[ 18 F]FLT-PET zur Evaluation der Proliferation und des Therapieansprechens maligner Lymphome

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1 Aus der Klinik für Nuklearmedizin des Universitätsklinikums Ulm Leiter: Prof. Dr. med Sven Reske [ 18 F]FLT-PET zur Evaluation der Proliferation und des Therapieansprechens maligner Lymphome Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm von Durda Kratochwil, geb. Tepsic Geboren in Karlovac 2010

2 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Andreas Buck 2. Berichterstatter: Prof. Dr. Stephan Stilgenbauer Tag der Promotion:

3 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 0. Abkürzungen...III 1. Einleitung Maligne Lymphome Epidemiologie, Ätiologie und Pathogenese Klassifikation und Prognose Staging Funktionelle Bildgebung mit FDG-PET Möglichkeiten zur Beurteilung der Proliferationsrate maligner Tumore Ziele Material und Methoden Klinische Studie Patientenkollektiv Radiochemische Synthese von FLT Durchführung der FLT-PET bzw. FLT-PET/CT Auswertung der FLT-PET bzw. FLT-PET/CT Histopathologie- HE-Färbung Immunhistochemie- Ki-67Färbung Routinestaging Datenanalyse Tierexperimentelle Studie Induktion von Lymphom-Xenotransplantaten in immundefizienten Mäuse Therapie-Schema Bestimmung der Proliferationsaktivität im Lymphom-Xenotransplantat Radiosynthese von [ 18 F]FLT I

4 Inhaltsverzeichnis Durchführung der FLT-PET Bestimmung der [ 18 F]FLT-Biodistribution im Gamma-Counter Semiquantitative Bestimmung der [ 18 F]FLT- Aufnahme in der PET Datenanalyse Ergebnisse Klinische Studie Patientenkollektiv / Zusammenfassung der Untersuchungsergebnisse Ergebnisse der Bildgebung von Lymphompatienten mit FLT-PET Grading maligner Lymphome: Vergleich von FDG-PET vs. FLT-PET Korrelation zwischen der Proliferationsfraktion und der [ 18 F]FLT-Aufnahme Tierexperimentelle Studie Auswirkung der Steroidtherapie auf Proliferationsrate und Tumorgröße Auswirkung der Steroidtherapie auf die [ 18 F]FLT Aufnahme des Lymphoms Bildgebung mit FLT-PET Diskussion Vergleich von FLT und FDG zum Staging maligner Lymphome Bestimmung der Proliferationsaktivität maligner Lymphome Grading maligner Lymphome FLT-PET zur Evaluation des Therapieansprechens maligner Lymphome Zusammenfassung Literaturverzeichnis Danksagung Lebenslauf...64 II

5 0. Abkürzungen 0. Abkürzungen Abb. al. aqua dest. bzw. C ca. CLL cm CT DMSO DNA EKG F FDG FLT HCL HIV HPLC HWZ i.v. kev kg m M MALT MBq mg Min. = Abbildungen = andere (lat. altera) = destilliertes Wasser = beziehungsweise = Kohlenstoff = circa = chronisch lympathische Leukämie = Zentimeter = Computertomographie = Dimethylsulfoxid = Desoxyribonukleinsäure = Elektrokardiogramm = Fluor = [ 18 F]-Fluor-Desoxyglucose = [ 18 F]-Fluor-Desoxythymidin = Salzsäure = human immunodeficiency virus = High-Pressure-Liquid-Chromatographie = Halbwertszeit = intravenös = Kiloelektronenvolt = Kilogramm = männlich = Mol = mucosa associated lymphatic tissue = Mega Becquerel = Miligramm = Minuten III

6 0. Abkürzungen MIP = Maximale Intensitäts- Projektion Ml = Mililiter mm = Millimeter MRT = Magnetresonanztomographie N = Stickstoff neg. = negativ NHL = Non-Hodgkin Lymphom NK = natürliche Killerzellen O = Sauerstoff PBS = Phosphatpuffer (phosphat buffered saline) PET = Positronen-Emissions-Tomographie Pt = Patient r = Korrelationskoeffizient REAL = Revised European American Lymphoma-Classification ROI = region of interest s.c. = subcutan SUV = standardized uptake value Tab. = Tabelle TBR = Tumor to background ratio TK1 = Thymidinkinase 1 WHO = World Health Organization IV

7 1. Einleitung 1. Einleitung 1.1. Maligne Lymphome Epidemiologie, Ätiologie und Pathogenese Es werden zwei Formen der malignen Lymphome unterschieden, Hodgkin-Lymphom und Non-Hodgkin-Lymphom (NHL). Die Inzidenz des Morbus Hodgkin zeigt weltweit eine geringe Variationsbreite (Parkin et al. 2005). Das Verhältnis zwischen Männern und Frauen ist ca. 3:2. Jedes Jahr erkranken in Deutschland 3 von Einwohnern an Morbus Hodgkin. Der Anteil der Hodgkin-Lymphome an allen Krebserkrankungen beträgt etwa 0,5%. Die Altersverteilung verläuft zweigipflig mit einem ersten Gipfel im 3. Jahrzehnt und dem zweiten Gipfel in der 7. Dekade. Das mittlere Erkrankungsalter beträgt ca. 35 Jahre (Arbeitsgemeinschaft Bevölkerungsbezogener Krebsregister, 2006; Dachdokumentation Krebs, Robert Koch-Institut). Die Ätiologie dieser Erkrankung ist nicht vollkommen geklärt. Eine Assoziation zu Infektionen mit dem Epstein-Barr-Virus wird beschrieben (Jarrett et al. 2003). In den westlichen Ländern konnte das Epstein-Barr- Virus in 26-50% der Fälle im Tumor nachgewiesen werden (Armstrong et al. 1998). Das Risiko, nach einer erfolgten Mononukleose an einem Hodgkin-Lymphom zu erkranken, wird als 3fach erhöht beschrieben (Young et al. 2003). Ebenfalls ein erhöhtes Erkrankungsrisiko besteht bei angeborenen und erworbenen Immundefekterkrankungen wie z.b. HIV und nach allogener Knochenmarkstransplantation (Swerdlow et al. 2003). An NHL erkranken in Deutschland pro Jahr 5 bis 10 pro Einwohner. Die Inzidenz dieser Lymphomgruppe hat sich in den letzten 25 Jahren bei Männern verdoppelt, bei Frauen ist sie um 70% gestiegen (Arbeitsgemeinschaft Bevölkerungsbezogener Krebsregister, 2006; Dachdokumentation Krebs, Robert Koch-Institut). 80% aller NHL sind B-Zell-Lymphome. Bei den NHL spielen Immundefekte (Knowles et al. 2003), Infektionen (Matsuo et al. 2004) und durch Translokation entstandene Hybrid-Gene (Kerbauy et al. 2004) eine Rolle in der Pathogenese der Lymphomentstehung. 1

8 1. Einleitung Klassifikation und Prognose Lymphome sind Neoplasien des lympathischen Systems. Gewöhnlich werden maligne Tumore nach ihrer zellulären Herkunft klassifiziert. Lange Zeit war es nicht möglich, dieses Prinzip erfolgreich auf die malignen Lymphome anzuwenden. Dies änderte sich erst mit der Klärung der zellulären Zusammensetzung des lympathischen Gewebes und der Entwicklung von Methoden, mit denen die verschiedenen Zellarten des lympathischen Systems zuverlässig voneinander unterschieden werden konnten (Coupland et al. 2000). Inzwischen wurde gezeigt, dass die zelluläre Herkunft die morphologischen und klinischen Merkmale der meisten Lympomkrankheiten ganz wesentlich bestimmt und somit eine Grundlage für die Klassifizierung der Lymphome darstellt (Coupland et al. 2000). Jahrzehntelang standen sich in der Fachliteratur unterschiedliche Einteilungen der malignen Lymphome gegenüber. Die Kiel- Klassifikation wurde im deutschsprachigen Raum und die Working Formation-Klassifikation vor allem in den USA verwendet. Anfang der 90er Jahre einigten sich die Pathologen der beiden Kontinente auf eine neue gemeinsame Klassifikation, die Revised-European-American-Lymphoma (R.E.A.L.) Klassifikation. Im Mittelpunkt dieser neuen Einteilung stand die Definition distinkter Lymphomkrankheiten, die sich mit guter Reproduzierbarkeit diagnostizieren lassen. Neben den bisher beachteten Kriterien, wie den klinischen und morphologischen Merkmalen, kamen jetzt die immunphänotypischen und molekulargenetischen Merkmale neu hinzu. Prinzipiell wird in der WHO-Klassifikation jede Entität definiert durch die Kombination morphologischer, immunphänotypischer, genetischer und klinischer Befunde (Harris et al. 1999). Modifikationen in der Terminologie sind adaptiert an die REAL-Klassifikation (siehe Tabelle 1). Die wichtigen Prognosefaktoren beider Lymphomarten sind die Histologie, das Staging, das Lebensalter der Patienten, die B-Symptomatik, wozu Gewichtsabnahme über 10 % innerhalb eines halben Jahres, Nachtschweiß und Fieber über 38 C gehören, und der Allgemeinzustand des Patienten. Der Morbus Hodgkin hat eine günstige Prognose, er gehört zu den am besten therapierbaren Malignomen mit einer 10-Jahres-Überlebensrate von über 80% für Stadium II und über 60% für Stadium III. Im Stadium IV beträgt die 10-2

9 1. Einleitung Jahres-Überlebensrate über 40% (Josting et al. 2002). Bei den NHL beträgt die mittlere Überlebenszeit bei den indolenten Lymphomen Jahre und bei den aggressiven 3-4 Jahre (Dreyling 2010, Murawski et al. 2010). Tabelle 1: WHO-Klassifikation der Lymphome (WHO = World Health Organization, MALT = mucosa associated lymphatic tissue ) B-Zell-Ursprung Chronische lymphozytische Leukämie/ lymphozytisches Lymphom Lymphoplasmozytisches Lymphom/Immunozytom/M. Waldenström Haarzell-Leukämie Splenisches Marginalzonenlymphom Marginalzonen-Lymphom Extranodales (MALT-B-Zell) Lymphom Nodales (monozytoid) Follikelzentrums-Lymphom/follikulär, Grad I Follikelzentrumslymphom/follikulär, Grad II Prolymphozytenleukämie Plasmozytom/Multiples Myelom Mantelzell-Lymphom T-Zell-Ursprung Leukämie großer granulärer Lymphozyten, vom T- und NK- Zell Typ Mycosis fungoides/sézary Syndrom "smoldering" und chronische adulte T-Zell Leukämie/Lymphom (HTLV+) Prolymphozytenleukämie Peripheres T-Zell Lymphom, nicht spezifiziert Angioimmunoblastisches Lymphom Follikelzentrums-Lymphom/follikulär, Grad III Angiozentrisches Lymphom Diffuses großzelliges B-Zell Lymphom Intestinales T-Zell Lymphom Primäres mediastinales (thymisches) B- Anaplastisches großzelliges Lymphom (Tgroßzelliges Lymphom und Null Zell-Typ) Hochmalignes B-Zell Lymphom, Burkitt-ähnlich Vorläuferzell B-lymphoblastisches Vorläuferzell T-lymphoblastisches Lymphom/Leukämie Lymphom/Leukämie Burkitt-Lymphom/akute B-Zell Leukämie Plasmazell-Leukämie Morbus Hodgkin Klassisches Hodgkin-Lymphom -Noduläre Sklerose -Lymphozytenreich -Gemischte Zellulärität -Lymphozytenarm Noduläres Lymphozytenprädominantes Hodgkin-Lmphom Adultes T-Zell Lymphom/Leukämie 3

10 1. Einleitung Staging Die Diagnose eines malignen Lymphoms wird durch die Lymphknotenhistologie gesichert. Zur Erfassung der Ausdehnung der Krankheit wird das klinische Staging durchgeführt. Dazu gehört die Anamnese mit der Frage nach der B-Symptomatik (Fieber über 38 C, Nachtschweiß und Gewichtsabnahme von mehr als 10% des ursprünglichen Gewichtes innerhalb von 6 Monaten), die Laborbefunde, Röntgen des Thorax, Sonografie und CT des Thorax und des Abdomens sowie die Knochenmarkbiopsie mit Zytologie. Gegebenfalls wird bei der weiteren Fragestellung, insbesondere nach Befall von ZNS, auch eine MRT durchgeführt. Ein sorgfältiges Staging ist entscheidend für die Prognose und Behandlung der Lymphome. Das bisher bedeutendste Verfahren zum Staging der Patienten ist die CT. Aussagen der CT über die Lymphadenopathien basieren auf der Lymphknotengröße. Dabei gelten Lymphknoten als pathologisch deren Durchmesser signifikant vergrößert ist. Es kann im CT jedoch nicht unterschieden werden zwischen reaktiv oder entzündlich vergrößerten Lymphknoten und solchen, die maligne verändert sind. Auch ist das Erkennen von kleinsten Tumorabsiedlungen in normal großen Lymphknoten nicht möglich (Vinnicombe et al. 2003). Die gleichen Kriterien der Durchmesserbestimmung des Lymphknotens gelten auch bei der MRT. Somit ergibt sich hier die gleiche Problematik wie beim CT. Hierbei könnte jedoch die Verwendung von superparamagnetischem Eisenoxid als Kontrastmittel zur Darstellung der Lymphknoten hilfreich sein. Das Eisenoxid wird von den retikuloendothelialen Zellen aufgenommen, wodurch es zu einer Signalminderung in T2-gewichteten Sequenzen kommt. In den Lymphknoten, die mit Tumorzellen durchsetzt sind, fehlen retikuloendotheliale Zellen, und es kommt nicht zu der Signalminderung. Damit können teilweise auch nichtvergrößerte Lymphknoten, die tumorös infiltriert sind, im MRT erkannt werden. Weiterhin können jedoch Mikrometastasen oder nur teilweise befallene Lymphknoten nicht eindeutig identifiziert werden (Mack et al. 2002). Die Stadieneinteilung bei den malignen Lymphomen erfolgt nach der Ann-Arbor- Klassifikation (siehe Tabelle 2). 4

11 1. Einleitung Tabelle 2: Stadieneinteilung der maligne Lymphome nach der Ann-Arbor-Klassifikation. Es werden vier klinische Stadien unterschieden. I Befall einer einzigen Lymphknoten-Station oder Vorliegen eines einzelnen extranodal lokalisierten Herdes (IE) II Befall von zwei oder mehr Lymphknotenregionen auf einer Seite des Zwerchfells oder Vorliegen lokalisierter extranodaler Herde und Befall einer oder mehrerer Lymphknotenregionen auf einer Seite des Zwerchfells (IIE) III Befall von Lymphknotenregionen auf beiden Seiten des Zwerchfells oder Vorliegen lokalisierter extranodaler Herde und Befall einer oder mehrerer Lymphknoten- regionen (IIIE), sodass Herde auf beiden Seiten des Zwerchfells resultieren IV disseminierter Befall eines oder mehrerer extralympathischer Organe mit oder ohne Lymphknotenbefall Zusätze: A: keine Begleitsymptome; B: mit Begleitsymptomen E: extranodaler Befall (umschriebener Organbefall durch direktes Einwachsen aus den beteiligten Lymphknoten oder im engen anatomischen Bezug) S: Milzbefall 1.2. Funktionelle Bildgebung mit FDG-PET Die Behandlungsgrundlagen der malignen Lymphome basieren auf der Histologie und dem Tumorstaging. In den letzten zwei Jahrzehnten war die CT das wichtigste Verfahren zum Tumorstaging und der Kontrolle des Therapieansprechens (Schreyer et al. 2005). Es ist allerdings nicht möglich, nicht vergrößerte, aber bereits befallene Lymphknoten sicher zu erkennen. Viele Behandlungsmethoden der malignen Lymphome sind zytostatisch und führen nicht sofort zu einer Minderung der Größe des Tumors. Veränderungen der Tumorgröße können erst nach Wochen oder Monaten nach der Therapie auftreten, wodurch Entscheidungen über Therapiemodifikationen bei Nichtansprechen nicht schnell genug getroffen werden können (Padhani et al. 2000). 5

12 1. Einleitung In verschiedenen Studien wurde die FDG-PET als ein sensitives Verfahren zur Aufdeckung nodaler, extranodaler und Knochenmarksbeteiligung in Vergleich zu den konventionellen Stagingmethoden - wie der CT, dem Ultraschall oder der MRT - evaluiert (Moog et al. 1997, Otero et al. 2009, von Falck et al. 2009, Kand et al. 2010). Die Positronen-Emissions-Tomographie ist ein nuklearmedizinisches Schnittbildverfahren, welches es ermöglicht, nicht-invasiv die Verteilung einer radioaktiv markierten Substanz in vivo zu bestimmen. Die FDG-PET ist eine diagnostische Methode, mit der vitale Tumore detektiert und gleichzeitig von den stoffwechselinaktiven diffenenziert werden können. Das biochemische Konzept besteht darin, dass Desoxy-Glucose analog zu Glucose durch Transporterproteine der Zellmembran ins Zellinnere transportiert wird, dieses nach Phosphorylierung nicht mehr verlassen, dort aber auch nicht weiter katabolisiert werden kann (siehe Abbildung 1). FDG FLT Glucosetransporter (Glut-1) Nukleosidtransporter FDG FLT Hexokinase II dephosphorylase Glucose- 6-Phosphatase Thymidinkinase I Thymidin- FDG-6-PO 4 FLT-PO 4 Glycolyse DNA-Synthese Abbildung 1: Trapping -Mechanismus von FDG und FLT: FDG wird über den Glukosetransporter Glut-1 in die Zelle aufgenommen und dort, hauptsächlich durch die Hexokinase II, phosporyliert. Nachgeschaltet finden kaum metabolischen Abbauprozesse statt, dadurch kumuliert das FDG-6-PO 4 in der Zelle. FLT wird in die Zelle über einen Nukleosidtransporter aufgenommen und durch die Thymidinkinase I phosporyliert. In dieser Form wird es weder in quantitativ bedeutendem Ausmaß in die DNA eingebaut, noch dephosporyliert. Es kommt ebenfalls zu einer intrazellulären Akkumulation. (FDG = Fluorodeoxyglucose; FLT = Flurodeoxythymidin; DNA = Desoxyribonukleinsäure ) 6

13 1. Einleitung Viele Tumorentitäten weisen eine erhöhte intrazelluläre Aufnahme des Glukoseanalogons FDG auf, zumeist bedingt durch eine erhöhte Expression des Glukosetransporters Glut-1 in der Zellmembran und eine höhere Rate der intrazellulären Phosporylierung über den Hexokinase-Signalweg. Das intrazelluläre Trapping der FDG-6-P beruht dabei auf der gesteigerten Phosporylierung durch Hexokinasen. Somit wird FDG analog des hochregulierten Glukosestoffwechsel in malignen Zellen vermehrt aufgenommen und kann dazu benutzt werden metabolisch aktive Tumorherde darzustellen (Poeppel et al. 2009). Zudem ist eine, nach der Chemotherapie persistierende, FDG-Anreicherung in Lymphomen prognostischer Hinweis auf ein frühes Rezidiv und dabei der konventionellen CT überlegen (Romer et al. 1998, Jerusalem et al. 2003). In weiteren Studien wurde darüber berichtet, dass FDG-PET für die Kontrolle des Therapieansprechens verschiedener Tumore verwendet werden kann, wie z.b. des Ösophaguskarzinom (Flamen et al. 2002), des malignen Glioms (Spence et al. 2002) und des malignen Lymphoms (Spaepen et al. 2001, Matthies et al. 2001, van der Hiel et al. 2001). FDG ist nicht tumorspezifisch (Wang et al. 2009, McDermott et al. 2010). Es kann sich ebenfalls in entzündlichen Läsionen mit erhöhtem Glukoseverbrauch, z.b. Abszessen, Pneumonien (Strauss et al. 1996), Tuberkuloseherden (Shreve et al. 1999), Sinusitiden (Yasuda et al. 1998) oder Sarkoidoseherden (Yamada et al. 1998) anreichern und so zu falsch positiven Ergebnissen bezüglich der Tumordiagnostik führen. Die FDG-Aufnahme weist in Organen mit physiologisch hohem Glukosemetabolismus, z.b. im Gehirn und Myokard, eine hohe Hintergrundaktivität auf. Weiterhin findet sich eine erhöhte Konzentration im Urogenitaltrakt, da (entgegen der Glukose) eine FDG-Ausscheidung über die Niere erfolgt. In der Skelettmuskulatur kann es ebenfalls zu einer Anreicherung kommen, falls es nach der FDG-Gabe zu verstärkter Muskelaktivität oder einem erhöhten Insulinspiegel kommt (Costelloe et al. 2009). Vor dem Hintergrund dieser Limitationen ist es sinnvoll, neue Radiopharmaka zu etabliert die nicht die Glucoseaufnahme des Tumors beurteilen sondern, wie beispielsweise die Nukleoside, der DNA-Synthese dienen und somit unmittelbarer die Proliferationsaktivität repräsentieren. 7

14 1. Einleitung 1.3. Möglichkeiten zur Beurteilung der Proliferationsrate maligner Tumore Die quantitative Alteration der DNA-Synthese reflektiert einen radiogenen oder chemotherapeutisch induzierten Zellschaden fakultativ besser als eine Veränderung der Glukoseutilisation. Daher könnten nichtinvasive Messungen der Proliferationsrate maligner Tumore hilfreich sein bei der Wahl der optimalen Therapie. Es wurden bereits Radiopharmaka als potentiell spezifische Proliferationsmarker zur selektiven Visualisierung maligner Tumore evaluiert, wie z.b. [ 11 C] Thymidin. Es stellt ein Pyrimidinbasenderivat dar, das für die in vivo DNA-Synthese gebraucht wird (Martiat et al. 1988, van Eijkeren et al. 1996, Wells et al. 2002). Es wird in die DNA eingebaut und dazu benutzt, die DNA-Syntheserate zu bestimmen (Vander Borght et al. 1991, Mankoff et al. 1999). Weiterhin wurde gezeigt, dass die [ 11 C] Thymidin Retention nach erfolgreicher Therapie schneller abnimmt als die Retention von FDG (Shields et al. 1998). [ 11 C] Thymidin ist aufgrund des schnellen Abbaus (Shields et al. 1992, Shields et al. 1998) und der kurzen Halbwertszeit des [ 11 C] (20 min) für den Routinegebrauch in der Klinik ungeeignet. Das Thymidin-Analogon [ 18 F] FLT ist in vivo stabil (Shields et al. 1998, Grierson et al. 2000) und ist beteiligt am Nukleosidstoffwechsel maligner Tumore. FLT wurde initial als Chemotherapeutikum für die Behandlung von Leukämien verwendet (Blau et al. 1989), wobei entdeckt wurde, dass dieser Antimetabolit eine anti-hiv Wirkung besitzt, vergleichbar des Wirkmechanismus von Azidothymidin (Kong et al. 1992). In weiteren klinischen Studien wurde jedoch eine höhere Toxizität des FLT, in pharmakologisch wirksamen Dosierungen, beobachtet (Flexner et al. 1994). Die erfolgreiche Kopplung von F-18 an FLT (Wilson et al. 1991) war ein Versuch, das [ 18 F] FLT als ein Radiopharmakon für das Monitoring von HIV-Infektionen zu benutzen. Dieser Ansatz wurde im Tiermodel zwar nie getestet, somit wurde aber die Basis für die Darstellung der tumoralen Proliferation mit Hilfe von FLT geschaffen. Es konnte nachgewiesen werden, dass [ 18 F] FLT in proliferierendem Gewebe akkumuliert (Shields et al. 1998). FLT wird von den Zellen aufgenommen (siehe Abbildung 1) und durch die Thymidinkinase 1 (TK1) phosporyliert, wodurch es zum intrazellulären Trapping von FLT kommt (Kong et al. 1992, Barthel et al. 2005). Das Verbleiben des FLT innerhalb 8

15 1. Einleitung der Zelle zeigt dabei die intrazelluläre TK-1-Aktivität. Die Thymidinkinase 1 ist ein Enzym, welches im engen Zusammenhang mit der zellulären Proliferation steht. Studien haben gezeigt, dass die TK-Aktivität um das 10-fache ansteigt, wenn die Zelle in die DNA- Synthesephase eintritt (Sherley et al. 1988). Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass hohe TK-1-Aktivität mit dem Wachstum der Tumorzellen korreliert (Sakamoto et al. 1993, Romain et al. 1997). Schließlich wurde die signifikante Korrelation der Tumorproliferation und der FLT-Aufnahme im Maus-Modell für das Lymphom (Wagner et al. 2003) und am Menschen für das Bronchialkarzinom (Buck et al. 2002) gezeigt Ziele Die Positronen-Emissions-Tomographie stellt die derzeit beste Methode dar, Stoffwechselvorgänge in vivo mit hoher Ortsauflösung bildlich darzustellen und zu quantifizieren. Das bisher am häufigsten verwendete Radiopharmakon [ 18 F]Fluorodesoxyglukose (FDG) hat eine hohe Sensitivität beim Nachweis maligner Tumore und ist den konventionellen Methoden, wie z.b. dem CT oder MRT, überlegen (Otero et al. 2009, von Falck et al. 2009). FDG reichert sich jedoch ebenfalls in entzündlichen Läsionen an, wodurch die Spezifität limitiert wird. Neben dem hochregulierten Glucosestoffwechsel ist die alterierte Zellzyklusregulation ein weiteres Selektionskriterium maligner Tumore. Daher sollte durch radioaktive Markierung von Nukleosiden, da diese die elementaren Bausteine in der DNA-Synthese sind, eine selektivere Anreicherung im Tumor erreicht werden und diese mit der PET abgebildet werden können. Ziel dieses Forschungsprojektes ist es, die proliferationsabhängige Anreicherung von FLT in malignen Lymphomen nachzuweisen und zu zeigen, dass dadurch die FLT-PET eine sinnvolle Ergänzung des Stagings maligner Lymphome darstellt. In einer prospektiven, klinischen Studie an Patienten mit histologisch gesichertem Lymphom soll überprüft werden, ob die mittels PET in vivo quantifizierbare, tumorale FLT-Aufnahme mit der Proliferationsaktivität im Tumor korreliert; diese wird ex vivo mit 9

16 1. Einleitung der immunhistologischen Färbung des proliferationsassoziierten Antigens Ki-67 als Referenzmethode quantifiziert. In einem weiteren Teil des Forschungsobjektes soll in einer tierexperimentellen Versuchsserie das [ 18 F] FLT zur Kontrolle des Therapieansprechens maligner Lymphome nach einer antiproliferativen Therapie mit Prednisolon in einem Maus-Xenotransplantat- Modell evaluiert werden. Es soll überprüft werden, ob die tumorale FLT-Aufnahme nach der Therapie zeitnah signifikant sinkt und ob die mittels PET quantifizierte FLT- Anreicherung mit der Proliferationsrate im Tumor korreliert. 10

17 2. Material und Methoden 2. Material und Methoden 2.1. Klinische Studie Patientenkollektiv In diese prospektive Studie wurden 28 Patienten eingeschlossen ( 19 Männer, 9 Frauen; siehe Tabelle 3). Patienten mit histologisch gesicherten malignen Lymphomen, die an dem Universitätsklinikum Ulm zum Staging oder Restaging aufgenommen wurden, nahmen an der Studie teil. Patienten mit Lymphom-Manifestation im Knochen, mit Zweitneoplasien und Patienten, die in den letzten 4 Monaten eine Radio- oder Chemotherapie hatten, wurden in die Studie nicht aufgenommen. Alle Patienten gaben eine schriftliche Einverständniserklärung über die Teilnahme an der Studie ab. Die Studie wurde von der Ethikkommission der Universität Ulm genehmigt Radiochemische Synthese von FLT Die Herstellung von [ 18 F]FLT erfolgte aus benzoylgeschütztem Anhydrothymidin nach der von Machulla beschriebenen Methode (Machulla et al. 2000). Die Radiosynthese wurde ferngesteuert und vollautomatisch in einem PET-Synthesegerät (Nuclear Interface; Münster) durchgeführt (Präcursor, Ansatzkit und Verbrauchsmaterial Merck, Darmstadt). [ 18 F]Fluorid wurde mittels der 18 O(p,n) 18 F Kernreaktion durch Beschuß von Isotopen angereichertem [ 18 O]Wasser mit einem 18 MeV-Strahl im Zyklotron Cyclone 18/9 (IBA, Louvain, Belgien) erzeugt. Nach der Wiedergewinnung des [ 18 O]Wasser mittels einer QMA Kassette (Milford, USA) wurde das [ 18 F]Fluorid mit 360 µl K 2 CO 3 Lösung (3,3 mg K 2 CO 3 ) ausgewaschen. 20 mg Kryptofix wurden danach zu 0,7 ml Acetonitril beigefügt, und das Gemisch des [ 18 F]Fluorids sowie des Kaliumkarbonats wurden bis zur Trockenheit eingedampft. Der Eindampfungsvorgang wurde mit 1 ml Acetonitril wiederholt, um letzte Spuren von Restfeuchtigkeit zu entfernen. Danach wurde eine Lösung von 10 mg des 5 -benzoyl-3,2- Anhydrothymidin in 1 ml DMSO zu dem trockenem Kryptat dazugefügt, und die 11

18 2. Material und Methoden entstandene Lösung wurde 10 min lang bei 160 C inkubiert. Durch Hydrolyse mit 1%iger 350 µl 1 M NaOH und Erhitzen bis 55 C für 10 min wurde die DMT-Schutzgruppe entfernt. Danach wurde das Hydrolysat über eine Alox N Patrone transferiert um freies [ 18 F]Fluorid zu eliminieren. Anschließend wurde das [ 18 F]FLT mittels präparativer Hochdruckflüssigkeitschromatographie gereinigt. Für die Trennung des [ 18 F]FLT wurde eine 18 C-Säule (Phenomenex, Luna 5u, 250 x 10 mm) verwendet, die mit isotonischer Natrium-Chlorid-Lösung und Ethanol (90/10, V/v) bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min ausgewaschen wurde. Die Verbleibzeit von FLT belief sich auf 10 min. Das FLT wurde somit von 18 F-Verunreinigungen getrennt. Abschließend wurde das gewonnene Produkt durch einen 0,2 µm Sterifix Filter (Braun, Melsungen) in eine sterile Injektionslösung überführt Durchführung der FLT-PET bzw. der FLT-PET/CT Die PET-Untersuchungen wurden an hochauflösenden, dedizierten Vollring-Tomographen (ECAT Exact oder ECAT HR+; Siemens/CTI, Knoxville, USA), welche bei einem axialen Gesichtsfeld von 15,5 cm 47 (ECAT Exact) oder 63 (ECAT HR+) Schnittbilder pro Bettposition generieren, durchgeführt. Vierminütige Transmissionsscans mit einer Germanium 68/Gallium 68-Stabquelle wurden vor der Tracerapplikation durchgeführt. Die Schwächungskorrektur ist für die Quantifizierung der Tracer-Aufnahme per SUV Voraussetzung. Die Patienten blieben 6 Sunden vor der PET-Untersuchung nüchtern. Statische Emissionsscanner wurden 60 min nach der i.v. Injektion von MBq [ 18 F]FLT (Mittelwert 334 MBq) bzw MBq 18 F-FDG (Mittelwert 391 MBq) gestartet. Fünf Bettpositionen decken bei jedem Patienten ein Messfeld von 77,5 cm ab. Die Emissionsscans umfassten jeweils Hals, Thorax, Abdomen, Becken und proximalen Femur der Patienten; die Akquisitionszeit betrug 8 min pro Bettposition. Die Schnittbilder wurden im Anschluss mit Hilfe des in Abteilung etablierten, iterativen Rekonstruktionsalgorithmus rekonstruiert (Schmidlin et al. 1997). Die PET/CT erfolgte am General Electric Discovery LS Hybrid-Scanner. Die applizierte Menge [ 18 F]FLT betrug ebenfalls MBq und wurde wiederum ca. 60 min vor dem Start der Untersuchung verabreicht. Die PET/CT-Untersuchung begann mit der 12

19 2. Material und Methoden Akquisition der CT in der so genannten Scout Definition des kombinierten Scanbereichs. Die Patientenliege wurde nach Akquisition der CT-Daten automatisch in die erste PET- Bettposition gebracht. Der weitere Verlauf der Untersuchung entspricht dem der oben genannten PET. Die CT-Transmissionsbilder wurden für die Schwächungs- und Streustrahlenkorrektur der PET-Emissionsdaten verwendet, dadurch sind im PET/CT keine separaten Transmissionsmessungen notwendig. Die Schnittbildrekonstruktion erfolgte mit dem vom Hersteller mitgelieferten OSEM-Algorithmus. Zur Auswertung der PET/CT wurde eine Fusions-Software verwendet. Diese ermöglicht die Auswertung von PET und CT-Bildern separat für beide Datensätze oder im Fusionsmodus (GE Entegra bzw. Xeleris) Auswertung der FLT-PET bzw. FLT-PET/CT Die Auswertung erfolgte verblindet ohne Kenntnis der Ergebnisse der Voruntersuchungen (CT) oder des histologischen Befundes. Kriterien für einen positiven Befund im Sinne eines Tumornachweises war eine eindeutige fokale FLT- Anreicherung in einem Gewebe mit normalerweise niedrigem, homogenem Speichermuster. Diese Kriterien basieren auf den Vorschlägen der Autoren, die erstmals mit [ 11 C]-Thymidin und PET gearbeitet hatten (Shields et al. 1998). Zur visuell-quantitativen Auswertung wurden fokale Mehranreicherungen in Organen mit üblicherweise fehlender oder homogener FLT- Speicherung als pathologisch gewertet. Ergänzend zur visuell-qualitativen Befundung erfolgte eine semi-quantitative Bestimmung der tumoralen Tracer-Aufnahme durch die Berechnung des jeweiligen standardized uptake values (SUV). Der SUV ist ein dimensionsloser Parameter, der die relative Aufnahme des Radiopharmazeutikum in einem Organ bzw. Gewebe beschreibt. Dieser relative Parameter bezieht die in einem Gewebevolumen durch regions of interest (ROI) erhaltenen mittleren Aktivitätswerte auf die injizierte Aktivitätsmenge und auf das Körpergewicht des Patienten (SUV = Aktivitätskonzentration im Gewebe [Bq/g] x Körpergewicht [g] / applizierte Aktivität [Bq]). 13

20 2. Material und Methoden Histopathologie HE-Färbung Der histologische Befund wurde in der Abteilung Pathologie der Universität Ulm bei 17 Patienten anhand der Doppelfärbung der Tumorschnitte mit Hämalaun und Eosin erstellt. Die Schnitte wurden entparaffiniert, mit Aqua dest. gewässert und in Hämalaun für 3-8 min gefärbt. Anschließend wurden die Schnitte gespült und gebläut. Als nächstes folgte die Färbung mit 0,1%iger Eosinlösung für 5-15 min. Abschließend wurden die Schnitte in %iges Ethanol und danach in Xylol gelegt. Als Färbeergebnis sind die Zellkerne, basophiles Zytoplasma und Kalk blau, azidophiles Zytoplasma, Bindegewebe und Fibrin rot. Anhand dieser Schnitte wurden die Präparate mit der besten Darstellung des Tumors für die Ki-67 Färbung ausgesucht Immunhistochemie - Ki-67-Färbung Die immunhistochemischen Färbungen der klinischen Studie wurden im Rahmen der klinischen Routine von der Abteilung Pathologie angefertigt. Die verwendeten Materialien und technisches Vorgehen entsprechen der von uns unter beschriebenen Methodik. Die histologischen Präparate wurden unter einem Mikroskop evaluiert und bei jedem Objekt 3 repräsentative Bereiche ausgewählt. Unter dem Mikroskop wurden dann in jedem Bereich 200 Zellen ausgezählt, pro Objektträger 600 Zellen. Die Proliferationsaktivität des Tumors wurde anhand des Prozentsatzes der MIB-1 gefärbten Kerne zu allen Kernen des ausgesuchten Bereiches berechnet Routinestaging Das Routinestaging beinhaltete die klinische Untersuchung, die laborchemische Untersuchung, die Oberbauchsonographie, Röntgen-Thorax, CT des Thorax und des Abdomens sowie die Knochenmarksbiopsie. Bei insgesamt 21 Patienten wurde eine FDG- PET durchgeführt. Die FDG-Aufnahme in das Lymphomgewebe war der für das FLT- PET beschriebenen Methode entsprechend. Um die Biodistribution von FLT mit der von FDG zu vergleichen wurde zusätzlich die FDG-Aufnahme in normalen Organen berechnet. 14

21 2. Material und Methoden Datenanalyse Nach dem Beenden der klinischen Studie wurden die Ergebnisse der Histopathologie, des Routinestaging und die FLT-Befunde miteinander korreliert. Mit Hilfe der linearen Regressionsanalyse wurde der Anteil der Ki-67 positiven Zellen und der SUV von FLT miteinander korreliert und der Korrelationskoeffizient r bestimmt. Die FLT-Aufnahme in indolenten und aggressiven Lymphomen wurde mit Hilfe des Mann-Whitney-U Tests verglichen. Unterschiede wurden als signifikant betrachtet für das Signifikanzniveau p<0,05. 15

22 2. Material und Methoden 2.2. Tierexperimentelle Studie Induktion von Lymphom-Xenotransplantaten in immundefizienten Mäusen Für diese Studie wurden 12 immundefiziente CB-17 SCID-Mäuse verwendet. Die 6-8 Wochen alten Mäuse wurden vom zentralen Tierforschungszentrum der Universität Ulm bereitgestellt. Die Tierversuche waren durch die zuständige Behörde genehmigt. Die humane, follikuläre, CD-20 positive B-Zell-Lymphom Linie DoHH2 wurde für die Induktion des Lymphom-Xenotransplantats verwendet. Von dieser Zelllinie ist bekannt, dass Thymidinkinase 1, einem Schlüsselenzym des Salvage Signalwegs der DNA-Synthese und somit erforderlich für das intrazelluläre Trapping von [ 18 F]FLT, überexprimiert wird. Zehn Millionen (10 x 10 6 ) DoHH2 Zellen wurden in 200 µl 0,9% NaCl suspendiert und s.c. in die rechte Schulter jeder immundefizienten Maus injiziert. Nach 3-5 Wochen erreichten die Tumore einen Durchmesser von 0,9 bis 2,8 cm, welcher mit einer Schublehre gemessen wurde. Die Kinetik von [ 18 F]FLT in DoHH2-Zellen wurde bereits früher von einer Arbeitsgruppe unserer Abteilung beschrieben (Wagner et al. 2003) Therapie-Schema Die 12 Versuchstiere wurden mit einer i.v.-einzeldosis von Prednisolon (Solu-Decortin, Merck, Darmstadt) mit einer Dosierung von 1,5 mg pro kg Körpergewicht behandelt. Das Therapieansprechen wurde 8 Tage nach der Einleitung der Therapie histologisch evaluiert. Die Versuchstiere der Kontrollgruppe (n=10) wurden mit einer i.v. Injektion physiologischer Kochsalzlösung (NaCl 0,9%) behandelt Bestimmung der Proliferationsaktivität im Lymphom-Xenotransplantat Die formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Schnitte (5 µm) des zu untersuchenden Tumorgewebes wurden entwachst, rehydriert und in einem 0,01 M Citratpuffer in die Mikrowelle für 20 Minuten gelegt, um die Antigene zu demaskieren. Als primärer Antikörper wurden 100 µl der monoklonalen Ki-67 spezifischen 16

23 2. Material und Methoden Antikörperlösung MIB-1 (DAKO, Hamburg, Verdünnung 1:100 mit PBS) in einer Verdünnung von 1:100 verwendet. Als sekundärer Antikörper wurde ein Träger des Peroxidase-Komplexes verwendet (EnVision, DAKO, Hamburg), welcher, zusammen mit 3-Amino-9-Äthylcarbazol (AEC, Sigma-Aldrich, Deisenhofen) als Chromogen diente und die rötliche Färbung der Kerne bewirkte. In jedem Tumor Xenotransplantat wurde die Proliferationsaktivität als Prozentanteil der MIB-1 gefärbten Zellkerne an der Gesamtzahl der Zellkerne in vier repräsentativen Schnitten berechnet. Für die Bestimmung der Immunreaktivität wurden 600 Zellen pro Schnitt und 2400 Zellen pro Tumor untersucht Radiosynthese von [ 18 F]FLT FLT wurde nach der von Machulla beschriebenen Methode (Machulla et al. 2000) produziert. Die Herstellungmethode wurde im Rahmen der klinischen Studie schon beschrieben (Abschnitt 2.1.2) Durchführung der FLT-PET Die FLT-PET wurde bei den behandelten Mäusen (n=12) und Kontrollmäusen (n=10) direkt vor und 8 Tage nach der Applikation von 1,5 mg/kg KG Prednisolon (Solu- Decortin, Merck, Darmstadt) durchgeführt. Zur Anästhesie wurde 100 mg Ketamin (Ketanest, Parke-Davis, Karlsruhe) und 16 mg Xylazin/kg (Rompun, Bayer Animal Health, Leverkusen) i.p. appliziert MBq [ 18 F]FLT wurde in die Schwanzvene der Versuchstiere injiziert. Nach einer Inkubationszeit von 60 Minuten wurde die FLT-PET mittels einem hochauflösenden Vollring-Scanner (ECAT HR+; Siemens/CTI, Knoxville, USA) durchgeführt, welcher 63 Schnitte pro Bettposition produziert. Das axiale Gesichtsfeld betrug 15,5 cm, somit wurden die Mäuse in einer Bettposition gemessen (Abbildung 2). 17

24 2. Material und Methoden Abbildung 2: Narkotisierte Mäuse im FLT-PET mit dem Siemens ECAT HR+ (FLT = Fluordesoxythymidin, PET = Positronenemissionstomographie) Bestimmung der [ 18 F]FLT-Biodistribution im Gamma-Counter Bei Kontrollmäusen und behandelten Mäusen wurde [ 18 F]FLT in die Schwanzvene injiziert (100 µl) mit einer Aktivitätsdosis von 5-10 MBq pro Maus. Nach der zweiten FLT-PET wurden die Mäuse getötet und seziert. Gewebeproben von dem Lymphom, Blut, Herz, Lunge, Leber, Milz, Niere, Interstitium, Magen, Knochen, Gehirn, Muskel und Wirbelkörper wurden gewogen und mit einem Cobra II Auto-Gamma-Counter (Packard Instrument) wurde die Radioaktivität in den Proben bestimmt. Die Daten wurden Zerfallkorrigiert und als mittlerer Prozentsatz (%ID) des Gewebes (g) angegeben (%ID/g). 18

25 2. Material und Methoden Semiquantitative Bestimmung der [ 18 F]FLT- Aufnahme in der PET Die Identifikation des Tumorgewebes erfolgte im Frontalbild der MIP, einem Projektionsverfahren zur Darstellung des Gesamtvolumens. Für alle Tumor-Xenotransplantate wurde das Tumor-Hintergrund-Verhältnis (Tumor to background-ratio = TBR) berechnet. Für diese Berechnung wurde die Region of Interest (ROI) in dem Tumorbereich und eine entsprechende ROI in die Muskulatur des rechten Oberschenkels gelegt. Die Traceraufnahme in dem Oberschenkelbereich wurde als Hintergrundanreicherung definiert. Tumor-Hintergrund Werte wurden für den mittleren Messwert innerhalb der ROI berechnet Datenanalyse Nach dem Beenden des tierexperimentellen Teils der Studie erfolgte der Vergleich der Ergebnisse der Histopathologie und der FLT-Daten. GraphPad Prism Software (Version 4,03, GraphPad, San Diego, CA) wurde für die statistische Analyse verwendet. Es wurde jeweils Mittelwert, Median, Standardabweichung, tumorale [ 18 F]FLT-Aufnahme und Proliferationsaktivität der mit Prednisolon behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe berechnet. Zur Bewertung der statistischen Signifikanz etwaiger Therapie-induzierten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen wurde der nicht-parametrische, in die Software implantierte Mann-Whitney-U Test verwendet. Ein p-wert kleiner als 0,05 wurde als signifikant ertrachtet. 19

26 3. Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1. Klinische Studie Patientenkollektiv / Zusammenfassung der Untersuchungsergebnisse Der histologische Befund ergab bei 12 Patienten die Diagnose eines indolenten Lymphoms, wobei 6 Patienten ein follikuläres Lymphom Grad I, 1 Patient ein follikuläres Lymphom Grad II, 1 Patient ein multiples Myelom (extraossär), 1 Patient ein Immunozytom, 1 Patient ein nichtspezifibares follikuläres Lymphom und 2 Patienten einen Morbus Hodgkin (gemischter Typ) aufwiesen. Bei 16 Patienten ergab sich die Diagnose eines aggressives Lymphoms, hierbei hatten 11 Patienten ein diffus großzelliges B-NHL, 4 Patienten ein anaplastisch großzelliges B-HNL und 1 Patient ein T-Zell reiches B-NHL. Das klinische Stadium der Patienten wurde nach visueller Befundung der bildgebenden und klinischen Untersuchungen festgelegt und die Zahl der jeweils mit FLT-PET oder im Routinestaging diagnostizierten Lymphommanifestationen bestimmt (vgl. Tabelle 3, Spalte 2). Das Routinestaging beinhaltet in unserer Klinik bei klinischer Indikation und technischer Verfügbarkeit auch eine Diagnostik mittels FDG-PET; In unserem Patientenkollektiv war dies bei 19 von 28 Patienten der Fall. Bei diesen Patienten wurde die Anreicherung der Radiopharmaka [18F]FLT und [18F]FDG im intraindividuellen Vergleich semiquantitativ, d.h. mittels Angabe des jeweiligen SUV, ermittelt; diese Ergebnisse wurden tabellarisch zusammengefasst (Tabelle 4). 20

27 3. Ergebnisse Tabelle 3 : Vergleich von FLT-PET und Routinestaging bezüglich der Anzahl detektierter Läsionen Übersicht über die Anzahl der jeweils mit FLT-PET und im Routinestaging entdeckten Läsionen in Abhängigkeit zur jeweiligen histopathologischen Klassifizierung als indolentes oder aggressives NHL oder eines Morbus Hodgkin. 28 konsekutiv eingeschlossenen Patienten mit gesichertem Lymphombefall erhielten 2004 an der Universitätsklinik Ulm sowohl eine Stadienbestimmung per FLT-PET als auch mit den konventionellen Bildgebungsverfahren Sonographie und Computertomographie. (FLT = Fluordesoxythymidin, PET = Positronenemissionstomographie, NHL = Non-Hodgkin-Lymphom) Pat- Histologie Alter Klinisches Läsionen Läsionen Nr. Stadium im FLT-PET Routinestaging indolentes Lymphom 2 follikuläres Lymphom Grad I 60 IV A Multiples Myelom (extraossär) 67 I A Immunozytom IgM (extraossär) 44 IV A follikuläres Lymphom Grad I 57 IV B follikuläres Lymphom Grad II 70 IV A follikuläres Lymphom, nicht spezifiziert 38 IV B follikuläres Lymphom Grad I 53 III A follikuläres Lymphom Grad I 48 II A E follikuläres Lymphom Grad I 37 III B follikuläres Lymphom Grad I 53 II A Morbus Hodgkin, gemischte Zellularität 20 I A Morbus Hodgkin, gemischte Zellularität 19 II A E 4 6 aggressive Lymphome 1 diffuses großzelliges B-NHL 70 IV anaplastisches großzelliges B-NHL 44 IV diffuses großzelliges B-NHL 64 IV B diffuses großzelliges B-NHL, mediastinal 49 III B rel diffuses großzelliges B-NHL 43 IV B rel anaplastisches großzelliges B-NHL 39 IV B diffuses großzelliges B-NHL 53 III A diffuses großzelliges B-NHL 61 III E diffuses großzelliges B-NHL 56 IV B diffuses großzelliges B-NHL 47 I A E diffuses großzelliges B-NHL, zentroblastisch 42 II A E diffuses großzelliges B-NHL 39 IV A diffuses großzelliges B-NHL 66 II E B anaplastisches großzelliges B-NHL 38 III B T-Zell reiches B-NHL 58 VI B anaplastisches großzelliges B-NHL 38 I A

28 3. Ergebnisse Tabelle 4 : SUVs in Abhängigkeit von Lymphomhistologie und Proliferationsrate Übersicht über die mittleren und maximalen SUVs der FLT- (FLT-SUV) und FDG-Untersuchung (FDG-SUV) und der jeweils histologisch bestimmten Proliferationsrate (Ki-67 Index aus der exemplarisch biopsierten Läsion) bei den 28 konsekutiv eingeschlossenen Patienten, die 2004 mit gesichertem Lymphombefall zur Stadienbestimmung per FLT-PET und FDG-PET in der nuklearmedizinischen Abteilung der Universitätsklinik Ulm vorgestellt wurden. (PET = Positronen-Emissions-Tomographie, n/a = nicht analysiert, FLT = Fluordesoxythymidin, FDG = Fluordesoxyglucose, SUV = standardized uptake value, NHL = Non-Hodgkin- Lymphom) Pat- Histologie mittlerer mittlerer Max. Max. Ki- 67 Index FLT- FDG- FLT-SUV FDG- Nr. SUV SUV SUV indolentes Lymphom 2 follikuläres Lymphom Grad I 2,0 6,3 3,6 10,2 4 5 Multiples Myelom (extraossär) 1,3 2,1 1,8 2,8 n/a 6 Immunozytom IgM (extraossär) 2,1 1,4 3,7 1,8 n/a 7 follikuläres Lymphom Grad I 4,5 3,9 8,1 6,1 n/a 9 follikuläres Lymphom Grad II 2,9 n/a 4,6 n/a follikuläres Lymphom, nicht spezifiziert 2,6 4,5 4,2 6,5 n/a 17 follikuläres Lymphom Grad I 1,5 3,2 2,7 5, follikuläres Lymphom Grad I 2,7 3,1 4,2 3, follikuläres Lymphom Grad I 2,8 n/a 5,1 n/a n/a 28 follikuläres Lymphom Grad I 1,9 n/a 3,2 n/a Morbus Hodgkin, gemischte Zellularität 1,4 1,4 2,2 2,6 2 Morbus Hodgkin, gemischte Zellularität 2,0 3,6 3,2 5,2 5 aggressive Lymphome 1 diffuses großzelliges B-NHL 5,5 3,1 10,3 4, anaplastisches großzelliges B- NHL 4,1 6,6 5,6 10, diffuses großzelliges B-NHL 4,8 3,6 5,3 5, diffuses großzelliges B-NHL, mediastinal 4,7 n/a 6,6 n/a diffuses großzelliges B-NHL 3,2 3,1 5,6 4,0 n/a 12 anaplastisches großzelliges B- NHL 9,2 n/a 12,3 n/a n/a 13 diffuses großzelliges B-NHL 5,3 n/a 8,7 n/a diffuses großzelliges B-NHL 5,8 n/a 10,4 n/a diffuses großzelliges B-NHL 5,7 2,0 9,7 3, diffuses großzelliges B-NHL 4,4 5,2 5,9 7,8 n/a 19 diffuses großzelliges B-NHL, zentroblastisch 8,5 15,9 17,0 21,2 n/a 20 diffuses großzelliges B-NHL 8,5 13,2 5,2 22,5 n/a 22 diffuses großzelliges B-NHL 4,8 8,5 8,7 13, anaplastisches großzelliges B- NHL 5,8 6,2 9,5 8, T-Zell reiches B-NHL 6,4 n/a 10,9 n/a n/a 26 anaplastisches großzelliges B- NHL 8,3 n/a 14,3 n/a 90 22

29 3. Ergebnisse Ergebnisse der Bildgebung von Lymphompatienten mit FLT-PET FLT-PET erzeugt Bilder mit hohen Kontrasten zum einen zwischen Lymphomen, zum anderen aber auch zwischen physiologisch-hochproliferativem Gewebe und dem jeweiligen Bindegewebshintergrund. Der durchschnittliche SUV(max) der FLT-Aufnahme in den Lymphomen betrug 6,9 (Median 5,6, Standardabweichung 3,8, Streubreite 1,8-17,0) und der durchschnittliche SUV(max) der FDG-Aufnahme 8,4 (Median 6,3, Standardabweichung 5,9, Streubreite 1,8-22,5). Der durchschnittliche SUV(max) des FLT-Uptake in der Subgruppe der biopsierten und histologisch klassifizierten Läsionen betrug 4,5 (Median 4,7, Standardabweichung 2,7, Streubreite 1,3 9,2) und im Vergleich dazu der durchschnittliche SUV(max) des FDG- Uptake 5,0 (Median 5,1, Standardabweichung 3,3, Streubreite 1,5 16,2). Die FLT-Anreicherung war im Vergleich zur FDG-Speicherung somit jeweils geringer; der Unterschied ist statistisch signifikant (p<0,05). Außer der Traceranreicherung in den malignen Lymphomen wurde eine hohe physiologische FLT-Aufnahme im Knochenmark beobachtet (mittlerer SUV-Wert 6,9, Medianwert 6,9, Streubreite 3,4-12). Die FLT-Aufnahme im Knochenmark war somit signifikant höher im Vergleich zur Aufnahme im Lymphom (p<0,05). Der durchschnittliche SUV der FLT- Aufnahme in der Leber war 4,6 (Median 4,3, Streubreite 4,1-6,6), in der Milz 2,9 (Median 1,9, Streubreite 0,8-6,2), im Magen-Darm-Tarkt 1,9 (Median 1,8, Streubreite 0,9-3,4) und in der Lunge 0,5 (Median 0,4, Streubreite 0,5-0,9). Im Gehirn wurde nur eine angedeutete FLT- Aufnahme beobachtet durchschnittlicher SUV(max) 0,2 (Median 0,18, Streubreite 0,1-0,8). In der Abbildung 3 wird die Biodistribution von FLT im Vergleich zur jeweiligen Verteilung des FDG bei den Patienten gezeigt, die jeweils eine PET mit beiden Tracern bekommen haben. Die malignen Lymphomen zeigten jeweils eine intensive Aufnahme beider Radiopharma, die FLT-Speicherung war jedoch geringfügig, aber statistisch signifikant, geringer als von FDG. Eine signifikant höhere physiologische Hintergrundanreicherung von FLT als von FDG wurde im Knochenmark, in der Milz und in der Leber beobachtet (jeweils 23

30 3. Ergebnisse p<0,05). Im Gegensatz zur physiologisch intensiven cerebralen Glukoseutilisation, d.h. hoher FDG-Anreicherung, zeigt das Gehirn lediglich eine flaue FLT-Aufnahme. 10 FLT FDG durchschnittlicher SUV Lymphom Knochen Leber Milz Magen- Darmtrakt Lunge Gehirn Abbildung 3: Biodistribution von [ 18 F]FLT Durchschnittliche Aufnahme (SUV) von FLT im malignen Lymphom und Normalorganen im Vergleich zur Aufnahme des Glucoseanalogons FDG. (FLT = Fluordesoxythymidin, FDG = Fluordesoxyglucose, SUV = standardized uptake value) Die im Routinestaging beschreibenen Lymphommanifestationen waren bei allen untersuchten Patienten auch in der PET FLT-positiv. An 12 Patienten konnten per FLT-PET ergänzend 75 weitere Läsionen identifiziert werden, an 4 Patienten wurden per FLT-PET insgesamt 9 Läsionen weniger detektiert als mit den konventionellen Verfahren. Bei einem Patienten war z.b. nur im FLT-PET bereits initial eine cerebrale Mehrspeicherung Darstellbar (Abbildung 4). Da diese im Verlauf mit FDG-PET/CT und MRT validiert wurde, ist diese Manifestation als richtig-positiv in der FLT-PET und falsch-negativ in den bildgebenden Standartverfahren zu werten. 24

31 3. Ergebnisse a b c d e d Abbildung 4: Nur mit FLT-PET bereits initial dargestellte periventrikuläre Lymphommanifestation; validierbar nach 3 Wochen mit MRT und FDG-PET a) MIP: FLT-PET, Patient 22 mit einem diffus großzelligem B-Zell NHL, klinisches Stadium II E B und einer durchschnittlichen FLT-SUV von 4,8. Im Hautniveau links parieto-occipital, im paramandibulären Weichteilgewebe links bis prämental sowie links retromandibulär und fokal sublingual ist eine intensive, ausgedehnte FLT-Mehranreicherung zu sehen. Weitere, gering intensive fokale Mehranreicherung findet sich links cervical, entlang der Gefäßnervenscheide, von der Schädelbasis bis in Höhe der Clavicula reichend. b) FLT-PET transversaler Schnitt, cerebrale Manifestation des Lymphoms. Es ist eine mäßig intensive fokale FLT-Speicherung periventrikulär bds. und im Gyrus cinguli erkennbar. c) CT-Schädel, transversaler Schnitt d) FDG-PET-CT Fusionsbild e) Ki-67 Immunhistochemische Färbung des Tumorgewebes mit 100 % Ki-67 positiver Kerne. (FLT = Fluordesoxythymidin, FDG = Fluordesoxyglucose, PET = Positronenemissionstomographie, SUV = standardized uptake value, MIP = maximale Intensitäts Projektion, CT = Computertomographie, NHL = Non- Hodgkin Lymphom, MRT = Magnetresonanztomographie) Unter den, diskrepant zur morphologischen Bildgebung, FLT-negativen Befunden befanden sich 3 ossäre Läsionen die aufgrund des physiologisch hohen Hintergrunds nicht abgrenzbar waren und im Gesamtkontext als falsch-negativ zu werten sind (Abbildung 5). 25

32 3. Ergebnisse a b Abbildung 5: Im FLT-PET falsch-negative ossäre Lymphommanifestation a) FLT-PET, Patient 4 mit Morbus Hodgkin, Mischtyp, klinisches Stadium I A, durchschnittliche FLT- SUV 1,4. Es sind vergrößerte mediastinale Lymphknoten erkennbar (Pfeil). b) Korrespondierende cerebrale und transaxiale Schichten der FDG-PET von demselben Patienten, durchschnittliche FDG-SUV 3,1. Außer den auch im FLT-PET gesehenen Lymphknoten mediastinal wurde hier zusätzlich eine ossäre Manifestation (roter Pfeil) des Tumors festgestellt, welche in der FLT- PET aufgrund der hohen Anreicherung im proliferierendem Knochenmark nicht zur Darstellung kommt. (FLT = Fluordesoxythymidin, FDG = Fluordesoxyglucose, PET = Positronenemissionstomographie, SUV = standardized uptake value ) Die Gesamtzahl der an 28 Patienten detektierten Läsionen betrug 448 mit der FLT-PET, 376 mit den Routineverfahren (vgl. Tabelle 3, Spalten 5,6). Die scheinbar höhere Nachweisbarkeitsrate der FLT-PET ist statistisch jedoch nicht signifikant (p=0,21; Mann- Whitney-U-Test). Letztendlich wurden sowohl mit den Standartverfahren, als auch mit der FLT-PET bei allen Patienten jeweils das gleiche klinische Stadium diagnostiziert (vgl. Tabelle 3). 26

33 b 3. Ergebnisse Grading maligner Lymphome: Vergleich von FDG-PET vs. FLT-PET Ohne Berücksichtigung der Histologie betrug der Mittelwert der SUV(mean) der FLT- Aufnahme in der gesamten Subgruppe der biopsierten Läsionen 4,2 (Median 4,3, Standardabweichung 2,2, Streubreite 1,3 9,2). Bei den 12 Patienten mit indolenten Lymphomen betrug der durchschnittliche SUV(mean) dabei 2,3 (Median 2,1, Standardabweichung 0,9, Streubreite 1,3-4,5), der durchschnittliche SUV(max) 3,9 (Median 3,7, Standardabweichung 1,6, Streubreite 1,8-8,1). Bei den 16 Patienten mit aggressiven Lymphomen war die durchschnittliche FLT-Aufnahme SUV(mean) 5,6 (Median 5,4, Standardabweichung 1,7, Streubreite 3,2 9,2), durchschnittliche SUV(max) belief sich bei diesen Patienten auf 9,1 (Median 9,1, Standardabweichung 3,4, Streubreite 5,2 17,0). Der durchschnittliche FLT-SUV(mean) bei Patienten mit einem Morbus Hodgkin war 1,7; FLT- SUV(max) 2,7. Im Vergleich zu den indolenten Lymphomen wiesen die aggressiven Lymphome somit eine signifikant höhere FLT-Aufnahme auf (p<0,0001). Die durchschnittliche FDG-Aufnahme SUV(mean) in den biopsierten Läsionen betrug ohne Berücksichtigung der Histologie 5,5 (Median 4,2, Standardabweichung 3,8, Streubreite 1,4 15,9). Bei 10 Patienten mit indolentem Lymphom war die durchschnittliche FDG-Aufnahme SUV(mean) 3,5 (Median 3,4, Standardabweichung 1,6, Streubreite 1,4 6,3), der durchschnittliche SUV(max) 5,3 (Median 5,2, Standardabweichung 2,6, Streubreite 1,8 10,2). Bei 12 Patienten mit aggressiven Lymphom war die durchschnittliche FDG-Aufnahme 7,1 (Median 6,4, Standardabweichung 4,3, Streubreite 3,1 15,9), der durchschnittliche FDG- SUV(max) betrug 11,0 (Median 9,4, Standardabweichung 6,6, Streubreite 3,2 22,5). Der durchschnittliche FDG-SUV(mean) bei Patienten mit einem Hodgkin-Lymphom war 2,5; FDG-SUV(max) 4,1. Die durchschnittliche FDG-Aufnahme der aggressiven Lymphome war somit nicht signifikant höher im Vergleich zu den indolenten Lymphomen (p = 0,16). Bei Verwendung der receiver operating characteristic (ROC) Analyse, unterscheidet der durchschnittliche FLT-SUV zwischen aggressiven und indolenten Lymphomen mit einem Bereich unter der Kurve (area under the curve =AUC) von 0,98 (maximaler FLT-SUV 0,97). 27

34 3. Ergebnisse Im Vergleich dazu unterscheidet die durchschnittliche FDG-SUV zwischen diesen beiden Lymphomformen nur mit einer AUC von 0,78 (maximaler FDG-SUV 0,79). Die Abbildung-6 illustriert den funktionsbildgebenden Unterschied von einem indolenten (ac) und einem aggresiven Lymphom (d-f) an jeweils einem inguinal lokalisiertem Lymphombulk. Abbildung 6: Geringer FLT-Uptake in indolentem, intensiver FLT-Uptake im aggresiven Lymphom A) FLT-PET, Patient 2 mit einem follikulären Lymphom Grad I. Im proliferierenden Knochenmark ist ein physiologisch intensiver FLT-Uptake zu sehen. In der Leber findet sich ein niedriger FLT-Uptake, bedingt durch die FLT- Glukoronisation. Weiterhin ist eine niedrige FLT-Aufnahme ebenso in der vergrößerten Milz und in den paraaortalen, iliakalen und inguinalen Lymphknoten zu sehen (Pfeil). B) PET- transaxialer Schnitt in Höhe der Inguinalregion. Es ist ein geringer FLT-Uptake im Lymphom links inguinal zu sehen (Pfeil). C) Ki-67 Immnhistochemische Färbung des aus dem linken Inguinallympknoten entnommenen Gewebes mit einer niedrigen Proliferationsfraktion von 4%. D) FLT-PET, Patient 14 mit einem diffus großzelligem NHL, klinisches Stadium III E, und einem mittleren FLT-SUV von 5,8. Im proliferierenden Knochenmark ist ein physiologisch intensiver FLT- Uptake zu sehen. In den cervicalen, axillären, mediastinalen, paraaortalen, iliacalen und inguinalen Lymphknoten ist eine intensive FLT-Aufnahme erkennbar (Pfeil). E) PET- transaxialer Schnitt in Höhe der Inguinalregion. Es zeigt sich eine intensive FLT-Aufnahme im Lymphom links (Pfeil). F) Ki-67 Immnhistochemische Färbung des aus dem li. Inguinallympknoten entnommenen Gewebes mit einer hohen Proliferationsfraktion von 95%. (FLT = Fluordesoxythymidin, PET = Positronenemissionstomographie, NHL = Non-Hodgkin Lymphom, SUV = standardized uptake value) 28

35 3. Ergebnisse Mit Ausnahme von Patient-7 mit einem niedrig-gradigem follikulärem Lymphom und einem FLT-SUV von 4,5, haben unsere Ergebnisse bei FLT-SUV=3,0 eine Grenze ergeben, die zwischen indolenten und aggressiven Lymphomen trennt (Abbildung 7a). Die FDG-SUVs von indolenten und aggressiven Lymphomen überlappen zu einem großen Teil, ein trennender cut-off -Wert war nicht zu definieren (Abblidung 7b). Abbildung 7a: FLT-Anreicherung (mittlerer FLT-SUV) in biopsierten Läsionen der indolenten und aggressiven Lymphome. Mit Ausnahme von Patienten 7 unterscheidet ein Trennwert von SUV=3,0 zuverlässig indolente von aggressiven Lymphomen. (FLT = Fluordesoxythymidin, SUV = standardized uptake value) mittlerer FDG-SUV indolent aggressiv Abbildung 7b: Durchschnittliche FDG-SUV Werte der biopsierten Läsionen der 7 Patienten mit indolentem und der 10 Patienten mit einem aggressiven Lymphom. Es wurde eine Überlappung der FDG-SUV Werte (von 1,4 5,8) der aggressiven und indolenten Lymphome festgestellt. (FDG = Fluordesoxyglucose, SUV = standardized uptake value) 29

36 3. Ergebnisse Der oben genannte statistische Ausreiser (Pat.-7) wurde jedoch nach erneuter Biopsie 4 Wochen später reklassifiziert von niedrig-gradigem follikulärem Lymphom in ein anaplastisches großzelliges B-NHL (Abbildung 8). a b c Abbildung 8: Transformation indolent aggressiv; Prädiktion durch vorrausgehendem ungewöhnlich hohem FLT-Uptake Patient 7 mit der initialen Diagnose eines follikulären Lymphoms Grad I, nach vier Wochen Reklassifizierung und Diagnose anaplastisches großzelliges B-NHL a) FLT-PET im Coronalschnitt, multiple intensive Mehranreicherungen cervical bds. (rechts intensiver), infraclaviculär bds. bis axillär bds. reichend. Paraaortale, inguinale und iliacale Lymphome bds. Mediastinale Mehranreicherung. b) Übersichtsaufnahme (MIP): Lymphombefall des Muskels c) Ki-67 Immunhistochemische Färbung des Tumorgewebes mit 88% Ki-67 positiven Zellkerne. (FLT = Fluordesoxythymidin, PET = Positronenemissionstomographie value, NHL = Non-Hodgkin Lymphom, MIP = maximale Intensitäts Projektion) Korrelation zwischen der Proliferationsfraktion und der [ 18 F] FLT-Aufnahme Bei insgesamt 18 Patienten, bei welchen genügend Lymphknotengewebe zur Verfügung stand, wurden die Proben immunhistochemisch gefärbt. Bei den restlichen 10 Patienten waren die Gewebeproben zu klein für die immunhistologische Auswertung, jedoch ausreichend für die Histopathologie. Alle Gewebeproben der malignen Lymphome enthielten Ki-67 positive Zellen. 30

37 3. Ergebnisse In der MIB 1 Immunhistochemie war die durchschnittliche Proliferationsfraktion der Lymphomproben 54 % (Median 50%, Standardabweichung 38,6%, Streubreite 1 100%). Bei den 7 biopsierten indolenten Lymphomen betrug die durchschnittliche Proliferationsrate 12,7% (Standardabweichung 17,5%, Streubreite 1 50%). Bei den 10 aggressiven Lymphomen belief sich die durchschnittliche Proliferationsrate auf 82,8% (Standardabweichung 14,1%, Streubreite %). Die lineare Regressionsanalyse zeigte bei allen malignen Lymphomen eine signifikante Korrelation zwischen [ 18 F] FLT-SUV und dem Ki-67-Index (p<0,001; r=0,86; Abbildung 9). Die Abbildungen 10 illustriert mit einem Bildbeispiel die geringe FLT-Aufnahme in einem indolenten Lymphom mit niedriger, die Abbildung 11 die intensive FLT-Anreicherung bei einem aggressiven Lymphom mit hoher Proliferationsrate. mittlerer FLT-SUV Fraktion der Ki-67 positiven Zellen (%) Abbildung 9: Lineare Regressionsanalyse des mittleren tumoralen [ 18 F]FLT-SUV und der Proliferationsfraktion (Prozentsatz der Ki-67 positiven Zellen): signifikante Korrelation für p<0,0001. (FLT = Fluordesoxythymidin, SUV = standardized uptake value) 31

38 3. Ergebnisse a b d c e Abbildung 10: Niedriger FLT-SUV bei einem Lymphom Grad I. a) MIP: FLT-PET, Patient 21 mit follikulärem NHL Grad I, klinisches Stadium II A E, und einem niedrigem mittleren FLT-SUV von 2,7. b) PET- transversaler Schnitt in Höhe der HWS mit geringer FLT-Speicherung in einem medial des M. Sternocleidomastoideus re. gelegenem LK (Pfeil). c) CT-transversaler Schnitt, geringgradige Vergrößerung des LK medial des M. Sternocleidomastiodeus. d) Übersicht (1:10) des entnommenen LK-Gewebes (Ki-67 Immunhistochemie). e) Ki-67 Immunhistochemische Färbung des Tumorgewebes mit 5% Ki-67 Antigen positiver braungefärbter Zellkerne (1:200). (FLT = Fluordesoxythymidin, PET = Positronenemissionstomographie, SUV = standardized uptake value, MIP = maximale Intensitäts Projektion, LK = Lymphknoten, CT = Computertomographie, M = Muskulus, HWS = Halswirbelsäule, NHL = Non-Hodgkin Lymphom) a b d c e Abbildung 11: Hoher FLT-SUV bei anaplastischem NHL a) MIP: FLT-PET, Patient 26 mit anaplastisch großzelligem B-NHL und einem hohen FLT-SUV von 8,3 im biopsierten Lymphom axillär rechts (Pfeil). b) PET- transversaler Schnitt in Höhe der LWS mit intensiver FLT-Anreicherung in axillär gelegenen LK rechts (Pfeil). c) CT- transversaler Schnitt, deutliche Vergrößerung der LK axillär rechts. d) Übersicht des entnommenen LK-Gewebes. e) Ki-67 Immunhistochemische Färbung des Tumorgewebes mit 90% Ki-67 positiven Zellkerne (FLT = Fluordesoxythymidin, PET = Positronenemissionstomographie, SUV = standardized uptake value, LWS = Lendenwirbelsäule, MIP = maximale Intensitäts Projektion, LK = Lymphknoten, CT= Computertomographie, NHL = Non-Hodgkin Lymphom) 32

39 3. Ergebnisse 3.2. Tierexperimentielle Studie Auswirkung der Steroidtherapie auf Proliferationsrate und Tumorgröße Die Referenzmethode für die Bestimmung der Proliferationsfraktion im Tumor ist die Immunhistochemie; In unserem Design wurde eine Färbung des Proliferationsmarkers Ki-67 durchgeführt. In den Tumorproben der unbehandelten Versuchstiere (n=6) waren 83,6% der Tumorzellen Ki-67 positiv, was einer hohen Proliferationsaktivität entspricht (Standabweichung 2,8, Median 82,5%, Streubreite 80,0% - 89,5%, Abbildungen 12a, 13a). Nach Therapie mit einer Einzeldosis Prednisolon (1,5 mg/kg i.v.) war die durchschnittliche Proliferationsfraktion in den Versuchstieren (n=12) 53,8% (Median 58,6%, Standardabweichung 4,9%, Streubreite 39 69,9%; Abbildungen 12b, 13b). Der Rückgang der Proliferationsfraktion war statistisch signifikant (p=0,001). Vor Beginn der Therapie wurde die Größe jedes Tumors mit Hilfe einer Schublehre bestimmt. Vor Therapie war der durchschnittliche Durchmesser der Lymphome 2,3 cm (Median 2,2 cm, Standardabweichung 0,4 cm, Streubreite 1,6 2,7cm). Acht Tage nach dieser Therapie hat sich der Tumordurchmesser signifikant vergrößert (2,8 cm, Medianwert 2,9 cm, Standardabweichung 0,5 cm, Streubreite 1,6 3,4 cm; p<0,0001; Mann-Whitney-Test). 33

40 3. Ergebnisse a b Abbildung 12: Immunhistologische Färbungen des Tumorgewebes a) Kontrollgruppe, Versuchstiere 1-6. Durchschnittlicher Prozentsatz der Ki-67 positiven Zellen 83,6 %. b) Nach achttägiger Behandlung mit Prednisolon, Versuchstiere Durchschnittlicher Prozentsatz der Ki-67 positiven Zellen 53,8%. 34

41 3. Ergebnisse Auswirkung der Therapie auf die [ 18 F]-FLT-Aufnahme des Lymphoms [ 18 F]-FLT wurde einer Kontrollgruppe (n=10) und der Gruppe der mit Prednisolon behandelten Mäuse (n=12) intravenös verabreicht und die Aufnahme von [ 18 F]-FLT in die Lymphome und andere Organe wurde mittels eines Cobra II Auto Gamma-Counter (Packard Instrument) gemessen. Die durchschnittliche tumorale FLT-Aufnahme in der unbehandelten Gruppe betrug 5,4% ID/g (Median 5,3%, Standardabweichung 2,4%, Streubreite 1,6 9,3). Acht Tage nach der Verabreichung von Prednisolon wurde eine signifikant niedrigere (p=0,0003) FLT-Aufnahme in den Lymphom-Xenotransplantaten beobachtet (durchschnittlicher Wert 1,3% ID/g, Median 0,9%, Standardabweichung 1,4%, Streubreite 0,1 2,2%; Abbildung 13). Aus den Gamma-Counter-Daten wurde ergänzend ein Tumor/Muskel-Verhältnis berechnet, was am ehesten ein realistisches invitro-surrogat für das Kontrastverhältnis Tumor/Hintergrund der PET-Bildgebung darstellt. Auch dieser relative Anreicherungs- Quotinent zeigte bei den mit Steroid behandelten Tieren (durchschnittlicher Wert 1,1, Standardabweichung 0,7) im Vergleich zu der Kontrollgruppe (durchschnittlicher Wert 4,2, Standardabweichung 2,6) einen signifikanten Rückgang. 35

42 3. Ergebnisse a b Abbildung 13: a) Durchschnittliche Proliferationsfraktion (Prozent Ki-67 positiver Zellkerne/Gesamtzahl der Kerne) der Kontrollgruppe ohne Therapie (n=10) und der Therapiegruppe 8 Tage nach der Behandlung mit Prednisolon (n=12). Die Proliferationsfraktion nimmt signifikant ab (p=0,0001). b) Durchschnittliche FLT-Aufnahme im Lymphom der Kontrollgruppe (n=10) und der therapierten Gruppe (n=12), p<0,0003. (FLT = Fluordesoxythymidin) Bildgebung mit FLT-PET Die FLT-PET wurde bei den 12 Versuchstieren vor und 8 Tage nach der Steroidtherapie durchgeführt. In der Abbildung 14 sind transaxialen Schnittbilder in Höhe der Tumorlokalisation im intraindividuellen Verglich vor und nach Steriodtherapie abgebildet, in 36

43 3. Ergebnisse denen jeweils eine Regions of interest (ROI) für die Berechnung der Tumor/Hintergrund- Ratio (TBR) definiert wurden. Die durchschnittliche TBR vor der Therapie betrug 3,1 (Standardabweichung 0,8, Streubreite 1,9 4,9), 8 Tage nach der Therapie mit Prednisolon verringerte sich die TBR auf einen durchschnittlichen Wert von 1,6 (Standardabweichung 0,6, Streubreite 1,1 2,0; p=0,0014). VT TBR:4.9 TBR: 3.5 TBR:4.6 TBR:2.6 NT TBR:2.0 TBR:1.7 TBR:2.0 TBR:1.8 VT TBR: 2.2 TBR: 1.9 TBR: 2.1 TBR: 2,1 NT TBR:1.3 TBR:1.2 TBR:1.1 Abbildung 14: Transaxiale Schichten der jeweils gleichen Versuchstiere vor Therapie (VT) und nach Therapie (NT). Es ist eine deutliche Mehranreicherung vor der Therapie erkennbar (roter Pfeil). (TBR = tumor/background-ratio) 37