0,490 apoptotisch [%] CD25 pos 0,31±0,20 0,16±0,82 0,041 nekrotisch [%] CD25 neg nekrotisch [%] 0,24±0,17 0,12±0,18 0,140 0,035 T-Test Mann-Whitney-U-Test JC1-Messung von Lymphozyten und Monozyten Tabelle 14 zeigt die sowohl vitalen als auch apoptotischen Lymphozyten und Monozyten nach JC1 Markierung. Die vitalen Lymphozyten des EDTA-Blutes zeigten einen Minimalwert von 86,22% und einen Maximalwert von 98,52% und unterschieden sich nicht signifikant von den Werten im Leukozytenkonzentrat, in welchem sich die Werte über eine Spannbreite von 75,97% bis 96,60% verteilten. Ebenso zeigte sich bei den vitalen Monozyten, die im EDTA-Blut einen Spannweitenbereich von 6,15% und im Leukozytenkonzentrat einen Bereich von 6,75% umfassen, kein signifikantes Ergebnis. Abb. 19: Boxplot der vitalen Monozyten

49 43 Dieser Spannweitenbereich blieb auch bei den apoptotischen Monozyten erhalten. Die apoptotischen Lymphozyten zeigten eine wesentlich größere Streuung der Werte im Leukozytenkonzentrat mit minimal 1,48% und maximal 13,14% apoptotischer Zellen als im EDTA-Blut mit einem Minimalwert von 0,57% und einem Maximalwert von 6,72%. Tab 14: JC1 markierte mononukleäre Zellen zum initialen Zeitpunkt Mittelwerte und Standardabweichung EDTA-Blut vor der Spende Leukozytenkonzentrate p-werte Lymphozyten vital 93,61±3,71 88,96±6,02 0,055 [%] Monozyten vital 96,83±1,89 96,51±2,00 0,718 [%] Lymphozyten apoptotisch 6,25±3,58 11,05±6,02 0,047 [%] Monozyten apoptotisch 3,16±1,88 3,49±2,00 0,702 [%] T-Test Mann-Whitney-U-Test BrdU Messung von mononukleären Zellen Die mit BRDU markierten mononukleären Zellen wurden hinsichtlich vitaler und apoptotischer Zellen unterschieden. Es zeigte sich eine sehr große Spannweite der Werte im EDTA-Blut sowohl bei den vitalen mononukleären Zellen mit minimal 65,68% (Extremwert) und maximal 98,80% als auch bei den apoptotischen Zellen mit einem Minimalwert von 1,35% und einem Maximalwert von 34,32% (Extremwert), während im Leukozytenkonzentrat die Spannweite bei den vitalen Zellen von 96,48% bis 99,63% und bei den apoptotischen Zellen zwischen 0,37% bis 3,42% lag. Unter Vernachlässigung der Extremwerte ließ sich kein signifikanter Unterschied zwischen EDTA-Blut und Leukozytenkonzentraten nachweisen.

50 44 Tab 15: BRDU markierte mononukleäre Zellen zum initialen Zeitpunkt Mittelwerte und Standardabweichung EDTA-Blut vor der Spende Leukozytenkonzentrate MNC vital [%] 90,90±12,40 98,38±1,05 MNC apoptotisch 8,92±12,48 1,61±1,04 [%] T-Test Mann-Whitney-U-Test p-werte 0,089 0,007 0,098 0, Darstellung mittels unterschiedlicher Analysen Annexin V- 7AAD positive Tregs Der prozentuale Anteil an T-Helferzellen in den Leukozytenkonzentraten betrug durchschnittlich 43,69±5,87% und in den LRS-Kammern 45,30±6,11%. Davon wurde der prozentuale Anteil an regulatorischen T-Zellen ermittelt, die als Oberflächenantigene CD4 positiv und CD25 positiv waren. Die folgenden Diagramme zeigen, dass sich die Anteile an regulatorischen T-Zellen in den Leukozytenkonzentraten und in den LRS-Kammern nicht signifikant voneinander unterschieden. Diagramm 2: Prozentuale Anteile der Tregs zum initialen Zeitpunkt 100% 80% 60% 50,38±9,19% 48,60±16,85% 40% 20% 49,42±9,07% 51,40+16,85% 0% Leukozytenkonzentrate CD25 positive T-Zellen LRS-Kammern CD25 negative T-Zellen

51 45 Diagramm 3: Prozentuale Anteile der Tregs nach 48-stündiger Lagerung 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 58,60±8,00% 41,41±8,0% Leukozytenkonzentrate CD25 positive T-Zellen 50,20±17,44% 49,80±17,44% LRS-Kammern CD25 negative T-Zellen Drei Stunden nach Konzentratgewinnung befanden sich in den Leukozytenkonzentraten zwischen 6,30% bis 13,73% apoptotische CD25 positive T-Zellen und somit hochsignifikant mehr als in den LRS-Kammern mit minimal 3,11% bis maximal 10,37%. Abb. 20: Boxplot der apoptotischen CD25 positiven Zellen zum initialen Zeitpunkt

52 46 Die apoptotischen CD25 negativen T-Zellen wiesen in den Leukozytenkonzentraten eine Spannweite von 9,41% mit einem Maximalwert von 11,33% auf und waren somit vergleichbar mit den Werten der LRS-Kammern, die eine Spannweite von 9,27% und einen Maximalwert von 10,31% zeigten. Der Anteil nekrotischer CD25 positiver T-Zellen zeigte zu Beginn mit Durchschnittswerten von 0,16±0,82% in den Leukozytenkonzentraten und 0,27±0,24% in den LRS-Kammern sehr geringe Werte. Abb. 21: Boxplot der nekrotischen CD25 positiven T-Zellen Die prozentualen Anteile der nekrotischen CD25 negativen T-Zellen in den Leukozytenkonzentraten und den LRS-Kammern zeigten ebenfalls keine signifikanten Unterschiede. Im Mittel lagen in den Leukozytenkonzentraten initial mehr Annexin V positive und 7AAD negative regulatorische T-Zellen vor als in den LRS-Kammern, während sich dieses Verhältnis bei den Annexin V positiven und 7AAD positiven regulatorischen T-Zellen umkehrte.

53 47 Tab 16: Annexin V/7AAD positive CD25 T-Zellen zum initialen Zeitpunkt Mittelwerte und Standardabweichung Leukozytenkonzentrate LRS Kammern p-werte CD25 pos 10,09±2,33 6,10±2,33 0,001 apoptotisch [%] CD25 neg apoptotisch [%] 5,22±3,04 3,21±2,69 0,135 CD25 pos nekrotisch [%] 0,16±0,82 0,27±0,24 0,178 CD25 neg 0,12±0,18 0,14±0,15 0,649 nekrotisch [%] T-Test Mann-Whitney-U-Test Nach sechs Stunden zeigten lediglich die Annexin V positiven und 7AAD positiven CD25 positiven T-Zellen signifikante Abweichungen. Während in den Leukozytenkonzentraten durchschnittlich 9,08±3,42% apoptotische CD25 positive Zellen nachweisbar waren, ließen sich in den LRS-Kammern nur 4,89±1,66% analysieren. Die prozentualen Anteile der apoptotischen CD25 negativen T-Zellen zeigten keine signifikanten Unterschiede in den beiden Leukozytenprodukten. Der mediane Wert der Leukozytenkonzentrate lag bei 3,07%, der der LRS-Kammern bei 2,07%. Abb. 22: Apoptotische CD25 positive T-Zellen nach sechs Stunden Lagerung

54 48 In den prozentualen Anteilen der Annexin V positiven und 7AAD positiven Tregs konnten keine signifikanten Unterschiede in den beiden Produkten nachgewiesen werden. Tab 17: Annexin V/7AAD positive CD25 T- Zellen nach sechs Stunden Mittelwerte und Leukozytenkonzentrate LRS Kammern p-werte Standardabweichung CD25 pos apoptotisch [%] 9,08±3,42 4,89±1,66 0,004 CD25 neg apoptotisch [%] 5,18±4,55 2,70±1,17 0,126 0,123 CD25 pos nekrotisch [%] 0,30±0,18 0,25±0,13 0,529 CD25 neg nekrotisch [%] 0,26±0,37 0,14±0,12 0,853 T-Test Mann-Whitney-U-Test Nach 24-stündiger Lagerung zeigten sowohl die apoptotischen CD25 positiven als auch die apoptotischen CD25 negativen T-Zellen in den beiden Zellprodukten ähnliche durchschnittliche Werte. An Annexin V positiven und 7AAD positiven CD25 positiven Zellen konnten in den Leukozytenkonzentraten durchschnittlich 2,02±2,74% Zellen nachgewiesen werden, während bei den LRS-Kammern lediglich im Durchschnitt 0,58±0,40% nekrotische Zellen nachzuweisen waren. Ebenfalls zeigten sich deutlich mehr nekrotische CD25 negative Zellen in den Leukozytenkonzentraten mit gemittelt 1,13±1,19% Zellen. In den LRS-Kammern fanden sich durchschnittlich dreimal weniger nekrotische CD25 negative Zellen. Somit lag der prozentuale Anteil an Annexin V positiven und 7AAD positiven regulatorischen T- Zellen in den Leukozytenkonzentraten nach 24-stündiger Lagerung höher als in den LRS-Kammern. Tab 18: Annexin V/7AAD markierte CD25 T- Zellen nach 24-stündiger Lagerung Mittelwerte und Standardabweichung Leukozytenkonzentrate LRS Kammern p-werte CD25pos apoptotisch [%] 6,34±1,12 6,40±3,80 0,965 CD25neg apoptotisch [%] 3,92±2,46 3,75±2,47 0,221 CD25pos nekrotisch [%] 2,02±2,74 0,58±0,40 0,047 CD25neg nekrotisch [%] 1,13±1,19 0,37±0,29 0,079 T-Test Mann-Whitney-U-Test

55 % 49 Bei Betrachtung der 48 Stunden Werte wiesen die apoptotischen CD25 positiven T- Zellen in den Leukozytenkonzentraten niedrigere Werte mit einem minimalen Wert von 0,60% und einem maximalen Wert von 6,18% auf, als die LRS-Kammern mit Werten zwischen 2,09% bis 10,93%. Ähnlich verhielt es sich mit den apoptotischen CD25 negativen T-Zellen. Hier zeigten die Leukozytenkonzentrate Werte zwischen 0,28% bis maximal 5,32% und die LRS-Kammern Werte von minimal 1,22% und maximal 10,15%. Die nekrotischen Zellen zeigten in den Leukozytenkonzentraten im Gegensatz zu den LRS-Kammern signifikant höhere Werte. Während die Leukozytenkonzentrate mit Durchschnittswerten von 6,69±9,10% nekrotischer CD25 positiver T-Zellen auffielen, waren in den LRS-Kammern lediglich Durchschnittswerte von 0,97±0,73% zu verzeichnen. Die nekrotischen CD25 negativen T-Zellen zeigten in den Leukozytenkonzentraten Werte bis maximal 19,76%, in den LRS-Kammern fand sich ein maximaler Wert von 6,73%. Diagramm 4: Darstellung der apoptotischen und nekrotischen CD25 positiven Zellen h Annexin apoptotisch LK apoptotisch LRSC nekrotisch LK nekrotisch LRSC CD25 positive T-Zellen LK= Leukozytenkonzentrat; LRSC= LRS-Kammern

56 % 50 Diagramm 5: Apoptotische und nekrotische CD25 negativen Zellen h Annexin apoptotisch LK apoptotisch LRSC nekrotisch LK nekrotisch LRSC CD25 negative T-Zellen LK= Leukozytenkonzentrat; LRSC= LRS-Kammern Nach 48 Stunden ließen sich signifikant mehr Annexin V positive und 7AAD positive regulatorische T-Zellen in den Leukozytenkonzentraten auffinden als in den LRS- Kammern, während sich die prozentualen Anteile Annexin V positiver und 7AAD negativer regulatorischer T-Zellen nicht wesentlich unterschieden. Tab 19: Annexin V/7AAD markierte CD25 T- Zellen nach 48-stündiger Lagerung Mittelwerte und Standardabweichung CD25 pos apoptotisch [%] CD25 neg apoptotisch [%] CD25 pos nekrotisch [%] CD25 neg nekrotisch [%] T-Test Mann-Whitney-U-Test Leukozytenkonzentrate LRS Kammern p-werte 4,15±1,79 5,04±2,71 0,398 2,74±1,39 3,06±2,68 0,739 0,427 6,69±9,10 0,97±0,73 0,078 0,002 8,26±6,98 1,61±2,13 0,015 0,026 Zusammenfassend zeigte sich, dass bei ähnlichen prozentualen Anteilen an regulatorischen T-Zellen in den beiden Leukozytenprodukten der Anteil an Annexin V positiven und 7AAD negativen (apoptotischen) CD25 positiven Helferzellen in den Leukozytenkonzentraten zu den Messzeitpunkten drei Stunden nach Gewinnung und sechs Stunden signifikant höher lag als in den LRS-Kammern. Nach einem Lagerungsintervall von 24 und 48 Stunden allerdings keine signifikant unterschied-

57 51 lichen Werte mehr zu finden waren. Bei den Annexin V positiven und 7AAD positiven (nekrotischen) Tregs konnten im ersten Lagerungszeitraum keine signifikanten Abweichungen der Werte in den beiden Produkten festgestellt werden. Erst nach 48 Stunden waren signifikant mehr nekrotische regulatorische Zellen in den Leukozytenkonzentraten nachweisbar JC1 detektierte Lymphozyten und Monozyten Mittels JC1 und CD4 Markierung konnten die beiden Populationen der mononukleären Zellen hinsichtlich ihres Apoptoseverhaltens und erhaltener Vitalität in einem Zeitraum von 48 Stunden beurteilt werden. Es zeigte sich, dass drei Stunden nach Gewinnung bereits gemittelt 11,05% apoptotische Lymphozyten im Leukozytenkonzentrat vorlagen. In den LRS-Kammern wurden signifikant dreifach höhere Werte mit einer Spannweite von 4,74% bis 76,37% ersichtlich. Abb. 23: Boxplot der apoptotischen Lymphozyten zum initialen Zeitpunkt In den LRS-Kammern zeigten sich minimal 0,42% bis maximal 91,90% apoptotische Monozyten und somit hochsignifikant mehr apoptotische Zellen als in den Leukozytenkonzentraten mit Werte zwischen 1,37% und 8,12% und einer Spannweite von 6,75%.

58 52 Abb. 24: Boxplot der apoptotischen Monozyten Nach sechsstündiger Lagerung zeigten sich apoptotische Lymphozytenwerte in den LRS-Kammern mit minimal 1,64% und maximal 62,85%, während sich die Werte der Leukozytenkonzentrate in einem Bereich von 3,59% bis 22,54% bewegten und somit signifikant geringere Werte zeigten. An apoptotischen Monozyten wiesen die LRS-Kammern durchschnittlich 30,83% Zellen und die Leukozytenkonzentrate gemittelt 5,29% Zellen auf. Auch hier ließen sich in den LRS-Kammern signifikant mehr apoptotische Monozyten aufzeigen. Tab 20: Vitale und apoptotische Lymphozyten und Monozyten nach sechs Stunden Messzeitpunkt: 6h Leukozytenkonzentrate LRS Kammern p-werte JC1 Lymphozyten vital [%] 89,72±6,57 73,34±19,76 0,030 Monozyten vital [%] 94,71±6,49 69,18±29,17 0,022 0,034 Lymphozyten apoptotisch [%] 10,27±6,57 26,65±19,76 0,030 Monozyten apoptotisch [%] 5,29±6,50 30,83±29,17 0,022 T-Test Mann-Whitney-U-Test 0,034

59 53 Mit längerer Lagerungsperiode wurden keine signifikanten Unterschiede mehr zwischen den beiden untersuchten Zellprodukten ersichtlich. In den Leukozytenkonzentraten befanden sich nach 24-stündiger Lagerung durchschnittlich 22,04% apoptotische Lymphozyten, in den LRS-Kammern durchschnittlich 33,52%. Auch nach weiteren 24 Stunden Lagerung zeigten sich weder in den LRS-Kammern noch in den Leukozytenkonzentraten signifikante Abweichungen in den Lymphozytenwerten. Tab 21: Vitale und apoptotische Lymphozyten und Monozyten nach 48 Stunden Messzeitpunkt: 48h Leukozytenkonzentrate LRS Kammern p-werte JC1 Lymphozyten vital [%] 50,28±29,47 66,58±22,91 0,185 Monozyten vital [%] 43,53±31,72 67,02±29,09 0,102 0,070 Lymphozyten apoptotisch [%] 49,71±29,48 33,42±22,92 0,185 Monozyten apoptotisch [%] 56,44±31,76 32,96±29,09 0,102 T-Test Mann-Whitney-U-Test 0,070 Die apoptotischen Monozyten verhielten sich ähnlich. In den Leukozytenkonzentraten zeigte sich nach 24-stündiger Lagerung eine Spannweite der Werte von 9,13% bis 23,46% und nach längerem Lagerungsintervall Werte von 12,41% bis 97,22%. Die LRS-Kammern wiesen innerhalb der Lagerungszeit Werte von anfangs 6,5% bis 91,95% und am Ende der Lagerung von 7,12% bis 85,30% auf. Diagramm 6 und 7 zeigen deutlich die prozentualen Unterschiede des apoptotischen Verhaltens der Lymphozyten und Monozyten. Während der Messzeitpunkte initial (drei Stunden nach Gewinnung), sechs Stunden und 24 Stunden lag der Anteil an apoptotischen Zellen in den Leukozytenkonzentraten wesentlich niedriger als in den LRS-Kammern. Zum Messzeitpunkt 48 Stunden waren deutlich mehr apoptotische Zellen in den Leukozytenkonzentraten zu finden als in den LRS- Kammern.

60 % % 54 Diagramm 6: Vitale und apoptotische Lymphozyten in den Aphereseprodukten vital LK vital LRSC apoptotisch LK apoptotisch LRSC Lymphozyten in den Aphereseprodukten initial JC1 6h JC1 24h JC1 48h JC1 LK= Leukozytenkonzentrate; LRSC= LRS-Kammern Diagramm 7: Darstellung der vitalen und apoptotischen Monozyten vital LK vital LRSC apoptotisch LK Monozyten in den Aphereseprodukten apoptotisch LRSC initial JC1 6h JC1 24h JC1 48h JC1 LK= Leukozytenkonzentrat; LRSC= LRS-Kammer Insgesamt konnten mit der JC1 Methode innerhalb der ersten sechs Stunden des Lagerungsintervalls signifikant mehr apoptotische Lymphozyten und Monozyten nachgewiesen werden als in den Leukozytenkonzentraten. Zu den Messzeitpunkten 24 und 48 Stunden unterschieden sich die beiden Leukozytenprodukte hinsichtlich der apoptotischen Zellen nicht mehr signifikant voneinander. Lediglich nach 48 Stunden lag der prozentuale Anteil an apoptotischen Zellen in den Leukozytenkonzentraten über dem der LRS-Kammern BrdU detektierte mononukleäre Zellen Die mononukleären Zellen wurden mittels BRDU detektiert und im zeitlichen Verlauf über 48 Stunden hinsichtlich Vitalität und Apoptoseverhalten untersucht. Zum initialen (drei Stunden nach Gewinnung) Zeitpunkt zeigten die Leukozytenkonzentrate eine signifikant höhere Apoptoserate mit einem minimalen Wert von 0,37% und ei-

61 55 nem maximalen Wert von 3,42% im Gegensatz zu den LRS-Kammern mit einem Wertebereich von 0,18% bis 1,49%. Tab 22: Vitalität und Apoptose in den beiden Zellprodukten Messzeitpunkt: initial Leukozytenkonzentrate LRS Kammern p-werte Apo BRDU MNC vital [%] MNC apoptotisch 98,38±1,05 99,27±0,43 0,028 1,61±1,04 0,73±0,43 0,023 [%] T-Test Mann-Whitney-U-Test Nach sechsstündiger Lagerung bei Raumtemperatur zeigte sich ebenfalls ein hochsignifikanter Unterschied im prozentualen Anteil der apoptotischen Zellen in den Leukozytenkonzentraten mit Werten zwischen 0,55% bis 5,50%, während die apoptotischen mononukleären Zellen in den LRS-Kammern lediglich einen Maximalwert von 1,90% erreichten. Tab 23: Vitalität und Apoptose in beiden Zellprodukten Messzeitpunkt: 6h Leukozytenkonzentrate LRS Kammern p-werte Apo BRDU MNC vital [%] MNC apoptotisch 97,68±1,38 99,08±0,70 0,011 2,31±1,35 0,91±0,68 0,009 [%] T-Test Mann-Whitney-U-Test Zum Messzeitpunkt nach 24 Stunden zeigten die apoptotischen Zellen in den LRS- Kammern mit durchschnittlich 1,16±1,16% und in den Leukozytenkonzentraten mit durchschnittlich 2,30±0,92% einen signifikanten Unterschied.

62 56 Abb. 25: Apoptotische mononukleäre Zellen nach 24-stündiger Lagerung Tab 24: Vitalität und Apoptose nach 24 Stunden Lagerung Messzeitpunkt: 24h Apo BRDU MNC vital [%] MNC apoptotisch [%] T-Test Mann-Whitney-U-Test Leukozytenkonzentrate LRS Kammern p-werte 97,70±0,94 98,84±1,15 0,026 0,003 2,30±0,92 1,16±1,16 0,026 0,003 Auch nach 48-stündiger Lagerung ließen sich in den Leukozytenkonzentraten prozentual mehr apoptotische Zellen mit einem minimalen Wert von 1,84% und einem maximalem Wert von 11,02% nachweisen als in den LRS-Kammern mit minimalen 0,17% und einem Maximalwert von 8,41%.

63 57 Tab 25: Vitalität und Apoptose nach 48-stündiger Lagerung Messzeitpunkt: 48h Apo BRDU MNC vital [%] MNC apoptotisch [%] T-Test Mann-Whitney-U-Test Leukozytenkonzentrate LRS Kammern p-werte 95,05±2,86 97,19±2,94 0,116 0,029 5,01±2,82 2,82±2,96 0,107 0,029 Bei der DNA-Strangbruchdetektierung mittels BrdU zeigten sich im gesamten Lagerungsintervall signifikant mehr apoptotische mononukleäre Zellen in den Monozytenkonzentraten als in den LRS-Kammern. 6.8 Einfluss der Kurzzeitlagerung Annexin V/ 7AAD positive Tregs im Aphereseprodukt Der prozentuale Anteil an CD4 positiven T-Helferzellen bezogen auf die durchflußzytometrisch ausgezählten Leukozyten nahm in den Leukozytenkonzentraten im zeitlichen Verlauf hochsignifikant von durchschnittlich 43,48% Zellen auf durchschnittlich 33,44% T-Helferzellen ab. Die CD25 positiven T-Zellen, die einen prozentualen Anteil an den T-Helferzellen darstellen, zeigten ebenfalls eine signifikante Abnahme mit anfänglich minimal 38,60% und maximal 63,61% CD25 positive Zellen und sinkt dann nach 48 Stunden auf Werte von minimal 32,49% und maximal 56,88%. Aufgrund der Abnahme an CD25 positiven Zellen kam es zum signifikanten Anstieg der CD25 negativen T-Zellen, da deren prozentualer Anteil zusammen mit dem prozentualen Anteil der CD25 positiven T-Zellen auf 100% T-Helferzellen bezogen wurde.

64 % 58 Diagramm 8: Abnahme an CD25 positiven T-Zellen in Kurzzeitlagerung CD25 posititve T-Zellen CD25 negative T-Zellen 50,38±9,19 51,61±8,72 55,42±9,22 58,60±8,00 49,42±9,07 48,39±8,72 44,57±9,22 41,41±8,00 initial 6h 24h 48h Lagerungszeit Tab 26: Annexin V/7AAD positive Helferzellen und Tregs im Leukozytenkonzentrat Mittelwerte und Lagerung: Lagerung: Lagerung: Lagerung: p-werte Standardabweichung initial 6h 24h 48h THZ [%] 43,48±6,36 43,69±5,87 40,30±6,36 33,44±9,19 0,001ɛ CD25 pos [%] 49,42±9,07 48,39±8,72 44,57±9,22 41,41±8,00 CD25 neg [%] 50,38±9,19 51,61±8,72 55,42±9,22 58,60±8,00 0,025ɛ 0,001π 0,023ɛ 0,001π THZ abs 10832± ± ± ±6295 0,001ɛ CD25 pos abs 5313± ± ± ±3239 0,025ɛ CD25 neg abs 5534± ± ± ±3802 0,002ɛ bei Normalverteilung:Verwendung von Messwiederholung; da kleine Stichprobe Verwendung der Greenhouse-Geisser-Korrektur ɛ keine Normalverteilung: Friedmans Zweifach-Rangvarianzenanalyse π Die T-Helferzellen der LRS-Kammern zeigten ebenfalls eine signifikante prozentuale Abnahme von anfangs durchschnittlich 45,30% auf 40,40% am Ende der Messreihe. Die prozentualen Anteile an CD25 positiven und negativen T-Zellen bezogen auf die CD4 positiven T-Helferzellen ließen ebenfalls einen signifikanten Abfall bzw. Anstieg erkennen. Der prozentuale Anteil an CD25 positiven T-Zellen nahm im Verlauf um 1,60% auf durchschnittlich 49,80% ab.

65 % 59 Diagramm 9: CD25+ und CD25- Zellen in den LRS-Kammern in Kurzzeitlagerung CD25 positive T-Zellen CD25 negative T-Zellen 48,60±16,85 49,41±17,07 49,58±17,15 50,20±17,44 51,40±16,85 50,59±17,07 50,42±17,15 49,80±17,44 initial 6h 24h 48h Lagerungszeit Tab 27: Annexin V/7AAD positive Helferzellen und Tregs in den LRS-Kammern Mittelwerte und Lagerung: Lagerung: Lagerung: Lagerung: p-werte Standardabweichung initial 6h 24h 48h THZ [%] 45,30±6,11 45,35±6,41 44,40±5,90 40,40±6,57 0,011ɛ CD25 pos [%] 51,40±16,85 50,59±17,07 50,42±17,15 49,80±17,44 CD25 neg [%] 48,60±16,85 49,41±17,07 49,58±17,15 50,20±17,44 0,252ɛ 0,077π 0,252ɛ 0,077ɛ THZ abs 17077± ± ± ±6987 0,496ɛ CD25 pos abs 7795± ± ± ±1918 0,792ɛ CD25 neg abs 5534± ± ± ±5446 0,016ɛ bei Normalverteilung:Verwendung von Messwiederholung; da kleine Stichprobe Verwendung der Greenhouse-Geisser-Korrektur ɛ keine Normalverteilung: Friedmans Zweifach-Rangvarianzenanalyse π Bei den apoptotischen regulatorischen CD25 positiven T-Zellen ließ sich in den Leukozytenkonzentraten eine hochsignifikante Abnahme von Annexin V positiven und 7AAD negativen Zellen (apoptotische Zellen) im Zeitverlauf nachweisen. Zum ersten Messzeitpunkt konnte ein maximaler Wert von 13,73% von apoptotischen Zellen verzeichnet werden. Nach 48-stündiger Lagerung ließen sich nur noch maximal 6,18% an apoptotischen CD25 positiven T-Zellen nachweisen. Auch bei den regulatorischen CD25 negativen T-Zellen zeigte sich eine signifikante Abnahme von

66 % 60 in Apoptose gegangenen T-Zellen von anfänglich 5,22% auf 2,74%. Folglich konnte bei den Annexin V positiven und 7AAD positiven regulatorischen T-Zellen (nekrotische Zellen) eine hochsignifikante Zunahme des prozentualen Anteils verzeichnet werden. Die CD25 positiven T-Zellen zeigten zu Beginn minimal 0,06% und maximal 0,31% nekrotische Tregs. Nach 48 Stunden ließen sich minimal 0,75% und maximal 31,64% nekrotische Zellen nachweisen. Die CD25 negativen regulatorischen T- Zellen zeigten ebenfalls einen starken Anstieg von durchschnittlich 8,14% auf gemittelte 8,26% nekrotische Zellen nach 48-stündiger Lagerung. Diagramm 10: Apoptotische und nekrotische Tregs im Leukozytenkonzentrat CD25 positive apoptotische T-Zellen CD25 negative apoptotische T-Zellen CD25 positive nekrotische T-Zellen 0 initial 6h 24h 48h Lagerungszeit CD25 negative nekrotische T-Zellen Tab 28: Annexin V/7AAD positive Tregs im Leukozytenkonzentrat Mittelwerte und Lagerung: Lagerung: Lagerung: Lagerung: p-werte Standardabweichung initial 6h 24h 48h CD25 pos Annexin V + 7AAD - [%] 10,09± 2,23 9,08±3,42 6,34±1,12 4,15±1,79 0,001ɛ CD25 neg Annexin V+ 7AAD- [%] CD25 pos Annexin V+ 7AAD+ [%] CD25 neg Annexin V+ 7AAD+ [%] 5,22±3,05 5,18± 4,55 3,92±2,46 2,74±1,39 0,16±0,08 0,30±0,18 2,02±2,74 6,69±9,10 0,12±0,18 0,26± 0,37 1,13±1,19 8,26±6,98 0,054ɛ 0,160π 0,001π 0,051ɛ 0,005ɛ 0,001π bei Normalverteilung:Verwendung von Messwiederholung; da kleine Stichprobe Verwendung der Greenhouse-Geisser-Korrektur ɛ keine Normalverteilung: Friedmans Zweifach-Rangvarianzenanalyse π

67 61 Es konnte somit gezeigt werden, dass es in den Leukozytenkonzentraten zur kontinuierlichen Abnahme der apoptotischen Tregs im Zeitverlauf kam mit gleichzeitigem Anstieg der prozentualen Anteile der nekrotischen Tregs. In den LRS-Kammern zeigte sich keine signifikante Abnahme von Annexin V positiven und 7AAD negativen regulatorischen T-Zellen im zeitlichen Verlauf. Sowohl bei den CD25 positiven als auch bei den CD25 negativen T-Zellen zeigte sich nach sechsstündiger Lagerung ein Abfall an Annexin V positiven und 7AAD negativen Zellen (apoptotische Zellen) von durchschnittlich 1,21% (CD25 positiv) und 0,51% (CD25 negativ). Anschließend ließ sich nach weiterer 18-stündiger Lagerung eine Zunahme an apoptotischen Zellen verzeichnen auf durchschnittlich 6,40% (CD25 positiv) und 3,75% (CD25 negativ), bevor der prozentuale Anteil der apoptotischen Zellen bei weiterer Lagerung wieder abfällt. Abb. 26: Apoptotische CD25 positive T-Zellen in den LRS-Kammern Bei den nekrotischen CD25 positiven T-Zellen in den LRS-Kammern ließ sich eine hochsignifikante Zunahme der prozentualen Anteile erkennen. Zu Beginn konnten Werte von minimal 0,07% und maximal 0,92% verzeichnet werden. Nach 48- stündiger Lagerung zeigte sich ein Anstieg der nekrotischen CD25 positiven Zellen auf Werte von minimal 0,22% bis maximal 2,45%. Die nekrotischen CD25 negativen T-Zellen zeigten ebenfalls einen hochsignifikanten prozentualen Anstieg von initial maximal 0,39% auf maximal 6,73% nekrotischer Zellen nach 48 Stunden.

68 % 62 Diagramm 11: Apoptotische und nekrotische Tregs in den LRS-Kammern initial 6h 24h 48h Lagerungszeit CD25 positive apoptotische T-Zellen CD25 negative apoptotische T-Zellen CD25 positive nekrotische T-Zellen CD25 negative nekrotische T-Zellen Tab 29: Annexin V/7AAD positive Tregs in den LRS-Kammern Mittelwerte und Lagerung: Lagerung: Lagerung: Lagerung: p-werte Standardabweichung initial 6h 24h 48h CD25 pos Annexin V+ 7AAD- [%] 6,10±2,33 4,89±1,66 6,40±3,80 5,04±2,71 0,128ɛ CD25 neg Annexin V+ 7AAD- [%] CD25 pos Annexin V+ 7AAD+ [%] CD25 neg Annexin V+ 7AAD+ [%] 3,21±2,69 2,70±1,17 3,75±2,47 3,06±2,68 0,27±0,24 0,25±0,13 0,58±0,40 0,97±0,73 0,14±0,15 0,14±0,12 0,37±0,29 1,61±2,13 0,516π 0,280ɛ 0,001π 0,008ɛ 0,001π 0,071ɛ bei Normalverteilung:Verwendung von Messwiederholung; da kleine Stichprobe Verwendung der Greenhouse-Geisser-Korrektur ɛ keine Normalverteilung: Friedmans Zweifach-Rangvarianzenanalyse π In den LRS-Kammern ließ sich nur bei den nekrotischen Tregs eine signifikante Zunahme im Zeitverlauf nachweisen. Die apoptotischen Tregs zeigten nach 24 Stunden einen nicht signifikanten prozentualen Anstieg und fielen nur nach sechs Stunden und 48 Stunden nicht signifikant ab JC1 markierte Zellen im Aphereseprodukt Die mit JC1 markierten Lymphozyten in den Leukozytenkonzentraten zeigten im Zeitverlauf eine hochsignifikante Abnahme ihrer Vitalität, während der prozentuale Anteil der in Apoptose gegangenen Zellen hochsignifikant zunahm. Zum ersten

69 63 Messzeitpunkt konnten minimal 75,97% und maximal 96,60% vitale Lymphozyten nachgewiesen werden. Nach 48-stündiger Kurzzeitlagerung wurden Werte für die vitalen Lymphozyten zwischen 7,27% bis 84,86% sichtbar. Abb. 27: Vitale Lymphozyten in den Leukozytenkonzentraten im Zeitverlauf Die apoptotischen Lymphozyten in den Leukozytenkonzentraten wiesen am Beginn der Messung Werte zwischen 3,40% und 24,03% auf. Während nach sechsstündiger Lagerung ein maximaler Wert von 22,54% erreicht wurde, stieg mit längerer Lagerungszeit der prozentuale Anteil apoptotischer Lymphozyten mit maximalen 30,46% nach 24-stündiger Lagerung und maximalen 92,73% nach 48-stündiger Lagerung stetig an. Abb. 28: Apoptotische Lymphozyten in den Leukozytenkonzentraten