Vom Gen zum Protein: Genexpression

Transkript

1 Vom Gen zum Protein: Genexpression Der gesamte Prozess, mit dem die genetische Information der DNA in das endgültige Genprodukt (meist ein Protein, aber auch trna, rrna*) umgesetzt wird, wird als Genexpression bezeichnet. Weil die Zelle nicht alle Genprodukte auf einmal und in gleicher Menge benötigt, sind die verschiedenen Schritte der Genexpression reguliert. *Die RNA, die für Proteine codiert heißt mrna (messenger RNA, Boten-RNA).

2 Vom Gen zum Protein: Genexpression Die Hauptkontrolle geschieht am ersten Schrittes der Genexpression, der Transkription. Gene, deren Produkt ständig für die alltäglichen Vorgänge der Zelle gebraucht werden ( house keeping genes ), werden ständig transkribiert (konstitutive Genexpression), bei anderen muß die Transkription speziell angeschaltet werden (Induktion), oder eine Hemmung der Transkription (Repression) muss ausgeschaltet werden.

3 Regulation der Transkription: das lac Operon Das als erstes und am besten studierte Regulationssystem der Transkription ist das lac-operon von E. coli (Jacob und Monod, 1961). Ein Operon ist eine Serie von Genen, die gemeinsam transkribiert werden. Die drei Gene des lac- Operons codieren für Proteine der Lactoseverwertung. Die β- Galactosidase (lacz) läßt sich besonders gut messen, da sie neben Lactose (wird zu Galactose + Glucose) auch 5- Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-Galactosid (X-Gal) zu einem blauen Farbstoff spaltet. Aufwendiger ist die Messung der Lactose-Permease (lacy) mit radioaktiv markierter Lactose.

4 Aufbau des lac Operons Vor den Genen liegt eine DNA-Region, die für die Kontrolle der Transkription verantwortlich ist, bestehend aus Operator und Promotor. Daneben liegt das Gen laci für das Regulatorprotein, den lac-repressor.

5 Regulation der Transkription: das lac Operon Wächst E. coli auf Glucose, enthält die Zelle kaum Enzyme des lac-operons. Nach Umsetzen auf Lactose-Medium steigt deren Konzentration in 20 Minuten über 1000fach an: Induktion der Genexpression. Erneuter Wechsel auf Glucose stoppt die Neubildung der Proteine (Repression der Genexpression) sehr schnell. Das wird auch dadurch möglich, weil die gebildete RNA eine kurze Lebensdauer hat, nach 3 Minuten ist sie bereits wieder abgebaut. Statt mit Lactose* läßt sich die Transkription auch mit dem künstlichen Induktor IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactosid) induzieren. Der experimentelle Vorteil ist, daß der Induktor nicht verbraucht wird, seine Konzentration also längere Zeit gleich bleibt.

6 Regulation der Transkription: das lac Operon *Der eigentliche natürliche Induktor ist gar nicht die Lactose (β - Galactosyl(1,4)-glucosid), sondern die Allolactose (β - Galactosyl(1,6)-glucosid), ein Isomer der Lactose. Wo kommt die Allolactose her? β -Galactosidase kann, statt die Lactose zu spalten, sie auch in Allolactose umbauen (Nebenreaktion, geschieht also in viel geringerem Ausmaß). Zum Anschalten des lac Operons muss also etwas β-gal vorhanden sein.

7 Natürliches Substrat Lactose, künstliches Substrat X-Gal und künstlicher Induktor IPTG Das lac Operon

8 Regulation der Transkription: das lac Operon

9 Regulation der Transkription: das lac Operon Mutanten der Genexpression lassen sich beim lac-operon leicht mittels X-Gal erkennen. Auf Kulturplatten mit Glucose und X-Gal bildet E. coli ungefärbte Kolonien, blaue Kolonien zeigen Mutanten mit konstitutiver Expression des lac-operons an.

10 Regulation der Transkription: das lac Operon In den meisten dieser Mutanten ist das laci-gen mutiert und damit das Repressor-Protein inaktiviert. Seltener sind Mutationen des Operator-Bereichs (O) vor den lac-genen, wo das Repressor-Protein sonst bindet und die Transkription verhindert. Diese Mutationen werden als O c (operator constitutive) bezeichnet. Wenn der lac-repressor an den (nicht-mutierten) Operatorbereich bindet, verhindert er, daß die RNA-Polymerase (die bereits am Promotor gebunden hat) das Operon transkribiert. Bindet Lactose (oder IPTG) an den Repressor, ändert er seine Konformation (verformt sich), löst sich dadurch vom Operator und gibt den Weg für die Polymerase frei.

11 Regulation der Transkription: das lac Operon Wie lassen sich die konstitutiv transkribierenden Mutanten in laci und O c unterscheiden? Die Operator-Mutation wirkt nur auf das Operon, vor dem sie im DNA-Strang liegt, sie wirkt in cis. Enthält die E. coli-zelle ein weiteres lac-operon (z.b. auf einem Plasmid oder F-Teilchen) mit unmutiertem Operator, so wird dies nicht konstitutiv transkribiert. Das laci-gen wirkt dagegen in trans, da es über ein diffusibles Produkt, das Repressorprotein, arbeitet. Ein unmutiertes laci kann alle lac-operons der Zelle abschalten, unabhängig davon, ob sie auf der selben DNA liegen wie es selbst, oder nicht.

12 Regulation der Transkription: das lac Operon O c wirkt in cis laci wirkt in trans.

13 Regulation der Transkription: das lac Operon Die Induktion des lac-operons funktioniert nur in Abwesenheit von Glucose. Die dann phosphorylierte Untereinheit EIIA des Phosphotransferasesystems (Glucose- Importer, wer kann sich noch daran erinnern?) aktiviert die Adenylatcyclase. Das entstehende camp bindet an ein Protein (CAP, Catabolit-Aktivator Protein), das dann die Bindung der RNA-Polymerase an den lac-promoter verstärkt. In Anwesenheit von Glucose hemmt die dann unphosphorylierte Untereinheit EIIA die Lactose-Permease, so dass keine Lactose in die Zelle gelangt und so keine Allolactose entstehen kann ( Inducer Exclusion - Ausschluss des Induktors).

14 Initiation der Transkription Das Umschreiben der DNA in RNA wird von RNA-Polymerasen durchgeführt. Bei Bakterien ist es ein großer Komplex (z.b. 465 kd mit σ 70 ) aus den Untereinheiten 2x α, β, β (und einem - nicht essentiellen - Stabilisierungs- und Assemblierungsfaktor ω) und Initiationsfaktor σ.

15 Initiation der Transkription Der Sigma-Faktor erkennt den Promotor. Die Kennsequenzen liegen jeweils 35 und 10 Basenpaare vor dem Startpunkt der Transkription (>bei -35 und -10, der Startpunkt ist +1). σ 70 bindet am besten an TTGACA bei -35 und TATAAT bei -10, kleine Abweichungen sind möglich, verringern aber die Transkriptionsrate (>Regulationsmöglichkeit für die Zelle).

16 Initiation der Transkription: Sigmafaktoren Neben einem Sigma-Faktor für die Transkription der meisten Gene (σ 70, 70 kd großes Protein) hat E. coli noch Sigma- Faktoren für Hitzeschockgene (σ 24, σ 32 ), für Stickstoff- Stoffwechselgene (σ 54, wird bei Mangel an Ammonium gebildet) und für die Flagellen-Biosynthese (σ 28 ), die jeweils unterschiedliche Bindungssequenzen haben.

17 Initiation der Transkription: Sigmafaktoren Die Sporulation von Bacillus subtilis wird durch eine Kaskade von Sigma-Faktoren gesteuert. So wird eine zeitliche Abfolge der Genexpression sichergestellt (frühe, mittlere, spätere Gene der Sporulation). Die Gene der Sigma-Faktoren werden jeweils durch den vorhergehenden Sigma-Faktor abgelesen.

18 Initiation der Transkription Nach dem Binden an den DNA-Doppelstrang ( geschlossener Komplex ) wird die DNA auf kurzer Strecke zur Transkriptionsblase aufgeschmolzen (dazu dient die AT-reiche -10 Region), so daß kurze Einzelstrangbereiche entstehen. Es werden die ersten 9 Nucleotide der neuen RNA gebildet, ohne daß sich der Enzymkomplex bewegt. Wenn das geklappt hat*, löst sich der Sigma-Faktor ab, der Rest der RNA-Polymerase wandert die DNA entlang und schreibt sie in RNA um, und der Promotorbereich steht für eine neue Initiation zur Verfügung. Diese Phase dauert 1-2 Sekunden, sie begrenzt die Häufigkeit, mit der ein Gen abgelesen werden kann. *sonst wird das kurze RNA-Stück freigesetzt (abortive Initiation) und ein neuer Versuch gestartet.

19 Initiation der Transkription

20 Fortschreiten der Transkription (Elongation) Die neue RNA beginnt mit einem Nucleosidtriphosphat, sie wird jeweils am 3 -OH-Ende verlängert. Dazu greift die Polymerase ein Trinucleotid, prüft, ob es passt und baut es ein bzw. läßt es wieder los. Erstaunlicherweise werden auch Nucleotidanaloga eingebaut, die keine Wasserstoffbrücken zur DNA-Base ausbilden können. Die Erkennung des richtigen Nucleotids erfolgt also wohl nicht über die Watson-Crick- Basenpaarung!!

21 Fortschreiten der Transkription (Elongation) Die RNA-Polymerase bewegt sich nicht kontinuierlich voran, sondern verkürzt und verlängert sich wie ein Regenwurm. Die Transkriptionsblase entwundener DNA wandert mit der Polymerase mit, da ebenso viele Basenpaare wieder hergestellt werden ( hinten ) wie aufgetrennt werden, ist dabei keine Energiezufuhr nötig.

22 Fortschreiten der Transkription Die RNA-Polymerase baut pro Sekunde etwa 40 Nucleotide ein, ist also etwa 20x langsamer als die DNA-Pol III (und etwa so schnell, wie die Ablesegeschwindigkeit der RNA durch das Ribosom bei der Translation). Was passiert, wenn die Replikationsgabel auf ein Gen während der Transkription stößt? Wenn die Laufrichtung gleich ist, kann die PolIII überholen, d.h., ohne dass die Transkription gestört wird, wird der DNA-Bereich repliziert. Dagegen scheint eine Kollision von Replikation und Transkription problematisch, vielleicht sogar tödlich. Alle wichtigen Gene in E. coli liegen in Replikationsrichtung, nur wenige, selten transkribierte in Gegenrichtung.

23 Termination der Transkription Am Ende einer zu transkribierenden Einheit (Gen, Operon) liegen Sequenzen, die zum Ablösen der RNA-Polymerase, Freisetzen der RNA und Schließen der Transkriptionsblase führen. Dabei müssen diese Sequenzen zunächst in die RNA umgeschrieben werden, diese bildet dann Haarnadelstrukturen, die zur Termination führen. Die meisten Terminatoren funktionieren ohne zusätzliche Faktoren (intrinsische Terminatoren), andere benötigen einen Proteinfaktor, Rho.

24 Terminatorstruktur Immer kommen der GCreiche gepaarte Bereich und der ungepaarte U-Abschnitt vor. Dadurch kann die RNA-Polymerase den Terminator von zufällig ähnlichen Strukturen unterscheiden (auch die anderen, z.b. codierenden Bereiche falten sich als einsträngige mrna zu komplizierten Strukturen mit Haarnadelbereichen). Haarnadelstruktur eines intrinsischen Terminators:

25 Terminatorstruktur Terminationsfaktor rho verfolgt die RNA- Polymerase auf der mrna. An rho- Terminationssequenzen pausiert die Polymerase. Holt rho sie dort ein, kommt es zur Termination.

26 Antitermination Terminationspunkte können mittels Antiterminationsfaktoren auch überlesen werden. Auf diese Weise kann die Zelle aus einem Operon verschiedene Sets von Proteinen erzeugen (nur die vorn codierten bzw. alle Gene).

27 Antitermination

28 Transkription im Überblick

29 Transkription bei Eukaryonten Auch bei der Transkription ist bei Eukaryonten gegenüber Bakterien der Grundprozeß ähnlich, aber in vielen Details anders, meist komplexer.

30 Transkription bei Eukaryonten Eukaryonten haben nicht nur eine RNA-Polymerase, sondern drei: -RNA-Polymerase I transkribiert rrna -RNA-Polymerase II transkribiert mrna -RNA-Polymerase III transkribiert trna und andere kleine RNAs Die RNA-Pol II aller Eukaryonten ist gegen α-amanitin (aus Knollenblätterpilzen) empfindlich, Pol I dagegen nie (die Empfindlichkeit von Pol III ist bei unterschiedlichen Eukaryonten verschieden).

31 Transkription bei Eukaryonten Die großen Untereinheiten der Polymerasen entsprechen denen von Bakterien, dazu kommen noch kleinere Proteine unbekannter Funktion.

32 Transkription bei Eukaryonten Zur Promotorerkennung und zur Initiation der Transkription werden zusätzliche Faktoren (Proteine) unbedingt benötigt. Die Promotoren für Pol II (also die vor Protein-codierenden Genen) variieren sehr stark. Sie sind im Aufbau modular: zusammengesetzt aus kurzen Abschnitten, die jeweils ein bestimmtes Regulatorprotein binden. Die Kombination der Regulationsmodule legt fest, auf welche Signale das Gen reagiert. Dadurch kann die eukaryontische Zelle vielfältiger auf unterschiedliche Situationen reagieren als die bakterielle Zelle mit der unflexiblen Operon-Struktur.

33 Transkription bei Eukaryonten Anders als bei Bakterien können Regulatorelemente auch weit (mehrere tausend Basenpaare) vom Gen entfernt auf der DNA (meist davor: upstream ) liegen. Die daran bindenden Regulatorproteine ( upstream factors ) wirken meist Transkriptions-verstärkend, ihr Bindungsbereich wird daher Enhancer (Verstärkungsregion) oder upstream activating sequence (UAS) genannt.

34 Transkription bei Eukaryonten Statt vor dem Gen können solche Elemente auch (seltener) downstream (hinter dem Transkriptionsstartpunkt) liegen, also hinter dem Gen oder sogar im Gen selbst. Ohne zusätzliche Faktoren sind eukaryontische Gene inaktiv. Daher überwiegt als Regulationsform die Aktivierung der Transkription, Repressoren treten selten auf.

35 Transkription bei Eukaryonten Die meisten Promotoren für RNA-Pol II haben bei -25 eine TATA-Box aus einer Folge von 8 A/T-Paaren (ähnlich der -10-Region der normalen E. coli-promotoren). Zum Einleiten der Transkription bindet dort das 30 kd TATAbindende Protein (TBP) und assozierte Faktoren zu einem Komplex (TFIID, TF bedeutet Transkriptionsfaktor) von 800 kd Größe.

36 Transkription bei Eukaryonten Durch die Bindung von TBP wird die DNA geknickt, dadurch werden die Proteinfaktoren in diesem Bereich näher zusammengebracht.

37 Transkription bei Eukaryonten Weitere Transkriptionsfaktoren und die Polymerase binden. Dieser große Komplex ist nur der Minimalapparat für die Transkription, dazu kommen meist noch zahlreiche regulative Faktoren. Im Vergleich erscheint der bakterielle Apparat einfach und klein.

38 Transkription bei Eukaryonten Die folgenden Elemente findet man häufig vor eukaryontischen Genen:

39 Transkription bei Eukaryonten Wie stark ein Gen abgelesen wird, hängt auf komplizierte Weise von Häufigkeit und Lage dieser und weiterer Elemente ab. U.a. können die Elemente so dicht aneinander liegen, dass sich die Bindeproteine gegenseitig stören. Aber auf solchen Feinheiten der Genexpression beruht die Funktionsvielfalt der höheren Eukaryonten (auch uns Menschen), mit komplizierter Entwicklung, vielen Organen und einer vernetzten Regulation (Hormone, Nerven...) des Gesamtorganismus. Die Forschung ist noch weit davon entfernt, dieses Regulationsgeschehen wirklich zu verstehen.

40 Transkription bei Eukaryonten Die bloße Anwesenheit eines Transkriptionsfaktors reicht meist noch nicht aus, er muss ev. erst aktiviert werden. Das geschieht z.b. durch Phosphorylierung oder Dephosphorylierung, durch Binden eines Liganden (z.b. eines Steroid- Hormons> Genexpression durch Signal von anderen Organen des Körpers) oder nach Abbau eines inhibierenden Faktors.

41 Aktivierung eukaryontischer Transkriptionsfaktoren

42 Transkription bei Eukaryonten: Reifung des Transkripts Anders als bei Bakterien wird das Transkript bei Eukaryonten noch umgebaut, außerdem muss es aus dem Kern ins Cytoplasma transportiert werden, bevor es translatiert werden kann. Diese Extraschritte können auch reguliert sein.

43 Zeitlicher Ablauf der Transkription Der Abbau der bakteriellen mrna beginnt bereits bevor die Transkription abgeschlossen ist! Die durchschnittliche Lebensdauer der mrna beträgt nur 2-3 Minuten. Bei Eukaryonten dauert es dagegen allein 20 Minuten, bis die reife mrna den Kern verlässt, die Lebensdauer liegt meist bei 8-24 Stunden.

44 Transkription bei Eukaryonten: Reifung des Transkripts

45 Reifung des Transkripts Die neu-transkribierte RNA wird als hnrna (heterogene nukleäre RNA) bezeichnet, sie liegt im Zellkern mit Proteinen assoziiert in einer Struktur vor, die an Nukleosomen erinnert.

46 Reifung des Transkripts Am 5 -Ende der RNA wird ein 5 -Cap (Kappenstruktur) aus einem methylierten Guaninrest an das initiale Triphosphat angebaut, am 3 -Ende eine lange Serie (ca. 200) von Adenosinresten (Poly-A-Schwanz)*. An den Poly-A- Schwanz binden Poly-A-bindende Proteine (PABP). Diese Veränderungen schützen die RNA vor dem Abbau und verlängern so ihre Lebensdauer. *Die Histon-mRNAs tragen keinen Poly-A-Schwanz und sind trotzdem nicht besonders kurzlebig.

47 Reifung des Transkripts: 5`-Cap

48 Reifung des Transkripts: 5`-Cap Vom initalen Triphosphat wird ein Phosphat abgespalten, dann bindet GTP in einer 5 >5 - Bindung, schließlich wird das Guanin und die Zucker der nächsten Nukleotide methyliert.

49 Reifung des Transkripts: Polyadenylierung Die mrna wird kurz hinter einem Consensus AAUAAA gespalten und dort der Poly-A-Schwanz angehängt.

50 Reifung des Transkripts Die Poly-A-bindende Proteine (PABP) binden außerdem an Proteine der 5 -Cap, eif-4g und eif-4e, die für die Initiation der Translation wichtig sind. Die reife mrna bildet also eine Schleife. Dadurch ist sichergestellt, das nur intakte mrnas in Proteine übersetzt werden: sind die 3 - Enden geschädigt oder abgebaut, können die PABP nicht binden und über die Initiationsfaktoren die Translation starten.

51 Reifung des Transkripts: Splicing Anders als bakterielle Gene sind in den meisten eukaryontischen Genen die codierenden Bereiche (mit der Information für das Protein, Exons) durch nicht-codierende Bereiche (Introns) unterbrochen. Diese werden im Splicing- Prozess aus der RNA herausgeschnitten.

52 Reifung des Transkripts: Splicing Introns von kerncodierten mrnas werden meist durch einen großen Komplex aus Proteinen und RNA- Molekülen (also einem Ribonucleoprotein) entfernt, dem Spliceosom.

53 Reifung des Transkripts: Splicing Der Splice-Vorgang muss basengenau erfolgen, sonst ist der Leserahmen des zukünftigen Proteins unterbrochen. Alle Spliceosom-gespaltenen Introns beginnen mit einem 5 GT- (die linke Seite des Introns, auch Donor-Seite genannt; auf der RNA ist die Sequenz natürlich 5 GU-!!) und enden mit -AG am 3 -Ende (rechte Seite, Akzeptor-Seite).

54 Reifung des Transkripts: Splicing Bei Bäckerhefe sitzt in jedem Intron (also zwischen GT- und - AG) die Consensussequenz TACTAAC. Sie dient nicht nur zum Identifizieren des Introns, sondern spielt auch beim Splice- Mechanismus eine Rolle. Bei Tieren ist diese Sequenz weniger streng erhalten, nur das funktionelle rechte A ist immer vorhanden.

55 Reifung des Transkripts: Splicing Der Splicevorgang verläuft über zwei Umesterungen, d.h., ohne Energieaufwand wird ein Phosphat von einem Zucker auf einen anderen umgehängt.

56 Reifung des Transkripts: Splicing Im ersten Schritt wird das 5 GU auf das rechte Consensus- Adenosin umgehängt. Das sitzt im RNA-Strang, ist also an seiner 3 - und 5 -OH-Gruppe schon verestert. Die neue Bindung erfolgt am 2`-OH der Ribose, so dass das Adenosin nun mit drei Nucleotiden verknüpft ist. Dabei entsteht eine Lasso- (lariat) Struktur. Zugleich wird die Ausgangs-RNA gespalten, das 3 -Ende des Exons ist frei. Es greift nun die Bindung vom -AG 3 -Ende des Introns zum nächsten Exon an. Durch Umesterung verbinden sich die beiden Exons, das Intron-Lasso wird frei und später abgebaut.

57 Reifung des Transkripts: Splicing Diese Vorgänge werden vom Spliceosom gesteuert, das die RNA in die richtige Form biegt und die Zwischenprodukte (das freie Ende des ersten Exons!) stabilisiert.

58 Die meisten Gene enthalten mehrere Introns. Es muss sichergestellt sein, dass die jeweils zusammengehörenden Intronränder miteinander gespliced werden, sonst würden Exons verloren gehen. Reifung des Transkripts: Splicing

59 Reifung des Transkripts: Splicing Dazu wäre ein logischer Mechanismus, dass das Splicesom die RNA entlangwandert und jedes 3 mit dem nächsten 5 -Intronende spliced. So ist es aber nicht, zwar werden die Introns meist in einer bevorzugten Reihenfolge gespliced, aber die springt zwischen den verschiedenen Introns hin- und her, und die Reihenfolge wird auch nicht zwingend eingehalten.

60 Reifung des Transkripts: Splicing Außerdem können im Reagenzglas* vom Spliceosom auch Exons auf verschiedenen RNA-Fäden vereinigt werden (trans-splicen), was dagegen spricht, dass es am RNA-Faden entlangwandert. *Dazu werden Introns eingesetzt, die zueinander komplementär sind. Die beiden RNAs bilden also einen Doppelstrang im Intronbereich. In der Natur geschieht Transspicen regelmäßig bei den Trypanosomen (Schlafkrankheit) und ist bei Menschen (selten, ev. eine Erbkrankheit) beobachtet worden.

61 Trans-Splicing

62 Reifung des Transkripts: Splicing Wozu nun dieser große Aufwand? Die Introns verbrauchen viel Platz und Energie auf der DNA und im primären Transkript (sie sind oft viel größer als die Exons!), auch der komplizierte Splicing-Apparat ist nicht billig, und der Prozess beinhaltet dazu noch das Risiko, durch Fehler defekte Proteine zu produzieren!?!

63 Splicing: Evolutionäres Relikt? Eine mögliche Erklärung ist, dass es sich um ein Relikt aus der frühen Evolution handelt. Dadurch konnten eventuell funktionelle Domainen (Abschnitte des Proteins) mit nützlicher Funktion (z.b. eine ATP-bindende Domaine) mit verschiedenen anderen Domainen zu einer Vielzahl von Proteinen kombiniert werden. Die Chance, dabei zu sinnvollen Produkten zu kommen, ist viel höher, als wenn bei jedem Protein von Zufallssequenzen begonnen wird, oder wenn Zufallsstücke von Genen verschmelzen (falsches Leseraster, Teildomainen ohne Funktion, Probleme der Proteinfaltung). Die Introns böten sich dabei als Rekombinationsbereiche zwischen Genen an.

64 Splicing: Evolutionäres Relikt? Für diese These spricht, daß viele Introns an Positionen sitzen, die Funktionsdomainen trennen. Ein Beispiel für das Exon-Kombinieren zur optimalen Funktionspassung ist das Lysozym. Zwischen Haushuhn und Bakteriophagen T4 sind die Exons 2 und 3 konserviert, die den enzymatisch aktiven Kern des Proteins codieren. Exon 1 des Huhns stabilisiert das Protein und fehlt beim Phagen, der kein langlebiges Lysozym braucht. Der Phage hat dagegen einen C-terminalen Abschnitt angehängt, der das Enzym an die Zellwand von E. coli bindet. Diese Funktion fehlt beim Hühnerlysozym, das ja nicht ein einzelnes Bakterium gezielt angreifen, sondern ganze Bakterienpopulationen vernichten soll.

65 Alternatives Splicing Ein sicheres Beispiel für eine sinnvolle Nutzung des Splicing ist das alternative Splicing: Einige Gene können auf verschiedene Weisen gespliced werden. Das Troponin-Gen wird in glatten Muskeln der Maus anders gespliced als in allen anderen Geweben, dadurch entstehen unterschiedliche (jeweils funktionelle) Varianten des Proteins.

66 Alternatives Splicing Bei Drosophila melanogaster (Taufliege) wird dasselbe Transkript in Männchen so gespliced, dass es kein Protein mehr bildet, in der Folge werden die Gene der weiblichen Ausprägung reprimiert. In Weibchen entsteht ein 200 AS Protein, das zur Repression männlicher Gene führt.

67 Typ III-Introns Die von Spliceosomen ausgeschnittenen Introns werden auch als Typ III-Introns bezeichnet. Sie werden offenbar ausschließlich durch ihren linken und rechten Rand (5 - GU-, 3 AG-) und einen kurzen Consensusbereich definiert, die Umgebung (anliegende Exons) und der Rest des Introns (und damit seine Sekundärstruktur) sind damit weitgehend beliebig!

68 Typ I- und Typ II-Introns Bei anderen Intron-Typen ist die RNA-Raumstruktur entscheidend für das Splicing. Man unterscheidet Typ I- und Typ II-Introns mit sehr verschiedenem Aufbau. Wie bei Typ III verläuft auch hier das Splicing ohne Energiebedarf durch Umesterung. Zuerst wird jeweils das 3 -Ende des ersten Exons freigesetzt, das sich im zweiten Schritt mit dem 5 -Ende des zweiten Exons verbindet und das Intron freisetzt. Bei Typ II reagiert wie bei Typ III im ersten Schritt ein internes Adenosin, so daß eine Lasso- Struktur entsteht. Bei Typ I-Introns wird ein Guanosinnucleotid als Cofaktor benötigt, der die erste Exon/ Intron-Bindung knackt.

69 Typ I- und Typ II-Introns Der Ablauf des Splicings ist bei Typ II-Introns und Typ III Introns (Kern- Proteingen-Introns) gleich. Beim Typ III treibt das Spliceosom die Reaktion an, bei Typ II (und I) die räumliche Anordnung der reagierenden Reste, also die Raumstruktur der Intron- RNA.

70 Typ I- und Typ II-Introns Den Typ I- und Typ II-Introns ist gemeinsam, dass sie, anders als Typ III-Introns, für den Splicevorgang keinerlei Protein brauchen. Zum mindestens in vitro (im Reagenzglas) kann sich die RNA selber splicen. Auch wenn in vivo immer Proteine beteiligt sind (vor allem wohl als Faltungshilfe für die RNA), ist damit bewiesen, dass auch RNAs Enzyme sein können.

71 Die RNA-Welt Die Möglichkeit von RNA-Enzymen (Ribozymen) hat große Bedeutung für Rekonstruktionen der Entstehung der ersten lebenden Zellen. Die heutige Trennung von Datenspeicher (Nukleinsäuren) und Maschinen (Proteinen) erfordert eine Übersetzungsmaschine, das Ribosom. Ein solcher Apparat ist wegen seiner komplizierten Aufgabe komplex aufgebaut, zu komplex, um durch Zufallsprozesse aus unbelebtem Material zu entstehen. Das Problem stellt sich nicht, wenn Datenspeicher und Maschinen identisch sind. In einer RNA-Welt, wie sie möglicherweise zu Beginn der Evolution vorlag, vermehren sich RNA-Moleküle über Basenpaarung und -verknüpfung, welche durch die RNA selbst katalysiert wird.

72 Die RNA-Welt Der Umstand, dass viele Coenzyme RNA-Bestandteile enthalten, könnte ein Relikt der RNA-Welt sein: NAD+/NADP+ und FAD/FMN, GTP, CTP und UTP als Adaptoren für Lipide und Zucker in Biosynthesen und Transport, ATP als die Grundeinheit für Energie. Auch der hohe RNA-Anteil in den Ribosomen und seine funktionelle Rolle bei der Translation (die Peptidyltransferase-Aktivität des Ribosoms wird von RNA katalysiert) deuten in dieselbe Richtung. Ein Ur-Ribosom hat möglicherweise nur aus RNA bestanden und produzierte Proteine, die die katalytische RNA zunächst nur unterstützen.

73 Typ II-Introns Der ähnliche Reaktionsablauf bei Typ II und III-Introns weist auf eine gemeinsame Herkunft her. Wahrscheinlich sind die RNA-Bereiche, die im Typ II-Intron (das in Mitochondrien vorkommt) für das Positionieren der Splice-Site zuständig waren, in Form kleiner RNA- Moleküle ins Spliceosom gewandert, wirken also nicht mehr in cis (im selben Molekül wie sie selbst), sondern in trans. In der weiteren Entwicklung übernahmen Proteine einen Teil der katalytischen Aufgaben. Ein möglicher Vorteil dieser Entwicklung ist es, dass die Introns dadurch in ihrem Aufbau weniger festgelegt sind (nun muss ja nicht mehr die ganze Struktur stimmen, sondern nur kurze Consensusbereiche).

74 Typ I-Introns Typ I-Introns kommen in niederen Eukaryonten, in Pilz- Mitochondrien und sogar in Bakterien vor. Sie sind (wie Typ II) selbstsplicend, allerdings brauchen sie ein Guanosinnucleotid (GTP, GDP, GMP oder Guanosin) als Cofaktor. Dieser spaltet die erste Exon/Intron-Bindung und hängt sich ans Intron, das Exonende bindet sofort (es ist nie freies Exon zu finden) an das zweite Exon und setzt das Intron linear frei. Schließlich cyklisiert das Intron und setzt das Guanosin frei, dabei werden ein paar Intronnucleotide mit abgespalten. Dieser Schritt ist reversibel und kann zum Ligieren verschiedener RNA- Fragmente führen - eine wichtige RNA-Welt -Reaktion.

75 Typ I-Introns

76 Typ I-Introns Da alle Elemente zum Selbstsplicing im Typ I- Intron enthalten sind, kann es in beliebige Gene gesetzt werden (z. B. das beliebte lacz-gen), spliced sich (auch in der E. coli-zelle) aus der RNA heraus, so dass ein funktionelles Protein entsteht. Mit diesem System lassen sich Mutationsanalysen des Introns durchführen.

77 RNA-Interferenz (RNAi) Die Expression einzelner Gene kann von RNA-Molekülen (der sirna, small interfering RNA) gezielt blockiert werden. Die RNA (als Doppelstrang) wird zuerst zerschnitten (Enzym Dicer ) und ein Strang in den RISC- Enzymkomplex (RNA-Induced Silencing Complex) eingebaut. Der kann dann zum gebundenen RNA-Strang passende mrna-moleküle zerstören, die Translation der mrna verhindern oder die Transkription des Gens blockieren. Die Methode wird bereits medizinisch verwendet. Fire und Mello, Nobelpreis 2006