Von der Datenanalyse zur Biomarkeridentifikation

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1 Von der Datenanalyse zur Biomarkeridentifikation Patrick Lang, 6. Biotech-Tag, 19. April 2012, Fachhochschule Bingen 1

2 Von der Datenanalyse zur Biomarkeridentifikation Biomarker Definition Identifikationsprozess Mathematische Herausforderungen Projektbeispiele ArrayCGH Kopienzahlschätzung und Klassifikation Zeitverlaufs-RNA Expressionsdaten aus Microarrays Proteinbiomarker zur Zelllinienklassifikation Sequenzdatenanalyse aus NGS-Daten 2

3 Was ist ein Biomarker? Offizielle NIH Definition eines Biomarkers: a characteristic that is objectively measured and evaluated as an indicator of normal biologic processes, pathogenic processes, or pharmacologic responses to a therapeutic intervention. Krankheitsbezogene Biomarker prädiktive Biomarker: anzeigen einer Krankheitsbedrohung diagnostische Biomarker: anzeigen einer bereits vorhandenen Erkrankung prognostische Biomarker: anzeigen wie sich die Erkrankung in einem individuellen Fall entwickeln könnte Medikationsbezogene Biomarker zeigen Effektivität einer therapeutischen Intervention in einem spezifischen Patienten an 3

4 Was ist ein Biomarker? Biomarker ermöglicht: verläßliche frühzeitige Diagnose von Krankheiten Patienten-individuelle Zuordnung geeigneter Therapieformen Biomarker zentral für Personalisierte Medizin Biomarkeridentifikation durch Data Mining in diagnostischen Daten klassifizierter Patientenkollektiven, insbesondere Omics -Daten (Genom, Proteom) Elektrokardiogram Daten Immunologische Parameter 4

5 Biomarker Identifikation Prozess Datenbereitstellung Selektion Datenquellen Messungen Einlesen und Zusammenführen Datenvorverarbeitung Fehlende Daten Normalisierung/ Synchronisierung Filterung Merkmals- Extraktion Kodierung Datentransformation Dimensionsreduktion Modellinferenz Modell- struktur Regression Clusterung Klassifikation Validierung Testset Klinische Studien (retrospek-tiv, prospek-tiv) 5

6 Biomarker Identifikationsprozess Mathematische Herausforderungen Große Mengen hochkomplexer und hochdimensionaler Daten Analyse dieser Daten erfordert: Wissen über zugrundeliegende Prozesse Gute mathematische Modelle Ziel: Vorhersagen / Entscheidungen auf Basis von Modell und Daten Unsicherheiten sowohl in Modellen als auch Daten Entscheidungen unter Unsicherheit / imperfektem Wissen Bedarf an fortschrittlichen leistungsstarken und robusten statistischen Modellen, Methoden und Algorithmen 6

7 Omics Biomarker: Genomik -Transkriptomik Proteomik - Metabolomik Konstruktionsplan gespeichert in den Genen auf der DNA im Zellkern Produktion von Boten-RNA (mrna), einer Kopie der benötigten DNA Sequenz (Transkription) nach etwas Nachverarbeitung (z.b. Slicing) Produktion eines Proteins (Aminosäurensequenz) unter Verwendung der kodierten Information auf der mrna (Translation) Interaktion des Proteins und der Umgebung (z.b. als Enzym) DNA RNA polymerase RNA primary transcript RNA primary transcript 1 mrna

8 Omics Biomarker: Genomik -Transkriptomik Proteomik - Metabolomik Messung des individuellen DNA Inhalts in der Zelle: Genomik Messung des aktuellen mrna Inhalts in der Zelle: Transkriptomik Messung des aktuellen Protein Inhalts in der Zelle: Proteomik Es existieren sogar weitere omics: Metabolomics, Glycomics, etc. DNA RNA polymerase RNA primary transcript RNA primary transcript 1 mrna

9 ArrayCGH : Kopienzahlschätzung und Klassifikation Genomik Genomik momentan die Anwendung der Personalisierten Medizin Variation auf dem individuellen Genom (DNA) ist ein klassischer Biomarker (genetischer Marker) Verschiedene Typen genetischer Marker möglich: Single nucleotide polymorphism (SNP): Variation auf einzelner DNA-Position Ganze Chromosome gewonnen/verloren (z.b. Trisomy) Kopienzahlvariationen Wohlbekanntes Beispiel: P53 Tumorsuppressor- Gen 9

10 ArrayCGH : Kopienzahlschätzung und Klassifikation Hybridisierung auf Microarrays Hybridisierung: Binden einer einzelnen DNA oder RNA Kette an komplementäre Kette Basismechanismus für high throughput DNA / RNA Messungen 2 Kanal Microarrays: Hybridisierung von farbstoffmarkierter biologischer RNA oder DNA Proben an komplementären Oligonucleotides auf Arraypunkten Markierung mit 2 Farben (rot + grün) erlaubt Vergleich (z.b. gesund/krank) es existieren verschiedene Typen von Microarrays: DNA tiling array: decken komplettes Genom ab (Genomik) RNA expression arrays: decken bekannte Gene ab (Transkriptomik) gescanntes Farbsignal trägt Information zu DNA Kopienzahl oder Genexpressionszustand 10

11 ArrayCGH : Kopienzahlschätzung und Klassifikation CGH: Comparative Genomic Hybridization Ziel: Entdecke Abweichungen in Kopienzahl chromosomaler DNA Duplizierte oder gelöschte Bereiche von Chromosomen, z.b. verursacht durch chromosomale Mutationen Vergleich genomischer DNA einer Referenz (normale DNA) und Probe (z.b. Tumor DNA) Array CGH: Benutze DNA (tiling) microarrays Auch mit Seq-Techniken möglich (NGS) Probleme: Meßrauschen Variationen treten in allen Skalen auf Die drei häufigsten Einzelchromosomvariationen: Auslöschung (1), Verdopplung (2) und Umkehr (3; verursacht keine Veränderung der Kopienzahl!) Source of figure: Wikipedia 11

12 ArrayCGH : Kopienzahlschätzung und Klassifikation Simulationsbasierter nichtlinearer Filterungsalgorithmus Fokus auf Schätzung / Klassifikation: DNA-Microarray Daten: verrauscht, fehlende Werte Stochastisches nichtlineares Modell Problem nicht analytisch lösbar Stattdessen Simulationsbasierter Algorithmus Hochrelevant für Personalisierte Medizin da auf individuellem Genom aufsetzend 12

13 ArrayCGH : Kopienzahlschätzung und Klassifikation Simulationsbasierter nichtlinearer Filterungsalgorithmus Gleichzeitige Kopienzahlschätzung und Klassifikation 4 Klassen: Klasse 1: Normal (Kopienzahl 2) Klasse 2: Stabiler Zuwachs oder Verlust Klasse 3: Hochvariabler Zuwachs oder Verlust Klasse 4: Verstärkung (sehr großer instabiler Zuwachs) Kopienzahl und Klassen modelliert als versteckte Zustände in nichtlinearem stochastischen Zustandsraummodell: Microarray Werte als gestörte Messungen (mit Rauschen und Outliern) Schätzung der Kopienzahl und Klasse mittels sequentieller Monte Carlo Methode (Partikelfilter und Glätter) 13

14 ArrayCGH: Kopienzahlschätzung und Klassifikation Beispiel: Chromosom 20 einer Brustkrebs Gewebeprobe Micro-array Daten Geschätzte Kopienzahlen mit Bestimmtheitsregionen Klassenwahrscheinlichkeiten Performance Maß des Algorithmus 14

15 Zeitverlauf RNA Expressionsdaten aus Microarrays Transkriptomik Messen des mrna Expressionslevels in einer Zelle Zeitabhängigkeit: Genexpression ist ein sehr stark regulierter Prozess (Reaktion auf Umweltstimuli) Hochdurchsatz-Messungen mit 2-Kanal Microarrays Ziel: Identifiziere co-exprimierte Gene und schließe auf das zugrundeliegende Genregulationsnetzwerk Image source: Wikipedia 15

16 Zeitverlauf RNA Expressionsdaten aus Microarrays Hintergrund und Aufgabe Gleichzeitige Messung der Expressionslevels von Genen Starkes Rauschen, viele Varianzquellen Hohe Kosten, daher geringe Zahl an technischen und biologischen Replikaten Sehr geringe Zeitauflösung für Zeitverlaufsdaten aufgrund von Kosten und technischer Machbarkeit Identifikation von unterschiedlich exprimierten Genen in Behandlungs- und Kontrollgruppe 16

17 Zeitverlauf RNA Expressionsdaten aus Microarrays DOE, Splineapproximation und Clusterung Fokus auf dem Zeitaspekt: RNA Expression stark regulierter Prozess Statisches Bild (zu nur einem Zeipunkt) kann wichtige Entwicklungen übersehen Microarray Messungen zu verschiedenen Zeitpunkten kann Genregulationsmechanismen (Netzwerke) enthüllen Relevanz für die Personalisierte Medizin: Verständnis für das zeitliche Verhalten von Genregulationsnetzwerken Systembiologischer Ansatz Wichtig für Vorhersage, Prognose und therapeutische Entscheidungsunterstützung 17

18 Zeitverlauf RNA Expressionsdaten aus Microarrays DOE, Splineapproximation und Clusterung Optimierung der Samplegröße und Experimentszenarios (Statistische Sample Size Schätzung) Reduktion der technischen Varianzen (Lowess-Transformation, Dye- Swaps,...) Schätzung von Genexpression und Abweichungen (Median, Bootstrap- Methode) Schätzung kontinuierlicher Zeitverlaufsdaten (Glättungssplines) 18

19 Zeitverlauf RNA Expressionsdaten aus Microarrays DOE, Splineapproximation und Clusterung Modifizierte Unähnlichkeitsmaße (Spline-L 2 -Abstand, rangbasiert,...) Clusterungsalgorithmen angepaßt für gewählte Unähnlichkeitsmaße und biologische Absichten (K-medoids, SOM, SOTA, Angepasste Lance- Williams-Update-Formel für hierarchisches Clustering...) Interne Clustervalidität Indizees (Silhouette Average Width, Angepasste Figure of Merit,...) 19

20 Proteinbiomarker zur Zelllinienklassifikation Produktion pharmazeutischer Proteine in Tierzellen Fokus auf Biomarkeridentifikation Zelllinien in Bioreaktor produzieren Antikörper ( Arzneimittel ) Herstellung neuer guter Zelllinien sehr zeitaufwändiger Prozess Ziel: Erkenne gute Zelllinien (hohe Produktivität) zu einem frühen Stadium Daher: Finde Proteom-Biomarker Relevanz für Personalisierte Medizin: Proteom als Biomarker Arzneimittelentwicklung Identifizierung von prädiktiven Markern oder Mustern zur Selektion leistungsfähiger Zelllinien 20

21 7-9 Wochen 4-6 Wochen Proteinbiomarker zur Zelllinienklassifikation Auswahl leistungsfähiger Zelllinien T 0 -Population Erzeugung und Auswahl monoklonaler Zelllinien A B C D E F G 4-6 Durchläufe MTX-Amplifikation hoher Zeitaufwand durch mehrfache Methotrexat-Amplifikation! A p B p C p D p E p F p G p Bewertung der Populationen High-Producer Low-Producer Ziel: Vorhersage der Zelllinienqualität nach der MTX-Amplifikation aus vor der MTX-Amplifikation gewonnen Daten 21

22 Proteinbiomarker zur Zelllinienklassifikation 2D-Gelelektrophorese Ziel: Identifiziere typische Muster in 2D-Gels für High- bzw. Low-Producer Prinzipielle Schwierigkeiten bei 2D-Gels Hohe Variation und hohe Unsicherheit Hochdimensionale Daten Missing values Üblicherweise geringe Stichprobengröße Vorgehen Untersuchung eines multidimensionalen Proteomdaten-Raums Nutzung von Statistik / mathematischen Klassifizierern zum Data-Mining Ansatz erlaubt die Identifizierung versteckter Marker (z.b. Merkmalskombinationen) 22

23 Proteinbiomarker zur Zelllinienklassifikation Optimierung und Regelung der Prozessparameter Ziel Bestimmung optimaler Prozessparameter, z.b. Zusammensetzung des Mediums, Zugabe von Nährstoffen, etc. mittels Pareto- Optimierung on-the-fly -Anpassung der Parameter während des Produktionsprozesses, basierend auf aktuellen Messungen mittels Model Predictive Control optimale Konfiguration der Startparameter Bioreaktor Model Predictive Control 23

24 Proteinbiomarker zur Zelllinienklassifikation Verbesserung des Modells Hypothesen aus Proteomdaten Metabolomdaten Modell Zellpopulation Nährstoffe/Abfallprodukte Proteinerzeugung Hintergrundwissen über Gen-/Proteom-Netzwerke Hintergrundwissen über Metabolom-Netzwerke 24

25 Sequenzdatenanalyse aus NGS-Daten Hintergrund und Aufgabe Schwarzfäule der Rebe (Guignardia bidwellii) Schädling der Weinrebe Ursprünglich aus Nordamerika stammend Befällt seit ca zunehmend auch heimische Reben: verursacht große Schäden! Genom unbekannt Nahziel: Analyse des Genoms (De novo Sequenzierung, Bestimmung von Open Reading Frames, Homologiesuche und Annotation) und differenzielle Genexpressionsanalyse in verschiedenen Stadien des Pilzes Fernziel: Entwicklung wirksamer Fungizide Foto: Daniel Molitor 25

26 Sequenzdatenanalyse aus NGS-Daten Next Generation Sequencing 3 Datensätze Genomische DNA Expressions-RNA aus Ruhestadium des Pilzes Expressions-RNA aus toxischem Stadium Short Reads (ca. 200 bp) gelesen mit Next Generation Sequencing (NGS) Technologie Paired Ends Enorme Datenmenge! Visualisierung der errechneten Scaffolds mit Tablet Alignment Viewer 26

27 Sequenzdatenanalyse aus NGS-Daten Hercules Cluster am ITWM High Performance Computing Cluster Hercules am ITWM Mehr als 1100 CPUs 2.8 TB Hauptspeicher 40 TB Plattenspeicher Ermöglicht die Berechnung von komplexen parallelisierbaren Aufgaben in kurzer Zeit 27

28 Sequenzdatenanalyse aus NGS-Daten Ergebnisse De novo assembly: Hochparallele Berechnung von Scaffolds unter Ausnutzung der Paired End-Information: 20 Minuten Scaffolds dienen als Backbone für Differenzielle Genexpressionsanalyse Ergebnisse zeigen, dass große Änderungen in der RNA-Expression nur für wenige Gene auftreten Angriffspunkt für weitere Untersuchungen! 28

29 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! 29

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