Fachbereich 1. Laborprotokoll FP 22 Lichtmikroskopie

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1 Fachbereich 1 Laborprotokoll FP 22 Lichtmikroskopie Schriftliche Ausarbeitung und Protokollauswertung im Fortgeschrittenenpraktikum für Physik SS 2007 Dozent: Tutorin: Prof. Dr. Thomas Schmidt Tanja Dodenhof vorgelegt von: Thorsten Schönbohm Eschenplatz Oldenburg th.schoenbohm@t-online.de Bremen,

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3 FP 22 - Lichtmikroskopie 1 Inhaltsverzeichnis 1 Einführung und Ziel des Versuches Theoretische Ausarbeitung Kurzbeschreibung des Gesamtsystems Mikroskops Kurzbeschreibung der wichtigsten Teile des Mikroskops Die wichtigsten Größen eines Mikroskops Grundbegriffe Brownsche Molekularbewegung, Bolzmann Konstante,... Avogadrokonstante Kontrastverändernde Methoden Phasenkontrast Differential-Interferenz-Kontrast (DIK) Reflektions-Interferenz-Kontrast (RIKM + Antiflex) Fluoreszenz Versuchsdurchführung und Auswertung Bestimmung der Auflösung und Tiefenschärfe von schwach bis mittel.. vergrössernder Objekte Bestimmung der Avogadrokonstante mit Hilfe der Brownschen... Molekularbewegung Vergleich der Kontrastmethoden Fluoreszenzanfärben von zellulären Strukturen Resümee Anhang...28

4 FP 22 - Lichtmikroskopie 2 1 Einführung und Ziel des Versuches Der Versuch ist in vier Aufgabenbereiche geteilt: 1. Bestimmung der Auflösung und Schärfentiefe mit dem Ziel, die Bedienung und den Aufbau des Mikroskops kennen zu lernen. 2. Bestimmung der Avogadrokonstante mit Hilfe der Brownschen Molekularbewegung, wobei hier in die digitale Bildverarbeitung eingeführt werden soll. 3. Hochauflösende Aufnahmen von Zellen dienen zur Einführung in die verschiedenen Kontrastmethoden: Ölimmersion, Phasenkontrast, Differential-Interferenz-Kontrast, Reflektions-Interferenz-Kontrast. 4. Einführung in die Fluoreszenzmikroskopie. Bei den Fragestellungen soll die Sichtweise der Biophysik angenommen werden, in dem man verschiedene Methoden der Lichtmikroskopie kennen lernt.

5 FP 22 - Lichtmikroskopie 3 2 Theoretische Ausarbeitung 2.1 Kurzbeschreibung des Gesamtsystems Mikroskops Mit Mikroskopen werden kleine im Nahbereich liegende Objekte in zwei Stufen vergrößert betrachtet, während eine Lupe nur eine einstufige Vergrösserung ergibt. Im Gegensatz zum Fernrohr wird das Objekt bereits durch das Objektiv vergrößert abgebildet; das Zwischenbild wird durch das Okular nachvergrößert 1. Die wichtigsten Komponenten eines Mikroskops sind: Lichtquelle Kondensor Objektiv Okular für ein Auflichtmikroskop kommt noch ein Strahlenteiler hinzu. Okular und Auflichtmikroskopie, Abb. 48b. gezeigt. verwendete Formelzeichen: Abbildung 1: Strahlengang eines Mikroskops (Zeichnung nach DIN 1335) a) Abbildung durch das Objektiv in die Okularbrennebene b) Abbildung durch das Objektiv nach, Einspiegeln der Auflichtbeleuchtung durch den Strahlenteiler T. Quelle: Schröder, Gottfried (1998) O, O' Objekt- und Bildpunkt auf der Achse F, F' Objekt- und Bildbrennpunkt Ob Objektiv Ok Okular AP t T L In der nachfolgenden Zeichnung werden die beiden wichtigsten, schematischen Strahlengänge für die Durchlichtmikroskopie, Abb. 48a mit Hygens- Aperturblende Brennpunktabstand von Systemen (optische Tubuslänge Strahlungsteiler Tubuslinse 1 Schröder, Gottfried: Technische Optik, Grundlagen und Anwendungen. 8. ü. Aufl. Würzburg: Vogel, 1998 (= Kamprath-Reihe), S. 149f.

6 FP 22 - Lichtmikroskopie 4 Abbildung 2: Strahlengang eines Durchlichtmikroskops. Quelle: ( ) 1. Stativfuß 1.a Kippgelenk bei älteren Mikroskopen mit Hufeisenfuß 2. Tubusträger oder Stativarm 3. Objekttisch 4. Kondensor 5. Zentrierschrauben 6. Kondensorhilfslinse 7. Filterhalter mit Einlegefilter 8. Kondensorträger (höhenverstellbar) 9. Grobtriebknöpfe (beidseitig) 10. Feintriebknöpfe (beidseitig) 12. Lampenfassung und Glühlampe Lampenkollektor 15. Beleuchtungsspiegel 16. Leuchtfeldblende 17. Objektiv 18. Objektivwechsler (Revolver) 19. Tubus: bei modernen Mikroskopen als Prismenkopf mit einem oder mehreren Umlenkprismen für den Schrägeinblick; auswechselbar gegen andere Tuben. 20. Okulartubus 21. Okular 22. Auge Abbildung 3: Seitenansicht eines Durchsichtmikroskops. Quelle: ( )

7 FP 22 - Lichtmikroskopie Kurzbeschreibung der wichtigsten Teile des Mikroskops Der Kondensor (Pos. 4) ist ein Linsensystem und dient zur Aufbereitung des Lichts. Das heißt, das von der Lichtquelle stammende Licht wird auf die Objektebene / das Objekt gebündelt. Dabei wird die Apertur des Objektivs ganz mit Licht gefüllt, um die größtmögliche Auflösung zu erreichen. Das Objektiv (Pos. 17.) sitzt meistens auf einem so genannten Revolver oder Objektivwechsler (Pos. 18). Dies soll eine einfache Handhabung beim Umschalten zwischen den verschiedenen Vergrößerungen gewährleisten. Das von ihm entworfene reale Zwischenbild des Objekts in der Zwischenbildebene ist ausschlaggebend für die Qualität des Bildes, das man im Okular sehen kann. Um Linsenfehler, wie sphärische und achromatische Aberration zu minimieren, besteht das Objektiv nicht aus Einzellinsen, sondern aus einem Linsensystem, dem so genannten Achromat. Um tiefer auf Linsenfehler einzugehen, vergleiche hierzu Demtröder: Experimentalphysik 2, Elektrizität und Optik, 3. Aufl. Berlin, Heidelberg, New York: Springer, 2004, S. 273 ff. Die Okulare (Pos. 21) dienen als Lupe um das Zwischenbild in der Zwischenbildebene zu vergrößern. Ähnlich wie bei den Objektiven bestehen die Okulare auch aus einem Linsensystem, um Linsenfehler zu minimieren Die wichtigsten Größen eines Mikroskops Die Gesamtvergrößerung eines Mikroskops berechnet sich aus der Vergrößerung des Okulars mal der Vergrößerung des Objektivs: V =V Ob V Ok (1) Hierbei sollte man aber beachten, dass es sich um die förderliche Vergrösserung und nicht um eine leere Vergrößerung handelt. 1 1 Schröder, Gottfried: Technische Optik, Grundlagen und Anwendungen. 8. ü. Aufl. Würzburg: Vogel, 1998 (= Kamprath-Reihe), S. 151f.

8 FP 22 - Lichtmikroskopie 6 Neben der Vergrößerung ist die Auflösung die wesentliche Größe eines Mikroskops. Unter der Auflösung wird in der Mikroskopie, wie auch in der Fotografie, die Möglichkeit verstanden, zwei Punkte zu unterscheiden. Je geringer der Winkelabstand der Punkte, die noch unterschieden werden können, desto größer die Auflösung. Hierzu kann das Rayleigh'sche Kriterium herangezogen werden. Es besagt, dass bei einer kreisförmigen Öffnung mit einem Durchmesser d die kritische Winkeldifferenz α k, bei der zwei Quellen noch getrennt wahrzunehmen sind, gegeben ist durch: k = 1,22 d (2) Dabei ist λ die Wellenlänge und d der Öffnungsdurchmesser der Linse. Nach Ernst Karl Abbe ist die Auflösung eines Mikroskops wesentlich von dessen Numerischer Apertur A N bestimmt. Diese ergibt sich aus dem Berechnungsindex n des Mediums zwischen Objekt und Objektiv und aus dem Sinus des halben Öffnungswinkels α des Objektivs: A N =n sin 2 (3) Damit lässt sich der minimale Abstand d min zweier unterscheidbarer Punkte folgender Maßen mit der Wellenlänge λ und A N ausdrücken: d min = 2 n sin = 2 2 A N (4) Die Schärfentiefe beschreibt die Länge der Strecke parallel zur optischen Achse, die vom Betrachter scharf wahrgenommen werden kann. Die Schärfentiefe hängt von der Objektiv-Brennweite, der Blendzahl, der Gegenstandsweite und dem Zerstreuungskreisdurchmesser ab.

9 FP 22 - Lichtmikroskopie Grundbegriffe 2.3 Brownsche Molekularbewegung, Boltzmann Konstante, Avogadrokonstante Robert Brown ( ) war Botaniker und entdeckte 1827, dass in Flüssigkeiten suspendierte Teilchen unregelmäßige Zitterbewegungen ausführen, die man unter einem Mikroskop beobachten kann. Diese Bewegungen lassen sich erklären, wenn man annimmt, dass die im Vergleich zu den Atomen sehr großen Teilchen in unserem Versuch handelt es sich dabei um Latex- Kugeln dauernd von sich schnell bewegenden Atomen bzw. Molekülen in statistisch verteilte Richtungen gestoßen werden. Abbildung 4 zeigt eine schematische Darstellung der Brownschen Bewegung. Die grundlegende Theorie zur Brownschen Molekularbewegung wurde 1905 gleichzeitig von Albert Einstein ( ) und Marian Smoluchowski ( ) entwickelt. Abbildung 4: Brownsche Molekularbewegung als Schema in zwei Vergrößerungen Einstein und Smoluchowski formulierten die Gleichung: D f =k T (5)

10 FP 22 - Lichtmikroskopie 8 Dabei beschreibt der Koeffizient f die Reibung der Teilchen im Medium, k ist die Boltzmann-Konstante und T die absolute Temperatur in Kelvin. Für eine Latexkugel entspricht f der Stokes'schen Reibung. Diese beschreibt die Abhängigkeit des Reibungskoeffizienten von der Viskosität η des Mediums und dem Radius r für sphärische Kugeln: f =6 r (6) Alle diese Größen sind messbar. Die Lohschmidt- oder auch Avogadro Konstante N A kann nun über die Beziehung: N A = R k (7) bestimmt werden. Die absolute Gaskonstante R ist ebenfalls makroskopisch messbar. Eine Alternativmethode, um die Avogadro-Konstante zu messen, ist den Zusammenhang F = N A * e zwischen der Faraday-Konstante F und der Elementarladung e auszunutzen. Eine empirische Beschreibung ermöglicht das Diffusionsgesetz, das den zeitlichen Verlauf des mittleren Abstandsquadrates r 2 zweier solcher Moleküle beschreibt. D ist die Diffusionskonstante, t die Zeit und n die Freiheitsgrade der Translation. r 2 =2 n D t (8) Im Mikroskop wird nur eine Ebene betrachtet, daher gilt für zwei Freiheitsgrade die Gleichung: r 2 =4 D t (9) 2.4 Kontrastverändernde Methoden Im Versuch FP 22 werden verschiedene kontrastverändernde Methoden der Mikroskopie verglichen. In diesem Abschnitt sollen die physikalischen Prinzipien, die hinter diesen Methoden stehen, näher erklärt werden. Dabei handelt es sich um die Phasenkontrast-Mikroskopie, entwickelt von den Niederländer Frits Zernike in den 1930er Jahren. Zernike bekam für diese Arbeiten 1953 den Physik-Nobelpreis, 1 DIK Mikroskopie, welche in den 1940er und 50er von der österreichischen Firma Reichert entwickelt wurde, 1 ( )

11 FP 22 - Lichtmikroskopie 9 RIK Mikroskopie / Antiflex. Die Methode wurde zuerst von Curtis (1964) zur Untersuchung der Zelladhäsion verwendet und mit der Einführung der Antiflex-Technik durch Ploem (1975) entscheidend verbessert. Floureszenz-Mikroskopie Phasenkontrast Der Strahlenverlauf im Phasenkontrast-Mikroskop verläuft folgend 1, (vergleiche auch hierzu die Abbildungen 5 und 6): Der von einer Lichtquelle stammende Lichtstrahl wird durch einen Kollektor und Leuchtfeldblende begrenzt und nahezu parallelisiert, dieser trifft dann in der vorderen Brennebene des Kondensators auf eine Ringblende. Durch die Ringblende wird ein Lichtzylinder erzeugt und durch einen Kondensor auf die Objektebene bzw. auf das Objekt fokussiert. Das Licht bricht sich im Objekt und ändert so seine Phase (Abbildung 5). Abbildung 5: Amplituden- und Phasenobjekte Das mikroskopische Bild entsteht durch Interferenz des direkten Mikroskopierlichts mit dem am Präparat gebeugten Lichts. Im Hellfeld- Mikroskop würde dieses gebeugte Licht zu schwach sein, um durch Interferenz mit dem direkten Mikroskopierlicht ein kontrastreiches Bild zu ergeben. Der anschließende Phasenring in der hinteren Objektiv-Brennebene verändert das direkte Licht durch Schwächung seiner Amplitude da der Phasenring getönt ist und Veränderung seiner Phase. Das gebeugte Licht nimmt dagegen weitgehend unbeeinflusst an der Bildentstehung teil. 1 ( )

12 FP 22 - Lichtmikroskopie 10 Im Phasenkontrast-Mikroskop wird somit der Einfluss des gebeugten Lichts relativ zum direkten Mikroskopierlicht durch das Objektiv und Okular vergrößert. Dadurch kommt es zu einer kontrastreichen Abbildung normalerweise schwer erkennbarer Präparatstrukturen. Vergleiche hierzu Abbildung 7 und 8. Abbildung 6: Strahlengang im Phasenkontrast-Mikroskop. Quelle: ( ) Abbildung 7: Präparat Abbildung 8: Präparat im Phasenkontrast im Hellfeld Wie in der Abbildung 8 zu erkennen, ist das Bild sehr kontrastschwach und Einzelheiten sind kaum zu erkennen. Hingegen erscheint in Abbildung 7 das gleiche Präparat kontrastreich und Details wie die beiden Zellkerne werden deutlich erkennbar ( )

13 FP 22 - Lichtmikroskopie Differential-Interferenz-Kontrast (DIK) Von einer monochomatischen Lichtquelle trifft das Licht über den Polarisator, das Nomarski Prisma und den Kondensor auf die Objektebene. Der Polarisator erzeugt linear polarisiertes Licht. Im Nomarski-Prisma wird nun das Licht in zwei kohärente Wellenfronten mit gleicher Amplitude aufgespalten. In der Abbildung ist dies durch Querstriche oder Punkte im Strahlengang kenntlich gemacht, die verdeutlichen sollen, dass die beiden Wellenfronten zueinander senkrecht orientierte Schwingungsebenen besitzen. Der Kondensor parallelisiert nun diese beiden Lichtstrahlen. Daher passieren die Wellenzüge die Objektebene und somit auch das Beobachtungsobjekt in einem kleinen Abstand zueinander. Dieser Abstand liegt aber unterhalb der Auflösungsgrenze des Mikroskops. Anschließend werden die Wellenzüge über ein zweites Nomarski- Prisma wieder vereint. Das zweite Nomarski-Prisma lässt sich senkrecht zum Strahlengang verschieben. Das kann man sich so vorstellen, dass zwei keilförmige Prismenhälften über die Diagonale verschoben werden. Dadurch lässt sich der Gangunterschied zwischen den beiden Wellenzügen stufenlos verändern. Nach dem zweiten Nomarski-Prisma befindet sich der Analysator in Kreuzstellung zum Polarisator. Nach dem Austritt aus dem Analysator kommt es zu Interferenz zwischen den zusammengeführten Wellenzügen. Diese Interferenzerscheinungen sind einerseits vom eingestellten Gangunterschied abhängig; andererseits wird der zwischen beiden Wellenzügen eingestellte Gangunterschied durch das Präparat zusätzlich modifiziert. Dies rührt daher, dass der eine Wellenzug beispielsweise nur durch das Einschlussmedium, der andere, lateral versetzt laufende Wellenzug jedoch bereits durch eine Präparatstruktur mit von dem Einschlussmedium abweichender Brechzahl verläuft. Die Abbildung zeigt eine Amöbe mit einem DIK Mikroskop aufgenommen. Typisch dabei sind die hellen (oben) und dunklen (unten) Ränder des Präparats. Diese Ränder machen das Bild quasi plastisch.

14 FP 22 - Lichtmikroskopie 12 Abbildung 9: Strahlengang eines DIK-Mikroskops Abbildung 10: Amöbe im DIK mit dem typischen Relief-Kontrast hervorgerufen durch Interferenz. Dadurch ergibt sich ein Hell-Dunkel-Effekt an den Zellaussenseiten.

15 FP 22 - Lichtmikroskopie Reflektions-Interferenz-Kontrast (RIKM + Antiflex) Für monochromatisches Licht sorgt eine Quecksilberdampflampe mit hoher Intensität, die inkohärentes Licht in einem Linienspektrum aussendet. Wie in der Abbildung erkennbar befindet sich zwischen Kollektor und Aperturblende ein Interferenzfilter (Monochromator), der eine bestimmte Lichtwellenlänge im grünen Linienspektrum passieren lässt. Eine anschließende Köhleroptik sorgt für eine gleichmäßige Ausleuchtung der Objektebene und bildet außerdem die Leuchtfeldebene in dieser Ebene ab. Nun gelangt der Wellenzug über einen dichroitischen Umlenkspiegel in das Objektiv, welches nun als Kondensor dient. An den verschiedenen Grenzflächen der Probe reflektiertes Licht interferiert und wird durch das Objektiv und die abbildende Linse in die CCD-Kamera oder zum Auge des Betrachters geleitet. Die entstehenden Bilder können mit Hilfe einer Bildverarbeitungssoftware weiter verarbeitet werden. Das Antiflex-Verfahren trägt zu einer Kontrastverbesserung bei, da sie Streulicht, das in der Mikroskopoptik entsteht, unterdrückt. Nach der Leuchtfeldblende wird wie beim DIK ein Polarisator in den Strahlengang eingesetzt, der für linear polarisiertes Licht sorgt. Das polarisierte Licht ist in der Abbildung als gestrichelte Linie dargestellt. Vorm Okular bzw. der CCD-Kamera befindet sich zum Polarisator der gekreuzte Analysator. Oberhalb des Objektivs befindet sich ein λ/4 Plättchen, welches linearpolarisiertes Licht in zirkularpolarisiertes Licht umwandelt. Die speziellen Eigenschaften des zirkularpolarisierten Lichts werden nun geschickt genutzt: Bei der Reflexion unter kleinen Winkeln an optisch dünneren Medien erhält die Komponente des elektrischen Felds, die parallel zur Einfallsebene liegt, eine Phasenverschiebung, die Komponente senkrecht zur Einfallsebene bleibt unverändert. Im Falle einer Reflexion an optisch dichteren Medien bleibt die parallele Komponente erhalten, die senkrechte verschiebt ihre Phase um einen bestimmten Betrag. Somit wird bei jeder Reflexion die Richtung der Zirkularpolarisation geändert und beim erneuten Durchgang durch das λ/4 Plättchen entsteht Licht, das senkrecht zur ursprünglichen Richtung linearpolarisiert (durch Plus-Zeichen im Strahlengang gekennzeichnet) ist.

16 FP 22 - Lichtmikroskopie 14 Dieses Licht kann den Analysator passieren und das Streulicht, welches nicht oberhalb des Objektivs entstanden ist, wird herausgefiltert. 1 Abbildung 11: Optischer Weg eines RIK Mikroskops Quelle: Lortz, Babara G.: Etablierung eines Modellsystems der Zelladhäsion über spezifische Bindungen geringer Affinität, Dissertation, TU München Lortz, Babara G.: Etablierung eines Modellsystems der Zelladhäsion über spezifische Bindungen geringer Affinität, Dissertation, TU München 2003

17 FP 22 - Lichtmikroskopie Fluoreszenz Im Gegensatz zur Phosphoreszenz, bei der die Emission eine sehr viel längere Abklingdauer (10-10 bis 10-7 s 1 ) besitzt und die Entstehung der Licht- Emission aus einem angeregten Triplett-Zustand (Gesamt-Spinquantenzahl S=1) stammt, besitzt die Fluoreszenz eine kürzere Lebensdauer (> 10 - ³ s) und dessen Emissionsenergie stammt aus strahlenden Übergängen von vibronischen Niveaus. Gewöhnlich sind es die niedrigsten eines elektronischen Anregungszustandes des Grundzustandes. Vergleiche dazu die Abbildung 12. für diese Übergänge gilt ebenfalls wie für die Absorption das Franck-Condon- Prinzip 2. Die Fluoreszenz erfolgt bei Quantenenergien, die kleiner oder höchstens gleich sind wie diejenigen der Absorption. 3 Abbildung 12: Termschema eines Moleküls mit Singulett- und Triplett-System zur Erläuterung der wichtigsten strahlenden und strahlungslosen Prozesse. 1 ( ) 2 Haken, Hermann; Wolf, Hans Cristoph: Molekühlphysik und Quantenchemie, Einführung in die experimentellen und theoretischen Grundlagen. 5. völlig neubearb. und erw. Aufl. Berlin; Heidelberg; New York: Springer, 2006 (=Springer-Lehrbuch) S. 275ff. und S. 343ff. 3 ebd. S. 303.

18 FP 22 - Lichtmikroskopie 16 3 Versuchsdurchführung und Auswertung Für die Bestimmung der Auflösung, Vergrößerung der Bilder sowie für alle weiteren Aufnahmen verwenden wir eine computergesteuerte CCD-Kamera, die durch die Software IGOR unterstützt wird. Mit IGOR ist es möglich, Bilder sowie Videosequenzen aufzunehmen, zu speichern und zu drucken. Die Kamera wird an einem zusätzlichen optischen Ausgang angeschlossen und es ist so möglich, zwischen Okular- und Kamerabetrieb umzuschalten. 3.1 Bestimmung der Auflösung und Tiefenschärfe von schwach bis mittel vergrössernder Objekte Vergrößerung der verwendeten Objektive (Kalibrieren) Zunächst soll die Vergrößerung der verwendeten Objektive bestimmt werden. In den Abbildungen 13 bis 15 sind die dazu aufgenommenen Bilder in 20-, 40-, 63- und 100-facher Vergrößerung zu sehen. Die beiden Objektive mit 63-facher und 100-facher Vergrößerung sind Ölimmersionsobjektive. Diese Objektive werden dazu verwendet, die Luft zwischen Objekt und Objektiv gegen Öl austauschen zu können. Da Öl einen höheren Brechungsindex als Luft besitzt, kann eine größere Numerische Apertur (Glg. 3) und dadurch eine bessere Auflösung (Glg 4) erzielt werden. Zur Kalibrierung wird ein Kalibriermaßstab verwendet. Dieser besitzt 100 Striche pro Milimeter. Mit dem jeweiligen Objektiv wurde dieser Kalibriermaßstab betrachtet, anschließend auf den zweiten optischen Ausgang umgeschaltet und über die CCD-Kamera ein Bild aufgenommen. Die Bilder haben am Rand eine Skala, dessen Werte in Pixel angeben sind. Mit einer Analysefunktion von IGOR kann nun ein Intensitätsprofil entlang einer gewählten Linie (in den Bildern blau dargestellt) aufgenommen werden. Das Intensitätsprofil ist jeweils über den Mikroskopaufnahmen zu sehen. Über eine weitere Softwarefunktion von IGOR lässt sich der Pixelabstand im Intensitätsprofil bestimmen. Dafür werden manuell zwei Marken ins Profil gesetzt. Der Abstand wird für mehrere Linien bestimmt, um Fehler bei der Messung zu minimieren.

19 FP 22 - Lichtmikroskopie 17 Das Programm gibt dann die gemessenen Pixel aus, mit denen über den Kalibrierungsmaßstab die Länge pro Pixel berechnet werden kann. Die unten stehende Tabelle listet die entsprechenden Kalibrierungsfaktoren auf. Die Berechnung erfolgt über die Gleichung: n Abstand der Striche k= Pixelanzahl zwischen n Striche (10) Objektiv Abstand Striche/ µm Pixel/ pix Faktor k / nm/pix 20 fach fach fach fach Tabelle 1: Berechnete Kalibrierungsfaktoren Einschätzung der Auflösung Um die Auflösung genauer zu bestimmen, müsste der Fehler des verwendeten Kalibrierungsmaßstabs und die genauere Pixelwahl im Intensitätsprofil des Programms bekannt sein. Hier wird aber der Größtfehler grob geschätzt. Für diese Schätzung vergrößern wir das Intensitätsprofil der 100fachen Vergrösserung. Da kein geeignetes Softwareprogramm für einen Ausschnitt zur Verfügung stand, wurde das gesamte digital vergrößerte Bild in den Anhang gestellt. Die Auswertung erfolgte jedoch am Bildschirm. Werden nun die schwarzen Teilstriche und die hellen Zwischenräume im Bild 16 stark vergrößert, erkennt man, dass die Teilstriche ca. 7 Pixel und die Zwischenräume ca. 12 Pixel breit sind. Dies entspräche bei einem Kalibrierungsfaktor für das 100 fach Objektiv für 7 Pixel ca. 518 nm und für 12 Pixel ca. 888 nm. Die Flanken der schwarzen Teilstriche verlaufen aber nicht sprunghaft, sonder eher wie eine steile Verteilungskurve. Führt man nun theoretisch zwei dieser Teillinien immer enger zusammen, so würde der helle Zwischenraum grauer werden und schließlich ganz in schwarz übergehen. Eine Auflösung würden wir so auf ca. 4 Pixel schätzen, bei denen noch zwei Teillinien vernünftig getrennt werden können. Dies liegt ca. bei ± 296 nm und aufgerundet bei ± 300 nm.

20 FP 22 - Lichtmikroskopie 18 Bilder mit Normalobjektiven aufgenommen: Abbildung 13: Kalibrierung für 20facher Vergrößerung Abbildung 14: Kalibrierung für 40facher Vergrößerung Bilder mit Ölimmersionsobjektive aufgenommen: Abbildung 16: Kalibrierung für 63facher Vergrößerung Abbildung 15: Kalibrierung für 100facher Vergrößerung

21 FP 22 - Lichtmikroskopie 19 Theoretische Bestimmung der Schärfentiefe Um eine Einschätzung der Schärfentiefe vorzunehmen, könnte man unter eine Seite des Kalibrierungsmaßstabs einen Gegenstand mit bekannter Höhe legen. Somit würde man einen definierten Höhenunterschied parallel zur optischen Achse erzeugen. An dem Kalibrierungsmaßstab lässt sich so ablesen, welcher Bereich noch scharf abgebildet wird. An dieser Stelle sollte noch darauf hingewiesen werden, dass es sich korrekterweise um die Schärfentiefe und nicht, wie es umgangssprachlich üblich ist, um die Tiefenschärfe handelt. Dieser Teil wurde im Praktikum nicht durchgeführt. 3.2 Bestimmung der Avogadrokonstante mit Hilfe der Brownschen Molekularbewegung Die Lösung der Latexkügelchen war bereits vorhanden. Anhand einer Aufnahme mit vorher kalibrierten Längenmaßangaben in µm kann die Größe der Latexkügelchen auf ca. 2,5-3µm am Bildschirm gemessen werden. Vergleiche hierzu Abbildung 17. Latexkügelchen Luftblase Abbildung 17: Drei Latexkügelchen (ca. 2,9 µm) im Größenvergleich zu einer eingeschlossenen Luftblase (ca. 22,5 µm).

22 FP 22 - Lichtmikroskopie 20 Um den sogenannten Random-Walk beobachten zu können, muss zunächst eine geschlossene Kammer für die Latexkügelchen hergestellt werden. Dazu wird auf einem Objektträger mit Vaseline ein Quadrat in Größe eines Deckplättchens gezogen. In dieses Quadrat wird mit einer Pipette eine Lösung mit Latexkugeln gegeben und anschließend mit einem Deckplättchen luftdicht verschlossen. Dies wird gemacht, da ansonsten die Lösung schnell im Strahlengang des Mikroskops verdunsten und so die Brownsche Molekularbewegung mit dem Verdunstungsstrom um ein vielfaches überlagern würde. Im Bild 19 kann dieser Effekt bereits beobachtet werden. Es zeugt davon, dass die Kammer ungenügend mit Vaseline abgedichtet wurde. Die Kugeln werden mit dem 20fach-Objektiv betrachtet und 10 Sekunden lang über die CCD-Kamera aufgenommen. Dazu gibt es zwei Auswertungsarten; die erste wäre, einzelne Latexkugeln aufzunehmen, die zweite mehrere Latexkugeln gleichzeitig auszuwerten. Im Praktikum haben wir uns auf die zweite Variante beschränkt, da nicht mehrere einzelne Latexkugeln gefunden wurden. Nach der Kalibrierung der Längen und der Zeit (Festlegen der Framerate in der Software) werden drei Kugeln markiert und mit Hilfe der Erkennungssoftware in IGOR verfolgt. Ein Makro protokolliert die Bewegungen der drei Latexkugeln. Abbildung 19 zeigt das protokollierte Ergebnis des Random-Walks der drei Kügelchen. IGOR erzeugt ein r²-t-diagramm mit einer Regressionsgerade und kann über diese mit Gleichung 9 die Diffusionskonstante D berechnen. Mit IGOR wurde die Diffusionskonstante D = 1,899 * m 2 /s bestimmt. Die Auswertung mit mehreren Kügelchen gleichzeitig führt man durch, da ein gemittelter Wert gegenüber Einzelwerten genauer ist. Mit der Diffusionskonstante D lässt sich nun die Bolzmann- Konstante k über k= 6 r D T bestimmen. Werte eingesetzt ergibt 3 Ns m 1, m 2 m s k= 303 K 11) 12) k = 2,36*10-23 J/K.

23 FP 22 - Lichtmikroskopie 21 Die Temperatur haben wir über die Annahme genähert, dass die Kammer bei Raumtemperatur (ca. 20 C) gelagert wurde und die Temperatur im Mikroskop durch die starke Beleuchtung um 10 C ansteigt. Als Radius der Latexkugeln haben wir den im Skript vorgegebenen Wert von 1,1 µm und unseren gemessenen Wert von 2,9 µm gemittelt. Mit Gleichung 7 ergibt sich über die Gaskonstante R = 8,31 J/mol *K die Beziehung zwischen N A und D (Glg 11 in 7 einsetzen): N A = R T 6 r D N A = 8,31 J mol K 303K Ns 2 2 µm 1, m2 m s N A = 3,52*10 23 mol -1 Verglichen mit dem Literaturwert von N ALit = 6,022*10 23 mol -1 ergibt dieser Einzelwert schon eine entsprechend gute Näherung. Auf eine Fehlerabschätzung wird in diesem Zusammenhang verzichtet, da nur ein Wert zur Verfügung stand. Würde man anstelle von einem Radius = 2µm den Skript- Radius von 1,1 µm einsetzen, wäre der Wert entsprechend näher am Literaturwert. Ebenso müssten wir uns genauer Gedanken über die tatsächliche Temperatur machen, da es sich auch bei diesem Wert um einen Schätzwert handelt.

24 FP 22 - Lichtmikroskopie 22 Abbildung 18: Brownsche Molekularbewegung (random-walk) von einer Latexkugel bei 63 facher Vergrößerung. Abbildung 19: Brownsche Molekularbewegung mit Drift in x- Richtung von drei Latexkügelchen bei 20 facher Vergrößerung. Abbildung 20: Multi-Auswertung von drei Latexkügelchen; r²-t- Diagramm bei 20 facher Vergrößerung.

25 FP 22 - Lichtmikroskopie Vergleich der Kontrastmethoden Für die Aufnahmen der 3T3-Zellen im Hellfeld und im Phasenkontrast wurde wiederum eine geschlossene Kammer angefertigt. Unter Anleitung wurde eine Lösung mit lebendigen 3T3-Zellen in die Kammer gegeben und anschliessend unter dem Mikroskop bei einer 40 fachen Vergrößerung betrachtet und jeweils von der selben Stelle mit IGOR eine Aufnahme aufgenommen. Abbildung 21: 3T3 Zellen im Hellfeld, 40x Abbildung 22: 3T3-Zellen im Phasenkontrast, 40x Deutlich zu erkennen ist, dass die Aufnahme im Phasenkontrast wesentlich weniger Artefakte hat und somit das Gesamtbild homogener erscheint. Die Zellen mit dem roten und blauen Pfeil haben eine ungefähre Abmessung von 100 µm. Wobei davon auszugehen ist, dass der Zellkern (Pfeilspitze) dicker ist als der übrige Zellkörper. Ebenso erkennbar ist, dass der Zellkern (blauer Pfeil) im Hellfeld dunkel und im Phasenkontrast hell erscheint. Dies ist durch konstruktive Interferenz zu erklären. Der rote Pfeil zeigt einen anderen Zellkern. Die Details im rechten Bild dieses Zellkerns (Abb. 22) scheinen bei Vergrößerung am Bildschirm reichhaltiger zu sein als im linken Bild.

26 FP 22 - Lichtmikroskopie 24 Die Abbildungen 23 und 24 wurden im DIC bzw. im RIC Verfahren aufgenommen. Hierbei handelt es sich wiederum um Ölimmersionsobjektive. Zu erkennen sind wiederum 3T3-Zellen mit 100 facher Vergrößerung bei der DIC Aufnahme und 63 fache Vergrößerung in der RIC Aufnahme. Abbildung 24: 3T3 Zelle im DIC, 100x Abbildung 23: 3T3 Zellen im RIC, 63x Um wirklich Vergleiche von Aufnahmen machen zu können, müsste man das gleiche Bild mit der gleichen Vergrößerung betrachten. Beides ist hier nicht der Fall und somit in diesem Beispiel nicht zu realisieren. Ebenso scheinen die Aufnahmen (besonders die DIC Aufnahme) recht verschwommen zu sein. Dies mag auch daran liegen, dass die Schärfentiefe sehr gering ist.

27 FP 22 - Lichtmikroskopie Fluoreszenzanfärben von zellulären Strukturen In diesem Versuchsteil wurden einige 3T3-Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Es handelt sich dabei einerseits um Phalloidin-Rodamin und andererseits um Ethidium-Bromid. Die Präparierung wurde unter Anleitung der Tutoren vorgenommen. Die Zellen wurden anschließend bei 10 facher und 20 facher Vergrößerung betrachtet. Abbildung 26: 3T3 Zellen, Rodamin 50%, 20x Abbildung 25: 3T3 Zellen, Rodamin und Brodamid 50%, 20x Abbildung 27: 3T3 Zellen, Bromid, 10x

28 FP 22 - Lichtmikroskopie 26 Die Präparierung der Proben kann in drei Schritten beschrieben werden: 1. Zur Konservierung und Erhaltung der Zellen wird mit einer Paraformaldehyd Stammlösung fixiert und durch Formaldehyd die Proteine vernetzt und denaturiert. 2. Um die Zellmembran permeabel für die Farbstoffe zu machen, werden die Zellen mit Triton X-100 aufgeschlossen. Triton X-100 löst Proteine aus der Zellmembran. 3. Anschließend werden die Zellen mit einem oder beiden Farbstoffen eingefärbt. Bei der Präparierung der Proben müssen die MSDS (Sicherheitsdatenblätter) der verwendeten Stoffe unbedingt beachtet werden, da diese Stoffe als giftig eingestuft sind. Ein entsprechender umsichtiger Umgang mit diesen Stoffen ist ebenfalls notwendig. Die Fluoreszenzfarbstoffe markieren unterschiedliche Zellbereiche. Rhodamin-Phalloidin markiert Aktin (das ist ein Protein der Zellmembran) und Ethidium-Bromid markiert hingegen die DNS bzw. die RNS, welche im Zellkern liegt. Drei Zellkulturen standen zur Verfügung. Eine wurde mit Ethidium- Bromid (Abb. 27), die zweite mit Rhodamin-Phalloidin (Abb. 26) und die dritte mit beiden Farbstoffen (Abb. 25) eingefärbt. Gut zu erkennen ist, welchen Bereich nun diese Farbstoffe zum Fluoreszieren bringen. In der Abbildung 26 ist Aktin hervorgehoben worden und somit auf dem Bild gut sichtbar. Leider sieht man auf den aufgenommenen Bilder nicht den farblichen Unterschied. Das Aktin erleuchtete dem Betrachter mit einem kräftigen Rot. Die Abbildung 27 zeigt mit Ethidium-Bromid eingefärbte Zellen. Bei Vergrößerung am Bildschirm ist gut zu erkennen, dass nur der Zellkern bzw. die DNS leuchten. Die Fluoreszenz überstrahlt aber dabei auch andere Bereiche des Zellkerns und somit ist eine genauere Auflösung der DNS nicht sichtbar.

29 FP 22 - Lichtmikroskopie 27 4 Resümee Als Gesamtversuch betrachtet gab dieser Versuch einen anwendungsbezogenen Einblick in die Lichtmikroskopie und deren Grundlagen aus den Bereichen Optik (Funktionsweise des Mikroskops und der Kontrastmethoden) und Quantenmechanik (Fluoreszenz). Die Aufgabe, das Mikroskop zu kalibrieren sowie eine Abschätzung der Auflösung und der Schärfentiefe vorzunehmen, konnte gut nachvollzogen werden. Dies gilt auch für die zweite Aufgabe, anhand der Brownschen Molekularbewegung die Bolzmann- und die Avogadro- Konstante zu bestimmen. Die dritte Aufgabe, die verschiedenen Verfahren miteinander zu vergleichen, gelang nur zwischen dem Hellfeld und dem Phasenkontrast, da gleiche Ausschnitte betrachtet werden konnten und diese Aufnahmen auch deutlich sichtbarer waren. Für den Vergleich und die Bewertung der DIK-Aufnahmen und RIK-Aufnahmen bedürfte es einer größeren Sorgfalt in der Durchführung und Vorbereitung und ggf. auch mehr Erfahrung im Bereich der Mikroskopie. Der vierte Aufgabenteil zeigte beeindruckende Bilder in die Fluoreszenzmikroskopie. Angeregt durch diese Bilder stieg auch die Motivation, sich eingehender mit der quantenmechanischen Wirkungsweise von Fluoreszenz und Phosphoreszenz auseinander zu setzen.

30 FP 22 - Lichtmikroskopie 28 4 Anhang ca.12 pix ca. 7 pix Abbildung 28: Digitale Vergrößerung von Bild 15