Beispiel C4 GELELEKTROPHORESE. Charakterisierung der Molekularen Masse. von Proteinen mittels SDS/PAGE

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1 Institut für Analytische Chemie und Lebensmittelchemie Analytisch Chemische Übungen für Molekularbiologen und Genetiker Beispiel C4 GELELEKTROPHORESE Charakterisierung der Molekularen Masse von Proteinen mittels SDS/PAGE 1

2 1. KURZÜBERSICHT ÜBER DAS BEISPIEL 1.1 ZIEL DES BEISIELS Bestimmung des Molekulargewichts eines Proteins unter Verwendung einer Kalibrierfunktion, welche mittels Markerproteinen erstellt wird. 1.2 EINGESETZTE ANALYSENTECHNIK SDS-Gelelektrophorese mit selbst angefertigten, isokratischen Polyacrylamid-Gelen (PAG). (Entwicklung auf einer Mighty Small II (Hoefer SE250) oder Hoefer 260 Vertikal-Gelelektrophoreseeinheit zur raschen Elektrophorese von Protein- oder Nukleinsäure-Proben geringen Volumens) 1.3 ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN IN DER PRAXIS Die eingesetzte Technik (diskontinuierliches System unter denaturierenden Bedingungen) ist ein Standardverfahren zur Auftrennung von Proteinen, zur Charakterisierung der Reinheit von Proteinen und zur näherungsweisen Bestimmung ihrer Molekulargewichte. 2

3 2. ARBEITSANLEITUNG 2.1 Gießen von zwei isokratischen Gelen in einer Gelgießkammer mit TwinS Elektrophoresesystem (peqlab) (Abb.1) SHORT INSTRUCTION Systems overview 1. Upper buffer chamber (UBC) with side clamps and electrodes 2. Safety lid with power cords 3. Lower buffer chamber (LBC) 4. Casting base Leak proof sealing of glass plates Invert casting base, so the black silicone mats face down- ward and the acrylic square upward. Place UBC on inverted casting base. Arrange gel assemblies and place on each side of the UBC. It is important that the bottom of the glass plates and the spacers sit flat on the acrylic square of the inverted casting base. Tighten side clamps. Tighten the blocking plate in a similar way at the other side of the UBC in case of casting only one gel. 3

4 Invert casting base and turn out the cams. Place UBC on the gaskets and turn the handles at the same time, half a turn. Assembling the system and electrophoresis The gel can now be poured. Pour slowly to avoid bubbles. After polymerization, lift UBC from casting base and place into the LBC. Add buffer to the UBC. Load the samples. Add buffer to the LBC. 4

5 Place safety lid onto the unit and start the run. After the run is completed turn off the power supply and remove lid. Lift UBC from LBC, loosen side clamps to remove gel assembly for further analysis. ACHTUNG: HANDSCHUHE TRAGEN! ACRYLAMID IST NEUROTOXISCH! 5

6 Pipettierschema für Sammelgel und Trenngel Die kleinen Volumina sind mit der Mikropipette zu dosieren. Trenngel (10% T ) Sammelgel (4% T) Acrylamid-/Bisacrylamidmonomerlösung 5,0 ml 0,7 ml (30% T, 2,7% C) 1 Trenngelpuffer (1,5M Tris-Cl, ph=8,8) 3,75 ml Sammelgelpuffer (0,5M Tris-Cl, ph=6,8) 1,25 ml 10% SDS (Sodiumdodecylsulfat) 0,15 ml 50 µl deionisiertes Wasser 6,0 ml 3,0 ml Lösung im Ultraschallbad 5 min entgasen 4 10%ige Ammoniumpersulfat-Lösung 2 84 µl 35 µl TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin) 9 µl 4 µl 3 Endvolumen 15 ml 5ml Lösung im Ultraschallbad 1 min entgasen 4 1 g( Acrylamid + Bisacrylamid) g( Bisacrylamid) % T = 100 % C = ml g( Acrylamid + Bisacrylamid) 2 Die Ammoniumpersulfat-Lösung dient als Radikalstarter für die radikalische Polymerisation. Die Lösung muß frisch hergestellt werden: Dazu werden die im Eppendorfgefäß eingewogenen 20 mg in 200 µl Wasser gelöst. 3 TEMED dient als Katalysator. 4 Die Lösungen für das Trenngel und das Sammelgel sind zu entgasen, da Sauerstoff die Polymerisation stört. 6

7 1. Die nach dem Pipettierschema hergestellte Trenngellösung wird mit einer Pasteurpipette etwa einen 0.5cm unterhalb vom später einzusetzenden Kamm in die Sandwiches gefüllt. ACHTUNG: Zügig arbeiten, da die Lösung relativ rasch polymerisiert! Beide Sandwiches werden mit je 100 µl wassergesättigtem 1-Butanol überschichtet, damit sich kein Meniskus bildet (1-Butanol mit Wasser schütteln, nach der Phasentrennung ist der Überstand wassergesättigt). Die Polymerisation benötigt ca. 30 Minuten. Durch leichtes Neigen der Gelgießkammer kann man feststellen, ob das Gel auspolymerisiert ist. Die restliche Trenngellösung lässt man im Becherglas auspolymerisieren. 2. Wenn das Trenngel auspolymerisiert ist, wird das Butanol durch Umdrehen der Gelgießkammer und Spülen mit deionisiertem Wasser entfernt. Danach wird das Sammelgel nach dem obigen Pipettierschema zubereitet. Die Sammelgellösung wird mit einer Pasteurpipette in die beiden Sandwiches pipettiert, bis diese vollständig gefüllt sind. Danach wird sofort ein Kamm in jeden Sandwich eingesetzt, wodurch die Auftragetaschen im Gel geformt werden. 3. Nach ca. 30 Minuten ist die Polymerisation des Sammelgels beendet. Durch vorsichtiges Herausziehen des Kammes lässt sich feststellen, ob das Gel auspolymerisiert ist. Nun kann die Gelgießkammer geöffnet werden. Die Sandwiches sind mittels eines dünnen Messers oder einer Rasierklinge voneinander zu trennen. Die Sandwiches - bestehend aus einer Aluminiumplatte, einem Gel und einer Glasplatte - dürfen nicht zerlegt werden. Die Sandwiches werden vorsichtig mit deionisiertem Wasser von Gelresten befreit. Mit einem Glasschreiber werden auf der Glasplatte die Auftragetaschen markiert. Die übrigen Teile der Gelgießkammer werden mit Wasser gereinigt. ACHTUNG: Keine organischen Lösungsmittel, Säuren oder Basen zum Reinigen der Kammerteile verwenden! Nicht sofort benötigte Gele können als Sandwich in Folie eingewickelt im Kühlschrank aufbewahrt werden. 2.2 Probenvorbereitung In Mikroeppendorfgefäßen werden mittels einer Mikropipette jeweils 5 µl der Standardproteine, des Standardprotein-Mixes bzw. der Probe (Konz: 1 mg/ml) mit 5 µl Denaturierungsmix gemischt und 5 Minuten am kochenden Wasserbad erhitzt. Die Proben werden entweder sofort zur Elektrophorese verwendet oder kühl gestellt. Tiefgekühlt sind die so behandelten Proben längere Zeit haltbar. 7

8 Zusammensetzung des Denaturierungsmixes unter reduzierenden Bedingungen: 0.125M Tris-Cl, ph=6.8, 4% SDS, 20% Glycerin, 10% 2-Mercaptoethanol, 1% Bromphenolblau. Bromphenolblau dient als Frontmarker, Mercaptoethanol reduziert die Disulfidbrücken der Proteine. Standardprotein-Mix Probe BSA Myoglobin Probe Ovalbumin Conalbumin γ-globulin Probe Standardprotein-Mix Abb.5: Mögliches Auftrageschema für Standardproteine und Probe. 2.3 Vorbereitung der Elektrophorese 1. Die Sandwiches sind an der Elektrophoreseeinheit mit je 2 Klammern so anzubringen, dass die Glasplatten nach vorne weisen. 2. Nun werden die Kühlschläuche angeschlossen und der Wasserhahn aufgedreht. 3. Die unteren Pufferkammern werden mit Laufpuffer (0.025M Tris, 0.192M Glycin, 0.1% SDS, ph=8.3) so hoch gefüllt, dass die Sandwiches ca. 1 cm eintauchen. Die Kämme werden entfernt und soviel Laufpuffer in die oberen Pufferkammern (hinter den Sandwiches) gegossen, dass auch die Auftragetaschen gefüllt sind. Der Laufpuffer kann max. 2mal verwendet werden. 4. Mit der Mikropipette werden jeweils 3-5 µl der denaturierten Standardproteine, des Standardprotein-Mixes bzw. der Probe vorsichtig in die Auftragetaschen eingebracht (siehe Abb.5). 5. Der Deckel wird nun auf die Elektrophoreseeinheit aufgesetzt (er muss einrasten) und die Kabel werden an das Netzgerät angeschlossen (ACHTUNG: Farben beachten!). 8

9 2.4 Elektrophorese 1. Durch Einschalten des Netzgeräts wird der Lauf gestartet. Durch Drücken der Pfeiltasten kann zwischen den Anzeigen Spannung (V), Stromstärke (ma) und Zeit (h) gewählt werden. Die Stromstärke beträgt zu Beginn der Elektrophorese 40 ma und sinkt im weitern Verlauf ab. Bevor der Frontmarker das Niveau des Puffers in der unteren Pufferkammer erreicht, wird der Lauf durch Abschalten des Netzgerätes gestoppt. Der Lauf dauert ca. 1 Stunde. Die Kabel werden abgesteckt, die Wasserkühlung abgedreht und der Deckel geöffnet. 2. Nach Entfernen der Klammern werden die Sandwiches mit Wasser abgespült und die Glasplatten vorsichtig mit einem Messer oder einer Rasierklinge von den Gelen abgehoben. Die Sammelgele werden abgetrennt und verworfen. Zur Markierung der beiden Trenngele wird vom ersten Gel ein kleines Stück des oberen rechten Ecks und vom zweiten Gel das untere rechte Eck abgeschnitten. 2.5 Färbung und Detektion ACHTUNG: Färbe- und Entfärbelösung sparsam verwenden! Es genügt, wenn die Gele gerade mit Lösung bedeckt sind! 1. Die beiden Trenngele werden in eine mit Färbelösung (0.125% Coomassie Blau R-250, 50% Methanol, 10% Essigsäure) gefüllte Porzellanschale transferiert. (Achtung: Die Gele nur mit nassen Handschuhen angreifen, da sie sonst leicht zerreißen!) 2. Die Färbung wird auf einer Heizplatte (35-40 C) durchgeführt und dauert 30 min. 3. Nach Abspülen mit Wasser werden die Gele 1 Stunde im Entfärbebad I (50% Methanol, 10% Essigsäure ) entfärbt. Danach werden die Gele im Entfärbebad II (7% Essigsäure, 5% Methanol) so lange entfärbt, bis der Hintergrund nur noch schwach gefärbt ist und die Gele fotokopiert werden können (Fotokopie vergrößern). Alternativ können die Gele nach der Färbung bzw. nach dem 1. (oder wenn nötig auch 2.) Entfärbeschritt in Wasser (oder 1/1 mit Wasser verdünnter Entfärbelösung II für noch nicht teilentfärbte Gele) über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt werden. 9

10 2.6 Auswertung Nach Entfärbung der Gele werden diese zwischen zwei Kunststofffolien gelegt und fotokopiert. Die Auswertung erfolgt auf folgende Weise: (i) (ii) (iii) Bestimmung der Rf-Werte der einzelnen Proteine durch Ausmessen deren Wanderungsweiten im Trenngel relativ zu der des zugefügten Frontmarkers. Erstellung der Kalibrationskurve Rf-Wert gegen log Mw Ermittlung des Molekulargewichts des Probeproteins aus seinem Rf- Wert mit Hilfe der Kalibrierfunktion. Für die Erstellung der Kalibrierfunktion werden folgende Proteine verwendet: Standardprotein Mw in kda Conalbumin 78 Rinderserumalbumin (BSA) 67 Ovalbumin 45 γ-globulin (human) (a) H-Ketten L-Ketten Myoglobin 17,8 (a) zerfällt unter reduzierenden Bedingungen in 2 schwere (H) und 2 leichte (L) Ketten. 3. PROTOKOLLIERUNG (i) (ii) (iii) Elektrophoreseparameter: Gelkonzentration, Geldicke, Trenngelhöhe Standardproteine und deren Konzentrationen Stromstärke Detektion Kalibrierfunktion (Rf gegen log Mw) berechnetes Mw des Probenproteins 10

11 4. PRINZIP DER POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE VON PROTEIN-SDS-KOMPLEXEN (SDS-PAGE) In freier Lösung wandern ionische Verbindungen elektrophoretisch (im elektrischen Feld) entsprechend ihrer Ionenbeweglichkeit, welche von ihrer Größe, Ladung und Form abhängt. Biopolymere wie Proteine werden demnach in freier Lösung ebenfalls nach Größe und Ladung getrennt, wobei letztere vom ph des Trennpuffers (relativ zum pi des Proteins) bestimmt wird. Um Proteine nach ihrer Größe zu trennen, verwendet man eine Matrix (mit einer permanenten oder temporären Porenstruktur), welche die Analyte entsprechend ihrer Größe retardieren soll. Als solche wird in der Gelelektrophorese, wie der Name sagt, ein Gel, z.b. aus Polyacrylamid, verwendet 1. Die Verwendung einer solchen siebenden Matrix reicht aber offensichtlich nicht aus, um die Analyte allein entsprechend ihrer Größe zu retardieren, da große Moleküle mit hoher Ladungszahl schneller wandern können als kleine Moleküle mit geringer Ladung. Um eine Trennung ausschließlich entsprechend der Größe zu erhalten, müssen die Ladungsdifferenzen der nativen Proteine eliminiert werden, besser gesagt ihre unterschiedlichen Verhältnisse von Ladung zu Größe. Alle Proteine sollten daher dieselbe Mobilität (in freier Lösung) besitzen. Dazu lässt man die Proteine mit Na-dodecylsulfat (SDS) reagieren. SDS ist ein Tensid und besitzt eine lipophile Alkylgruppe (C12) und einen hydrophilen, anionischen Sulfatrest. Man belegt nun die Proteinoberfläche mit den lipophilen C12- Ketten (dies geschieht vorwiegend bei erhöhter Temperatur). Je größer das Protein ist, desto mehr SDS-Moleküle binden an seiner Oberfläche. Die ursprüngliche Proteinladung wird dabei maskiert. Da jedes bindende SDS-Molekül mit seiner Sulfat-Gruppe jeweils eine negative Ladung beisteuert, sind die entstehenden Protein-SDS-Komplexe umso stärker negativ geladen, je mehr SDS am Protein angelagert ist. Da die Anzahl der angelagerten SDS-Ketten hauptsächlich (wenn auch nicht ausschließlich) von der Proteingröße abhängt, entstehen Komplexe mit demselben Ladung-zu-Masse-Verhältnis, d.h. mit derselben Mobilität (in freier Lösung). Ohne Siebmedium würden die Komplexe tatsächlich mit derselben Geschwindigkeit im elektrischen Feld wandern. In der Siebmatrix hingegen wandern sie entsprechend ihrer Größe ohne Einfluss der nativen Ladung der Proteine. Darauf beruht das Prinzip der größenspezifischen Trennung in der SDS-PAGE. Experimentell wurde gefunden, dass ein weitgehend linearer Zusammenhang zwischen dem Logarithmus der molekularen Masse (log M W ) und der relativen Wanderungsstrecke (Rf) der Separanden 2 besteht. Dieser Zusammenhang lässt sich 1 Man beachte, dass dieser Matrix eine Elektrolytlösung beigefügt ist, welche den ph vorgibt und im wesentlichen für den elektrischen Stromtransport verantwortlich ist. 2 Der Rf-Wert ist wie in der Dünnschichtchromatographie definiert: als Wanderungsstrecke des Analyten relativ zur Wanderungsstrecke einer nicht-retardierten Substanz (Frontmarker-Farbstoff). 11

12 als einfache Kalibrierfunktion nutzen. Die Ermittlung der Molekülmasse eines Proteins mittels SDS-PAGE erfolgt also durch Bestimmung der Wanderungsstrecke des betreffenden Proteins in einem Gel, und dem Vergleich dieser Strecke mit den Wanderungsstrecken von Referenzproteinen bekannter Molekülmasse. 12

13 PLATZINVENTAR 1. Geräte 1 Netzgerät (Consort E455 bzw. Amersham EPS 310) 1 Elektrophorese-Apparatur Hoefer "Mighty Small II" SE 250 (bestehend aus Elektrophoresekammer und Deckel mit Anschlußkabeln) bzw. Hoefer SE 260 (bestehend aus Elektrophoresekammer und Deckel mit Anschlußkabeln) 1 Gelgießkammer Hoefer "Mighty Small" SE 275 (bestehend aus 1 Rahmen mit Gummidichtung und Frontplatte, sowie 3 rote Gummidichtungsstücke) bzw. Amersham Dual Gel Caster SE 245 (bestehend aus Grundblock (mit zwei Dichtungen) und zwei Halterungseinsätzen (mit 6 Feststellschrauben und 4 Dichtungshebeln)) 2. Zubehör Gelelektrophoresesystem: Mittelteil mit Platinelektrode untere Pufferkammer Sicherheitsdeckel mit Stromkabeln Gießbasis 2 normale Glasplatten 2 ausgeschnittene Glasplatten 2 Kämme, 0.8 mm dick, 10 Zähne 4 Seitenspacer, 0.8mm dick 1 Blindplatte für Einzelgelläufe 1 "SpacerPlacer" zum Ausrichten der Spacer 2 Meßpipetten 1 ml 1 Meßpipette 5 ml 1 Mikropipette 0,5-10 µl 1 Hamilton-Spritze 100 µl Pasteurpipetten und Saugball 2 Bechergläser 250 ml 1 Becherglas 400 ml 13

14 1 Erlenmeyerkolben 50 ml 2 Uhrgläser Gummihandschuhe Mikroeppendorfgefäße Peleus-Ball 1 Rasierklinge 2 Wasserschläuche 1 Plastikwanne 1 Porzellanschale Plastikfolie zum Fotokopieren der Gele 14