Struktur-Funktionsbeziehungen. NADH-Oxidase aus. Thermus thermophilus

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1 Struktur-Funktionsbeziehungen der NADH-Oxidase aus Thermus thermophilus Von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation von Mathias Siebner aus Osnabrück

2 Gliederung 1 Einleitung Funktion und Struktur von Enzymen Makromolekulare Strukturforschung Molekulare Evolution: Ähnliche Proteinsequenzen Modellierung ähnlicher Proteinstrukturen Protein Engineering Protein-Ligand-Wechselwirkungen Thermostabilität von Proteinen NAD(P)H-abhängige Oxidoreduktasen Systematik der Dehydrogenasen Flavoproteine NADH- Oxidasen Nitroreduktasen NAD(P)H-Flavin-Oxidoreduktasen Charakteristik^ der untersuchten Proteine NADH-Oxidase aus Thermus thermophilus Nitroreduktase aus Enterobacter cloacae Flavin-Oxidoreduktase aus Vibrio fischeri Anwendungen dernadox Ziele der Arbeit 17 2 Material und Methoden Materialien Proteine Bakterienstämme Aminosäuren und deren DNA Kodierung Plasmide, DNA undoligonukleotide 19

3 2.1.5 Liste der verwendeten Oligonucleotide Medien, Antibiotikum und Induktor Computer und Programme Chemikalien ' Laborgeräte Enzympräparation Kultivierung und Stammhaltung von rekombinanten E. coli Zellaufschluß Hitzedenaturierung Säulenchromatographische Trennungen Reinigung der NADOX mittels Blue Sepharose Aufreinigung von Holoenzym der NADOX Aufreinigung von Apoenzym der NADOX Präparation der Luciferase aus Photobacterium leiognathi Enzymkristallisation Konzentrierung von Proteinlösungen 'Sitting drop '-Kristallisation Enzymcharakterisierung Enzymtest Bestimmung der Substratspezifität Bestimmung der Proteinkonzentration Polyacrylamidgel-Elektrophorese CD-Spektroskopie Bestimmung des Cofaktors Massenspektrometrie ' HPLC Bestimmung von K^-Werten Bestimmung des Redoxpotentials Nachweis von freiem, reduziertem FMN mittels Luciferase Isotherme Titrationskalorimetrie Titrationsdifferenzspektroskopie Fluorimetrie Präparative isoelektrische Fokussierung 39

4 iii 2.5 Molekularbiologische Methoden Isolierung von Plasmid-DNA ptnadoxaus E. coli Konzentrationsbestimmung von DNA 41, Spaltung des Plasmids ptnadox mit Restriktionsendonucleasen Trennung von DNA-Fragmenten mittels Agarosegelen PCR-Mutagenese Ligation von DNA-Fragmenten Herstellung und Transformation von kompetenten E. coli-zellen DNA-Sequenzierung Proteinmodellierung Homologiesuche in Proteindatenbanken Modellerstellung aus einem homologen Modell Energieminimierung und Kraftfeldberechnungen mit Liganden Ergebnisse und Diskussion Optimierung der Aufreinigung 5/ 3.2 Charakterisierung FMN- und FAD-Isoformen der NADOX Bestimmung des Cofaktors Kinetische Charakterisierung der NADH-Oxidase Temperaturstabilität von NADOX und NITRED Bestimmung des Redoxpotentials Bestimmung des isoelektrischen Punktes der NADOX Circularer Dichroismus Substratspezißtät Reaktivität mit verschiedenen Flavinen Reaktion mit Chinonen Reaktion mit aromatischen Nitroverbindungen Reaktion mit anderen Elektronenakzeptoren Reaktionen in Gegenwart von freiem FMN Temperaturabhängigkeit der Substratspezißtät der NADOX Substratanaloge Komplexe der NADOX 74

5 JV 3.4 Reaktionsmechanismus NADH-Oxidase-Reaktion Flavine als Cofaktoren und Cosubstrate Abweichender Reaktionsmechanismus Cofaktorbindung während der Reaktion der NADOX Mechanismus der Aufreinigung an Blue Sepharose Vergleich der aktiven Zentren von NADOX und NITRED Cofaktor-Bindung Substratbindungsstelle Einbindung des künstlichen Cofakors DFMN in NADOX Modell der NITRED und Planung der Varianten der NADOX Varianten der NADOX Modell und Kristallisation der FORED Verwandte Enzyme der NADOX Zusammenfassende Diskussion Zusammenfassung Literaturverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 132