Abbildungsverzeichnis. Tabellenverzeichnis. Abkürzungsverzeichnis. 1 Einleitung 1

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1 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis I Abbildungsverzeichnis VI Tabellenverzeichnis VIII Abkürzungsverzeichnis IX 1 Einleitung Wasser, ein limitierender Faktor für die Landwirtschaft Anpassungen von Pflanzen an Wassermangel Austrocknungstoleranz Craterostigma plantagineum: ein Modellorganismus für Austrocknungstoleranz Die molekulare Trockenstressantwort Late Embryogenesis Abundant Proteine Nomenklatur Funktion Struktur CDeT11-24: ein LEA-like Protein aus Craterostigma plantagineum Phosphorylierung von Proteinen Intrinsisch ungeordnete Proteine Zielsetzung der Arbeit 19 2 Material und Methoden Chemikalien Kits Geräte Enzyme und Marker Sonstige Materialien Software Pflanzenmaterial Austrocknung und Bestimmung des relativen Wassergehalts Bakterienstämme Vektoren Primer Mikrobiologische Methoden Anzucht von Bakterien 25 I

2 Glycerin-Stammkulturen Molekularbiologische Methoden Plasmid Isolierung im kleinen Maßstab Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Extraktion Restriktionsverdau von DNA Ligation Herstellung Rubidiumchlorid-kompetenter Escherichia coli Zellen Transformation Rubidiumchlorid-kompetenter Escherichia coli Zellen DNA-Sequenzierung Bestimmung der DNA-Konzentration Polymerase-Kettenreaktion Ortsgerichtete Mutagenese Kolonie-PCR Agarose-Gelelektrophorese Isolierung von DNA-Fragmenten aus einem Agarosegel Allgemeine proteinbiochemische Methoden Fällung von Proteinen mit Aceton Fällung von Proteinen mit TCA Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford Bestimmung der Proteinkonzentration bei 280 nm Heterologe Expression von rekombinantem Protein in E. coli Native Aufreinigung von rekombinanten Protein aus Escherichia coli Native Aufreinigung von rekombinantem CDeT11-24 ohne 6His-tag Elektrophorese von Proteinen SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese D-Gelelektrophorese Coomassie-Brillant-Blau-Färbung von Proteinen im Gel Phosphoproteinfärbung mit Pro-Q Diamond Trocknen von Polyacrylamid-Gelen Western Blot Ponceau Färbung Immunologischer Proteinnachweis Aufreinigung von nativem CDeT aus Craterostigma plantagineum Kopplung von Proteinen an eine HiTrap NHS-aktivierte Säule Isolierung monospezifischer Antikörper mit einer Antigen-Säule Aufreinigung von leicht löslichem Protein aus Craterostigma plantagineum Immunaffintitaätschromatographie Anreicherung von phosphoryliertem CDeT Circulardichroismus-Spektroskopie Enzym-Austrocknungs-Assays Citratsynthase-Austrocknungs-Assay 43 II

3 Lactatdehydrogenase Austrocknungs-Assay Protein-Lipid-Interaktion Protein-Lipid-Interaktion in Lösung Protein-Lipid-Interaktion auf Nitrocellulose-Membran Kinase Aufreinigung Aufreinigung von nativem Gesamtprotein Fraktionierte Fällung mit Ammoniumsulfat Ionenaustauschchromatographie mit einer HiTrap SP FF Säule Hydrophobe Interaktionschromatographie Ionenaustauschchromatographie mit der FPLC Anreicherung von Kinasen Kinase Assays In-Gel-Kinase-Assay In vitro Kinase Assay Massenspektrometrie 52 3 Ergebnisse Aufreinigung und Lipidbindung des CDeT11-24 Proteins In silico Analyse des Lysin-reichen Sequenzelements von CDeT Lipidbindung des rekombinanten Proteins 6His-CDeT Klonierung und Aufreinigung des 6His-CDeT11-24 Proteins Protein-Lipid-Overlay-Assay und Liposomen-Assay mit rekombinantem 6His-CDeT11-24 Protein Lipidbindung von nativem CDeT11-24 Protein Lipidbindung von rekombinantem CDeT11-24 ohne 6His-Tag Klonierung und Aufreinigung von CDeT11-24 ohne 6His-Tag Protein-Lipid-Overlay-Assay und Liposomen-Assay mit rekombinantem CDeT11-24 Protein ohne 6His-Tag Lipidbindung von K-CDeT Klonierung und Aufreinigung von K-CDeT Protein-Lipid-Overlay-Assay und Liposomen-Assay mit rekombinantem K-CDeT Liposomen-Aggregation durch CDeT Untersuchungen zur Proteinstruktur von CDeT In silico Untersuchungen der CDeT11-24 Proteinstruktur Circulardichroismus-Spektroskopie von phosphoryliertem und nicht-phosphoryliertem CDeT Aufreinigung von phosphoryliertem und nicht-phosphoryliertem CDeT11-24 aus Craterostigma plantagineum In vitro Phosphorylierung des 6His-CDeT11-24 Proteins mit Casein Kinase Circulardichroismus-Spektroskopie von phosphoryliertem und nicht-phosphoryliertem CDeT III

4 3.2.3 Circulardichroismus-Spektroskopie von 6His-CDeT11-24 mit Trifluorethanol Circulardichroismus-Spektroskopie von 6His-CDeT11-24 mit SDS Circulardichroismus-Spektroskopie von CDeT11-24 und K-CDeT Circulardichroismus Spektroskopie von CDeT11-24 und K-CDeT11-24 mit TFE Circulardichroismus-Spektroskopie von getrocknetem CDeT Schutzfunktion von CDeT11-24 in vitro Citratsynthase-Austrocknung-Assay Lactatdehydrogenase-Austrocknungs-Assay Identifizierung von CDeT11-24 phosphorylierenden Kinasen In-Gel-Kinase-Assay mit Myelin Basic Protein In-Gel-Kinase-Assay mit 6His-CDeT Aufreinigung von CDeT11-24 Kinasen Fraktionierte Fällung mit Ammoniumsulfat Ionenaustauschchromatographie mit HiTrap SP FF Hydrophobe Interaktionschromatographie mit HiTrap Phenyl Sepharose HP Ionenaustauschchromatographie mit Mono S Spezifische Aktivität der Kinaseanreicherung Kinaseanreicherung 95 4 Diskussion Lipidbindung von CDeT Das CDeT11-24 Protein bindet in vitro an Phosphatidsäure Das Lysin-reiche Sequenzelement ist Bestandteil der Phosphatidsäure Bindung des CDeT11-24 Proteins Die Bindung des 6His-CDeT11-24 Proteins an Phosphatidsäure wird durch den 6His-Tag verursacht Das CDeT11-24 Protein induziert die Aggregation von Liposomen Hypothetische Funktion der CDeT11-24 Bindung an Phosphatidsäure In vitro Schutzfunktion von CDeT Das CDeT11-24 Protein schützt Enzyme vor einem Aktivitätsverlust durch Austrocknung Das Lysin-reiche Sequenzelement ist ausschlaggebend für die Schutzfunktion des CDeT11-24 Proteins Strukturuntersuchungen des CDeT11-24 Proteins durch CD-Spektroskopie Die Phosphorylierung hat keinen Einfluss auf die intrinsisch ungeordnete Struktur des CDeT11-24 Proteins Das CDeT11-24 Protein hat die Neigung zur disorder to order -Transition Die Struktur des Lysin-reichen Sequenzelements Isolierung und Identifikation von CDeT11-24 Kinasen Beurteilung der biochemischen Aufreinigung von CDeT11-24 Kinasen Identifizierung von CDeT11-24 Kinasen IV

5 4.5 CDeT11-24 Kinasen Ausblick Zusammenfassung Literaturverzeichnis Anhang Vektorkarten DNA-Sequenzen Proteinsequenzen Massenspektrometrische Kinase-Identifizierung Identifizierung der CK2α-Peptide Identifizierung des cpvik-peptids Danksagung Teilpublikation 152 V