Neue Methoden zur Sequenzierung festphasengebundener Cyclopeptide

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1 Neue Methoden zur Sequenzierung festphasengebundener Cyclopeptide Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften an der Universität Konstanz vorgelegt von Angelika Semmler Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Chemie Universität Konstanz ktober 2009

2 Dissertation der Universität Konstanz Tag der mündlichen Prüfung: Referent: Prof. Dr. Valentin Wittmann 2. Referent: Prof. Dr. Dr. h. c. Michael Przybylski Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. Gerhard Müller

3 meinem Großvater Albert Anton Höfert

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5 Vorwort Vorwort Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von September 2005 bis ktober 2009 in der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. Valentin Wittmann im Fachbereich Chemie der Universität Konstanz. Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Valentin Wittmann für die Überlassung des sehr interessanten und herausfordernden Themas und die freundliche Aufnahme in die Arbeitsgruppe, sowie für das in mich gesetzte Vertrauen. Herrn Prof. Dr. Michael Przybylski danke ich für die Übernahme des Zweitgutachtens. Da wissenschaftliche Arbeit immer auch Diskussion, Kooperation und gegenseitige Unterstützung bedeutet, möchte ich mich bei einigen Menschen bedanken: Dominik Wöll für hilfreiche Diskussionen bei den Photolyse-Experimenten, Diana Klingler für gemeinsame Gehversuche und manche spannende Stunde am LC-MS, Markus Wieland und Astrid Joachimi für Unterstützung bei den SPR-Experimenten und Anke Friemel für die Aufnahme der NMR-Spektren. Ein besonderer Dank gebührt allen aktuellen und ehemaligen Mitgliedern der Arbeitsgruppen Wittmann und Möller für eine wirklich tolle gemeinsame Zeit. Besonders hervorheben möchte ich meine Laborkolleginnen Claudia Meßmer und Mônica Boldt, mit denen so manch bitterer Labortag doch noch süß wurde. Für das Suchen und Finden von Fehlern im Manuskript möchte ich mich bei Anja Meißner, Henning Beckmann, Dominik Gauß und Christian Risinger bedanken. Außerdem möchte ich Dominik Dömi Gauß für die gemeinsame Peptidos-Zeit danken. Der Laborerstbesetzung Frank Sicherl, Franklin John, Marco Worch, Caroline Maierhofer und Daniel Specker danke ich für die herzliche Aufnahme und viele lustige Grillfeste. Für den gemeinsamen Weg vom ersten Tag an der Uni Konstanz bis zum letzten, danke ich Magnus Schmidt und Henning Beckmann. I

6 Vorwort Natürlich gibt es ein Leben außerhalb des Labors. Auch da war Christian immer für mich da, ich danke Dir. Außerdem möchte ich meiner Familie und vor allem meiner Mutter Resi danken, die immer an mich geglaubt hat. Für die Möglichkeit zum Abschalten und Auspowern danke ich dem Masters-Team des RV Neptun; vor allem meinen Mädels vom Doppelvierer (Anja, Conny und Claudia) danke ich für viele gemeinsame Kilometer bei jedem Wetter. II

7 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGEN VII 1 EINLEITUNG Cyclische Peptide Was ist ihr Nutzen? Cyclopeptidbibliotheken Die Problematik der Analytik Die Ermittlung von Peptidsequenzen aus BC-Bibliotheken Sonderfall cyclische Peptide Fluoreszenzmarkierte Phosphopeptide für SH2-Domänen-Mikroarray 10 2 AUFGABENSTELLUNG Analytik von Cyclopeptiden Synthese von fluoreszenzmarkierten Phosphopeptiden 14 3 SLLBRUCHSTELLEN Photolabile Sollbruchstelle Methionin als Sollbruchstelle Auswahl eines Linkers orthogonal zur Met-Sollbruchstelle Tryptophan als Sollbruchstelle Enzymatische Sollbruchstelle Ringöffnung durch Edman-Abbau 46 III

8 Inhaltsverzeichnis 4 ANALYTIK De-novo-Sequenzierung Massenspektrometrische Untersuchung der Bibliothek von cyclischen Peptiden mit photolabiler Sollbruchstelle Massenspektrometrische Untersuchung nach Anwendung der Met-Sollbruchstelle Partieller Edman-Abbau (PED) Die Mikrosequenzierung der klassische Edman-Abbau Partieller Edman-Abbau (PED) die Leitersequenzierung Erweiterung des PEDs auf BC-Cyclopeptidbibliotheken 59 5 ANWENDUNG DER METHDE Streptavidin: Ein biologisches Modelltarget Aufbau einer BC-Cyclopeptidbibliothek Das Screening Etablierung des Screenings Screening der BC-Cyclopeptidbibliothek Die Hitbead-Peptidsequenzen Bestimmung der Bindungskonstanten Synthese der ausgesuchten Peptidsequenzen SPR-Experimente 88 6 SYNTHESE FLURESZENZMARKIERTER PHSPHPEPTIDE Darstellung von Phosphopeptiden Auswahl des Fluoreszenzlabels Synthese der beiden Peptide Y241 und py Synthese der beiden Peptide Y230 und py IV

9 Inhaltsverzeichnis 7 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK Analytik von Cyclopeptiden Fluoreszenzmarkierte Phosphopeptide EXPERIMENTELLER TEIL Allgemeine Angaben zur Analytik HPLC Massenspektrometrie Kernresonanzspektroskopie Infrarotspektroskopie UV-Vis-Absorptionsspektroskopie Allgemeine Arbeitsvorschriften für die SPPS Synthetisierte Peptide Synthese der photolabilen cyclischen Peptide Synthese des cyclischen Peptids 31 zur Untersuchung von Methionin als Sollbruchstelle Synthese des cyclischen Peptids 41 zur Untersuchung von Methionin als Sollbruchstelle Synthese des Peptids 51/52 zur Stabilitätsuntersuchung des Glykolamid-Linkers und des HMBA- Linkers Synthese des festphasengebundenen Peptids 63 zur Untersuchung der Trp-Xaa Sollbruchstelle Synthese des festphasengebundenen Peptids 66 zur Untersuchung von Trp als Linker Synthese des festphasengebundenen Peptids 77 als Modellpeptid zur Etablierung des Partiellen Edman-Abbaus (PED) Synthese des Peptids 71 zur Untersuchung einer enzymatischen Ringöffnung Synthese der Peptide (92-97) zur Bestimmung der K D -Werte Synthese der fluoreszenzmarkierten Peptide Modell in Lösung zur Aufklärung der Nebenreaktion im PED Synthese von 5-Isopropyl-3-phenyl-2-thiohydantoin (PTH-Val) Synthese von 5-Isopropyl-3-phenyl-2-hydantoin n-bead-screening Zusammensetzung der Puffer und Lösungen für das Screening: Biotinyliertes TentaGel S-NH Enzymgekoppelter Farbreaktionstest Partielle Edman-Sequenzierung 161 V

10 Inhaltsverzeichnis 8.6 SPR-Experimente zur Bestimmung der K D -Werte Zusammensetzung der Puffer und Lösungen für die SPR-Experimente Durchführung der SPR-Experimente LITERATURVERZEICHNIS ANHANG 171 VI

11 Abkürzungen Abkürzungen Die Abkürzungen der Aminosäuren und Peptide richtet sich nach den Vorschlägen der IUPAC-IUB-Kommission für biochemische Nomenklatur. Diese können auf folgender Internetseite abgerufen werden URL: Cyclische Peptide werden durch ein vorgestelltes cyclo gekennzeichnet. Im Fall einer Seitenketten-Cyclisierung sind die an der Ringbildung beteiligten Aminosäuren unterstrichen. AAV Abb. abs. Ac All Alloc AP aq. BCIP BNPS Boc BrCN Bu Bzl bzw c ca. CHCA CSY DCC DCM DHB DIPEA allgemeine Arbeitsvorschrift Abbildung absolut Acetyl Allyl Allyloxycarbonyl Alkalische Phosphatase wässrig 5-Brom-4-chlor-3-indoylphoshat-Dinatriumsalz 2-Bromo-2-(2-nitrophenylsulfenyl) tert. Butyloxycarbonyl Bromcyan Butyl Benzyl beziehungsweise Konzentration circa (ungefähr) α-cyano-4-hydroxyzimtsäure correlation spectroscopy N,N -Dicyclohexhylcarbodiimid Dichlormethan 2,5-Dihydroxybenzoesäure Diisopropylethylamin VII

12 Abkürzungen DMF EDC EDT ELISA ESI eq. Fl Fmoc GC h HATU HBTU HMBA HAt HBt Hsl HSQC IC 50 ID IR J K D kda M MALDI Me MeCN MeIm MHz min ml MS MSNT N,N -Dimethylformamid N-Ethyl-N -(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid Ethandithiol enzyme-linked immunosorbent assay Elektrospray-Ionisation Äquivalente Fluoreszenzlabel 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Gaschromatographie Stunde -Azabenzotriazolyl-1,1,3,3-tetramethyluronium-Hexafluorophosphat -Benzotriazolyl-1,1,3,3-tetramethyluronium-Hexafluorophosphat 4-Hydroxymethylbenzoesäure Hydroxyazabenzotriazol Hydroxybenzotriazol Homoserinlacton heteronuclear single quantum correlation Inhibitionskonstante Innendurchmesser Infrarot Kopplungskonstante Dissoziationskonstante kilo Dalton Molar matrix assisted laser desorption ionisiation Methyl Acetonitril Methylimidazol Megahertz Minuten Milliliter Massenspektrometrie 1-(Mesitylene-2-sulphonyl)-3-nitro-1H-1,2,4-triazole VIII

13 Abkürzungen NBT NBS neg. NHS NMP NMR Nu BC Pbf PBS PE PED Pip PITC Pll pos. PTH py PyAP PyBP Pyr RESY RP-HPLC RU SA SH2 SPPS SPR SRBS Su TBS TFA p-nitroblau-tetrazoliumchlorid N-Bromsuccinimid negativ N-Hydroxysuccinimid n-methylpyrrolidin nuclear magnetic resonance (Kernspinresonanz) Nucleophil one-bead-one-compound 2,2,4,6,7-Pentamethyldihydro-benzofuran-5-sulfonyl Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung Polyethylen partial edman degradation (partieller Edman-Abbau) Piperidin Phenylisothiocyanat Photolabilerlinker positiv 3-Phenyl-2-thiohydantoin Phosphotyrosin 7-Azabenzotriazol-1-yloxytris(pyrrolidino)phosphonium-Hexafluorophosphat Benzotriazol-1-yloxytris(pyrrolidino)phosphonium-Hexafluorophosphat Pyridin rotating frame nuclear verhauser and exchange spectroscopy Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie resonance units Streptavidin Scr-homology-2 solid phase peptide synthesis surface plasmon resonance (berflächen-plasmonen-resonanz) Sulforhodamin-B-sulfonyl Succinimid Tris-gepufferte Salzlösung Trifluoressigsäure IX

14 Abkürzungen TG Thi THF TIS TNBS TF TCSY t R Tris Trt UV Xaa Tenta Gel Thienylalanin Tetrahydrofuran Triisopropylsilan 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure time of flight total correlation spectroscopy Retentionszeit Tri(hydroxymethyl)-aminomethan Trityl Ultraviolett beliebige Aminosäure X

15 1 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Cyclische Peptide Was ist ihr Nutzen? Cyclische Peptide sind in der Natur weit verbreitet. Man kann sie in Pflanzen, Pilzen [1], maritimen Schwämmen, anderen einfachen marinen Lebewesen und [2, 3] Bakterien nachweisen. Wie andere Naturstoffe auch, zeigen viele cyclische Peptide ein vielversprechendes therapeutisches Potential. Durch ihre Aminosäurebausteine sind sie dem menschlichen rganismus nicht fremd. Im Vergleich zu ihren linearen Analoga weisen sie eine höhere metabolische Stabilität (verminderter enzymatischer Abbau in vivo) auf, wodurch eine größere Wirkungsdauer bei medizinischem Einsatz zu erwarten ist. Zudem wird die konformative Flexibilität des Peptidrückgrats durch die cyclische Form beträchtlich reduziert. Dies kann eine deutliche Erhöhung der Bindungsaffinität und der Rezeptorselektivität hervorrufen. Desweiteren wurde eine erhöhte Membrandurchgängigkeit postuliert, welche jedoch noch diskutiert wird [4]. Auch heute schon stellen cyclische Peptide eine Verbindungsklasse dar, die entscheidende Beiträge zur Behandlung von Krankheiten leisten konnten. Cyclosporin A 1, auch Ciclosporin, als Medikament unter Sandimmun (Novartis), Cicloral (Hexal) und Ciclosporin Pro (Teva) bekannt (Abb. 1.1), ein Immunosuppressivum, wird als Calcineurin-Inhibitor vor allem in der Transplantationsmedizin verwendet. Der Wirkstoff bindet an Calcineurin und blockiert im Zellplasma so die Bindung an NF-AT (nuclear factor activating t-cell), ein Gen-regulierendes Protein. In aktivierten T-Zellen ist Calcineurin für die Dephosphorylierung von NF-AT verantwortlich. Daraufhin kann NF-AT in den Zellen transloziert werden und dort die Transkription von zahlreichen Zytokinen und Zelloberflächenrezeptoren (u. a. Interleukin-2 und Gamma-Interferon) aktivieren. Als Arzneimittel eingesetzt führt Cyclosporin A also zu einer eingeschränkten Aktivität des Immunsystems und senkt somit zum Beispiel das Risiko der rganabstoßung nach einer Transplantation. 1

16 1 Einleitung Echinocandin 2 (Abb. 1.1) gab einer ganzen Substanzgruppe ihren Namen. Zur Wirkstoffklasse der Antimykotika zugehörig, werden sie zur Behandlung von Pilzinfektionen eingesetzt. Echinocandine inhibieren die β(1-3)-d-glucan Synthase, ein Enzym zur Synthese von β(1-3)-d-glucan. Dieses ist ein wichtiger Baustein für den Aufbau von Zellwänden in Pilzen. Das cyclische Depsipeptid Daptomycin 3 (Abb. 1.1), als Medikament unter Cubicin bekannt (Cubist Pharmaceuticals), ist ein Antibiotikum. Der Arzneistoff wird vor allem bei Haut- und Weichteilinfektionen mit gram-positiven Problemkeimen eingesetzt. ftmals ist der Wirkstoff auch dann noch wirksam, wenn andere Antibiotika aufgrund von Resistenzen bei der Therapie versagen. Abb. 1.1: Beispiele für cyclische Peptide in der Therapie. Ciclosporin 1, ein Immunosuppressivum, Echinocandin 2, ein Antimykotikum und Deptamycin 3, ein Antibiotikum. 2

17 1 Einleitung Neben ihrem breiten Einsatzbereich als Wirkstoffe eignen sich cyclische Peptide, aufgrund ihrer hohen Rezeptorselektivität und Bindungsaffinität, auch als molekulare Hilfsmittel in der Diagnostik. So kann beispielsweise rheumatische Arthritis mit dem sogenannten anti-ccp-test mit einer Sensitivität von nahezu 80% und einer Spezifität von nahezu 98% nachgewiesen werden. [5] Zur Diagnostik wird im Blut nach Rheumafaktoren (RF-Antikörpern) gesucht. Peptide, bei denen Arginin durch das Enzym Peptidylarginin-Deiminase (PAD) in Citrullin umgewandelt wurde, konnten als natürliches Antigen mit rheumatoider Arthritis in Zusammenhang gebracht werden. Antikörper gegen citrullinierte Peptid-/Protein-Antigene (ACPA) gelten als sogenannter Biomarker für die rheumatoide Arthritis und werden in einem ELISA (enzym-linked immunosorbent assay) nachgewiesen. Es gelang, ein synthetisches cyclisches Peptid darzustellen, das sich vom natürlichen Antigen ableitet und eine deutlich erhöhte Bindungsaffinität zu diesem Antikörper aufweist. Für den Anti-CCP- Test wird dieses cyclische citrullinierte Peptid (ccp) an der berfläche von Mikrotiterplatten immobilisiert. Daraufhin erfolgt eine Inkubation mit dem Antikörper (ACPA in Patientenserum). Durch erneute Inkubation mit einem anti-humanen IgG- Peroxidase-Konjugat und anschließender Farbreaktion kann der Biomarker ACPA nachgewiesen werden. Diese Entwicklung hat nicht nur zu einer deutlichen Verbesserung in der Labordiagnostik geführt, sondern ermöglicht auch die Diagnose der Krankheit in frühen Stadien. Desweiteren eignen sich cyclische Peptide auch als molekulare Werkzeuge bei der Suche nach einem hoch affinen Rezeptor (oder beim Verständnis des Struktur- Wirkungs-Mechanismus). [6] Die konformative Einschränkung der cyclischen Peptide erleichtert die Bestimmung der für die biologische Wirkung bedeutenden dreidimensionalen Struktur der aktiven Substanzen. 3

18 1 Einleitung 1.2 Cyclopeptidbibliotheken Die Auswahl an Methoden zur Darstellung von Cyclopeptidbibliotheken ist inzwischen sehr groß. Prinzipiell eignen sich alle Methoden, die auch für die Synthese von Bibliotheken linearer Peptide zur Verfügung stehen; da man üblicherweise zunächst die lineare Peptidsequenz synthetisiert und anschließend unter Einsatz einer gezielten Schutzgruppenstrategie eine selektive Cyclisierung vornehmen kann. Gängige Verfahren zur Synthese von Peptidbibliotheken sind Multiple-Pin-Methode, [7] Tea-Bag-Methode, [8] Split-Mix-Methode, [9, 10] lichtgesteuerte Synthese [11] und Spot-Synthese [12] Viele dieser Methoden erfordern jedoch eine spezielle und vor allem teure Laborausstattung. Bei der sogenannten Split-Mix- Methode [9, 10] ist das nicht der Fall, weshalb sie häufig die Methode der Wahl ist. Abb. 1.2 Das Prinzip der Split-Mix-Methode. Bei der von Furka vorgestellten Split-Mix-Methode wird das Harz vor dem ersten Reaktionsschritt in mehrere gleich große Aliquote aufgeteilt (engl. split) und separat mit dem entsprechenden Reaktionsbaustein zur Reaktion gebracht. Nach der Reaktion werden die Harzaliquote vereinigt (engl. mixed) und nach der Aufarbeitung erneut aufgeteilt, um den zweiten Baustein anzukuppeln (Abb. 1.2). Dieser Zyklus, bestehend aus Aufteilen, Reaktion und Vereinigen, wird solange wiederholt, bis die gewünschte Anzahl der Schritte erreicht ist. Man erhält eine Bibliothek mit 4

19 1 Einleitung N = a x Komponenten, wobei a die Anzahl der Reaktionsbausteine pro Zyklus und x die Anzahl der Zyklen ist. Da sich pro Reaktionsgefäß immer nur ein Reaktand in Lösung befindet, können alle Reaktionen, trotz unterschiedlicher Kinetik, bis zum vollständigen Umsatz geführt werden. Das vorrangige Ziel von Furka bestand in der Darstellung von Peptidmischungen innerhalb kürzester Zeit erkannten Lam et al. ein weiteres Potential von Split-Mix-Bibliotheken. [13] Auf jeder Harzkugel einer Substanzbibliothek befindet sich nur eine Verbindung in vielfacher Kopie (ne-bead-ne-compound, BC). Verzichtet man also auf die Abspaltung des Peptids vom Harz, kann man eine große Anzahl von Peptiden testen und anschließend getrennt identifizieren. Um sicherzustellen, dass jede theoretisch mögliche Verbindung in der Bibliothek enthalten ist, muss die Anzahl der eingesetzten Harzkugeln groß genug sein. Statistische Musterrechnungen hierzu können den Publikationen von Burgess et al. [14] und Zhao et al. [15] entnommen werden. 5

20 1 Einleitung 1.3 Die Problematik der Analytik Die Ermittlung von Peptidsequenzen aus BC-Bibliotheken Der Preis, den man für die hohe Syntheseeffizienz der BC-Bibliotheken zu zahlen hat, ist die Notwendigkeit einer eindeutigen Substanzidentifikation jeder positiv getesteten Kugel. Zur Sequenzierung von linearen Hitpeptiden aus einer BC- Bibliothek stehen vier verschiedene Methoden zur Wahl. Diese sind im Fließschema in Abb. 1.3 dargestellt. Abb. 1.3 Methode zur Ermittlung der Peptidsequenz, die sich auf einer als positiv getesteten Harzkugel aus einer BC-Bibliothek befindet. Bei der Leitersynthese [16] wird das Problem der Analytik bereits während der Synthese, das heißt dem Split-Mix-Aufbau der Bibliothek, bedacht. Hierzu wird bei jedem Kupplungsschritt ein kleiner Teil der im Aufbau befindlichen Peptidsequenz gecappt, beispielsweise durch Zugabe von 5% Ac-Ala-H oder der entsprechenden Boc-geschützten Aminosäure. Die weiteren Arbeitsschritte verlaufen analog zum 6

21 1 Einleitung Split-Mix-Protokoll. Nach dem Screening werden die positiv getesteten Kugeln aussortiert. Die an der Kugel gebundene Peptidleiter muss nur noch abgespalten werden und steht dann zur massenspektrometrischen Analyse zur Verfügung. Aus den erhaltenen Massenspektren kann nun die Sequenz ausgelesen werden. Der große Nachteil dieser Methode ist, dass das ne-bead-ne-compound Prinzip verloren geht, da sich beim Screening die ganze Peptidleiter auf der Kugel befindet und somit alle Leitersprossen als potentielle aktive Verbindungen zur Verfügung stehen. In späteren Veröffentlichungen [17] versuchte man, dieses Problem durch eine Aufteilung der Kugel in äußere und innere Schale (biphasic beads) zu umgehen. Die Synthese wird dabei so modifiziert, dass beim Screening der Bibliothek die eigentlich zu testende Substanz dem Target/Rezeptor auf der äußeren Schale angeboten wird, während sich die zur Verschlüsselung mitsynthetisierte Peptidleiter im Innern der Kugel befindet. Ganz ohne Verschlüsselung kommen hingegen tandem-ms, Edman-Abbau und die Leitersequenzierung aus. Zur rein massenspektrometrischen Sequenzierung (tandem-ms) von aktiven Peptiden aus BC-Bibliotheken wird das Peptid vor der Probenvorbereitung von der Kugel gespalten. [18] Während der massenspektrometrischen Charakterisierung wird das intakte Peptidion im Massenspektrometer isoliert und anschließend fragmentiert. Aus den erhaltenen Peptidfragmentionsignalen können dann Rückschlüsse auf die Peptidsequenz gezogen werden. Für die Durchführung solcher Experimente benötigt man jedoch ein speziell zur Sequenzierung ausgestattetes Massenspektrometer, das die Möglichkeit bietet, Peptidionen zu isolieren und zu fragmentieren. [19-23] Während meiner Diplomarbeit konnte ich zeigen, dass harzgebundene Peptide mittels MALDI-FTICR-MS/MS sequenzierbar sind. [24] Durch den Einsatz eines photolabilen Linkers erfolgte die Abspaltung des Peptids vom Harz durch den Laserstrahl der MALDI-Quelle, wodurch ein vorheriges Abspalten vom Harz entfiel. Die Gruppe um Albericio zeigte eine Sequenzierung mittels MALDI-TF/TF-MS. [25] Die Abspaltung des Peptids erfolgte hierbei direkt auf dem MALDI-Target durch Einwirkung von Ammoniakdampf (Spaltung des HMBA-Linkers). Zur weiteren Probenpräparation musste lediglich Matrix addiert werden. 7

22 1 Einleitung Eine weitere Möglichkeit der direkten Sequenzierung von Peptiden, die sich auf Hitbeads aus einem Screening befinden, bietet der Edman-Abbau, auch Mikrosequenzierung genannt. Hier wird jede positiv getestete Kugel einzeln der klassischen Mikrosequenzierung zugeführt. Ein vorheriges Abspalten des Peptids vom Harz ist nicht erforderlich, da während des Abbaus Aminosäure für Aminosäure vom Harz gespalten und anschließend mittels RP-HPLC detektiert wird. Mit einer Sequenzierungsrate von 3-4 Kugeln pro Tag ist diese Methode jedoch sehr zeitintensiv und eignet sich dadurch nur bedingt zum Einsatz im Hochdurchsatzverfahren. Die Leitersequenzierung [26], welche partiellen Edman-Abbau mit anschließender MALDI-TF Massenspektrometrie umfasst, wurde ursprünglich als zeitsparende Methode zur Sequenzierung von Peptiden in Lösung eingeführt. Die Gruppe um Pei übertrug diese Methode auf festphasengebundene Peptide aus BC- Bibliotheken. [27] Hierzu werden alle Kugeln, die eine positiv getestete Peptidsequenz tragen, vereinigt und anschließend einem gemeinsamen partiellen Edman-Abbau unterzogen. Der partielle Abbau wird durch die Behandlung mit einer Mischung aus PITC (zur Spaltung) und Fmoc-Su (zum Capping) realisiert. Am Ende erhält man auch hier eine Fragmentleiter, welche mittels Massenspektrometrie (MALDI-TF- MS) nachgewiesen wird Sonderfall cyclische Peptide Möchte man eine rein massenspektrometrische Sequenzanalyse (tandem-ms/ De-novo-Sequenzierung) auf einen kombinatorischen Ansatz anwenden, so ist der Erhalt aller Fragmentionen zur vollständigen und eindeutigen Sequenzierung unbedingt notwendig. Demnach muss die Wahrscheinlichkeit eines Bindungsbruchs zwischen den Aminosäuren im gesamten Peptid gleich groß sein. Wird dieses Prinzip zur Sequenzierung cyclischer Peptide verwendet, so sollte der Bruch des peptidischen Rings an jeder beliebigen Stelle gleich wahrscheinlich sein. Die dadurch erhaltenen linearen Peptidfragmente haben eine gemeinsame Zusammensetzung der Aminosäuren, somit eine identische Masse, aber eine unterschiedliche Aminosäuresequenz. Weitere Fragmentierungen führen zu immer komplexeren Spektren. [28] In der Gruppe von Ghadiri wurde ein Computerprogramm entwickelt, 8

23 1 Einleitung welches LC-MS/MS-Spektren automatisiert aus- bzw. bewertet. Das Programm ist speziell auf cyclische Peptide aus BC-Bibliotheken zugeschnitten und berücksichtigt durch die Split-Mix-Synthese vorhandene Sequenzinformationen, wie eingesetzte Aminosäuren, sowie die Anzahl und Häufigkeit der Aufspaltungen. Zur Auswertung können jedoch keine Peaklisten, sondern lediglich die erhaltenen Rohdaten von Hitachi 3DQ-ion trap Massenspektrometern herangezogen werden. [29] a A B C D E a A b b B C D E A E D B C C D E A B D E A B C E A B C D Abb. 1.4 Die Isolierung und anschließende Fragmentierung eines cyclischen Peptids im Massenspektrometer führt zu einer Reihe von Fragmentionen mit identischer molekularen Masse aber unterschiedlicher Aminosäurensequenz. Soll zur Sequenzierung eines cyclischen Peptids eine auf Edman-Chemie basierende Sequenzierungsmethode (Microsequenzierung oder Leitersequenzierung) zum Einsatz kommen, ist das Vorhandensein des freien N-Terminus unbedingt notwendig. Eine präanalytische, also unmittelbar vor der Sequenzierung stattfindende, Umwandlung der cyclischen Peptide in lineare Peptide würde einen deutlich besseren Zugang zur Sequenzinformation mittels massenspektrometrischer und Edman-basierter Methoden ermöglichen. 9

24 1 Einleitung 1.4 Fluoreszenzmarkierte Phosphopeptide für SH2-Domänen-Mikroarray Scr-homology-2-(SH2)-Domänen sind eine von vielen Familien innerhalb der Proteindomänen, die Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Signaltransduktion vermitteln. Wie andere Domänen auch, sind SH2-Domänen über eine konservierte Region in der Aminosäuresequenz definiert. Die charakteristische Faltung dieser 100 Aminosäuren umfassenden Domäne ermöglicht eine spezifische Erkennung und Bindung an Phosphotyrosin-beinhaltende Liganden. Phosphotyrosin (py) beinhaltende Protein-Protein Wechselwirkungen, wie zum Beispiel solche, die durch SH2-Domänen ermöglicht werden, sind eines der primary means, um Signalproteine zu rekrutieren und spielen daher eine Hauptrolle bei der Signalübermittlung. SH2- Domänen wurden in Enzymen, Adapterproteinen, Regulationsuntereinheiten von Signalproteinen, Gerüstproteinen, Transkriptionsfaktoren und onkogenen Proteinen gefunden. Diese Proteine sind fest eingebunden in den Prozess der Signalübermittlung, da sie als Verbindung zwischen Rezeptor und nachgeordneten Signalmoleküle fungieren. Sie vermitteln Signale zwischen Zellen und regulieren die Kinaseaktivität bestimmter Proteine. [30] Die Phosphorylierung von Proteinen ist eine Abb. 1.5 C-terminale Aminosäuresequenz [ ] des CEACAM3 Proteins. Die beiden Tyrosine (Y230 und Y241) sind fettgedruckt hervorgehoben. Ausgehend von diesen beiden Y, sieben Aminosäuren in der Sequenz in Richtung C- und N-Terminus, ergeben sich die zwei ITAM-ähnlichen Sequenzen (Peptid Y230 beziehungsweise Y241), die unterstrichen hervorgehoben sind. 10

25 1 Einleitung der Haupinformationsleitungen der zellulären Verständigung. Eine Störung im SH2- Domänen-abhängigen Signalweg kann oftmals direkt oder indirekt mit Humanerkrankungen in Verbindung gebracht werden. Die Arbeitsgruppe um Prof. Christof Hauck (Fachbereich Biologie, Universität Konstanz) beschäftigt sich ausführlich mit der Aufklärung der Rolle der ITAM (immunoreceptor tyrosine based activation motif)-ähnlichen Sequenzen von CEACAM3 (carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule) in Signalwegen (Abb. 1.5). Mit Hilfe eines SH2-Domänen-Mikroarrays soll ermittelt werden, an welche SH2-Domänen die ITAM-ähnlichen Sequenzen von CEACAM3 binden. Hierzu soll eine mit unterschiedlichen SH2-Domänen versehene Glasoberfläche mit einem synthetischen Peptid, welches Phosphotyrosin beinhaltet und mit einem Fluoreszenzlabel versehen wurde, inkubiert werden. Findet eine Ligand- Proteinwechselwirkung statt, kann diese im Chipreader mittels Fluoreszenz sichtbar gemacht werden (Abb. 1.6). Durch die Identifikation der SH2-Domänen, an die der zu erforschende Ligand bindet, kann nachgewiesen werden, an welchem Signalweg dieser Ligand beteiligt ist. [31] Abb. 1.6 SH2-Domänen-Mikroarray: a) Der Glasträger wird mit unterschiedlichen SH2- Domänen versehen. b) Inkubation mit einem Phosphotyrosin beinhaltenden und fluoreszenzmarkierten Peptid (möglicher Ligand). c) Ligand bindet nur am passenden Rezeptor und kann über Fluoreszenz nachgewiesen werden. 11

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27 2 Aufgabenstellung 2 Aufgabenstellung 2.1 Analytik von Cyclopeptiden In der Natur sind cyclische Peptide weit verbreitet. In vielen Fällen weisen sie eine hohe biologische Aktivität auf und stellen somit eine potentielle Substanzklasse für Wirkstoffe, Leitstrukturen und molekulare Werkzeuge dar. Die Split-Mix-Synthese [10] ermöglicht eine effiziente und schnelle Darstellung cyclischer BC- Peptidbibliotheken [13] mit einer großen Mitgliederzahl. Nach dem Screening, dem Test der Mitglieder auf Aktivität, stößt man jedoch bei der Analytik der Hitbeads auf den Engpass der Methode. Zur Identifikation der aktiven Komponente steht lediglich eine einzelne Harzkugel zur Verfügung. An diese sind je nach Beladungsdichte typischerweise zwischen 100 pmol und 5 nmol der aktiven Verbindung gebunden. Aufgrund ihrer hohen Sensitivität können Massenspektrometrie und auch auf Edman- Abbau basierte Methoden zur Analytik solch geringer Peptidmengen herangezogen werden. Neben der geringen Substanzmenge weisen BC-Cyclopeptidbibliotheken jedoch noch eine weitere analytische Herausforderung auf. Sie besitzen oft keinen freien N-Terminus und sind somit für die Chemie des Edman-Abbaus nicht zugänglich. Auch in der Massenspektrometrie liefern sie aufgrund ihrer cyclischen Verbrückung meist keine eindeutig auswertbaren Spektren. [28] Eine präanalytische, also unmittelbar vor der Sequenzierung stattfindende, Transformation der cyclischen Peptide in lineare Peptide würde einen deutlich besseren Zugang sowohl zu massenspektrometrischen, als auch zu Edman-basierten Methoden ermöglichen. Ziel der Arbeit war die Entwicklung einer effizienten Methode zur Sequenzierung cyclischer Peptide, die als aktive Substanzen aus einer BC-Bibliothek hervorgingen. Zunächst sollte die Einführung und Spaltung molekularer Sollbruchstellen zur gezielten Peptidringöffnung untersucht werden. Die daraus resultierenden, vormals cyclischen, Peptide sollten anschließend zuverlässig mit in unseren Laboratorien zur Verfügung stehenden Methoden sequenziert werden. Nach der Entwicklung der Methode sollte ihr Nutzen anhand einer konkreten Anwendung gezeigt werden. Die durch die Anwendung gefundenen Cyclopeptide sollten schließlich auf Ihre Bindungsaktivität hin untersucht werden. 13

28 2 Aufgabenstellung 2.2 Synthese von fluoreszenzmarkierten Phosphopeptiden Für den Einsatz im SH2-Domänen-Mikroarray (mehr dazu in Kapitel 1.4) sollten die in Abb. 2.1 gezeigten Peptide Y241 und Y230 synthetisiert werden. Die Tyrosine sollten in jeder der beiden Sequenzen als Phosphotyrosin (aktive Peptide: py241 und py230) beziehungsweise als Tyrosin (Negativkontrolle: Y241 und Y230) vorliegen, so dass sich vier synthetische Peptide ergeben. Die Peptide sollten als Peptidylsäuren erhalten werden. Für den Einsatz im Mikroarray sollten die Peptide mit einem mit dem Chip-Reader kompatiblen Fluoreszenzlabel versehen werden. Abb. 2.1 Die fluoreszenzmarkierten Peptide (Fl = Fluoreszenzlabel). 14

29 3 Sollbruchstellen 3 Sollbruchstellen Für eine spätere Sequenzierung cyclischer Peptide müssen diese, wie in der Einleitung beschrieben, in lineare Peptide überführt werden. Zunächst wurden daher mehrere Herangehensweisen experimentell untersucht, um eine Sollbruchstelle in den peptidischen Ring einzubringen. Denkbar sind chemische und enzymatische Sollbruchstellen. Der Ring muss erst geöffnet werden und anschließend das lineare Peptid von der Kugel gespalten werden. Auf den Einsatz von Disulfidbrücken, eine Verbrückung über Cysteinseitenketten, wurde bewusst verzichtet, da ein selektives und stabiles Öffnen bzw. Schließen des peptidischen Rings auf diese Weise als problematisch eingestuft wird. [32-34] 3.1 Photolabile Sollbruchstelle Lichtinduzierte Spaltungsreaktionen ermöglichen eine Erweiterung der rthogonalität von Linkern und Schutzgruppen in der präparativen organischen und kombinatorischen Synthese auf eine weitere Dimension. Die photolytische Spaltung verläuft unter sehr milden Reaktionsbedingungen und kommt ohne Erwärmen und ohne Zusatz von Reagenzien aus. Ein erster Ansatz bestand daher im Einbau einer photolabilen Sollbruchstelle. Abb. 3.1 Zwei von Holmes et al. entwickelte photolabile Linker. Nach photoinduzierter Reaktion erhält man eine Peptidylsäure (wenn X=), beziehungsweise ein Peptidylamid (wenn X=N). Die in Abb. 3.1 gezeigte Verbindung 4 enthält einen kommerziell erhältlichen photolabilen Linker [35, 36], wie er auch in meiner Diplomarbeit verwendet wurde. Durch Laserbestrahlung (Stickstofflaser, 337 nm), zum Beispiel während der Laser- 15

30 3 Sollbruchstellen induzierten Ionisierung im MALDI-Experiment, kann das Peptid direkt vom Harz gespalten werden. Ein vorheriges Abspalten zur Probenvorbereitung ist nicht notwendig. Im Rahmen meiner Diplomarbeit konnte ich jedoch feststellen, dass die Esterverknüpfung in Verbindung 4 unter Standard-Abspaltbedingungen von säurelabilen Schutzgruppen (TFA/TIS/Wasser (95:2,5:2,5)) nicht vollständig stabil ist. Die Amidverknüpfung zwischen Peptid und Linker in Verbindung 5 sollte diese Säurelabilität hingegen nicht aufweisen. Da es sich bei diesem Linker um eine Verbindung mit Carboxyl- und Aminogruppe handelt, also eine Amino-Säure - Funktionalität vorliegt, sollte diese Verbindung innerhalb einer Peptidkette auch als Sollbruchstelle nutzbar sein. Wird die Verbindung als Linker zwischen fester Phase und Peptid und zugleich im Peptidzyklus verwendet, so sollte eine gleichzeitige Abspaltung des Peptids von der festen Phase und eine Peptidringöffnung möglich sein (Abb. 3.2). Der für den Aufbau von Verbindung 5 notwendige Baustein 7 ist kommerziell nicht erhältlich. Abb. 3.2 Wird der photolabile Linker zwischen Peptid und Harzkugel und im cyclischen Peptid verwendet, so sollte durch Bestrahlung der Peptidzyklus gezielt geöffnet und gleichzeitig das Peptid vom Harz gespalten werden. Abb. 3.3 zeigt diesen kommerziell nicht erhältlichen Linker 7, der freundlicherweise im organischen Grundpraktikum unter der Leitung von Herrn Dr. Huhn nach einer Vorschrift von Holmes et al. dargestellt wurde. [35] Ausgehend von 4-Hydroxy-3-methoxyacetophenon kann dieser in sieben Stufen mit einer Literaturausbeute von 56% synthetisiert werden. 16

31 3 Sollbruchstellen Abb. 3.3 Der Fmoc-geschützte photolabile Linker (Fmoc-Pll-H) 7 kann ausgehend von 4-Hydroxy-3-methoxy-acetophenon 6 in sieben Schritten synthetisiert werden. Um zunächst die photolabile Sollbruchstelle untersuchen zu können, wurde eine kleine Bibliothek von cyclischen Peptiden an SieberAmid-TentaGel-Harz synthetisiert (Abb. 3.4). Die Verwendung des SieberAmid-Linkers ermöglichte das Abspalten der cyclischen Peptide, ohne den Ring zu öffnen. So konnte eine anschließende Charakterisierung und eine Studie der Spaltung der Sollbruchstelle folgen. Abb. 3.4 Durch parallele Synthese erhaltene Bibliothek von Cyclopeptiden. Abb. 3.5 zeigt exemplarisch für alle Peptide den Syntheseweg zur Darstellung von Peptid 8. Die Synthese der linearen Vorläufersequenz erfolgte im 10 µmol Ansatz am Peptidsynthesizer unter Fmoc-Bedingungen. Der Syntheseverlauf wurde über eine Leitfähigkeitsmessung der Fmoc-Abspaltlösung verfolgt. Die photolabile Aminosäure 7, welche später als Sollbruchstelle im Ring fungiert, wurde manuell angeknüpft. Nach vollständiger Elongation der Peptide wurde die N-terminale Fmoc-Gruppe abgespalten. Anschließend wurde das Peptidylharz mit Pd(0) und Diaminoboran-Komplex in DCM behandelt, um die Allyl-Schutzgruppe der Glutaminsäurenseitenkette zu entfernen. Die Cyclisierung erfolgte über eine 17

32 3 Sollbruchstellen N-Terminus-zu-Carbonsäureseitenkette-Amidverknüpfung. Dazu wurde die Carboxylgruppe der Glutaminseitenkette mit PyBP/HBt und DIPEA aktiviert. Nach jedem wichtigen Syntheseschritt erfolgte eine Testabspaltung des Peptids von der festen Phase und eine anschließende Charakterisierung mittels RP-HPLC und offline-ms. TFA/TIS/H ) 20% Piperidin in DMF 2) Fmoc-Pll-H 7 /HBt/ HBTU/DIPEA (4 eq: 6 eq: 4 eq: 8 eq), 19h Fmoc-Gly-Pro-Gly-Ala-Phe-Glu(All)-Lys(Boc)-SieberAmid- Fmoc-Pll-Gly-Pro-Gly-Ala-Phe-Glu(All)-Lys(Boc)-SieberAmid- TFA/TIS/H ) [Pd(PPh 3 ) 4 ]/(CH 3 ) 2 NHBH 3 (0,8 eq: 15 eq) 5) 20% Piperidin in DMF H-Pll-Gly-Pro-Gly-Ala-Phe-Glu-Lys(Boc)-SieberAmid- 17 TFA/TIS/H ) PyBP/HBt/DIEA (5 eq: 5 eq: 10eq), 18,5h NH N 2 HN N N H H N Me N H H N NH N H SieberAmid TFA/TIS/H HN Abb. 3.5 Nach automatisierter Elongation des linearen Vorläuferpeptids 13 wurde manuell die photolabile Aminosäure 7 (Fmoc-Pll-H) angeknüpft. Nach Abspaltung der Fmoc- und Allyl-Schutzgruppe erfolgte die Cyclisierung. Nach jedem wichtigen Syntheseschritt erfolgte eine Testabspaltung mit anschließender RP-HPLC-offline-MS-Charakterisierung. Den Syntheseweg durchliefen alle fünf Bibliotheksmitglieder (Peptid 8-12) getrennt nacheinander. 18

33 3 Sollbruchstellen Die erhaltenen Chromatogramme sind in Abb. 3.6 dargestellt. Zur Peptidsequenzierung wurden massenspektrometrische Untersuchungen vorgenommen, die in Abschnitt näher beschrieben werden. Abb. 3.6 RP-HPLC-Diagramm der Testabspaltungen während der Synthese von 8. Die Peak-Fraktionen wurden aufgesammelt und anschließend massenspektrometrisch untersucht. Säule: C18 Nucleosil 100-5, 4x25 mm; Flussrate = 1 ml/min. Die gewählte Detektorwellenlänge ist 254 nm. Gradient: 10-85% MeCN in 30 min (MeCN und H 2 mit 0.1% TFA). In den Chromatogrammen der cyclischen Peptide 8-12 traten immer zwei Hauptpeaks auf (Abb. 3.6 in grün abgebildet), welche massenspektrometrisch nicht zu unterscheiden waren. Da die photolabile Aminosäure 7 eine chirale Verbindung ist, die nicht enantiomerenrein in der SPPS eingesetzt wurde, entstehen Diastereomere. Möglicherweise sind diese nach der Cyclisierung in ihrer Konformation soweit eingeschränkt, dass sie sich chromatographisch voneinander trennen lassen. Zur Bestätigung dieser Hypothese wurde das cyclische Peptid 10 erneut synthetisiert, beide Produkte aufgetrennt und NMR-spektroskopisch untersucht. Die Synthese erfolgte wie bereits oben beschrieben. 19

34 3 Sollbruchstellen Abb. 3.7 RP-HPLC-Diagramm nach einer Testabspaltung des photolabilen cyclischen Peptids 10 mit 1% TFA. Unter diesen Bedingungen bleibt die Boc- Schutzgruppe weitestgehend im Peptid erhalten. Deutlich zu erkennen sind zwei Produktpeaks pro Peptid. Säule: C-18 Nuclosil 100-5, 4x25 mm; Flussrate = 1 ml/min. Die gewählte Detektorwellenlänge ist 254 nm. Gradienten: 10-85% MeCN in 20 min. Beiden Eluenten (Wasser und MeCN) wurde je 0.1% TFA zugesetzt. Abb. 3.7 zeigt das Chromatogramm eines analytischen RP-HPLC-Laufes nach einer Testabspaltung des Peptids 10. Unter den bei der Testabspaltung verwendeten Standard-SieberAmid-Abspaltbedingungen (TFA/TIS/DCM (1:1:98)) bleibt die Boc- Schutzgruppe weitestgehend auf der Aminogruppe der Lysinseitenkette erhalten. Die quantitative Abspaltung des Peptids vom Harz erfolgte durch Behandlung mit TFA/TIS/DCM (95:2,5:2,5), wodurch simultan die Boc-Schutzgruppe entfernt wurde. Mittels präparativer RP-HPLC wurden die beiden Komponenten voneinander getrennt. Zur NMR-spektroskopischen Untersuchung wurden von beiden Produkten CSY-, HSQC-, TCSY- und RESY-Experimente durchgeführt. Die Durchführung eines NESY-Experiments ist für diese Verbindung nicht sinnvoll, da die Intensität der erhalten Signale von der molaren Masse abhängt und bei ca g/mol gegen Null geht. Die vollständige Auswertung der erhaltenen Datensätze bestätigt, dass es sich um zwei cyclische Peptide der gleichen Sequenz mit vermutlich unterschiedlicher Konfiguration handelt. Abb. 3.8 zeigt exemplarisch einen Ausschnitt aus einem RESY-Spektrum, aus dem die Sequenz ausgelesen werden kann. Alle weiteren NMR-Daten können dem Anhang entnommen werden. 20

35 3 Sollbruchstellen Abb. 3.8 Ausschnitt aus dem 600-MHz-RESY-Spektrum von Peptid 10 (nach präparativer Auftrennung; Fraktion t R = 9,7min). Schematisch eingezeichnet ist die Zuordnung der Peptidsequenz. Die Kreuzsignale sind mit der in Cara [37] üblichen Nomenklatur bezeichnet. Die zur Auswertung verwendeten Signale sind mit gelb hervorgehoben und zur besseren Verständlichkeit mit Nummern versehen, die sich in der Struktur oben wieder finden. 21

36 3 Sollbruchstellen Abb. 3.9 Denkbarer Reaktionsmechanismus der photolytischen Spaltung. [38] Für eine kinetische Untersuchung der photolytischen Sollbruchstelle wurde Peptid 9 herangezogen. Durch Behandlung des Harzes mit 1% TFA wurde das Bocgeschützte Peptid 9 von der festen Phase gespalten und anschließend gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde in einem Lösungsmittelgemisch aus Acetonitril (66,6%), Methanol (16,6%), Wasser (16,3%) und Ameisensäure (0,3%) (v/v) gelöst und in ein HPLC-Probegefäß überführt. Anschließend erfolgte eine Bestrahlung der Peptidlösung mit UV-Licht (366 nm) für 20, 60, 120, 180, 240 und 360 Sekunden. Ein hypothetischer Reaktionsmechanismus kann Abb. 3.9 entnommen werden. [38] Nach Ablauf der Bestrahlungsdauer wurden RP-HPLC- Chromatogramme von je 10 µl Peptidlösung aufgenommen. In Abb ist eine Auswahl der erhaltenen Chromatogramme dargestellt. Vor der Bestrahlung zeigt das Chromatogramm den Doppelpeak (rot hervorgehoben) des cyclischen Peptids 9 bei Retentionszeiten von 13,3 und 13,6 min. Im Verlauf der Reaktion nimmt dieser Eduktpeak, wie erwartet, ab. Synchron zu seinem Verschwinden, wurde die Entstehung eines Produkts (blau hervorgehoben) bei einer Retentionszeit von 12,6 min beobachtet, dessen UV-Spektrum leicht bathochrom verschoben ist. Das neu gebildete Produkt zeigte das Phänomen des Doppelpeaks nicht, was nicht weiter verwunderte, da während der Photoreaktion das Chiralitätszentrum verloren geht. Mit zunehmendem Reaktionsverlauf ist eine weitere Produktbildung (t R 13,2 min, grün hervorgehoben) zu erkennen. Da zwischen den einzelnen Bestrahlungszyklen immer ein HPLC-Lauf erfolgte, lag die Vermutung nahe, dass es sich hierbei nicht um eine photolytische Reaktion, sondern um eine Zersetzung des photolytischen Spaltproduktes handeln könnte. Deshalb wurde die Peptidlösung nach der letzten 22

37 3 Sollbruchstellen Bestrahlung für 62 Stunden im Kühlschrank gelagert und erneut mittels RP-HPLC untersucht. Ein Vergleich der Chromatogramme zeigte eine deutliche Abnahme des photolytischen Spaltproduktes (blau hervorgehoben) und eine Zunahme der neuen Komponente mit einer Retentionszeit von 13,2 min. Somit konnte die Vermutung bestätigt werden, dass das gewünschte Produkt der photolytischen Ringöffnung nicht stabil ist. Durch Ermittlung der Peakflächen bei t R 12,6 min und t R 13,6 min, welche zu den Stoffmengen proportional sind, und Auftragung dieser gegen die Bestrahlungsdauer, wurde das Diagramm in Abb erhalten. Auch hier wurde deutlich, dass es sich zunächst um eine direkte Umwandlung des Edukts zum Produkt handelte. Die Kinetik der direkten Umwandlung entspricht der einer Reaktion 1. rdnung. Mit fortschreitendem Reaktionsverlauf wandelt sich das Primärprodukt zu einer neuen Verbindung um. Abb RP-HPLC-Diagramme von Peptid 9 nach unterschiedlicher Bestrahlungsdauer mit 366 nm. Die rot unterlegten Peaks stellen das cyclische Peptid 9 dar. Das photolytische Spaltprodukt ist in blau unterlegt und wandelt sich ohne Bestrahlung in eine neue Verbindung um. Diese ist grün unterlegt. Säule: C-18 Nuclosil 100-5, 4x25 mm; Flussrate = 1 ml/min und einem Gradienten von 10-85% MeCN in 20 min verwendet. Beiden Eluenten (Wasser und MeCN) wurden je 0,1% TFA zugesetzt. 23

38 3 Sollbruchstellen Abb Die Kinetik zeigt in rot die Abnahme des Edukts. In schwarz ist die Entstehung des Primärproduktes zu sehen. Auch andere Arbeitsgruppen haben bei der photolytischen Spaltung dieses Linkers diverse Nebenreaktionen, wie beispielsweise Dimerisierungen und nucleophile [39, 40] Angriffe durch primäre Amine oder Thiole, beobachtet. ftmals [39, 41] Nebenprodukte allerdings nicht identifiziert werden. Anhand konnten die der erhaltenen HPLC-, UV- und MS-Daten konnte auch in unserem Fall keine weitere Aussage über das entstandene Nebenprodukt gemacht werden. Um weitere Informationen über das durch Photolyse erhaltene Peptidprodukt zu gewinnen, wurde das cyclische Peptid 10 erneut synthetisiert und mit 1% TFA vom Harz gespalten. Für die anschließende Photolyse wurde das lyophilisierte Peptid 10 in Acetonitril (66,6%), Methanol (16,6%), Wasser (16,3%) und Ameisensäure (0,3%) (v/v) gelöst und 420 Sekunden mit UV-Licht bestrahlt. Die bestrahlte Lösung wurde im Kühlschrank für 24 Stunden verwahrt und anschließend mittels präparativer RP- HPLC aufgereinigt. Zur NMR-spektroskopischen Charakterisierung wurden CSY-, 24

39 3 Sollbruchstellen HSQC-, TCSY- und RESY-Experimente durchgeführt. Vergleicht man den erhaltenen Datensatz mit dem Datensatz des cyclischen Peptids, so bemerkt man einige Unterschiede: Die Spur der Aminofunktion der Sollbruchstelle (Verknüpfung zwischen photolabiler Aminosäure und Glutaminsäure) fehlt im TCSY-Spektrum. Die Signale der CHCH 3 -Gruppe am Pll-Aromaten sind weiterhin zu sehen. Der vierte Substituent am Pll-Aromaten, im Edukt die Nitrogruppe, ist jedoch unklar. Im HSQC- Spektrum ist eine deutliche Veränderung an der kx-position der Pll-Kette zu sehen. Das freie Amin in der Glutaminseitenkette fehlt. Die Signale der Protonen im Pll- Aromaten verändern sich fast nicht. Eine vollständige Identifizierung der Verbindung war jedoch leider nicht möglich. Da man für MS-Identifizierungen der Peptidsequenz auf stabile und eindeutige Produkte angewiesen ist, ist diese Sollbruchstelle für diesen Zweck nicht geeignet. 25

40 3 Sollbruchstellen 3.2 Methionin als Sollbruchstelle Bereits in den 1960er Jahren beschrieben Gross und Witkop die Bromcyanvermittelte selektive Spaltung von Peptidbindungen, an denen die Carbonylgruppe eines Methionins beteiligt ist. [42, 43] Bis heute ist dies die wichtigste nichtenzymatische Spaltung von Proteinen und Polypeptiden in der Biochemie. Inglis und Edman befassten sich mit Studien zu Kinetik und Mechanismus dieser Spaltung. [44] Der heute in Lehrbüchern [45] verbreitete Mechanismus ist in Abb dargestellt. Die hoch selektive Transformation beginnt mit einer S-Alkylierung des Methioninrests durch Bromcyan-Behandlung unter wässrig sauren Bedingungen. Die Elektronen des Cyan-Kohlenstoffs sind in Richtung des elektronegativeren Bromids verschoben. Dies führt zu einer positiven Teilladung am Kohlenstoff, welche einen nucleophilen Angriff des Sulfids (Methionin) ermöglicht. Es folgt eine intramolekulare Cyclisierung, bei der Methylthiocyanat 22 als gute Abgangsgruppe eliminiert wird. Nach saurer Hydrolyse des entstandenen Iminolactons gelangt man zum C-terminalen Homoserinlacton (Hsl) 26 und einem freien Amin. Abb Mechanismus der BrCN-Spaltung, wie er üblicherweise in Lehrbüchern zu finden ist. [45] 26

41 3 Sollbruchstellen Neben der Bromcyanspaltung zur Fragmentierung von Polypeptiden findet man in der Literatur auch zahlreiche Beispiele, in denen Methionin als Linkergruppe in der [16, 21, 27, 46-50] SPPS eingesetzt wurde. Nach der Standard-Fmoc-SPPS wird das Peptid dabei üblicherweise durch Behandlung mit einer Lösung, bestehend aus BrCN in 70% wässriger TFA (70 mg/ml), vom Harz abgespalten. Abb Cyclisches Peptid mit Methionin als Linker zum Harz und Sollbruchstelle im Peptidzyklus. Durch Behandlung mit BrCN wird das Peptid vom Harz gespalten und der Ring geöffnet. Man erhält ein lineares Peptid in Lösung. Inspiriert von diesen Arbeiten kam der Gedanke auf, Methionin nicht nur als Linker, sondern zusätzlich als Sollbruchstelle im cyclischen Peptid zu verwenden. Wird ein solches System einer BrCN-Behandlung ausgesetzt, so sollte simultan das Peptid vom Harz gespalten und der peptidische Ring geöffnet werden. Man erhält ein lineares Peptid in Lösung, welches nun einer Sequenzierung unterzogen werden kann. Um das Potential von Methionin als Sollbruchstelle im Zyklus zu überprüfen, wurde zunächst Peptid an SieberAmid-TentaGel-Harz synthetisiert (Abb. 3.14). Im Hinblick auf eine spätere Sequenzierung des Peptids mittels Massenspektrometrie, wurde zwischen dem Peptidzyklus und dem Trägerharz eine kurze Massenspacersequenz, bestehend aus -βala-pro-pro-arg-, synthetisiert. Der Spacer nutzt in zweierlei Hinsicht. Erstens bringt er die zur Sequenzierung notwendigen Peptidfragmente in einen Massenbereich größer 500 m/z und somit über den Massenbereich der Matrix-Hintergrund-Signale im MALDI-Experiment. Zum Zweiten wird durch die Anwesenheit von Arginin eine positive Ladung im Peptid gesichert, welche für die massenspektrometrische Detektion nötig ist. 27

42 3 Sollbruchstellen Abb Synthese des cyclischen Peptids 33 und anschließende Ringöffnung mit BrCN-Behandlung. Abb RP-HPLC von Testabspaltungen während der Synthese von 33. Die Peak- Fraktionen wurden aufgesammelt und anschließend massenspektrometrisch untersucht. Säule: C18 Nucleosil 100-5, ID 4 mm; Flussrate = 1 ml/min. Die gewählte Detektorwellenlänge war 254 nm. Gradient: 10-85% MeCN in 20 min (MeCN und H 2 mit 0,1% Ameisensäure). 28

43 3 Sollbruchstellen Die Synthese des linearen Vorläuferpeptids 27 erfolgte unter Standard-Fmoc-SPPS am Peptidsynthesizer. Der Syntheseverlauf wurde mittels Leitfähigkeitsmessung der Fmoc-Abspaltlösung verfolgt. Nach Entschützung des N-Terminus und der Carboxylgruppe der Glutaminsäureseitenkette erfolgte zwischen diesen die Cyclisierung unter Verwendung von PyBP. Die Reaktionsbedingungen können der Abb entnommen werden. Zur Untersuchung der Sollbruchstelle wurde das harzgebundene Cyclopeptid 31 anschließend über Nacht mit Bromcyan in wässrig saurer Lösung behandelt. Alle Schritte wurden mittels RP-HPLC und nachfolgender Massenspektrometrie analysiert (Abb. 3.15). In den Chromatogrammen der Peptide 28, 30 und 32 wurden je zwei Hauptpeaks beobachtet. Die massenspektrometrische offline-charakterisierung ergab, dass es sich bei den Peaks mit niedrigerer Retentionszeit (17,921 min, 13,395 min und 13,710 min) jeweils um das entsprechende Peptid handelte, bei dem Methionin oxidiert vorliegt. Aus den Chromatogrammen in Abb wird ebenfalls ersichtlich, dass das cyclische Peptid 32 durch Behandlung mit BrCN zum linearen Peptid 33 umgewandelt werden kann. Methionin ist somit als Sollbruchstelle in cyclischen Peptiden durchaus geeignet. Die daran anschließenden massenspektrometrischen Sequenzierungsexperimente sind in Abschnitt ausführlich beschrieben. Wie dort ausführlich erläutert stellte sich die rein massenspektometrische Sequenzierung als ungeeignet heraus, somit erübrigte sich die Anwendung einer simultanen Ringöffnung und Harzspaltung. Der partielle Edman-Abbau (PED) zeigte sich dagegen als geeigneter zur Sequenzierung (eine ausführliche Beschreibung hierzu befindet sich in Kapitel 4). Dies stellt jedoch besondere Anforderungen an den Linker. Ein simultanes Peptidringöffnen und Abspalten des Peptides vom Harz ist bei dieser Methode nicht mehr möglich. Alle Schritte müssen festphasengebunden vonstatten gehen und erst unmittelbar vor der Analytik darf das Peptid vom Harz gespalten werden. 29

44 3 Sollbruchstellen Auswahl eines Linkers orthogonal zur Met-Sollbruchstelle In den oben beschriebenen Experimenten wurde Methionin als Sollbruchstelle und Linker verwendet. Somit wurde durch die Behandlung mit Bromcyan der Peptidzyklus geöffnet und gleichzeitig das Peptid vom Harz gespalten. Soll die Bromcyanvermittelte Ringöffnung jedoch ohne simultane Abspaltung des Peptids vom Harz erfolgen, benötigt man einen Linker, der allen verwendeten Bedingungen standhält. Zur Darstellung des cyclischen Peptids werden folgende Bedingungen verwendet: Die Standard-Bedingungen der Fmoc-SPPS (20% Piperidin in DMF bzw. NMP), Entfernung der Allyl- bzw. Alloc-Schutzgruppe (Pd(0) und Nucleophil) und Abspaltung der säurelabilen Boc-, Trt-, t-bu- und Pbf-Schutzgruppen (95%TFA aq.). Zum Öffnen des Peptidzyklus wird eine Bromcyan-Spaltung durchgeführt (BrCN in 70% TFA aq.). Außerdem sollen die festphasengebundenen cyclischen Peptide einem Screening unterzogen werden (Abschnitt 5.3), welches im wässrigen Milieu zwischen ph=1-9 verläuft; auch hierbei darf der Linker nicht reagieren. Da sich herausstellte, dass der partielle Edman-Abbau die geeignetste Methode zur Sequenzierung ist, muss der Linker schließlich auch zu diesen Bedingungen kompatibel sein. Peptid-Synthese vor dem Screening Abb Ein geeigneter Linker muss zu allen hier aufgeführten Bedingungen kompatibel sein. 30