Berichte des Forschungszentrums Jülich 3938

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1 Berichte des Forschungszentrums Jülich 3938

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3 Ex vivo Expansion von humanen CMV spezifischen T-Lymphozyten im Bioreaktor Ulrike Hilbert

4 Berichte des Forschungszentrums Jülich ; 3938 ISSN Institut für Biotechnologie Jül-3938 D5 (Diss., Bonn, Univ., 2002) Zu beziehen durch : Forschungszentrum Jülich GmbH - Zentralbibliothek Jülich - Bundesrepublik Deutschland.^" / Telefax : 02461/ zb-publikation@fz-juelich.de

5 Abkürzungen ADCC AE AIDS APC ATCC BSA BHK bp BR CD CML CMV (HCMV) ConA CTL Cy d DC DMSO DNS DSMZ DTPA E EBV EDTA ELISA ER ESI Eu EZR F FACS FBS FcR FITC FSC g G GBF Gluc Gln Antibody Dependent Cytotoxicity Antikörper Einheiten Acquired Immunodeficiency Syndrome Antigenpräsentierende Zelle American Type Culture Collection Bovine Serum Albumin Baby Hamster Kidney Basen Paare Background, Hintergrundsignal Cluster of Differentiation Chronische Myeloische Leukämie Zytomegalievirus (humaner Zytomegalievirus) Concanavalin A Zytotoxische T-Lymphozyten CyChrome TM Tag Dendriten Dimethylsulfoxid Desoxyribonukleinsäure Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Diethylenetriamine Pentaacetic Acid Effektorzelle Epstein-Barr-Virus Ethylendiamintetraessigsäure Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay Endoplasmatisches Retikulum Elektro Spray Ionisationsquelle Europium Extrazellulärraum Farad Fluoreszenzaktivierter Zellsortierer Fetal Bovine Serum kristallisierbares Fragment - Rezeptor Fluorescein Isothiocyanat Forward Scatter Gramm Golgi Apparat Gesellschaft für Biotechnologische Forschung in Braunschweig Glukose Glutamin

6 II GM-CSF Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor GvH Graft-versus-Host Gy Gray h Stunde HbsAg Hepatitis-B-surface-Antigen HCV Hepatitis-C-Virus hhiq-plasma Quarantäne-Plasma (Typ AB) HIV Human Immunodeficiency Virus HLA Human Leucocyte Antigen HPLC High Performance Liquid Chromatography HS Humanes Serum HSV Herpes Simplex Virus IE Immediate Early IFN Interferon IgG Immunglobulin G IL Interleukin Ile Isoleucin L Liter LAK Lymphokin-aktivierte Killerzellen LDA Limiting Dilution Analysis Leu Leucin m milli mab monoklonaler Antikörper MACS Magnetic Cell Sorter MALT Mucosa Associated Lymphoid Tissue M-CSF Macrophage - Colony Stimulating Factor MEIA Mikropartikel-Enzymimmunoassay Met Methionin MG Molekular Gewicht MHC Major Histocompatibility Complex MNC Mononukleäre Zellen Mo Monozyten MR Maximal Release, maximale Freisetzung MTT Natrium (3-[4,5-Dimethylethiazol-2y1]-2,5-diphenyltetrazolium Bromid) n nano bzw. Anzahl der Versuche N Nukleolus n.b. nicht bestimmt NK Natürliche Killerzellen NTA Naphthoyl-Trifluoroacetone OTR Oxygen Transfer Rate OUR Oxygen Uptake Rate PBMC Periphere Blut mononukleäre Zellen PB S Phosphat-Buffered-Saline

7 III PCR Polymerase-Kettenreaktionstechnik PE Phycoerythrin PHA Phytohemagglutinin Phe Phenylalanin PI Propidium lodid PIP Phosphatidylinositol Bisphosphat PM Plasmamembran PMA Phorbol-12-Myristate-13-Acetat PWM Poeweed Mitogen P02 Sauerstoffpartialdruck pp Peptid RGT Reaktion-Geschwindigkeit-Temperatur (van't Hoff Regel) RNS Ribonukleinsäure rpm Umdrehungen pro Minute SEB Staphylococcus Enterotoxin B spez. spezifisch SR Spontan Release, spontane Freisetzung SSC Sideward Scatter T Zielzelle T75 75 cm2 Gewebekulturflaschen TAA Tumor Associated Antigen TAP Transporter Associated with Antigen Processing TH T-Helferzelle theo. theoretisch TIL Tumor-infiltrierende Lymphozyten TNF Tumor Nekrose Faktor Trp Tryptophan TZR T-Zellrezeptor U Unit Val Valin VZV Varizella Zoster Virus W Waschlösung XTT Natrium (2,3-bis [2-Methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl]-2H-tetrazolium-5- carboxanilid) Z Zytosol Z/mL Zellen/mL

8 IV NLVPMVATV HCMV Struktur Matrix Peptid pp6549s-sos N L V P M A T Asparagin Leucin Valin Prolin Methionin Alanin Threonin Warenzeichen Bezeichnung CASY CyChromeTM MACS Milli-Q Leukomax Cellferm-pro Inhaber Schärfe System GmbH, Reutlingen BD PharMingen, San Diego, CA, USA Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach Millipore Corporation, Bedford, MA, USA Novativ Pharma GmbH, Nürnberg DASGIP mbh, Jülich

9 Abbildungsverzeichnis Abb. 1-1 Konzept der Arbeit (APC = Antigenpräsentierende Zelle) 4 Abb. 2-1 Schematische Darstellung der Entwicklung der lymphoiden und myeloiden Zellen des Immunsystems. Zur Vereinfachung wurden die Zwischenstufen nicht dargestellt 8 Abb. 2-2 Expression von charakteristischen Oberflächenmoleküle und Sekretion von Zytokinen auf Dendriten (nach Banchereau und Steinman, 1998) 13 Abb. 2-3 An der Aktivierung von T-Lymphozyten beteiligte Oberflächenmoleküle (Z = Zytosol, PM = Plasmamembran, EZR = Extrazellulärraum) 15 Abb. 2-4 Schematische Darstellung der Phasen der Immunantwort (nach Michal, 1999) 19 Abb. 2-5 Schematische Darstellung der Adoptiven Immuntherapie 21 Abb. 2-6 Schematische Darstellung der infektiösen Komplikationen nach einer Stammzelltransplantation (nach Einsele und Kanz, 1999) 22 Abb. 2-7 Schematische Darstellung der an einer CMV-Infektion beteiligten Komponenten (nach Rentenaar et al., 2000) 26 Abb. 2-8 Schematische Darstellung der Kultivierungsmöglichkeiten von T-Lymphozyten 34 Abb. 2-9 Schematischer Ablauf der Generierung von Dendriten aus CD14+-Monozyten (nach Cella et al., 1997) 35 Abb. 3-1 Schematische Darstellung des Kultivierungssystem Cellferm -pro 51 Abb. 3-2 Schematische Darstellung des kontrollierten Suspensionsreaktors 52 Abb. 3-3 Prinzip der Zellrückhaltung 52 Abb. 3-4 Fotographie des kontrollierten Suspensionsreaktors 53 Abb. 3-5 Schematischer Ablauf des Zytotoxizitätstests (T = Zielzelle, E = Effektorzelle, EU 3+ = Europium als Komplex gebunden) 58 Abb. 3-6 Prinzip des IFN-y Sekretionstests (nach Manz et al., 1995) 60 Abb. 3-7 Schematische Abbildung der Intrazellulären Zytokin Markierung (N = Nukleolus, ER = Endoplasmatisches Retikulum, G = Golgi-Apparat; nach einer Produktbeschreibung der Firma Becton Dickinson) 62 Abb. 4-1 Durchflusszytometrische Untersuchung verschiedener Zellpopulationen nach polyklonaler Stimulation mit monoklonalen Antikörpern 64 Abb. 4-2 Einfluss der Zelldichte auf den Expansionsfaktor polyklonal stimulierter T- Lymphozyten (A : Z/mL ; B : 2, Z/mL ; C : Z/mL; D : Z/mL) 67 Abb. 4-3 Expansion CD8+-T-Lymphozyten mit Variation der Temperatur 69

10 VI Abb. 4-4 Einfluss des ph-wertes auf die Kultivierung polyklonal stimulierter T- Lymphozyten in Spinner-Flaschen des Cellferm-pro Systems 72 Abb. 4-5 Einfluss der Fütterungsstrategie auf die Kultivierung humaner T-Lymphozyten 74 Abb. 4-6 Zerfall von Interleukin-2 bei einer Kulturtemperatur von 37 C im Medium ohne Konsument 77 Abb. 4-7 Verlauf der IL-2 Konzentration während der Kultivierung von T-Lymphozyten mit Variation der IL-2 Ausgangskonzentration 77 Abb. 4-8 Vergleichende Kultivierung von PBMCs in Spinner- und Gewebekulturflaschen mit einer Ausgangszelldichte von 5105 Z/mL bei einem Reaktionsvolumen von 30 ml 79 Abb. 4-9 Einfluss der diskontinuierlichen Zellfütterung auf den Verlauf der Wachstumsrate von PBMCs in Spinner-Flaschen 80 Abb A: Kultivierung aktivierter PBMCs im Suspensionsreaktor mit Zellrückhaltung und im 20 L Standard-Rührkessel ; B : Verlauf des Kulturvolumens während der Kultivierung aktivierter PBMCs im Suspensionsreaktor und im 20 L Rührkessel 81 Abb Einfluss der kontinuierlichen Zellfütterung auf den Verlauf der Wachstumsrate von PBMCs im kontrollierten Suspensionsreaktor und 20 L Standard- Rührkessel 83 Abb Einfluss des verwendeten Kultursystems auf die Proliferation von aktivierten PBMCs (A : Suspensionsreaktor ; B: Gewebekulturflasche) 85 Abb Füllvolumen und Restkonzentration von Glukose im Suspensionsreaktor 85 Abb. 5-1 Prozentualer Anteil von T- und B-Lymphozyten, Monozyten und Natürlichen Killerzellen nach der Aufarbeitung von 34 verschiedenen Blutspenden 92 Abb. 5-2 Generierung reifer Dendriten aus adhärenten Monozyten mit GM-CSF, IL-4 und ab Tag 6 zusätzlich mit TNF-a 94 Abb. 5-3 Mikroskopische Aufnahme einer aus Monozyten generierten dendritischen Zelle (DC) mit einem T-Lymphozyt (T), Vergrößerung 40x 95 Abb. 5-4 Einfluss von TNF-a auf die Expression kostimulatorischer Oberflächenmoleküle bei der Generierung von Dendriten 96 Abb. 5-5 Verteilung von charakteristischen Molekülen zur Antigenpräsentation auf Zellpopulationen in PBMCs 97 Abb. 5-6 Expression charakteristischer Oberflächenmoleküle von verschiedenen APCs 98 Abb. 5-7 Verlauf der Kultivierung polyklonal stimulierter T-Lymphozyten 2 verschiedener Spenden bei Variation des Serums 103 Abb. 5-8 Variation des Widerstands während der Elektroporation von zwei Zelllinien (Ansatz A: 100 S2, Ansatz B : 200 S2) 110 Abb. 5-9 Bestimmung der Europiumkonzentration in den Waschlösungen (W) nach Elektroporation der K

11 VII Abb Verschiedene Reagenzien zur Totallyse für die Bestimmung der spontanen Freisetzung (Ansatz A: 2% Triton X 100 ; Ansatz B: 25% Ethanol) 112 Abb Spontane Freisetzung von Europium von verschiedenen Zelllinien bei Variation der Inkubationsdauer 113 Abb Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs eines Versuchs zur Generierung spezifischer Zellen 115 Abb Kultivierung HCMV spezifischer T-Lymphozyten mit Variation der Zellzahlverhältnisse zwischen APC und T-Lymphozyten 117 Abb Untersuchung der Zytolysefähigkeit von HCMV spezifischen T-Zellen bei Variation des Zellzahlverhältnisses zwischen APC und T-Lymphozyten an Tag 20 (V1) 119 Abb Untersuchung der Zytolysefähigkeit von HCMV spezifischen T-Zellen bei Variation der antigenpräsentierenden Zelle an Tag 22 (V2) 119 Abb Kultivierung HCMV spezifischer T-Lymphozyten mit Variation der antigenpräsentierenden Zellen (V2) 121 Abb Kultivierung Peptid spezifischer T-Lymphozyten mit Variation des Serums (A : FBS, B : hhiq-plasma, C : HS (Lot : ), D : HS (Lot : 099H0614)) 123 Abb Vergleich der Stimulierung bei intrazellulärem Nachweis von IFN-y (A : spezifisch generierte Zellen ; B: aufgetaute PBMCs) 129 Abb Vergleich des Sekretionstests und intrazellulärem Detektionstest zum Nachweis IFN-,-T-Lymphozyten (A : spezifisch generierte Zellen; B : aufgetaute PBMCs) 130 Abb Gesamtexpansion und Expansion CD4+IFN-,-T-Zellen nach Variation der Pulszeit des Antigens (A : 6 h, B: 24 h, C: unstimuliert) 132 Abb Einfluss der IL-2 Zugabe auf die Kultivierung von HCMV spezifisch aktivierten T-Zellen (A: IL-2 ab d7 ; B : IL-2 ab d5 ; C : IL-2 ab d2 ; D: unstimuliert) 134 Abb Einfluss der APCs zur Induktion auf die Kultivierung von HCMV spezifischen T-Lymphozyten ; Tag 21 (A: DCs, B : akt. T-Zellen, C : unstimuliert) 137 Abb Einfluss der Zelldichte auf die Kultivierung von HCMV spezifischen T-Zellen (A : Z/mL, B : I_106 Z/mL, C : Z/mL, D : unstimuliert) 139 Abb Einfluss der Zelldichte auf die Expansion spezifischer Zellen ; Tag 20 (A : Z/mL, B : Z/mL, C : Z/mL) 139 Abb Einfluss der Zellzahlverhältnisse zwischen APC und T-Lymphozyten auf die Expansion spezifischer Zellen (A : 1 :3, B : 1 :10, C : 1 :20) 141 Abb Einfluss der Ausgangspopulation und der Zelldichte auf die Expansion spezifischer T-Zellen (A : Z/mL, ohne Mo ; B : Z/m_L, mit Mo ; C: Z/mL, ohne Mo ; D: Z/mL, mit Mo) 143

12 VIII Abb Einfluss des Zelltyps zur 1. Restimulation auf die Kultivierung von HCMV spezifischen T-Zellen (A : PBMCs, B : akt. T-Zellen, C : unstimuliert) ; dargestellt ist die Expansion aller Zellen 145 Abb Einfluss der APCs zur Restimulation und der Zelldichte auf die Expansion spezifischer T-Zellen; Tag 20 (A : Z/mL, DC ; B : Z/mL, PBMC + «CD28 mab; C : 5105 Z/mL, DC ; D: 5105 Z/mL, PBMCs + «CD28 mab) 148 Abb Einfluss verschiedener Kultursysteme und Kultivierungstemperaturen auf die Generierung spezifischer Zellen (A : 6 Lochplatte, 37 C ; B : 6 Lochplatte, 38,5 C ; C: Spinner-Flasche, 37 C) 156 Abb Kultivierung spezifischer Zellen in Spinner-Flaschen mit Variation der Zelldichte (A : Spinner, 1_106 Z/mL ; B : Spinner, Z/mL) 158 Abb Kultivierung HCMV spezifischer T-Zellen im Suspensionsreaktor und Gewebekulturflasche (R1) 161 Abb Wachstumsraten von PBMCs nach HCMV spezifischer Kultivierung in verschiedenen Kultursystemen (Rl) 162 Abb Durchflusszytometrische Charakterisierung der CD4+- und CD8+-T- Lymphozyten im Suspensionsreaktor über eine Kulturdauer von 20 Tagen (R1) 163 Abb Gemessene ph- und p02-werte während der Kultivierung spezifischer Zellen im Suspensionsreaktor (R3) 166 Abb Kultivierung HCMV spezifischer T-Zellen im Suspensionsreaktor und in der Gewebekulturflasche (R3) 167 Abb Anteil IFN-y-T-Lymphozyten im Verlauf der Kultivierung im Reaktor (R3) 169 Abb Expansion der CD4+- und CD8+-T-Lymphozyten über eine Kulturdauer von 28 Tagen im Suspensionsreaktor (R3) 169 Abb Vergleich der Wachstumsraten und Anzahl spezifischer T-Lymphozyten verschiedener Arbeitsgruppen 173

13 IX Tabellenverzeichnis Tab. 2-1 Zelluläre und lösliche Komponenten des Immunsystems 10 Tab. 2-2 Einteilung der T-Helferzellen in Subpopulationen 17 Tab. 2-3 Überblick der in der adoptiven Immuntherapie eingesetzten Kulturtechniken 28 Tab. 3-1 Eingesetzte HCMV-Antigene 41 Tab. 3-2 Übersicht über die eingesetzten humanen HS-Chargen 44 Tab. 3-3 Verendete Antikörper für die Durchflusszytometrie (siehe auch Anhang ; FITC = Fluorescein Isothiocyanat; PE = Phycoerythrin) 47 Tab. 3-4 Zytokine zur Generierung von Dendriten 48 Tab. 3-5 Durchflusszytometrische Färbungen von Dendriten und PBMCs (Cy = CyChrome TM, FITC = Fluorescein Isothiocyanat, PE = Phycoerythrin) 56 Tab. 3-6 Antikörper für die hnmunfluoreszenz Färbung intrazelluläre Zytokine 62 Tab. 4-1 Parameter zur polyklonalen Stimulation humaner T-Lymphozyten 63 Tab. 4-2 Kulturparameter zur Untersuchung verschiedener Zelldichten nach einer einheitlichen Stimulationsphase 66 Tab. 4-3 Durchschnittliche Wachstumsraten und Verdopplungszeiten von polyklonal stimulierten T-Lymphozyten nach 10 Tagen Kultivierung mit Variation der Zelldichte 67 Tab. 4-4 Parameter zur Untersuchung des Temperatureinflusses 68 Tab. 4-5 Osmolalitäten verschiedener Standardmedien für die Kultivierung humaner T- Lymphozyten 70 Tab. 4-6 Kulturparameter zur Untersuchung des ph-wertes auf die Proliferation humaner T-Lymphozyten 71 Tab. 4-7 Kulturparameter zur Untersuchung verschiedener Fütterungsstrategien 73 Tab. 4-8 Durchschnittliche Wachstumsraten und Anteil der Restkonzentrationen von Glukose und Glutamin am 10. Tag der Kultivierung bei Variation der Fütterungsstrategie (Ausgangskonzentration Glukose : 5,5 mmol/l ; Glutamin : 1,8 mmol/l) 75 Tab. 4-9 Kulturparameter zur Untersuchung des Einflusses verschiedener IL-2 Konzentrationen 76 Tab Kulturparameter zur vergleichenden Kultivierung von PBMCs in Spinner- und Gewebekulturflaschen 78 Tab Parameter zur vergleichenden Kultivierung von PBMCs in Gewebekulturflasche und Suspensionsreaktor 84

14 Tab Bestimmung von Subpopulationen und HCMV spezifischen T-Lymphozyten zu Beginn und im Verlauf der Kultivierung in verschiedenen Kultursystemen 84 Tab. 5-1 Versuchsparameter der Generierung von Dendriten 93 Tab. 5-2 Expression charakteristischer Oberflächenmoleküle aufreifen Dendriten 95 Tab. 5-3 Vergleich von generierten Dendriten aus kryokonservierten und frisch aufgearbeiteten PBMCs 99 Tab. 5-4 Parameter der Untersuchung des Substratverbrauches bestrahlter T-Zellen und Dendriten als -PCs 101 Tab. 5-5 Zellspezifische Glukoseverbrauchsraten bestrahlter T-Zellen und Dendriten nach 21 Tagen Kultivierung (Glukose-Konzentration des Kulturmediums = 10,2 mmol/l) 101 Tab. 5-6 Parameter der Untersuchung der Variation des Serums 102 Tab. 5-7 Parameter der Untersuchung für eine stabile Markierung der Zielzelllinien mit Europium 109 Tab. 5-8 Parameter zur Untersuchung von Zellverhältnissen zwischen APC und T- Lymphozyten (V1) 116 Tab. 5-9 Parameter zur Untersuchung der APC zur Generierung von spezifischen T- Lymphozyten (V2) 118 Tab Verteilung von CD4+- und CD8+-T-Lymphozyten und NK-Zellen während der Kultivierung von V1 (Ansatz C) und V2 (Ansatz A) 120 Tab Parameter zur Generierung Peptid spezifischer T-Lymphozyten mit Variation des Serums 122 Tab Durchflusszytometrische Untersuchung und Zytotoxizitätstest von der Kultivierung HCMV spezifischer Zellen bei Variation des Serums 124 Tab Parameter zur Untersuchung der Pulszeit von Protein mit APCs 132 Tab Kulturparameter zur Untersuchung des Zeitpunkts der IL-2 Zugabe 133 Tab Expansionsfaktoren und durchflusszytometrische Charakterisierung der Kultur 134 Tab Kultivierung HCMV spezifischer Zellen mit Variation des Serums, d Tab Kulturparameter der APCs zur Induktion 136 Tab Variation der APCs zur Induktion; Expansion am Tag Tab Parameter zur Untersuchung von Zellzahlverhältnissen zwischen APC und T- Lymphozyten 141 Tab Ergebnisse der Kultivierung spezifischer Zellen mit Variation des Zellzahlverhältnisses zwischen APC und T-Lymphozyten 142 Tab Kulturparameter zur Untersuchung der Ausgangspopulation in Kombination mit der Zelldichte 143

15 XI Tab Untersuchung der Parameter zur Restimulation 144 Tab Ergebnisse der Kultivierung spezifischer Zellen mit Variation der APCs zur 1. Restimulation 146 Tab Kulturparameter zur Untersuchung der APCs zur Restimulation in Kombination mit der Zelldichte 147 Tab Abhängigkeit der Expansion spezifischer Zellen von der Reinheit der Dendriten zu Beginn des Versuches 150 Tab Kulturparameter zur Untersuchung verschiedener Kultursysteme und Kultivierungstemperatur 155 Tab Kultivierung spezifischer Zellen in Spinner-Flaschen mit Variation der Zelldichte 157 Tab Kulturparameter zur Generierung von HCMV spezifischen T-Zellen im Suspensionsreaktor 159 Tab Prozentualer Anteil der Restsubstratkonzentrationen und zellspezifischen Verbrauchsraten für Glukose und Glutamin am Tag 10 für den Suspensionsreaktor (R1) 163 Tab Kulturparameter zur Generierung von HCMV spezifischen T-Zellen im Suspensionsreaktor (R3) 165 Tab Prozentualer Anteil der Restsubstratkonzentrationen und zellspezifischen Verbrauchsraten für Glukose und Glutamin am Tag 18 für den Suspensionsreaktor (R3) 167 Tab Prozentualer Anteil der Restsubstratkonzentrationen und zellspezifischen Verbrauchsraten für Glukose und Glutamin am Tag 18 für das statische Kultursystem (R3) 168 Tab Versuchsparameter zur Generierung spezifischer T-Lymphozyten verschiedener Arbeitsgruppen 171 Tab. 6-1 Kalkulation des Kulturvolumens zur Generierung 109 spezifischer Zellen aus polyklonal stimulierter T-Lymphozyten 178 Tab. 6-2 Kalkulation des Kulturvolumens zur Generierung 109 spezifischer Zellen aus spezifisch aktivierten T-Lymphozyten 179

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17 Inhaltsverzeichnis Abkürzungen I Abbildungsverzeichnis V Tabellenverzeichnis IX 1. Einleitung und Aufgabenstellung Einleitung Aufgabenstellung Theoretischer Hintergrund Anatomie des Immunsystems Physiologie der Immunantwort Erkrankungen des Immunsystems Ex vivo Aktivierung und Kultivierung humaner T-Lymphozyten Material und Methoden Arbeiten mit primären Zellen und Zelllinien Medien und Medienanalytik Zytokine und Antikörper Kultursysteme Zellanalytik Überprüfung der Funktionalität antigenspezifischer T-Lymphozyten Verfahrensentwicklung polyklonal stimulierter T-Lymphozyten Polyklonale Stimulation von PBMCs mit monoklonalen Antikörpern Verfahrenstechnische Parameter zur Kultivierung von aktivierten T-Lymphozyten Kultivierung von aktivierten T-Zellen in Spinner- und Gewebekulturflaschen Kultivierung von aktivierten T-Zellen im kontrollierten Suspensionsreaktor und 20 L Rührkessel Diskussion

18 5. Verfahrensentwicklung monoklonal stimulierter T-Lymphozyten Grundlegende Voruntersuchungen Generierung von HCMV Peptid spezifischen T-Lymphozyten Parameter zur Generierung HCMV Protein spezifischer T-Lymphozyten Kultivierung spezifischer Zellen in verschiedenen Kultursystemen Schlussfolgerung Isolierung spezifischer Zellen aus einer Blutspende zur Prophylaxe Isolierung spezifischer Zellen aus polyklonal stimulierten T-Lymphozyten Monoklonale spezifische Generierung zur Behandlung einer Virusinfektion Ausblick B. Zusammenfassung Literaturverzeichnis XIII Anhang XXXIII

19 1. Einleitung und Aufgabenstellung 1.1. Einleitung Das Immunsystem hat die Aufgabe, den Organismus vor Infektionen oder malignen Veränderungen zu schützen. Eine Schwächung des Immunsystems durch Krankheit oder therapeutische Maßnahmen, z.b. nach einer Knochenmarktransplantation bei Patienten mit Leukämie, verringert häufig dessen Funktion. Infektionen, wie sie durch den Zytomegalievirus (HCMV) verursacht werden und normalerweise harmlos verlaufen, können für den immungeschwächten Patienten lebensbedrohlich werden. Schon vor einhundert Jahren versuchte William B. Coley, durch körpereigene Bestandteile des Immunsystems den Krebs zu bekämpfen. In der Hoffnung, dass durch eine unspezifische Stimulierung die körperliche Abwehr gegen das entartete Gewebe mobilisiert würde, wurden austherapierte Patienten mit lebenden Krankheitserregern infiziert (Old, 1992). Inzwischen ist man dazu übergegangen, mit spezifischen Immuntherapien die Krebszelle oder virusinfizierte Zelle gezielt zu behandeln. Neben der passiven Immunisierung auf Antikörper-Basis und der aktiven Immunisierung auf Vakzine-Basis, stellt die adoptive Immuntherapie eine hoffnungsvolle Alternative dar (Curti, 1997 ; Yee et al., 1997). Bei dieser Form der Therapie werden dem Patienten entnommene Zellen, z.b. dendritische Zellen oder T-Lymphozyten, außerhalb des Körpers kultiviert, expandiert (d.h. in vitro vermehrt) und/oder genetisch modifiziert (Rosenberg et al., 1986 ; Nikol und Höfling, 1996). Diese vermehrten bzw. veränderten Zellen werden dem Betreffenden wieder injiziert. Für eine erfolgsversprechende Therapie werden zwischen 10 9 (z.b. HCMV spezifische T-Lymphozyten) und Zellen (unspezifische LAK oder TIL Zellen) benötigt (Greenberg et al., 1998). Um diese Zellmengen, die nicht aus einer einzelnen Blutspende gewonnen werden können, zu generieren, werden labortypische, statische Kultursysteme wie Milcrotiterplatten oder Gewebekulturflaschen häufig in großer Zahl parallel betrieben (Rosenberg et al., 1985). Neben dem großen Arbeits- und Kostenaufwand besteht ein hohes potentielles Risiko einer Kontamination durch Mikroorganismen. Zur Generierung klinisch relevanter Zellmengen ist man bestrebt, die herkömmlichen Methoden durch neue Techniken mit kontrollierten und geregelten Bedingungen mit reproduzierbaren Prozessabläufen und reduziertem Risiko einer Kontamination zu ersetzen. Dabei ist insbesondere ein kontrollierter Austausch verbrauchten Kulturmediums, die Prozesskontrolle von ph, P02 und Temperatur, sowie eine vereinfachte Probenahme und Zellernte von besonderem Interesse (Armstrong et al., 1995). Die Etablierung von hochzelldichten Kultursystemen zur Produktion virus- bzw.

20 tumorspezifischer T-Zellen könnte ein erster Schritt für den Gebrauch als klinisches System sein Aufgabenstellung Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, ein Verfahren für die Generierung spezifischer T- Lymphozyten zu entwickeln. Zuvor erfolgt die Etablierung der Charakterisierung von Immunzellen in vitno. Neben der ausführlichen Bestimmung von Oberflächenmolekülen mittels Durchflusszytometrie wird die Effektorfunktion der Immunzellen charakterisiert (Zytotoxizitätstest gegen spezielle Zelllinien, IFN-y Sekretionstest, Intrazelluläre Detektion von IFN-y). Als biologisches Modell wird die Generierung von Zytomegalievirus spezifischen T-Lymphozyten aus peripherem Blut (PBMC) verwendet. Dabei sollen zwei verschiedene Konzepte untersucht werden, eine polyklonal unspezifische Stimulierung und eine monoklonal spezifische Stimulierung (Abbildung 1-1). Charakterisierung von Immunzellen in vitro Polyklonal (unspezifisch) Untersuchung Aktivierung der Kultur- "' über Antikörper bedingungen Monoklonal (spezifisch). Aktivierung. Untersuchung über APCs der Stimulationsbedingungen Expansion unspezifischer T-Zeilen im Bioreaktor Isolierung spezifischer T-Zellen Kultivierung und Expansion spezifischer T-Zellen im Bioreaktor Abbildung 1-1 : Konzept der Arbeit (APC = Antigenpräsentierende Zelle)

21 1. Einleitung und Aufgabenstellung 5 Polyklonal (unspezifisch) Ein mögliches Konzept der Generierung HCMV spezifischer T-Lymphozyten besteht in der unspezifischen polyklonalen Aktivierung und Vermehrung von T-Lymphozyten und der anschließenden Isolierung der HCMV spezifischen Zellen. Nach einer selektiven Aktivierung der humanen T-Lymphozyten über monoklonale Antikörper, werden im kleinen Maßstab, verfahrenstechnische Parameter wie Zelldichte, Osmolalität, Temperatur, PH, P02, Medienbestandteilen und Zellfütterung untersucht. Anschließend soll, nach einer Übertragung der optimierten Kultivierungsbedingungen und Medienbestandteilen auf hochzelldichte Kultursysteme wie Suspensionsreaktor und Rührkessel, die Spezifität der expandierten T- Zellen überprüft werden. Monoklonal (spezifisch) Ein weiteres Konzept beruht auf der Generierung spezifischer T-Lymphozyten mittels Antigenpräsentierender Zellen (z.b. Dendriten). Zielsetzung dieses Konzeptes ist es, die Stimulationsparameter für die Generierung von HCMV spezifischen T-Lymphozyten zu untersuchen (z.b. Antigenpräsentierender Zelle, Verhältnis zwischen APC und T- Lymphozyten, Restimulation). Hierdurch soll die Kultivierung und Expansion dieser Zellen in kontinuierlicher Kultur, z.b. im Suspensionsreaktor, vorbereitet werden. Durch die Übertragung der untersuchten Stimulationsparameter auf hochzelldichte Kultursysteme wird die Generierung von HCMV spezifischen T-Lymphozyten im klinisch relevanten Maßstab angestrebt.

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23 2. Theoretischer Hintergrund Die Aufgabe des Immunsystems ist es, den Organismus vor schädigenden Infektionen und Veränderungen zu schützen. Dies erfolgt in erster Linie durch die Unterscheidung zwischen körperfremden und körpereigenen Strukturen. Anschließend erfolgt die Eliminierung von veränderten Zellen bzw. Mikroorganismen. Die Wirkungsweise und Funktion des Immunsystems bei diesen Aufgaben ist äußerst vielfältig. Um diese Funktionen zu erfüllen, setzt es eine Reihe von unterschiedlichen Erkennungssystemen und Folgereaktionen, sogenannte Effektormechanismen, in Gang Anatomie des Immunsystems Der zelluläre Teil des Immunsystems besteht aus drei verschiedenen Zelltypen. Dazu gehören lymphoide und myeloide Zellen sowie spezialisierte epitheliale Zellen. Diese Zellen proliferieren und differenzieren im retikulären Bindegewebe, welches das Gerüst der lymphatischen Organe bildet. Sowohl die lymphoiden Zellen (Lymphozyten) als auch die myeloiden Zellen (Granulozyten, Monozyten/Makrophagen, Erythrozyten und Thrombozyten) stammen von einer pluripotenten hämatopoetischen Stammzelle ab. Diese Stammzelle ist beim Embryo bis Ende des zweiten Monats im Dottersack, danach in der Leber lokalisiert. Beim Erwachsenen befinden sich diese Stammzellen im Knochenmark. Abbildung 2-1 gibt einen Überblick der Entwicklung der lymphoiden und myeloiden Zellen des blutbildenden Systems. Damit ein ausreichendes Repertoire an lymphoiden und myeloiden Vorläuferzellen gewährleistet ist, erfolgt zunächst eine kontinuierliche, antigen-unabhängige Teilung der pluripotenten hämatopoetischen Stammzelle. Jede der hämatopoetischen Entwicklungslinien entwickelt sich über zahlreiche Zwischenstufen und unter Einwirkung von Wachstumsfaktoren zu der endgültigen Form, wie sie schließlich im Blut zu finden ist (Kramer, 1997). Aus der myeloiden Vorläuferzelle entwickeln sich sämtliche Granulozyten, Monozyten/Makrophagen (phagozytische Zellen), dendritische Zellen (professionelle antigenpräsentierende Zellen), Mastzellen (verantwortlich für allergische Reaktionen), Erythrozyten (rote Blutkörperchen für den Sauerstofftransport) und Thrombozyten (essentiell für die Blutgerinnung bei Gewebeverletzungen). Aus den lymphoiden Vorläuferzellen entstehen die B- und T-Lymphozyten sowie Natürliche Killerzellen. Die T-Lymphozyten wiederum können in zytotoxische CD8+-T-Lymphozyten, inflammatorische CD4+-T-

24 Lymphozyten und CD4+-T-Helferlymphozyten unterteilt werden. ihrer Effektorfunktion (Janeway und Travers, 1995). Sie unterscheiden sich in h~ice \'c ;rlii~ h v~elle LerC ~Im tle \ tl :iolcr~z :" Ile lut und sekundäre lymphatische Organe 0 öa 80 Erythrozyten Thrombozyten Granulozyten Monozyten B-Zellen T-Zellen NK-Zellen Peripheres Gewebe Effektorzellen Dendriten Plasmazellen CD4'-T-Zellen CD$'-T-Zellen Abbildung 2-1 : Schematische Darstellung der Entwicklung der lymphoiden und myeloiden Zellen des Immunsystems. Zur Vereinfachung wurden die Zwischenstufen nicht dargestellt. Anhand von Oberflächenmolekülen lassen sich Säugetierzellen charakterisieren. So entwickeln B- und T-Lymphozyten nach einer Aktivierung eine Reihe von charakteristischen Oberflächenmolekülen, anhand derer sich der Differenzierungsgrad der Zelle ablesen lässt. Viele membrangebundene Rezeptormoleküle, die bei einer immunologischen Reaktion beteiligt sind, können einer sog. Immunglobulin-Supergenfamilie zugeordnet werden. Charakteristisch für einen Teil der Mitglieder dieser Genfamilie ist die Immunglobulin (Ig)- Domäne", eine typische, räumliche Struktur und eine Länge von Aminosäuren. Genauso werden neben den Rezeptormolekülen, für die Aktivierung und die Zell/Zell- Interaktion der Lymphozyten essentielle Oberflächenmoleküle, in diese Immunglobulin- Supergenfamilie eingegliedert. Auch die Integrine bilden eine Superfamilie, die für die Zell/Matrix-Adhäsion und die Immunantwort von großer Bedeutung ist. Zur Vereinfachung wurde eine internationale Nomenklatur geschaffen : die sog. CD-Nomenklatur (CD = cluster of differentiation; Kramer, 1997 ; Singer et al., 1994).

25 2. Theoretischer Hintergrund 9 Weitere wichtige Bestandteile des Immunsystems sind die lymphatischen Organe. Sie werden aus Lymphozyten, Epithel- und Stromazellen aufgebaut. Bei diesen Organen unterscheidet man zwischen primären und sekundären lymphatischen Organen. Primäre lymphatische Organe In den primären lymphatischen Organen, zu denen Knochenmark und Thymus zählen, erfolgt u.a. die Lymphopoese (= Bildung der Lymphozyten aus der pluripotenten hämatopoetischen Stammzelle) und die Differenzierung zu immunkompetenten Lymphozyten. Im Knochenmark findet die Hämatopoese und somit auch die Bildung von lymphoiden Vorläuferzellen statt. Weiterhin differenzieren dort die Vorläufer-B-Zellen zu immunkompetenten B-Zellen aus. Nach einer Antigenstimulation können B-Lymphozyten in das Knochenmark zurückkehren und dort zu Antikörper produzierenden Plasmazellen ausdifferenzieren. Unreife Vorläufer-T- Lymphozyten wandern aus dem Knochenmark in den Thymus und differenzieren nach verschiedenen Selektionsmechanismen zu immunkompetenten T-Lymphozyten aus. Sekundäre lymphatische Organe Zu den sekundären lymphatischen Organen zählen die Lymphknoten, die Milz, die Tonsillen, das Schleimhaut-assoziierte lymphatische Gewebe (mucosa-associated lymphoid tissue, MALT) und Teile des Knochenmarks. Hier findet die Erkennung der Antigene und die Einleitung einer Immunantwort mit dem Ziel der Eliminierung des Antigens statt. Antigene können unterschiedlichen Substanzgruppen wie Proteinen, Sacchariden, Lipiden, Glykolipiden und Lipoproteinen angehören (Nossal, 1993) Physiologie der Immunantwort Funktionell wird die natürliche, angeborene, nicht adaptive Immunantwort von der spezifischen, erworbenen, adaptiven Immunantwort unterschieden. Beide bestehen aus verschiedenen zellulären und löslichen Komponenten, die bei der Ausbildung der Immunantwort eng zusammenarbeiten (Michal, 1999 ; Abbas und Janeway, 2000). In Tabelle 2-1 sind verschiedene Komponenten aufgelistet. Im Folgenden wird verstärkt auf die adaptive Immunantwort eingegangen.

26 10 Tabelle 2-1 : Zelluläre und lösliche Komponenten des Immunsystems nicht adaptive Immunantwort adaptive In munantwort Zellen Haut- und Mucosazellen B-Lymphozyten Phagozyten CD4+-T-Lymphozyten Natürliche Killerzellen CD8+-T-Lymphozyten Mastzellen Granulozyten Lösliche Komponenten Komplementfaktoren Akutphase-Proteine Zytokine Antikörper Zytokine Eine Immunreaktion löst bei aktivierten Lymphozyten Proliferation und Differenzierung zu speziellen Effektorzellen aus. Nach spezifischer Erkennung des Antigens ( klonale Selektion") über die Antigenrezeptoren vermehren sich die betreffenden Zellen ( klonale Expansion") und differenzieren zu den benötigten Effektorzellen. B-Lymphozyten differenzieren zu Plasmazellen, die Antikörpermoleküle produzieren und sezernieren. T- Lymphozyten können je nach Aktivierung einerseits zu zytotoxischen CD8+-T-Lymphozyten differenzieren, die durch Abgabe von Toxinen die Zielzelle eliminieren oder andererseits zu CD4+-T-Helferzellen, die durch Ausschüttung von Zytokinen die Fähigkeit besitzen, B Lymphozyten, Natürliche Killerzellen, CD8+-T-Lymphozyten und Makrophagen zu stimulieren (Abbas und Janeway, 2000) Antigenerkennung Zu einem funktionstüchtigen Immunsystem gehört eine ständige Wanderung der Lymphozyten zwischen dem Blut- und Lymphgefäßsystem. Pro Stunde sind 1-2% aller Lymphozyten im Gefäßsystem. B- und T-Lymphozyten weisen verschiedene Mechanismen der Antigenerkennung auf. Generell erfolgt die Antigenerkennung über spezifische Rezeptoren an der Zelloberfläche der Lymphozyten. B-Lymphozyten besitzen Immunglobuline (Antikörper) als Rezeptormoleküle und erkennen Antigene im extrazellulären Raum. Durch eine Bindung zwischen Antikörper und Antigen kommt es zur Aktivierung der B-Zelle und zur Sezernierung von löslichen Antikörpern. T-Lymphozyten hingegen haben sich auf die Erkennung von Antigenen bzw. deren Peptidfragmenten im intrazellulären Raum spezialisiert. Dazu wird das Antigen, zum Beispiel ein Protein, von antigenpräsentierenden Zellen aufgenommen und zunächst in ein niedermolekulares Peptid

27 2. Theoretischer Hintergrund 11 zerlegt. Dieses Peptid wird an sogenannte Trägermoleküle (MHC-Moleküle, major histocompatibility complex-moleküle) einer antigenpräsentierenden Zelle gebunden und dem T-Lymphozyten präsentiert. Dieser Vorgang wird als Antigenprozessierung bzw. Antigenpräsentation bezeichnet. T-Lymphozyten besitzen als spezifische Antigenrezeptoren den T-Zellrezeptor (TZR), ein Heterodimer aus zwei Glykoproteinen, der a- und der ß-Kette. Zellen, die sowohl eine a- als auch eine ß-Kette assoziiert haben, werden als ocß+-t-zellen bezeichnet. Zusätzlich sind die Oberflächenmoleküle CD4 oder CD8, die als sog. Korezeptoren fungieren, für eine Antigenbindung notwendig. Naive T-Zellen, die keinen TZR tragen und weder die Moleküle CD4 oder CD8 exprimieren, werden als doppelt negativ" (CD4 -CD8 -) bezeichnet. Reife T- Lymphozyten exprimieren nur eines der beiden Oberflächenmoleküle. Im Blut sind 65% der aß +-T-Zellen CD4 +CD8 - und 35% CD8 +CD4 -. Mit der Bindung des Antigen-MHC Komplexes an diese Rezeptoren ist eine Aktivierung der T-Zelle verbunden. Die DNS-Rekombination während der Lymphozytenreifung gewährleistet, dass jeder T- oder B-Zellklon eine individuelle genetische Information für die Ausbildung von Antigenrezeptoren bekommt (somatische Genumlagerung). Dies bedeutet, dass für jedes Antigen ein passender Antigenrezeptor zur Verfügung steht (Kramer, 1997 ; Janeway und Travers, 1995). Wie schon angedeutet, fungieren MHC-Moleküle als Bindungs- und Präsentationsmoleküle. Die MHC-Moleküle des Menschen werden auch als human leucocyte antigens" (HLA) bezeichnet und wurden bei genetischen Untersuchungen zur Transplantatabstoßung entdeckt. Anhand der Struktur kann man zwei MHC-Moleküle voneinander unterscheiden, die man als MHC-Klasse I-Moleküle" bzw. MHC-Klasse II-Moleküle" bezeichnet (Seliger et al., 2000). MHC-Klasse 1-Moleküle Von den MHC-Klasse I-Molekülen sind beim Menschen 3 Genloci und dementsprechend auch 3 Genprodukte bekannt, die man als HLA-A, HLA-B und HLA-C bezeichnet. Alle kernhaltigen Körperzellen und Thrombozyten exprimieren MHC-Klasse 1-Moleküle. Vor allem virale Proteine, die in das Zytoplasma einer Zelle gelangt sind, werden durch Proteasomen (= hochmolekulare Komplexe aus proteolytischen Enzymen) bis auf eine Länge von 9 bis 11 Aminosäuren abgebaut und in das Endoplasmatische Retikulum transportiert. Dieser Transport erfolgt durch Transportproteine (TAP-transporter associated with antigen processing). Im Endoplasmatischen Retikulum erfolgt eine Bindung zwischen MHC-Klasse I-

28 1 2 Molekülen und (viralem) Antigenpeptid. Nach anschließender struktureller Modifikation im Golgi-Apparat, wird das Antigen an der Zelloberfläche schließlich präsentiert. Das MHC- Klasse 1-Molekül besitzt eine Bindungsstelle für das CD8-Molekül (a3-domäne). MHC-Klasse 11-Moleküle Von den MHC-Klasse II-Molekülen sind ebenfalls 3 Genloci bekannt, HLA-DR, HLA-DP und HLA-DQ. Für jeden Genlocus existieren in der Bevölkerung multiple Allele (> 40). Der genetische Polymorphismus führt dazu, dass so gut wie kein Individuum einem anderen in dem Gesamtmuster seiner MHC-Moleküle gleicht. Die Allele der HLA Gene und somit die verschiedenen HLA-Antigene werden durchnummeriert. MHC-Klasse 11-Moleküle werden auf dendritischen Zellen (antigenpräsentierenden Zellen), Monozyten/Makrophagen und B- Zellen exprimiert. MHC-Klasse II-Moleküle unterscheiden sich in ihrer Antigenprozessierung von MHC-Klasse 1-Moleküle. Das Antigen wird hier (MHC 11) über Rezeptor-vermittelte Endozytose aus dem extrazellulären Raum aufgenommen und im Endolysosom teilweise in Antigenpeptide zerlegt. Frisch im Endoplasmatischen Retikulum synthetisierte MHC-Klasse II-Moleküle gelangen in das sog. loading compartment", in welchem eine Bindung zwischen MHC-Molekül und Antigenpeptid zustande kommt. Im Unterschied zum MHC-Klasse 1- Molekül ist die Bindungstasche des MHC-Klasse 11-Moleküls an beiden Enden offen, sodass Peptide mit einer Länge von 12 bis 24 Aminosäuren gebunden werden. Dieser gebildete Komplex wird an die Zelloberfläche transportiert. Das MHC-Klasse II-Molekül besitzt eine Bindungsstelle für das CD4-Molekül (ß2-Domäne). Dendriten (DC) Der Anteil derjeniger T-Zellen, die den für die Erkennung einer Peptid/MHC-Kombination notwendigen Antigenrezeptor exprimieren, sind in einem nichtimmunisierten Organismus sehr klein. Nur ein Lymphozyt aus 2 bis 4104 T-Lymphozyten exprimiert den TZR für eine entsprechende Peptid/MHC-Kombination. Eine zentrale Rolle bei dieser Antigenpräsentation spielen die antigenpräsentierenden Zellen, die Dendriten (Steinman, 1991 ; Hart, 1997 ; Banchereau und Steinman, 1998 ; Thery und Amigorena, 2001). Diese Zellen kommen in vielen nicht lymphatischen Geweben, wie Haut, Leber, Lunge und Darm, sowie in lymphatischen Geweben, Thymus und Tonsillen, vor. Durch das afferente Lymphgefäßsystem oder den Blutstrom gelangen Dendriten zu den lymphatischen Organen. Im Blut sind diese Zellen mit <1% der mononukleären Zellen zu finden. Dendriten besitzen einen sternförmigen Zellkörper mit langen Lamellipodien und kennzeichnen sich durch die Expression

29 2. Theoretischer Hintergrund 13 spezifischer Oberflächenmoleküle aus (Abbildung 2-2). Neben der Expression von MHC- Klasse Molekülen, die für die Präsentation des Antigens wichtig sind, werden auch zahlreiche Adhäsionsmoleküle und Moleküle zur Kostimulation (137.1 (CD80) und (CD86)) ausgebildet. Die Reifung der Dendriten zu effektiven antigenpräsentierenden Zellen kann in zwei Phasen untergliedert werden. In der ersten Phase können Dendriten über Rezeptor-vermittelte- Endozytose oder Macropinozytose große Mengen an Antigen aufnehmen (Lanzaveccia, 1996 ; Brossart und Bevan, 1997 ; Cella et al., 1997 ; Engering et al., 1997a/b). In der zweiten Phase durchlaufen diese Zellen eine Reifung und sind nun auf die Wanderung zu lymphatischen Organen und Präsentation des Antigens spezialisiert. Dabei wird unter dem Einfluss von proinflammatorischen Zytokinen (GM-CSF, TNF-0c) die Expression von MHC-Molekülen verstärkt und weitere Strukturen, die die Antigenprozessierung und Antigenpräsentation begünstigen, hochreguliert. Dabei ist eine reife dendritische Zelle in der Lage bis zu 100 T- Lymphozyten zu aktivieren. Anschließend wird eine Immunreaktion eingeleitet und es folgt die Eliminierung von veränderten oder infizierten Zellen (Tarr, 1996 ; Cella et al., 1997 ; Chapuis et al., 1997 ; Bottomly, 1999). Zytokine IL-12,IL-18, IL-6, IL-15, TNF andere Moleküle CD2, CD25, CD83 Antigenaufnahme Mannose Rezeptar, FcR, CD36 Antigenprozessierung Cystatin, DC-LAMP, Cathepsin Migration CD 11, CD49d, CD44, E-Cadherin Adhäsion und Kostimulation CD50, CD54, CD58 CD80, CD86 Antigenpräsentation MHC-Klasse I, MHC-Klasse II, CD1a Abbildung 2-2 : Expression von charakteristischen Oberflächenmoleküle und Sekretion von Zytokinen auf Dendriten (nach Banchereau und Steinman, 1998)

30 Aktivierung und Signaltransduktion Für eine vollständige, primäre antigen-spezifische Aktivierung von T-Lymphozyten werden zwei Signale benötigt. Das erste Signal besteht aus der Bindung des T-Zellrezeptors (TZR) an den Peptid/MHC-Komplex. Der TZR ist nicht-kovalent mit dem CD3 Molekülkomplex verbunden und besteht aus 3 membranverankerten Polypeptiden, unter anderem auch einer zytoplasmatischen Domäne, die eine Signalweiterleitung in das Zellinnere vermittelt. Ein kostimulatorisches Signal, das durch die Interaktion zwischen (CD80) bzw (CD86) auf der antigenpräsentierenden Zelle und CD28 auf den T-Lymphozyten hergestellt wird, bildet das zweite Signal. Die Bezeichnung der Oberflächenmoleküle und bzw. CD80 und CD86 werden in der Literatur parallel verwendet (de Boer et al., 1992 ; Favero und Lafont, 1998 ; Abbas und Janeway, 2000). Die wichtigste Funktion des kostimulatorischen Signals ist es, die Synthese von Interleukin-2 (IL-2; T-Zell- Wachstumsfaktor) zu unterstützen. Die Interaktion zwischen B7/CD28 wirkt sich positiv auf die Stabilisierung der IL-2-mRNS aus. Durch die Stabilisierung und gesteigerte Transkription der IL-2-mRNS steigt die IL-2 Produktion ca. um den Faktor 100. T-Zellen, die in Abwesenheit von kostimulatorischen Faktoren nur über den T-Zellrezeptor stimuliert werden, werden inaktiviert und als anerg bezeichnet (Ledbetter et al., 1990 ; Janway und Travers, 1995 ; Taams und Wauben, 2000). Weitere akzessorische Moleküle spielen bei der T-Zellaktivierung eine wichtige Rolle. können akzessorische Moleküle auf der einen Seite als Korezeptoren (die Moleküle CD4 und CD8) fungieren und auf der anderen Seite auch die Zell/Zell-Adhäsion zwischen T-Zelle und antigenpräsentierender Zelle bzw. abzutötender Zelle unterstützen (Abbildung 2-3). Eine komplette Aktivierung von T-Zellen über den TZR bei gleichzeitiger Kostimulation hat die Teilung und somit Vermehrung (Proliferation) der T-Zelle und ihre Reifung, d.h. Differenzierung in Effektorzellen, zur Folge. Second-messenger-Systeme sind für die Signalübertragung bei der T-Zellaktivierung verantwortlich. Eine wichtige Rolle dabei spielt der Anstieg zytoplasmatischer Cal+ - Konzentrationen und die Aktivierungen von Kaskaden verschiedener Kinasen. Diese Mechanismen entsprechen denen von nicht-lymphoiden Zellen (Abbas und Janeway, 2000). Diese Signalübertragung sorgt über die Transkription zahlreicher Gene für den Fortgang der T-Zellaktivierung und die Einleitung der Effektorfunktion (Kramer, 1997). So

31 2. Theoretischer Hintergrund 15 T-Zellrezeptor Antigen MHC-Klasse 11-Molekül MHC-Klasse 1-Molekiil CD28 Molekül _ 'i iiti - etip i lise titi ci,eiide B7 Molekül Abbildung 2-3 : An der Aktivierung von T-Lymphozyten beteiligte Oberflächenmoleküle (Z = Zytosol, PM = Plasmamembran, EZR = Extrazellulärraum) Proliferation und Reifung Nach einer vollständigen Aktivierung der T-Zelle wird die Vermehrung (Proliferation) eingeleitet. Aber auch Signale die Antigen unabhängig über Zell/Zell-Kontakte und über lösliche Faktoren vermittelt werden, müssen gesteuert, kontrolliert und aufeinander abgestimmt werden. Dieser geordnete Ablauf erfolgt durch Zell/Zell-Kommunikation der Zellen untereinander, in dem spezielle strukturelle Gruppen von Peptiden und Glykoproteine, die sog. Zytokine, eine bedeutende Rolle spielen. Die immunologisch aktiven Zytokine beeinflussen zelluläre und humorale Immunreaktionen, indem sie deren Qualität und Ausmaß mitbestimmen (DeBerardinis, 1991 ; Kramer, 1997). Die Freisetzung der Zytokine erfolgt durch Sekretion und ist zeitlich und räumlich begrenzt. Zytokine können mehrere unterschiedliche Zelltypen beeinflussen, d.h. sie sind pleiotrop. Die Wirkung der Zytokine auf eine Zelle erfolgt über spezifische Zytokinrezeptoren. Häufig wird durch Zytokine die Zellteilung induziert. Zytokine wirken auf der Ebene der Transkription, sind also für die Neusynthese von mrns verantwortlich. Die klonale Expansion antigenspezifischer T-Lymphozyten wird durch eine autokrine Reaktion (die relevanten Rezeptoren liegen auf der zytokinproduzierenden Zelle selbst) ausgelöst. Der ausschlaggebende proliferationsinduzierende Mediator ist IL-2. Andere Zytokine, wie zum Beispiel IL-4 oder IL-12, können bei bestimmten T- Lymphozytenpopulationen die Differenzierung in eine bestimmte Richtung fördern.

32 1 6 Naive Zellen sind meist kleine Zellen mit wenig Zytoplasma. Ein großer Teil des Chromatins liegt im Kern kondensiert vor und das Zytoplasma enthält kaum Organelle. Dieses morphologisch unscheinbare Bild ändert sich nach einer Antigenbindung und Aktivierung. In einem aktivierten Lymphozyten (Lymphoblasten) nimmt das Chromatin ab, Nucleoli erscheinen und das Volumen des Zytoplasmas nimmt stark zu. Weiterhin ist eine hohe Dichte an Mitochondrien und Endoplasmatischem Retikulum zu beobachten, was auf die Neusynthese von RNS und Proteinen hindeutet. In diesem Stadium beginnt die Zelle mit der Teilung und verdoppelt sich zwei- bis viermal täglich. Dieser Vorgang hält drei bis fünf Tage an. Die Zahl der CD8+-antigenspezifischen T-Lymphozyten kann in dieser Zeit um einen Faktor von zunehmen, was einer Verdopplungszeit von ca. 6 Stunden entspricht. Für CD4+-T-Lymphozyten liegt die Zunahme mit einem Faktor von 100 bis 1000 wesentlich niedriger (Janeway und Travers, 1995 ; Abbas und Janeway, 2000). Auch anhand der Änderung der Zelloberflächenmoleküle wird das Stadium der funktionellen Reife der T- Lymphozyten wiedergespiegelt Immunantwort Das Ziel der Proliferation ist es, neben antigenspezifischen Gedächtniszellen, die bei erneutem Kontakt mit diesem Antigen schneller und effizienter reagieren, antigenspezifische Effektor-T-Zellen auszubilden. Nach der vollständigen Reifung der Lymphozyten zu Effektorzellen kommt es zur Effektorreaktion und Sezernierung bestimmter Effektormoleküle. Die Aktivität der Effektorzellen eliminiert letztendlich das Antigen (den Krankheitserreger) und entfernt somit den auslösenden Reiz, wodurch die Immunantwort abklingt. Immunologische Effektormechanismen können nach ihrem Wirkprinzip eingeteilt werden. Bei der Neutralisation wird durch Bindung von Antikörpern die Toxizität und Infektiosität eines Mikroorganismus reduziert oder aufgehoben. Durch die Zytotoxizität werden infizierte Zielzellen lysiert. Krankheitsverursachende Mikroorganismen können in verschiedenen Kompartimenten des Körpers (Extrazellulärraum und Intrazellulärraum) vorkommen. Die adaptive Immunabwehr reagiert auf diese Infektionen mit drei verschiedenen T-zellvermittelten Effektorfunktionen. Antigene von Pathogenen, die sich im Zytoplasma eingenistet haben und vermehren, werden von MHC-Klasse I-Moleküle an die Zelloberfläche gebracht und den zytotoxischen CD8+-T- Zellen präsentiert. Sie leiten die Zytolyse der Zielzelle ein. Antigene von Krankheitserregern, die sich in intrazellulären Vesikeln vermehren, und solche, die von aufgenommenen extrazellulären Bakterien und Toxinen abstammen, werden von MHC-Klasse 11-Molekülen