Bioinformatik: Eine Anleitung zum Lesen der Gene

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1 Bioinformatik: Eine Anleitung zum Lesen der Gene Gerhard Thallinger Institut für Genomik und Bioinformatik, TU Graz 1 1

2 Themen für Projekte, Bachelor- und Masterarbeiten Themen sind zu finden unter Für weitere Themen und eigene Ideen kontaktieren Sie 2 3

3 Bioinformatik Gene Funktion 3 5

4 Vorlesungsüberblick Biologische Datenbanken: Überblick Suche Definition und Aufbau Prediktive Methoden basierend auf DNA und Protein Sequenzen Multiples Sequenzalignment Phylogenentische Analyse Next Generation Sequencing Technologien Anwendungen 4 6

5 Biologische Datenbanken 3 große Zentren: National Center for Biotechnology Information (NCBI, NIH, Bethesda, USA) European Bioinformatics Institute (EBI, EMBL, Hinxton, UK) DNA Databank of Japan (DDBJ, NIG, Mishima, Japan) Sehr große Zahl von spezialisierten Datenbanken (SwissProt, KEGG, PDB, PFAM, RFAM, mirbase, ) Jährliche Publikation in der Datenbankausgabe von Nucleic Acids Research 5 7

6 Biologische Datenbanken: Suche basierend auf David Landsman Computational Biology Branch NCBI 6 8

7 Überblick NCBI Entrez System 7 9

8 NCBI: Wieviel Information ist gespeichert? Nucleotide records 167,295,840 Nucleotides 154,192,921,011 Protein sequences 97,127,736 3D structures (PDB) 94,715 Expression data samples (GEO) 1,010,406 Human Unigene clusters 130,029 Complete genomes (GOLD) 17,481 Different taxonomy nodes dbsnp (human only) Human Refgene records PubMed records OMIM records 1,075, ,952,851 40,453 23,175,261 23,163 (Stand August 2013) 8 10

9 Entwicklung des Datenaufkommens 9 11

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12 Autoimmune lymphoproliferative syndrome 12 14

13 13 15

14 14 16

15 15 17

16 16 18

17 17 19

18 18 20

19 19 21

20 20 22

21 21 23

22 22 24

23 23 25

24 24 26

25 ALPS Fallstudie (online) 25 27

26 ALPS Fallstudie (online) 26 31

27 MyNCBI 27 32

28 28 33

29 29 34

30 30 35

31 31 36

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33 Biologische Datenbanken: Mehr zur die Suche 33 38

34 34 39

35 35 40

36 36 41

37 37 42

38 38 43

39 39 44

40 Struktursuche

41 41 46

42 42 47

43 43 48

44 44 49

45 45 50

46 Das Ensembl Projekt Wurde initiiert, um Genome von Metazoen zur Verfügung zu stellen Ziel: Die beste automatische Genom-Annotation zu entwickeln Die Kerngruppe analysiert das humane und das Mausgenom Software, Daten und Resultate sind frei verfügbar Aufteilung zwischen EBI und Sanger (vom Wellcome Trust finanziert) Das größte Computerzentrum für die Biologie in Europa Entwicklergemeinschaft > 300 Personen (inkl. beteiligte Firmen) Sanger Center, Hinxton, UK 46 51

47 Das Ensembl Projekt Core database Normalisiert Jeder Datenpunkt genau einmal gespeichert (keine Redundanz) Rasche Aktualisierung Geringster Speicherbedarf ABER: Viele Tabellen Viele JOINS in komplexen Abfragen Sehr langsam für das Data Mining Mart database (EnsMart) Nicht normalisiert Tabellen mit redundant Informationen Optimiert für Abfragen Schnell und flexibel 47 52

48 Vergleichende Genomik in Ensembl Die Compara Datenbank ist eine große Multispecies Datenbank Gen Ortholog / Paralog Vorhersage Protein Clustering Alignments über ganze Genome Berechnung von Synteny Regions 48 53

49 EB-eye

50 Das Ensembl Projekt 50 55

51 Ensembl Core vs. EnsMart Species Data size (Gb) Homo sapiens Mus musculus 92.7 Sus scrofa 25.9 Bos taurus 20.8 Rattus norvegicus 17.9 Pongo abelii 15.7 Gallus gallus 15.4 Canis familiaris 13.7 Mustela putorius 13.7 Pan troglodytes 12.6 Other (53) Total Multi-species Data size (Gb) Ancestral 35.9 Archive 0 Compara Mart Ontology 0.2 Production 0 Stable 2.2 Website 0.1 Total

52 Literatursuche

53 PubMed PubMed ist die Literaturdatenbank der National Library of Medicine PubMed ist aus MEDLINE (CD-ROM Datenbank) hervorgegangen Enthält Publikationen aus dem Gebiet der Medizin und angrenzenden Wissenschaften mit Autoren Journal Zusammenfassung Schlüsselbegriffe Links zu Volltext (beim Verlag) und anderen (NCBI) Datenbanken

54 PubMed: Was ist NICHT enthalten Alle Journale Meeting Abstracts Bücher und Buchkapitel sind nicht indiziert Volltext zu den Publikationen (im Allgemeinen) Teilweise (Open Access Journale, Publikationen aus NIH geförderten Projekten) 54 60

55 55 61

56 PubMed: Beispiele zur Suche Autoren: Autor und Begriff ubject.html Einfache Begriffssuche Suche nach einem Journal Benachrichtigungen

57 PubMed: Die wichtigsten Feldschlüssel [au] Autor [ta] Abkürzung des Journalnamens (journal title abbreviation) [ti] Titel der Publikation [1au] Erstautor (1st author) [dp] Datum der Veröffentlichung (date of publication) [ab] Kurzfassung (abstract) [mh] MeSH Begriff (Medical subject headings term) Überblick: part=pubmedhelp#pubmedhelp.search_field_descrip 57 63

58 Weitere Datenbanken

59 ExPASy 59 65

60 UniprotKB 60 66

61 Prosite - Motivdatenbank 61 67

62 Brenda Enzymdatenbank 62 68

63 Protein Data Bank 3D Strukturen 63 69

64 Biologische Datenbanken: Definition und Aufbau Basierend auf: Francis Ouellette Current Topics in Genome Analysis

65 Datenbanken Eine Datenbank ist eine systematisch strukturierte Sammlung von Informationen Daten, die man einmal darin gespeichert hat, können daraus wieder abgerufen werden. Durch Abfragen können neue Zusammenhänge zwischen den Daten gefunden werden. Eine Datenbank vereinfacht und reduziert den Datenraum durch Spezialisierung (Fokussierung) auf einen bestimmten Teilbereich. Eine Datenbank kann eine Ressource für andere Datenbanken und für Analysewerkzeuge sein

66 Datenbank Komponenten Definition und Beschreibung der Struktur Eindeutigen Schlüssel Links zu anderen Datenbanken Dokumentation Prozess für das Einreichen, Aktualisieren und Korrigieren von Einträgen 66 74

67 Datenbank Design.. The more closely and elegantly a model follows a real phenomenon, the more useful it is in predicting or understanding the natural phenomenon it mimics. Ostell J, et al. The NCBI Data Model. In: Bioinformatics, a Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins., Eds: Baxevanis AD and Ouellette BF. John Wiley & Sons, New York, 1998:p

68 Das NCBI Daten Model ist in ASN.1 definiert ASN.1 (Abstract Syntax Notation) ist eine Datenbeschreibungssprache ähnlich einer Backus-Naur Normalform. ASN.1 ist eine formale Sprache, die speziell dafür geschaffen wurde, komplexe Datenstrukturen in einer Form zu spezifizieren, die unabhängig von Computer, Betriebssystem, DBMS und Programmiersprache ist. ASN.1 ist ein internationaler Standard (ISO 8824, 8825) ASN.1 wird in vielen Protokollen zum Datenaustausch verwendet (e.g. X.400 or Z39.50)

69 Eine Bioseq definiert ein Koordinatensystem für Sequenzen ASN.1 Definition Bioseq ::= SEQUENCE { } id SET OF Seq-id, descr Seq-descr OPTIONAL, inst Seq-inst, annot SET OF Seq-annot OPTIONAL Die einfachste Bioseq besteht aus einer ID und der Sequenzinstanz (z.b. Länge, Topologie, Residuen)

70 Es gibt viele Klassen einer Bioseq Eine Bioseq kann eine DNA-, RNA-, oder Proteinsequenz beschreiben Eine Bioseq kann in verschiedenen Formen repräsentiert werden Eine Bioseq kann eine Historie (Seq-hist) haben 70 78

71 Seq-id s haben unterschiedliche Formen und Bedeutungen Eine Seq-id ist definiert als eine Menge von unterschiedlichen Typen, die unterschiedliche Formate und Bedeutungen haben. Einige davon spiegeln die Form und Anwendung in der Quelldatenbank wider. Die NCBI gi ist ein beliebiger ganzzahliger Identifier, der: explizit eine spezifische Sequenz identifiziert stabil ist und unverändert über die Zeit abgerufen werden kann die selbe Form über alle Sequenzdatenbanken hat es ermöglicht, eine Historie der Änderungen zu einer Sequenz zu schaffen 71 79

72 Zusätzliche Ressourcen Full dump der Daten (über FTP) Dokumentation der Datenbanken Programmatische Suche in den Datenbanken (Entrez Programming Utilities) Einheitliche Abfragesprache Dokumentation der Software für den Datenzugriff Details:

73 Primärdaten DNA-, RNA- und Proteinsequenzen sind Primärdaten in den biologischen Datenbanken. In den meisten Fällen sind die Proteinsequenzen von den DNA-, bzw. RNA-Sequenzen abgeleitet. Das Verständnis der unterschiedlichen Sequenztypen ist eine wesentliche Vorraussetzung für die Interpretation und Analyse der Sequenzen. Trotz aller Sorgfalt enthalten biologische Datenbanken Fehler. Das muss bei allen Abfragen berücksichtigt werden und die Resultate immer kritisch betrachtet werden

74 Was umfasst GenBank? GenBank ist die NIH Sequenzdatenbank aller öffentlich verfügbaren DNA- und deren abgeleiteten Protein Sequenzen. Jede dieser Sequenzen enthält Annotationen, die zusätzlichen biologische Informationen enthalten. Benson DA, Karsch-Mizrachi I, Lipman DJ, Ostell J, Sayers EW. Nucleic Acids Res. 2009;37(Database issue):d

75 Nucleotide Tägliche Synchronisation zwischen den INSDEC Datenbanken 75 83

76 GenBank - Release Oktober ,335,396 Einträge (Sequenzen oder GBFFs) 155,176,494,699 Nukleotide Vollständige Release von GenBank: alle 2 Monate. Inkrementelle und kumulative Releases: täglich

77 Einige Bemerkungen zu GenBank GenBank ist ein nukleotide-zentrischer Blick auf den Datenraum. GenBank ist ein Repository für alle öffentlich verfügbaren Sequenzen. Was nicht in GenBank gefunden werden kann, ist nicht in der public domain. GenBank Einträge sind nach unterschiedlichen Kriterien gruppiert. Das Verstehen dieser Gruppierungen ist essentiell für eine optimale Nutzung. Die Qualität der Daten in GenBank (und in biologischen Datenbanken i.a.) hängt primär vom Einreicher ab: Das muss sowohl bei Abfragen als auch beim Einreichen berücksichtigt werden

78 GBFF and ASN.1 GenBank Daten werden am NCBI im ASN.1 Format verwaltet. ASN.1 als Datenbeschreibungssprache ist i.a. nicht dazu gedacht von einem Menschen gelesen zu werden, sondern durch einen Computer interpretiert zu werden. Deshalb stellt GenBank unterschiedliche Ansichten auf die Daten. Das GenBank Flat File (GBFF) ist eine dieser Ansichten, das aus dem ASN.1 Format generiert werden kann

79 ASN.1 als lingua franca der Bioinformatik 79 87

80 Aufbau eines GenBank Flat Files (GBFFs) LOCUS HSU bp mrna linear PRI 21-MAY-1998 DEFINITION Homo sapiens integrin-linked kinase (ILK) mrna, complete cds. ACCESSION U40282 VERSION U GI: KEYWORDS. SOURCE human. ORGANISM Homo sapiens Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo. REFERENCE 1 (bases 1 to 1789) AUTHORS Hannigan,G.E., Leung-Hagesteijn,C., Fitz-Gibbon,L., Coppolino,M.G., Radeva,G., Filmus,J., Bell,J.C. and Dedhar,S. TITLE Regulation of cell adhesion and anchorage-dependent growth by a new beta 1-integrin-linked protein kinase JOURNAL Nature 379 (6560), (1996) MEDLINE REFERENCE 2 (bases 1 to 1789) AUTHORS Dedhar,S. and Hannigan,G.E. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (07-NOV-1995) Shoukat Dedhar, Cancer Biology Research, Sunnybrook Health Science Centre and University of Toronto, 2075 Bayview Avenue, North York, Ont. M4N 3M5, Canada REFERENCE 3 (bases 1 to 1789) AUTHORS Dedhar,S. and Hannigan,G.E. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (21-MAY-1998) Shoukat Dedhar, Cancer Biology Research, Sunnybrook Health Science Centre and University of Toronto, 2075 Bayview Avenue, North York, Ont. M4N 3M5, Canada REMARK Sequence update by submitter COMMENT On May 21, 1998 this sequence version replaced gi: FEATURES Location/Qualifiers source /organism="homo sapiens" /db_xref="taxon:9606" /chromosome="11" /map="11p15" /cell_line="hela" gene /gene="ilk" CDS /gene="ilk" /note="protein serine/threonine kinase" /codon_start=1 /product="integrin-linked kinase" /protein_id="aac " /db_xref="gi: " /translation="mddiftqcregnavavrlwldntendlnqgddhgfsplhwacre GRSAVVEMLIMRGARINVMNRGDDTPLHLAASHGHRDIVQKLLQYKADINAVNEHGNV PLHYACFWGQDQVAEDLVANGALVSICNKYGEMPVDKAKAPLRELLRERAEKMGQNLN RIPYKDTFWKGTTRTRPRNGTLNKHSGIDFKQLNFLTKLNENHSGELWKGRWQGNDIV VKVLKVRDWSTRKSRDFNEECPRLRIFSHPNVLPVLGACQSPPAPHPTLITHWMPYGS LYNVLHEGTNFVVDQSQAVKFALDMARGMAFLHTLEPLIPRHALNSRSVMIDEDMTAR ISMADVKFSFQCPGRMYAPAWVAPEALQKKPEDTNRRSADMWSFAVLLWELVTREVPF ADLSNMEIGMKVALEGLRPTIPPGISPHVCKLMKICMNEDPAKRPKFDMIVPILEKMQ DK" BASE COUNT 443 a 488 c 480 g 378 t ORIGIN 1 gaattcatct gtcgactgct accacgggag ttccccggag aaggatcctg cagcccgagt 61 cccgaggata aagcttgggg ttcatcctcc ttccctggat cactccacag tcctcaggct 121 tccccaatcc aggggactcg gcgccgggac gctgctatgg acgacatttt cactcagtgc 181 cgggagggca acgcagtcgc cgttcgcctg tggctggaca acacggagaa cgacctcaac 241 cagggggacg atcatggctt ctcccccttg cactgggcct gccgagaggg ccgctctgct 301 gtggttgaga tgttgatcat gcggggggca cggatcaatg taatgaaccg tggggatgac 361 acccccctgc atctggcagc cagtcatgga caccgtgata ttgtacagaa gctattgcag 421 tacaaggcag acatcaatgc agtgaatgaa cacgggaatg tgcccctgca ctatgcctgt 481 ttttggggcc aagatcaagt ggcagaggac ctggtggcaa atggggccct tgtcagcatc 541 tgtaacaagt atggagagat gcctgtggac aaagccaagg cacccctgag agagcttctc 601 cgagagcggg cagagaagat gggccagaat ctcaaccgta ttccatacaa ggacacattc 661 tggaagggga ccacccgcac tcggccccga aatggaaccc tgaacaaaca ctctggcatt 721 gacttcaaac agcttaactt cctgacgaag ctcaacgaga atcactctgg agagctatgg 781 aagggccgct ggcagggcaa tgacattgtc gtgaaggtgc tgaaggttcg agactggagt 841 acaaggaaga gcagggactt caatgaagag tgtccccggc tcaggatttt ctcgcatcca 901 aatgtgctcc cagtgctagg tgcctgccag tctccacctg ctcctcatcc tactctcatc 961 acacactgga tgccgtatgg atccctctac aatgtactac atgaaggcac caatttcgtc 1021 gtggaccaga gccaggctgt gaagtttgct ttggacatgg caaggggcat ggccttccta 1081 cacacactag agcccctcat cccacgacat gcactcaata gccgtagtgt aatgattgat 1141 gaggacatga ctgcccgaat tagcatggct gatgtcaagt tctctttcca atgtcctggt 1201 cgcatgtatg cacctgcctg ggtagccccc gaagctctgc agaagaagcc tgaagacaca 1261 aacagacgct cagcagacat gtggagtttt gcagtgcttc tgtgggaact ggtgacacgg 1321 gaggtaccct ttgctgacct ctccaatatg gagattggaa tgaaggtggc attggaaggc 1381 cttcggccta ccatcccacc aggtatttcc cctcatgtgt gtaagctcat gaagatctgc 1441 atgaatgaag accctgcaaa gcgacccaaa tttgacatga ttgtgcctat ccttgagaag 1501 atgcaggaca agtaggactg gaaggtcctt gcctgaactc cagaggtgtc gggacatggt 1561 tgggggaatg cacctcccca aagcagcagg cctctggttg cctcccccgc ctccagtcat 1621 ggtactaccc cagcctgggg tccatcccct tcccccatcc ctaccactgt gcgcaagagg 1681 ggcgggctca gagctttgtc acttgccaca tggtgtcttc caacatggga gggatcagcc 1741 ccgcctgtca caataaagtt tattatgaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa // Header Features Sequence 80 88

81 Beispiel eines GenBank Eintrags LOCUS HSU bp mrna linear PRI 21-MAY-1998 DEFINITION Homo sapiens integrin-linked kinase (ILK) mrna, complete cds. ACCESSION U40282 VERSION U GI: KEYWORDS. SOURCE human. ORGANISM Homo sapiens Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo. REFERENCE 1 (bases 1 to 1789) AUTHORS Hannigan,G.E., Leung-Hagesteijn,C., Fitz-Gibbon,L., Coppolino,M.G., Radeva,G., Filmus,J., Bell,J.C. and Dedhar,S. TITLE Regulation of cell adhesion and anchorage-dependent growth by a new beta 1-integrin-linked protein kinase JOURNAL Nature 379 (6560), (1996) MEDLINE REFERENCE 2 (bases 1 to 1789) AUTHORS Dedhar,S. and Hannigan,G.E. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (07-NOV-1995) Shoukat Dedhar, Cancer Biology Research, Sunnybrook Health Science Centre and University of Toronto, 2075 Bayview Avenue, North York, Ont. M4N 3M5, Canada 81 89

82 Beispiel eines GenBank Eintrags FEATURES Location/Qualifiers source /organism="homo sapiens" /db_xref="taxon:9606" /chromosome="11" /map="11p15" /cell_line="hela" gene /gene="ilk" CDS /gene="ilk" /note="protein serine/threonine kinase" /codon_start=1 /product="integrin-linked kinase" /protein_id="aac " /db_xref="gi: " /translation="mddiftqcregnavavrlwldntendlnqgddhgfsplhwacre GRSAVVEMLIMRGARINVMNRGDDTPLHLAASHGHRDIVQKLLQYKADINAVNEHGNV PLHYACFWGQDQVAEDLVANGALVSICNKYGEMPVDKAKAPLRELLRERAEKMGQNLN RIPYKDTFWKGTTRTRPRNGTLNKHSGIDFKQLNFLTKLNENHSGELWKGRWQGNDIV VKVLKVRDWSTRKSRDFNEECPRLRIFSHPNVLPVLGACQSPPAPHPTLITHWMPYGS LYNVLHEGTNFVVDQSQAVKFALDMARGMAFLHTLEPLIPRHALNSRSVMIDEDMTAR ISMADVKFSFQCPGRMYAPAWVAPEALQKKPEDTNRRSADMWSFAVLLWELVTREVPF ADLSNMEIGMKVALEGLRPTIPPGISPHVCKLMKICMNEDPAKRPKFDMIVPILEKMQ DK" BASE COUNT 443 a 488 c 480 g 378 t ORIGIN 1 gaattcatct gtcgactgct accacgggag ttccccggag aaggatcctg cagcccgagt 61 cccgaggata aagcttgg ccgcctgtca caataaagtt tattatgaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 82 90

83 FASTA - Format 1. Zeile beginnt mit >, gefolgt von der Bezeichnung der Sequenz (keine Leerzeichen!), Text nach dem ersten Leerzeichen ist Kommentar und wird von den Programmen meist ignoriert >gi gb M CAJRR16SC Campylobacter fetus veneralis 16S TATGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAGTGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGGAGT ATTAAGAGAGCTTGCNNNNTTAATACTTAGTGGCGCACGGGTGAGTAATGTATAGTTAATCTGCCCTACA CTGGAGGACAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACTCCATACTCCTTCTTAACATAAGTTAAGTCGGGAAA GTNTTTCGGTGTAGGATGAGACTATATTGTATCAGCTAGTTGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGGCTNTGA CGCATAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCNNCGGGAGGC AGCAGTAGGGAATATTGCTCAATGGGGGAAACCCTGAAGCAGCAACGCCGCGTGGAGGATGACACTNTTC GGAGCGTAAACTCCNTTTGTTAGGGAAGAACCATGACGGTACCTAACGAATAAGCACCGGCTAACTCCGT GCCAGCAGCCGCGGTNATACGGAGGGTGCNAGCGTTACTCGGAATCACTGGGCGTAAAGGACGCGTAGGC GGATTATCAAGTCTTTTGTGAAATCTAACAGCTTAACTGTTAAACTGCTTGAGAAACTGATAATCTAGAG TGAGGGAGAGGCAGATGGAATTGGTGGTGTAGGGGTAAAATCCGTAGAGATCACCAGGAATACCCATTGC GAAGGCGATCTGCTGGAACTCAACTGACGCTAATGCGTGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTNGATACC Nucleotide Sequenz 1 Buchstabencode 83 91

84 1- Buchstabencode für Nukleinsäuren Code description A C G T U Adenine Cytosine Guanine Thymine Uracil R Purine (A or G) Y Pyrimidine (C, T, or U) M K W S C or A T, U, or G T, U, or A C or G B C, T, U, or G (not A) D A, T, U, or G (not C) H A, T, U, or C (not G) V A, C, or G (not T, not U) N Any base (A, C, G, T, or U) 84 92

85 FASTA - Format >seq1 MEKTMSAILLVLYIFVLHLQYSEVHSLATTSDHDFSYLSFAYDATDLELEGSYDYVIVG >seq2 GGTSGCPLAATLSEKYKVLVLERGSLPTAYPNVLTADGFVYNLQQEDDGKTPVERFVSED >seq3 GIDNVRGRVLGGTSIINAGVYARANTSIYSASGVDWDMDLVNQTYEWVEDTIVYKPNSQS Im FASTA Format können mehrere Sequenzen hintereinander in derselben Datei abgelegt werden und an Analyse Programme übergeben werden (z.b. multiples Sequenzalignment) 85 93

86 1- und 3-Buchstabencode für Aminosäuren Aminosäure 3-Buchst. 1-Buchst. Alanin Ala A Arginin Arg R Asparagin Asn N Asparaginsäure Asp D Cystein Cys C Glutamin Gln Q Glutaminsäure Glu E Glycin Gly G Histidin His H Isoleucin Ile I Leucin Leu L Lysin Lys K Methionin Met M Phenylalanin Phe F Prolin Pro P Serin Ser S Threonin Thr T Tryptophan Trp W Tyrosin Tyr Y Valin Val V zusätzliche Codes: Asp/Asn Asx B Glu/Gln Glx Z Selenocystein Sec U Pyrrolysin Pyl O 86 94

87 LOCUS, Accession, Accession.version & gi LOCUS: HSU40282 Nucleotide GI: ACCESSION: U VERSION: U Protein GI: ACCESSION: AAC16892 VERSION: AAC

88 LOCUS, Accession, Accession.version & gi LOCUS: eindeutige ID, bestehend aus 10 Buchstaben und Ziffern. Wird nicht datenbankübergreifend gewartet und ist daher eine schlechte Sequenz-ID. ACCESSION: eine eindeutige ID, die sich nicht ändert, wenn ein Eintrag aktualisiert wird. Eine gute Sequenz-ID, die in Publikationen verwendet werden soll Nucleotide gi: Geninfo identifier (gi), eine eindeutige, ganzzahlige Sequenz-ID, die sich jedes Mal ändert, wenn sich die Sequenz ändert. Accession.version: eindeutige ID für einen Eintrag. Die Version wird inkrementiert, wenn die Sequenz sich ändert. Protein gi: gleich wie Nucleotide gi, für die Proteinsequenz protein_id: gleich wie Nucleotide Accession.version 88 96

89 GenBank Release 186 nach Organismen Entries Bases Species Homo sapiens Mus musculus Rattus norvegicus Bos taurus Zea mays Sus scrofa Danio rerio Strongylocentrotus purpuratus Oryza sativa Japonica Group Nicotiana tabacum Xenopus (Silurana) tropicalis Arabidopsis thaliana Drosophila melanogaster Pan troglodytes Vitis vinifera Canis lupus familiaris Gallus gallus Glycine max Macaca mulatta Solanum lycopersicum 89 97

90 GenBank Organismal divisions PRI -Primate ROD - Rodent MAM - Mammalian VRT - Vertebrate INV - Invertebrate PLN - Plant, fungal, and algal BCT -Bacterial VRL -Viral PHG - Phage SYN - Synthetic UNA - Unannotated 90 98

91 GenBank Functional Divisions PAT -Patent EST - Expressed Sequence Tags STS - Sequence Tagged Sites GSS - Genome Survey Sequences HTG - High Throughput Genome HTC - unfinished high-throughput cdna sequencing ENV - environmental sampling sequences 91 99

92 EST: Expressed Sequence Tag Expressed Sequence Tags sind einzelne, kurze ( bp) Reads von mrna (cdna), die in einem Hochdurchsatzverfahren generiert werden. Sie repräsentieren eine Momentaufnahme der Gene, die in einem gewissen Gewebe zu einem gewissen Zeitpunkt (z.b. Entwicklungszustand) expremiert (aktiv) sind

93 GSS: Genome Survey Sequences Genome Survey Sequences sind ähnlich zu ESTs, mit dem Unterschied, das sie Abschnitte genomischer DNA representieren und nicht cdna (reverse transcribed mrna)

94 Download Formate GBFF GenBank GBFF GenBank (vollständig) FASTA Nur Header und Sequenz FASTA Feature Tabelle ASN.1 GenBank vollständig XML GenBank (vollständig) XML International Nucleotide Sequence Database Collaboration content XML Tiny sequence

95 Prinzipien in der GenBank In GenBank werden Einträge nach verschiedenen Kategorien gruppiert, das betrifft sowohl organismusbezogene als auch funktionsbezogene Gruppen Das Verständnis dafür ist für die vollständige Nutzung dieser Datenbank essentiell

96 Bioinformatik: Next Generation Sequencing: Technologien Gerhard Thallinger Institut für Genomik und Bioinformatik, TU Graz

97 Entwicklung der Sequenziertechnologie First Generation 1977 Sanger Sequenzierung (GOLD Standard) Second Generation Sequencing (von Roche aufgekauft) 2005 Solexa Sequencing (von Ilumina aufgekauft) 2006 APG SOLiD Sequencing (von Life Technologies aufgekauft) Third Generation Helicos 2008 Pacific Biosciences 2011 Ion Torrent (von Life Technologies aufgekauft) Nanopore Sequencing (Roche & IBM)

98 Entwicklung der Sequenzierkosten

99 Sequenzierung eines Humanen Genoms 2001: Human Genome Project 2.7G$, 11 Jahre Log 10 (Kosten) : Celera 100M$, 3 Jahre 2007: 454 1M$, 3 Monate : SOLiD / Life 60K$, 2 Wochen 2009: Illumina, Helicos 40-50k$ 2010: Complete Genomics. 5k$, 1 W. 2014: 100$, <24 h? 2010 Jahr

100 Begriffe Library Pool von DNA Fragmenten, der aus einer Probe nach einem bestimmten Protokoll generiert wurde Run Sequenzierlauf mit einer oder mehreren Libraries Read Eine DNA-Sequenz, die in einem Run generiert wird (eine von sehr vielen, siehe Ausbeute) Read Länge Länge eines Reads (in basepairs [bp] angegeben) Ausbeute Gesamtanzahl der bp, die in einem Run generiert wird (in Gbp) errechnet sich aus Anzahl der Reads * der durchschnittlichen Read Länge

101 Zweite Generation: 454 / Roche Library Generierung mit emulsion PCR Erzeugung der Reads über pyrosequencing Read Länge ~750bp Ausbeute ~1 Gbp An sich geringe Fehlerrate, aber Probleme bei Homopolymer Abschnitten: z.b.: AAAAAAAAAA -> eff. Fehlerrate ~1% Margulies M, et al., Nature. 2005;437(7057): Mardis ER. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2008;9:

102 Zweite Generation: 454 Pyrosequencing Während der DNA Synthese wird ein dntp an das 3 Ende des DNA Stranges angehängt. Die beiden Phosphatgruppen am Ende des dntp werden als Pyrophosphat (PPi) freigegeben. ATP sulfurylase erzeugt über PPi und Adenosine 5 -phosphosulfat ATP. Das Enzym Luciferase erzeugt das Leuchten der Glühwürmchen. Luciferin und ATP sind die Substrate, es werden dabei Luciferin zu Oxyluciferin unter der Abgabe von sichtbaren Licht konvertiert. Nach Ende der Reaktion wird Apyrase hinzugefügt, um die überschüssigen dntps zu zerstören

103 Zweite Generation: Solexa / Illumina Library Generierung mit bridge PCR Erzeugung der Reads mit Polymerase und reversible terminators Read Länge ~50-250bps Ausbeute ~600 Gbps Etwas höhere Fehlerrate als 454 Bentley DR, et al. Nature. 2008;456(7218): Mardis ER. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2008;9:

104 Zweite Generation: Solexa / Illumina

105 Zweite Generation: Solid / Life Technologies Library Generierung wie bei 454 Read Länge ~100 bp Ausbeute ~100 Gbp Geringe Fehlerrate Complementary strand elongation mit Ligase und speziellen 8-mer probes Jede Position wird 5-mal gelesen Ausgabe der Sequenz im Colorspace, daher sehr empfindlich auf Fehler einer einzelnen Base die gesamte nachfolgende Sequenz ändert sich Shendure J, et al., Science 309 (2005) Mardis ER. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2008;9:

106 Zweite Generation: SOLiD / Life Technologies

107 Zweite Generation: SOLiD / Life Technologies

108 Dritte Generation: Helicos Single molecule sequencing, keine Amplifizierung notwendig Ligation eines poly-a zur Fixierung auf einem Array Read Länge: ~ 50bp Ausbeute: 25 Gbp Lipson D, et al., Nat Biotechnol. 2009;27(7):

109 Dritte Generation: Pacific Biosciences Single molecule sequencing, keine Amplifizierung notwendig Realtime sequencing, Basenabfolge kann direkt abgelesen werden Die Geschwindigkeit der Polymerase kann gemessen werden Methylierung einer Base kann detektiert werden Eid J, et al. Science. 2009;323(5910):

110 Dritte Generation: Pacific Biosciences Circular Sequencing, die DNA Sequenz wird mehrfach gelesen um eine höhere Genauigkeit zu erreichen Read Länge: bis zu 25kps, Ø 3kbp, Ausbeute 0,2 Gbp, 15% Fehler (Insertionen und Deletionen), Laufzeit: ~1h

111 Dritte Generation: Pacific Biosciences

112 Dritte Generation: Ion Torrent ph sensing Library Generierung wie bei Roche 454 Read Länge: ~100bp, Ausbeute 1 Gbp, Laufzeit: ~2h ( 318 chip) Fehlerrate: ~1% (Homopolymers) Rothberg JM, et al. Nature 2011;475(7356):

113 Dritte Generation: Ion Torrent / Life Techn Ablauf wie bei 454 in Zyklen: Nukleotide werden in definierter Abfolge eingebracht und die ph Wert Änderung pro Well gemessen Welldichte (Anzahl Wells pro Chip) definiert die Ausbeute

114 Vierte Generation: Nanopore DNA Strang läuft durch eine Pore Die Spannungsänderung pro Nukleotid / Nukleotidpaar wird gemessen Anzahl der Poren definiert die Ausbeute Readlänge & Ausbeute noch unbekannt Fehlerrate noch unbekannt Clarke J, et al. Nat Nanotechnol. 2009;4(4):

115 Eckdaten der Technologien Hersteller Sanger / ABI Generierung der Library PCR, Clonal amplification 454 / Roche Emulsion PCR Solexa / Ilumina Bridge PCR Generierung der Reads Polymerase (Dideoxy sequen.) Polymerase (pyrosequencing) Polymerase (reversible termin.) Kosten pro Mb ($) Gerätekosten (k$) Read Länge (bp) Ausbeute (Gbp) Fehler rate (%) Lauf -zeit (d) ~5000 ~ , ,01 ~ ,5 ~ bis zu > SOLiD / Life Technologies Helicos Pacific Biosciences Ion Torrent / Life Techn. Emulsion PCR Single Molecule Single Molecule Emulsion PCR Ligase (octamers 2 base encoding) Polymerase (asyn. extensions) ~ bis zu 100 ~ bis zu 55 Polymerase ~1 625 bis zu Polymerase (ph sensing) 155 > ~25 ~4 2 0,2 ~15 0,05 ~1 50/200 > Adapted from Glenn TC. Molecular Ecology Resources 2011;11(5):

116 Next Generation Sequencing Details zur Biochemie unter

117 Bioinformatik: Next Generation Sequencing: Sequenz Assembly und Annotation Gerhard Thallinger Institut für Genomik und Bioinformatik, TU Graz

118 NGS Anwendungen Genom Sequenzierung Genom Re-Sequenzierung Transkriptom Sequenzierung (EST Sequenzierung) SNP Analyse Gen-Expressionsanalyse (RNA-seq) microrna Profiling Bestimmung der Transcription start site (TSS) Analyse der Transkriptionsdynamik (global run-on sequencing, GROseq) Transkriptionsfaktor Analyse (ChIP-seq) Globale Enhancer Aktivität (STARR-seq) Nukleosome Positionierung Methylierungsanalyse Microbiome Analyse Metagenome Analyse

119 Genom Sequenzierung: Ablauf Sequenzierung -> Rohdaten De novo Assemblierung -> Contigs / Scaffolds Finishing -> Genomsequenz (1 oder mehrere Chromosomen, Plasmide, Mitochondrium) Annotation -> annotiertes Genom (GBFF oder EMBL File) Einreichen (EMBL Nucleotide, GenBank oder DDBJ)

120 Anwendung: Genome Sequenzierung TG..GT TC..CC AC..GC CG..CA TT..TC AC..GC GA..GC TG..AC CT..TG GT..GC AC..GC AC..GC AA..GC AT..AT TT..CC Genome Kurze DNA Fragmente Kurze DNA Sequenzen de novo Assembly ACGTGGTAA CGTATACAC TAGGCCATA GTAATGGCG CACCCTTAG TGGCGTATA CATA ACGTGGTAATGGCGTATACACCCTTAGGCCATA ACGTGACCGGTACTGGTAACGTACA CCTACGTGACCGGTACTGGTAACGT ACGCCTACGTGACCGGTACTGGTAA CGTATACACGTGACCGGTACTGGTA ACGTACACCTACGTGACCGGTACTG GTAACGTACGCCTACGTGACCGGTA CTGGTAACGTATACCTCT... Genomsequenz

121 Anwendung: Genome Sequenzierung Contig: Ein contig ist eine zusammenhängender Abschnitt einer genomischen Sequenz, die aus überlappenden Reads gebildet wird. Paired-end (mate-pair) reads: Read Paar mit einem definierten Abstand auf dem Genom Scaffold: Ein Scaffold besteht aus Contigs und Gaps. Die Gap Länge kann aus paired-end bzw. matepair Information abgeschätzt werden. Green 2001, Nature Reviews Genetics 2:

122 Genome Assemblierung Relativ einfach in einer perfekten Welt Ohne Sequenzierfehler Ohne Repeats Mit uniformer Abdeckung (Coverage) Assemblierung mit O(n²) Aufwand (n=anzahl der Reads) In der Realität Chimerische Sequenzen aufgrund der PCR Verschiedenartige Sequenzierfehler (Fehler in der Länge von Homopolymerabschnitten, Indels, fehlerhafte Basen) Repeats unterschiedlicher Länge Genomeabschnitte ohne (mit geringer) Abdeckung

123 Genome Assemblierung Grundprinzip: Kombiniere alle Reads basierend auf Sequenzähnlichkeit in Es wird angenommen, dass überlappende Reads aus dem selben Bereich im Genom kommen Contigs müssen nachbearbeitet werden (Finishing): Assembler erzeugen i.a. zu viele Contigs. Finishing nimmt die Contigs als Basis um eine vollständige Genomsequenz zu bilden. Scaffolder reihen Contigs in Scaffolds basierend auf der paired-end / mate-pair Information. Jeder Scaffold enthält Gaps, die sich aufgrund der Reihenfolge der Contigs ergeben. Sequenzgaps sind Gaps zwischen Contigs im selben Scaffold. Physische Gaps sind Gaps zwischen Scaffolds (entstehen aufgrund ungenügender / fehlender paired-end / mate-pair Sequenzen)

124 Assemblierung: Algorithmen Contig Bildung: Greedy Algorithmus Finde den kürzesten gemeinsamen Superstring einer Menge an Read Ausgehend von den Reads {s 1, s 2, } finde den kürzesten String T, so dass jeder Read s i ein Teilstring von T ist. Die Lösung dieses Problems ist sehr zeitaufwändig (NP-hard) aber kann durch einen Greedy Algorithmus effizient angenähert werden. Greedy Algorithmen wurden erfolgreich für das Assembly von Bakterien und einzelligen Eukaryonten eingesetzt Limitierung: realtiv langsam für grosse Anzahl von Reads Verwendet von phrap, TIGR, CAP3 für Sanger-Daten, SSAKE, VCAKE, SHARCGS für NGS-Daten

125 Assemblierung: Algorithmen Contig Bildung: Overlap-layout-consensus Der Algorithmus basiert auf Graphentheorie Es wird ein Graph konstruiert dessen Knoten den Reads entsprechen Kanten überlappende Reads entsprechen Ein Contig ist dann ein einfacher Pfad im Graphen Ein einfacher Pfad ist ein Pfad durch den Graphen, der einen Knoten maximal einmal enthält Der Assembler konstruiert den Graphen Output ist eine Menge von sich nicht schneidenden einfachen Pfaden, wobei jeder Pfad einem Contig entspricht. Verwendet von Arachne, Celera Assembler, newbler, Minimus, Edena

126 Assemblierung: Algorithmen Contig Bildung: Eulersche Pfade / De Bruijn graph Der Algorithmus basiert ebenfalls auf Graphentheorie Eulscher Pfad: Ein Pfad, der alle Kanten eines Graphen besucht Reads werden in überlappende k-mers aufgespalten. Der De Bruijn Graph eines of eines Assemblies hat als Knoten alle eindeutigen k 1 mers Eine Kante wird dann gebildet, wenn es eine Überlappung zwischen dem k-1 Prefix eines k-mers und dem k-1 Suffix des k- mers gibt Das zugrundeliegende Problem wird nun reduziert auf das Finden eines Pfades, der alle Kanten im Graphen besucht. Der Ansatz mit Eulerschen Pfaden ist effizienter, in der Praxis sind die beiden Ansätze aber ungefähr gleich schnell. Verwendet von Euler, Velvet, Allpath, ABySS

127 Assemblierung: Algorithmen Contig Bildung: Eulersche Pfade / De Bruijn graph

128 Assemblierung: Repeat Behandlung Assembler sollten Repeat schon während des Assemblierungsprozesses erkennen Damit wird eine falsche Rekonstruktion des Genoms vermieden Assembler sollten so viele Repeats wie möglich auflösen. Damit können arbeitsintensive Nacharbeiten im Labor vermieden werden (PCR, weitere Sequenzierungsläufe)

129 Assemblierung: Repeat Behandlung Repeat Erkennung Annahme: Reads sind gleichförmig und zufällig verteilt Basierend auf dieser Annahme, können Repeats als Bereiche mit wesentlich höherer Coverage identifiziert werden. Leider ist diese Annahme of nicht erfüllt (abhängig von der Sequenziertechnologie, dem GC-Gehalt des Genoms, ) Repeats können auch über komplexen Teilgraphen des De Bruijn graph erkannt werden Paired-end bzw. mate-pair Information kann ebenfalls zur Repeat Identifikation verwendet werden (z.b. über Read-Paare die einen zu großen oder zu geringen Abstand haben) Geringe Unterschiede in der Repeatsequenz können zur korrekten Einbindung in die Genomsequenz verwendet werden

130 Assemblierung: Scaffolding Scaffolding ist der Prozess Contigs in Untermengen mit bekannter Reihenfolge und Orientierung zu bringen. Knoten sind Contigs Eine gerichtete Kante zwischen 2 Contigs wird dann eingeführt, wenn ein Read-Paar den dazwischenliegenden Gap überbrückt

131 Assemblierung: Scaffolding Probleme beim Scaffolding: Alle verbundenen Komponenten zu finden Eine konsistente Orientierung für alle Contigs im Graphen zu finden. Fehlerhafte Read-Paare (spurious links zwischen Contigs) Große Streuung bei der Insert-Länge (Abstand des Read-Paars) Genomsequenzen von engverwandten Species können für das Scaffolding verwendet werden (Achtung: Rearrangements) Programme: Bambus, SSPACE Newbler, Mira, Velvet (im Assembler integriert)

132 Genom Sequenzierung: Finishing Scaffold Reihenfolge / Orientierung: PCR Primer Design für die Enden aller Scaffolds (forward & reverse) PCR aller Primer Kombinationen PCR Reaktionen mit Amplikon -> Scaffolds an die die Primer binden sind benachbart Scaffold Reihenfolge / Orientierung: Optical Mapping DNA mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdauen Bestimmung der Fragmentlänge mit Hilfe eines optischen Verfahrens In silico Verdau der unterschiedlichen Genomvarianten und Vergleich der Längen

133 Genom Sequenzierung: Finishing Gap closing: PCR Primer Design für die Enden der benachbarten Contigs PCR -> Amplikon (weil benachbart im Scaffold) Sanger Sequenzierung der Amplikons und Integration der Sequenz in das Genom Gap closing: in silico gap closing Verwendung der paired-end Reads Contigs in die Sequenz integrieren

134 Assemblierung: Abschätzung der Qualität Anzahl und Größe der Contigs Annahme: wenige große Contigs sind besser als viele kleine N50 Wert wird als Masszahl verwendet: Entspricht der Länge des kleinsten Contigs in einem Set der größten Contigs, deren zusammengerechnete Länge mindestens 50% des Assemblies beträgt Maximale und durchschnittliche Länge eines Contigs Anzahl der Scaffolds und Anzahl der Contigs im Scaffold Annahme: wenige Scaffold mit einer großen Anzahl von Contigs sind besser als viele mit wenigen Eine natürliche Untergrenze für die Anzahl der Scaffolds ist die Anzahl der Chromosomen S50 Wert wird als Masszahl verwendet (analog zu N50) Maximale und durchschnittliche Länge eines Scaffolds

135 Assemblierung: Abschätzung der Qualität Sequenzqualität Phred quality score (Q) ist das negative Verhältnis der Wahrscheinlichkeit einer fehlerhaften Base (P) bezogen auf die Referenz in Dezibel (db): Q = -10 log 10 P Relative Anzahl der fehlerhaften Basen Q30.. ~ eine fehlerhafte Base in 1000 Q60.. ~ eine fehlerhafte Base in

136 Genom Sequenzierung: Annotation Von der Sequenz. zur Liste von annotierten Genen

137 Genom Sequenzierung: Annotation Identifikation von funktionellen Sequenzabschnitten Genen Protein kodierende Gene nicht protein kodierende Gene, z.b. ncrnas (rrna, trna, mirnas, ) Funktionszuweisung der Proteine Identifikation von Transcription Start Sites und Bindestellen für Transkriptionsfaktoren

138 Gen Identifizierung: Terminologie Gen: "a locatable region of genomic sequence, corresponding to a unit of inheritance, which is associated with regulatory regions, transcribed regions, and or other functional sequence regions ". Pearson H. Nature 2006; 441(7092): Operon: Gruppe von Genen, die gemeinsam transkribiert werden (in Prokaryonten) 138

139 Gen Identifizierung: Terminologie Eine Abfolge von DNA Nukleotiden, die ein Gen enthält, hat unterschiedliche Regionen: Exons kodierende Regionen Introns nicht kodierende Regionen innerhalb eines Gens Getrennt durch funktionelle Sites (boxes) Start- (S) und Stopkodons (T) Splice sites Acceptors (A) und Donors (D)

140 Gen Identifizierung: Probleme Es muss mit dem korrekten Reading Frame begonnen werden Ein Intron kann ein Exon mitten in einem Kodon unterbrechen Es gibt keine schnelle und eindeutige Regel für die Identifizierung der Donor- und Acceptor Spliceposition Signale sind sehr schwach

141 HMM Gene Finders: AUGUSTUS Basiert auf einem generalisiertem HMM Kann Zusatzinformationen (z.b. Lage einzelner Exons) integrieren Kann cdna Alignments (ESTs) zur Verbesserung des Ergebnisses verwenden Stanke M, et al. Bioinformatics. 2008;24(5): Stanke M & Waack S. Bioinformatics. 2003;19(2):ii215-ii

142 HMM Gene Finders: GlimmerHMM Basiert auf einem generalisierten HMM Zusätzlich werden Splice site Modelle verwendet, die aus GeneSplicer adaptiert wurden Nutzt einen Decision tree aus GlimmerM und interpolierte Markov Modelle für die kodierenden und nicht kodierenden Sequenzabschnitte. Majoros WH, et al. Bioinformatics. 2004;20(16):

143 Gene Finders: Vergleich Gene Finder Vergleich anhand P. aroginosa. LESB58 Prodigal liefert das beste Ergebnis bei diesem GC-reichen Genom Glimmer sagt längere Gene voraus Homologie-basierende Methoden (Rast) liefern schlechte Ergebnisse AMIGene findet neue Gene durch die Analyse der Codon usage Die beste Strategie ist die Verwendung einer Kombination von Gene Findern, gefolgt von einer evidenzbasierten manuellen Überarbeitung

144 Identifikation von ncrnas: rrnas In Prokaryonten: 5S rrna (~120nt), 16S rrna (~1500nt), 23S rrna (~2900nt) Die DNA Sequenz ist stark konserviert Identifikation über Homologie RNAmmer ( RDP (( NAST ( Infernal (

145 Identifikation von ncrnas: trnas Zwischen 1 und 6 verschiedene trnas für jede Aminosäure Sehr kurz (74 95nt) Die DNA Sequenz ist sehr schwach konserviert, die Sekundärstruktur sehr stark Identikation über Modelle der Sekundärstruktur. RNAmmer ( trnascan-se (

146 Funktionsannotation Zuweisung über Homologie Suche nach bereits annotierten Proteinen mit ähnlicher Sequenz Übernahme der Annotation Funktion (Bezeichnung) Gene Ontologie (GO) Annotation Clusters of Orthologous Genes (COG) Zuordnung Enzymklasse Zuordnung zum Stoffwechselpfad

147 Funktionsannotation: Web Resources BaSys ( RAST ( IMG/ER ( JCVI (

148 Bioinformatik: Prädiktive Methoden basierend auf DNA und Protein Sequenzen Gerhard Thallinger Institut für Genomik und Bioinformatik, TU Graz

149 Umsetzung der genetischen Information Gen Funktion

150 Prädiktive Methoden Problem: Neue DNA oder Proteinsequenz, aber keine Information über die Funktion Idee: Vorhersage der Funktion über die Ähnlichkeit der Sequenz zu bereits bekannten, annotierten Sequenzen Neues Problem: Wie finde ich Sequenzen, die zur unbekannten Sequenz ähnlich sind

151 Protein Sequenz Analyse Protein Sequence Comparative Methods Predictive Methods Homology Profile Physical Structural Searches Analysis Properties Properties Gemeinsame Vorgänger (Vorfahren)? Ähnliche Funktion? Homologie auf Domain oder Sequenzebene?

152 BLAST BLAST Basic Local Alignment Search Tool Suche nach homologen Sequenzen durch Ausrichtung einer Sequenz zu einer anderen mit dem Ziel die größtmögliche Überdeckung zu erreichen Local bedeutet, dass Teile (Segmente) der Sequenz ausgerichtet werden und nicht die gesamte Sequenz (global) Erste Version von Altschul et al Weitere Version von Gish et al

153 BLAST Ablauf Sequenzen werden in Words gesplittet Seeds: identische Words in Query and Subject Suche nach high-scoring segment pairs (HSPs) Paare von Sequenzsegmenten die aligned (ausgerichtet) werden können Ausgehend von den Seeds wird das Alignment erweitert Die Segmentpaare haben nach dem Alignment den maximal erreichbaren Score (der Score kann durch Hinzufügen oder Weglassen von Teilen der Sequenz nicht mehr verbessert werden) Der Score muss über dem angegebenen Limit S liegen Zwei Versionen gapped (2.0) oder ungapped (1.4) Der Algorithmus beruht auf Dynamischer Programmierung mit einer Komplexität von O(n²), wobei n die Länge der längeren Sequenz ist

154 BLAST Ressourcen BLAST Web Service Kommandozeile blastall -p progname -d -db -i query > outfile Tutorial

155 Arten der BLAST Suche: DNA vs. DNA GCNTACACGTCACCATCTGTGCCACCACNCATGTCTCTAGTGATCCCTCATAAGTTCCAACAAAGTTTGC GCCTACACACCGCCAGTTGTG-TTCCTGCTATGTCTCTAGTGATCCCTGAAAAGTTCCAGCGTATTTTGC GAGTACTCAACACCAACATTGATGGGCAATGGAAAATAGCCTTCGCCATCACACCATTAAGGGTGA---- GAATACTCAACAGCAACATCAACGGGCAGCAGAAAATAGGCTTTGCCATCACTGCCATTAAGGATGTGGG TGTTGAGGAAAGCAGACATTGACCTCACCGAGAGGGCAGGCGAGCTCAGGTA TTGACAGTACACTCATAGTGTTGAGGAAAGCTGACGTTGACCTCACCAAGTGGGCAGGAGAACTCACTGA GGATGAGGTGGAGCATATGATCACCATCATACAGAACTCAC CAAGATTCCAGACTGGTTCTTG GGATGAGATGGAACGTGTGATGACCATTATGCAGAATCCATGCCAGTACAAGATCCCAGACTGGTTCTTG

156 Arten der BLAST Suche: Protein vs. Protein

157 DNA translated vs. Protein

158 DNA translated vs. DNA translated

159 BLAST Versionen Programm Query Sequenz Subject Sequenz BLASTN Nucleotide Nucleotide BLASTP Protein Protein BLASTX Nucleotide, six-frame translation Protein TBLASTN Protein Nucleotide, six-frame translation TBLASTX Nucleotide, six-frame translation Nucleotide, six-frame translation

160 BLAST Vorraussetzungen Eine query Sequenz, im FASTA Format Auswahl der BLAST Version Auswahl der Datenbank in der gesucht werden soll Festlegung der Suchparameter

161 BLAST: Aufbau der Suche paste your sequence here choose database specify search region nr ~ non-redundant database Others are subsets of nr database

162 BLAST: Optionen Beispiel: protease NOT hiv1[organism] Einschränkung der Suche auf einen Organismus Lower EXPECT thresholds are more stringent. The smaller the word size, the higher the sensitivity

163 BLAST: Filter Low-complexity: Einige Sequenzsegmente sind biologisch weniger interessant (z.b., Treffer in säure-, basen- oder Proline-reichen Regionen) die über die SEG bzw. DUST Programme identifiziert werden. Solche Segmente werden von der Suche ausgeschlossen. Human repeats: Mit dieser Option werden Repeats (LINE's und SINE's) im humanen Genom ausgeschlossen. Damit kann die Suchgeschwindigkeit wesentlich erhöht werden (besonders bei langen Sequenzen (>100 kb)). Mask for lookup table only: BLAST Suchen bestehen aus zwei Phasen: 1) Suche nach Hits mit Hilfe einer Tabelle und 2) Erweiterung der Hits. Mit dieser Option werden die ausgewählten Filter nur in der ersten Phase angewendet. Mask Lower Case: Sequenzen in Kleinbuchstaben werden nicht berücksichtigt. Damit können Filterregionen durch den Benutzer festgelegt werden

164 BLAST: Interpretation der Resultate query Sequenz BLAST Hits. Durch Klicken auf eine Zeile gelangt man zum paarweisen Alignment. Dieses Bild zeigt die Verteilung der BLAST Hits für die query Sequenz. Jede Zeile entspricht einem Hit. Der Bereich, den eine Linie überdeckt, repräsentiert die Region, wo eine Sequenzähnlichkeit gefunden wurde. Die verschiedenen Farben entsprechen Bereichen verschiedener BLAST- Scores (Bit scores)

165 BLAST: Interpretation der Resultate Die Beschreibungs- bzw. (Definitions-) Zeilen werden under der Überschrift "Sequences producing significant alignments angezeigt. "significant" bezieht sich auf alle Hits deren E-value geringer als das gewählte Limit ist. Das bedeutet jedoch keine biologische Signifikanz. Gene/Sequence Definition Expect value je kleiner desto besser. Representiert die Wahrscheinlichkeit eines zufälligen Hits ID (GI #, refseq #, DB-specific ID #) Über diesen Link gelangt man zur GenBank Bit score je höher desto besser. Über diesen Link gelangt man zum paarweisen Alignment Links

166 BLAST Resultat: Paarweises Alignment Query: Das Segment aus der query Sequenz. Subjct: Das Segment aus der hit (subject) Sequenz aus der Datenbank. Zwischenzeile: consensus Basen

167 BLAST Demo

168 Substitutions Matrizen Was ist eine Substitutionsmatrix? Eine 2-dimensionale Matrix mit den 4 Nukleotiden als Indices Werte in einer Zelle beinhalten den Score für den Austausch eines Nukleotids in der Query Sequenz um das Nukleotid an der selben Position in der Subject Sequenz zu erhalten Warum wird eine Substitutionsmatrix verwendet? Um die Wahrscheinlichkeit der Homologie zwischen zwei Sequenzen festzustellen. Substitutionen, die wahrscheinlicher sind, sollten einen höheren Score bekommen Substitutionen, die weniger wahrscheinlich sind, sollten einen geringeren Score bekommen

169 Substitutions Matrizen Wie sieht eine Substitutions-Matrix aus? A G C T A G C T

170 Beispiel anhand der Identity Matrix A G C T A G C T CAGGTAGCAAGCTTGCATGTCA raw score = 19 CACGTAGCAAGCTTG-GTGTCA

171 Beispiel anhand einer realistischeren Matrix A G C T A G C T CAGGTAGCAAGCTTGCATGTCA raw score = 19-9 = 10 CACGTAGCAAGCTTG-GTGTCA

172 Substitutions Matrizen Nukleotid Substitutions Matrizen, die bei Auswahl eines bestimmten Prozentsatzes der Sequenzähnlichkeit verwendet werden: % Sequenzidentität Match/Mismatch 99% 1/-3 98% 2/-5 95% 1/-2 90% 2/-3 85% 3/-4 80% 4/-5 75% 1/-1 70% 11/-10 65% 5/-4 60% 7/-5 50% 3/

173 Scoring Matrizen Matrix von Log-odds Werten, wo jede Zelle den Logarithmus des Wahrscheinlichkeitratios angibt, dass die betreffenden AA i durch die AA j substituiert bzw. aligned wird. Sij log beobachtete Anzahl Häufigkeit der AA von Substitutionen AAi nach AAj j Sie sind ein empirisches Schema zur Gewichtung eines Alignments mit Berücksichtigung der Biologie Cys/Pro sind wichtig für die Struktur und Funktion Trp hat große Seitenketten Lys/Arg haben positiv geladene Seitenketten

174 Scoring Matrizen Es ist wichtig, die Scoring Matrizen zu verstehen Sie werden in allen Analysen zum Sequenzvergleich verwendet Sie repräsentieren implizit eine gewissen Ansatz der Evolutionstheorie Die Wahl der Matrix beeinflusst das Resultat stark Score des Alignments = Summe der log-odds Werte aller AA Paare im Alignment

175 Struktur einer Scoring Matrix

176 PAM Matrizen Margaret Dayhoff, 1978 Point Accepted Mutation (PAM) Untersuchung der Substitutionsmuster in verwandten Proteinen (~1500 Proteine aus 71 Familien) Eine Mutation gilt als akzeptiert, wenn die Funktion der Seitenkette erhalten bleibt ( acceptance ) 1 PAM entspricht durchschnittlich der Änderung von einer Aminosäure pro 100 Residuen 1 PAM ~ 1% Sequenzunterschied Für Proteine mit größerem evolutionärem Abstand ist es notwendig, die Muster zu extrapolieren PAMx = PAM1 x Dayhoff MO, Schwartz RM, Orcutt BC. A Model of Evolutionary Change in Proteins. In: Atlas of Protein Sequence and Structure. National Biomedical Research Fundation. 1978;

177 PAM Matrizen Annahmen Die AA Substitution ist unabhängig von den benachbarten Residuen Die Wahrscheinlichkeit einer Mutation ist für alle Positionen in der Sequenz gleich Die Sequenzen, die verglichen wurden, repräsentieren die durchschnittliche Verteilung der AA Fehlerquellen Kleine, globuläre Proteine wurden zur Ableitung der Matrizen verwendet (Abweichung von der Annahme einer durchschnittlichen AA Verteilung) Fehler in PAM 1 werden vergrößern sich bis PAM 250 Konservierte Blöcke und Muster werden nicht berücksichtigt

178 BLOSUM Matrizen Henikoff und Henikoff, 1992 Blocks Substitution Matrix (BLOSUM) Es werden nur Unterschiede in konservierten Regionen (ohne Gaps) einer Proteinfamilie betrachtet. Sensitiver auf strukturelle oder funktionelle Substitutionen BLOSUM n Sequenzen mit > n% Identität werden mit 1 gewichtet Die Substitutionhäufigkeiten werden stärker von Sequenzen beeinflusst, die mehr als dieser Prozentsatz von einander abweichen Clustering reduziert den Beitrag von sehr ähnlichen Sequenzen Wahl einer Matrix mit kleinerem n liefert Sequenzen, die evolutionär weiter entfernt sind Henikoff S, Henikoff JG. Amino acid substitution matrices from protein blocks. PNAS. 1992;89(22):