Praktikumsskript, Febr. 2015, sowie März 2015 Inst. für Pathophysiologie

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1 Praktikumsskript, Febr. 2015, sowie März 2015 Inst. für Pathophysiologie 1. Ableitung spannungsgesteuerter Na + -Ströme mittels whole cell recording 1.1 Spannungsgesteuerte Na + -Kanäle Im menschlichen Genom gibt es 9 Gene, die für spannungsgesteuerte Na + - Kanalproteine, Na v 1.1 bis Na v 1.9. (Abb. 1) kodieren. Davon werden 7 im Nervensystem exprimiert, unter Anderem der Na v 1.2. Na-Kanäle sind für den schnellen Na + - Einstrom und den Aufstrich der Aktionspotenziale aller erregbaren Zellen notwendig. Spannungsgesteuerte Ionenkanäle lassen sind im homologen Gewebe (Nervenzellen) oder in Testzellen untersuchen. Letztere müssen vorher mit entsprechender Fremd- DNA transfiziert werden. Testzellen vom Typ HEK-239 wurden mit der cdna kodierend für den neuronalen Na + -Kanal der Ratte (Na v 1.2) transfiziert und über längere Zeit kultiviert. Der Kanal wird stabil exprimiert. Abb. 1: Membranfaltungsdiagramm des Na v 1.2 mit 4 Domänen der -Untereinheit sowie der 1 -Untereinheit. Die -Untereinheit besteht bei Mensch und Ratte aus 2005 Aminosäuren (228 kda). Die S4-Segmente tragen positive Ladungen (Arginine), welche den Spannungssensor des Kanals ausmachen. Mutationen, die zu Aminosäure-Austauschen führen (rote Kreise) verursachen eine frühkindliche Form der Epilepsie mit Fieber. Nach Berkovic et al., Ann Neurol, 55: , R-Arginin, Q-Glutamin, L,- Leucin, V-Valin, I-Isoleucin, F-Phenylalanin. 1

2 Alternativ zu den transfizierten HEK-293 Zellen können Nervenzellen verwendet werden. Ihre Isolierung und Kultivierung ist jedoch nicht einfach und auch die Ableitung von Ionenströmen ist aufgrund der Zell-Morphologie problematisch. Daher sucht man für verschiedene Fragestellungen nach Modellsystemen. Ein geeignetes Modellsystem, um grundsätzliche Eigenschaften von Neuronen zu analysieren, sind Neuroblastomzellen. Neuroblastomzellen leiten sich von Tumorzellen ab und sind in Form von Zelllinien unbegrenzt in Kultur vermehrbar. Einige Neuroblastomzellen lassen sich mittels Veränderungen des Kulturmediums oder dem Zusatz von Chemikalien zur Differenzierung bringen. Sie entwickeln sich dann innerhalb einiger Tage zu einem Neuronen-ähnlichen Phänotyp. Die in der Literatur gut beschriebene Zelllinie neuro-2a (LePage et al., Crit Rev Neurobiol. 17:27-50, 2005) erfüllt die genannten Bedingungen und dient uns als alternatives Modell zu den HEK-Zellen. 1.2 Ableitung in der whole-cell Konfiguration Na + -Ströme können mittels whole cell recording von HEK-293 Zellen (und alternativ dazu von Neuroblastomzellen neuro-2a) abgeleitet werden. Dazu wird eine mit Elektrolytlösung (interne Lösung) gefüllte Glaskapillare (Elektrode, Spitzendurchmesser, ca. 1 µm) in Kontakt mit einer einzelnen HEK-Zelle gebracht und der Ganzzellmodus (whole cell) hergestellt (Abb. 2). 2

3 Elektrode vorsichtig nähern leichtes Ansaugen cell-attached Modus CsC Vorgabe der Spannung und Ableitung der Ströme NaCl kräftiges Ansaugen: whole-cell Modus möglich Abb. 2: Vorgehensweise zur Ableitung von Na + -Strömen. Die Glaskapillare (Elektrode) wird mit gepufferter CsCl-Lösung gefüllt (s.u. interne Lösung). Die Elektrode wird der Zelle genähert und der cell-attached Modus hergestellt. Durch einen kurzen, kräftigen Unterdruck gelingt es hin und wieder, die unter der Kapillare befindliche Membran zu durchbrechen, ohne die Verbindung von Zelle zu Kapillare zu beschädigen. In dieser Situation sollte ein Haltepotenzial von ca. 80 mv eingestellt werden. Das Zellinnere füllt sich rasch mit CsCl. Durch Applikation von Spannungspulsen können nun Einströme durch Na + -Kanäle der Zellmembran gemessen werden. Sie betragen erfahrungsgemäß 2 bis maximal 10 na. Gewisse Leckströme (roter Doppelpfeil) lassen sich bei den Messungen nicht vermeiden. Mittels Testpulsen, in der Regel 10 ms-lange Rechteckpulse von 10 mv lassen sich die verschiedenen in Abb. 3 dargestellten Konfigurationen kontrollieren. Durch einen repetitiven Spannungspuls (Rechteckpuls, 10 mv) kann man den Elektrodenwiderstand der Patchpipette bestimmen. Er sollte im Bereich von 1-3 Megaohm liegen. 3

4 Versuchen Sie, die Glaselektrode mittels Mikromanipulator an eine Zelle heranzuführen und durch leichtes Ansaugen einen Gigaseal herzustellen. In dieser Situation lassen sich die Zellen meistens vom Schalenboden ablösen. Stellen Sie durch einen kurzen abrupten Unterdruck die whole cell Konfiguration her. In dieser Situation lassen sich die Zellen ebenfalls meistens vom Schalenboden ablösen, ohne die Konfiguration zu zerstören. Wenden Sie die voreingestellten Spannungspulsprogramme an 1. Variation des Testpotenzials 2. Variation des Präpotenzials 1.3 Fragen Wieso kommt es bei Erhöhung der Spannungspulse (Testpotenziale) im Bereich von - 50 mv bis -10 mv zunächst zur Vergrößerung der Stromamplitude und bei weiterer Erhöhung im Bereich von -10 bis +50 mv zur Verminderung/Auslöschung der Ströme? Wie lässt es sich erklären, dass mit steigendem Präpotenzial bei konstanten Testpulsen die Stromamplitude immer weiter abnimmt? Worin liegt die biologische Bedeutung des Effekts? 1.4. Zusammensetzungen der verwendeten Lösungen externe Lösung (in mm): 140 NaCl, 3,5 KCl, 1,0 CaCl 2, 1,0 MgCl 2, 5 HEPES-NaOH, ph 7.4. interne Lösung (für Glaselektrode, in mm): 140 CsCl, 1,4 MgCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES-CsOH, ph

5 2. Kalziumtransienten in Neuroblastomzellen, HEK-293 Zellen und/oder isolierten Skelettmuskelfasern 2.1 Kaliuminduzierte Kalziumtransienten Fura-2 ist ein kalziumsensitiver Fluoreszenzfarbstoff, der mit Ca 2+ -Ionen Chelatkomplexe bildet und als Indikator für die intrazelluläre Kalziumkonzentration dient. Wenn Ca 2+ an Fura-2 gebunden ist, so lässt sich das Molekül mit einer Wellenlänge von 340 nm anregen. Kalziumfreies Fura-2 hat hingegen eine optimale Anregungswellenlänge von 380 nm. Mit Hilfe des Verhältnisses (Ratio) der Fluoreszenzantworten nach Anregung mit 340 bzw. 380 nm lassen sich Änderungen des intrazellulären Kalziumspiegels in einzelnen Zellen detektieren (ratiometrische Messung). Applikation von Kaliumchlorid an die Zellmembran führt zu einer Depolarisation der Membran (vergleiche: Gleichgewichtspotenzial von K + vor und während Applikation von KCl) und triggert die Kalziumfreisetzung aus dem sarkoplasmatischen bzw. endoplasmatischen Retikulum, die als sogenannte Kalziumtransienten (Abb. 3) detektierbar sind. 1,05 1,00 Fluorescence 340/380 0,95 0,90 0,85 0,80 0, t (ms) Abb. 3: Kaliuminduzierter Kalziumtransient einer isolierten Skelettmuskelfaser der Maus. Aufgetragen ist der Quotient der Fluoreszenzintensität nach Anregung mit UV-Licht der Wellenlängen 340 und 380 nm. Zugabe von KCl nach 15 s. 5

6 Versuchsdurchführung: Die Zellen werden in Standard-Extrazellulärlösung (Zusammensetzung siehe unten) mit 2 μm Fura-2/AM inkubiert (Wichtig: Zellen müssen dunkel lagern) Nach 45 Minuten wird die Fura-2-haltige Extrazellulärlösung durch Extrazellulärlösung ohne Fura-2-ersetzt. Die Zellen werden in der dafür vorgesehenen Badkammer auf das Fluoreszenzmikroskop verbracht. Durch den Strahlengang des Mikroskops wird monochromatisches Licht (380 nm) auf die Zelle gegeben, und das bei nm emittierte Signal wird zuerst durch das Okular und danach auf dem Computerbildschirm bei o 400-facher Vergrößerung betrachtet. 340 und 380 nm Signale werden alternierend mit einer Frequenz von 4 Hz auf die ausgesuchte Zelle, die sich unbedingt im Fokus befinden muss, appliziert und die emittierten Signale werden mit Hilfe der zugehörigen Software aufgezeichnet. Über eine Glaskapillare, die an ein Luftdrucksystem angeschlossen ist, wird ca. 20 Sekunden nach Beginn der Messung Kaliumchlorid an die Zellmembran appliziert. Die Kapillaren werden von den Studenten selbst mit Hilfe eines Kapillarenziehgerätes hergestellt. Zur Auswertung der Transienten, die ungefähr wie in Abb. 4 aussehen sollten, ist die Zeit von Beginn bis zum Maximum der Antwort und die Abklingzeit wichtig; dafür stehen Auswerteprogramme zur Verfügung. 2.2 Bradykinin-induzierte Kalziumtransienten in Neuroblastomzellen Ein geeignetes Modellsystem, um grundsätzliche Eigenschaften von Neuronen zu analysieren, sind Neuroblastomzellen. Neuroblastomzellen leiten sich von Tumorzellen ab und sind in Form von Zelllinien unbegrenzt in Kultur vermehrbar. Einige Neuroblastomzellen lassen sich durch Veränderungen des Kulturmediums oder dem Zusatz von Chemikalien zur Differenzierung bringen. Sie entwickeln sich dann innerhalb einiger Tage zu einem Neuronen-ähnlichen Phänotyp. Die in der Literatur gut beschriebene Maus-Neuroblastom-Zelllinie neuro-2a (LePage et al., Crit Rev Neurobiol. 17:27-50, 2005) erfüllt die genannten Bedingungen und dient uns als 6

7 Modell, um einen rezeptorvermittelten Anstieg des intrazellulären Kalziums zu detektieren. Neuro-2a Zellen exprimieren u.a. Bradykininrezeptoren. Das Neuropeptid Bradykinin wird bei Entzündungsreaktionen freigesetzt, sensibilisiert nozizeptive Neurone und führt zur Vasodilatation (Endothel-vermittelt). Bradykininrezeptoren sind auch im ZNS exprimiert. Schnelle Applikation von Bradykinin (BK) und die Bindung an BK-Rezeptoren hat einen Anstieg der zytosolischen Kalziumkonzentration zur Folge. Die BK-Rezeptoren B1 und B2 (für den genauen Signalweg siehe Lehrbücher der Physiologie und Neurowissenschaften, Bear, S. 452ff) sind G-Protein gekoppelte Rezeptoren. Die Versuchsdurchführung entspricht der oben für KCl beschriebenen, jedoch enthält die Glaskapillare nun Bradykinin in der Konzentration 1 μm zusammen mit der Standard-Extrazellulärlösung. Die Transienten sollen in ihrer Form und Kinetik mit den kaliuminduzierten Transienten verglichen werden. 2.3 Kalziumanstieg durch Aktivierung des Transient Receptor Potential Kanals TRPC6 in HEK-293 Zellen HEK-293 ist eine seit mehr als 30 Jahren kultivierte Zelllinie, die sich durch ihre leichte Kultivier- und Transfizierbarkeit als nützliches Modell in der Forschung etabliert hat. Es stehen herkömmliche HEK-Zellen und HEK-Zellen, die den canonischen Transient Receptor Potential Kanal TRPC6, einen nicht-selektiven Kationenkanal mit einer hohen Leitfähigkeit für Kalzium, stabil exprimieren, zur Verfügung. Der TRPC6-Kanal wird direkt durch Diacylglycerol (DAG) aktiviert. Im Praktikumsversuch wird 1-Oleoyl-2- acetyl-sn-glycerol (OAG), ein DAG-Derivat appliziert und die Antworten von TRPC6- transfizierten und nicht-transfizierten Zellen auf OAG-Applikation sollen miteinander verglichen werden. Die Versuchsdurchführung geschieht wie in 2.1 beschrieben. 7

8 2.4. Zusammensetzungen der verwendeten Lösungen (alle Konzentrationen in mmol/l) Extrazellulärlösung: - NaCl: KCl: 2,7 - CaCl 2 : 1,5 - MgCl 2 : 1 - Glucose: 6 - HEPES: 12 Der ph-wert wird mit NaOH auf 7,3 eingestellt Modifizierte KCl-haltige Applikationslösung: - KCl: NaCl: 32,7 - CaCl 2 : 1,5 - MgCl 2 : 1 - Glucose: 6 - HEPES: 12 Einstellung des ph mit KOH auf 7,3 Endkonzentration Bradykinin: 1 μm Endkonzentration OAG: 150 μm Bradykinin und OAG werden in normaler Extrazellulärlösung gelöst. 8

9 3. Methoden der Zellkultur von Säugetierzellen Neben der Untersuchung frischer Organ- und Gewebeproben steht der modernen Molekularbiologie auch die Kultivierung von Säugetierzellen außerhalb eines Organismus zu Verfügung, was eine deutliche Vereinfachung bei der Bearbeitung verschiedenster Fragestellungen ermöglicht. In der Zellkultivierung unterscheidet man hierbei zwischen primären und so genannten permanenten Zelllinien. Während primäre Linien aus frischen Geweben gewonnen werden und nur über eine begrenzte Passagierbarkeit (Lebensdauer) verfügen, sind permanente Zelllinien immortalisiert (viral, chemisch oder physikalisch) und können nahezu unbegrenzt vermehrt werden, ohne dass sie ihre grundlegenden Eigenschaften verlieren. Im Rahmen der folgenden Versuche sollen grundlegende Methoden in der Zellkultur anhand der permanenten Zelllinie HEK293 vermittelt werden. Bei den seit den frühen 70iger Jahren existierenden HEK293 Zellen handelt es sich um eine viral transformierte Zelllinie menschlicher embryonaler Nierenzellen (human embryonic kidney), in die DNA-Sequenzen des humanen Adenovirus 5 übertragen wurden. HEK293 Zellen zeigen eine fibroblastoide Morphologie und wachsen in Kulturgefäßen zu einem einschichtigen Zellrasen (Monolayer) aus (Abb. 4). Aufgrund der Einfachheit, mit der diese Zellen kultiviert und transfiziert werden können, sind HEK293 Zellen heute in der Forschung und Entwicklung weit verbreitet. Abb. 4: HEK-Zellkultur im Phasenkontrast HEK29 9

10 3.1: Versuch 1: Mikroskopische Untersuchung und Anzucht von HEK293 Zellen Im ersten Versuch soll eine Kultur HEK293 unter dem Lichtmikroskop begutachtet werden. Die Zellen sollen anschließend mittels Trypsinverdau vom Kulturgefäß gelöst und in eine neue 6-well Kulturschale eingesät werden. Achtung: Steriles Arbeiten unter einer Laminarbox Desinfektionsmittel und Handschuhe benutzen! Umsetzen von Zellen mittels Trypsinverdau: Mit einer serologischen 10 ml Pipette wird das Kulturmedium vollständig aus der Flasche abgesaugt und verworfen. Die Zellen vorsichtig mit ca. 2 ml PBS (phosphat buffered saline,ph 7.4) überschichten und durch sanftes Schwenken der Kulturflasche waschen. Die Waschlösung nun ebenfalls vollständig absaugen und die Zellen mit 4 ml Trypsin-Lösung überschichten. Anschließend wird die Flasche bis zum vollständigen Ablösen des Zellrasens bei RT inkubiert (ca. 5 min). Die Zellsuspension wird hiernach mit 4 ml frischem Kulturmedium versetzt und durch sanftes Auf- und Abpipettieren vorsichtig homogenisiert. Anschließend werden 7 ml der Zellsuspension aus der Flasche entnommen und für eine neue Aussaat in ein 15 ml Falcon-Röhrchen überführt. Die ausgedünnte Kultur in der Flasche wird mit ca. 25 ml frischem Kulturmedium versetzt und nach sanftem Mischen im Zellkulturbrutschrank weiter inkubiert Anlegen einer frischen 6-well Kulturschale: Für die frische Aussaat einer 6-well Kulturschale werden ca. 1 ml der aus der Kulturflasche entnommenen Zellsuspension (1.1) in einem neuen Falcon mit 15 ml frischem Kulturmedium gemischt. Anschließend werden die Zellen zu jeweils 2,5 ml / well in eine 6-well Schale gegeben und die Platte durch sanftes Kreisen vorsichtig gemischt. Die Kulturschale wird über Nacht im Zellkulturschrank inkubiert und die Zellen am folgenden Tag mikroskopisch begutachtet. 10

11 3.2. Benötigte Medien und Lösungen Versuch 1: PBS (phosphat buffered saline, ph 7.4): 140 mm NaCl 6,5 mm Na 2 HPO 4 1,5 mm KH 2 PO 4 2,7 mm KCl Kulturmedium für Zellen: 225 ml DMEM (Dulbecco s modified eagle medium) 25 ml fetales Kälberserum Trypsinlösung: 1 ml 10x Trypsin-EDTA Lösung (0,5%) 9 ml PBS (ph 7.4) 11

12 3.3. Versuch 2: Transfektion von HEK293 Zellen Unter Transfektion versteht man das Einbringen von Fremd-DNA (oder auch RNA) in eukaryotische Zielzellen (vergleichbar mit Transformation bei Bakterien, Abb. 5). Hierfür bedient man sich einer Reihe kommerzieller Vektoren, welche die konstitutive Expression eines Zielgens unter Kontrolle eines zumeist starken Promotors viralen Ursprungs vermitteln. Zelllinien können transient (zeitlich begrenzt) oder stabil (permanent) transfiziert werden. Während in transient transfizierten Zellen die Plasmid-DNA zumeist autonom als Episom im Zellkern verbleibt, resultieren stabil transfizierte Linien aus der Integration des Vektors ins zelluläre Genom. Durch den Wachstumszustand der Zielzellen zum Zeitpunkt der Transfektion kann man dies teilweise beeinflussen. Abb. 5. Ein Prinzip der Transfektion von Säugetierzellen mit Fremd-DNA. Im zweiten Versuch sollen die zuvor frisch ausgesäten HEK293 Zellen (Versuch 1) bei subkonfluenter Zelldichte (entspricht ca %) mit den Vektoren pegfp-n1 und pcdna-trpv4-yfp transfiziert werden (Abb. 5) Das Plasmid pegfp-n1 kodiert für das EGFP Protein (enhanced green fluorescent protein), dessen Expression durch eine deutliche grüne Fluoreszenz in den Zielzellen signalisiert wird. Der Vektor pcdna-trpv4-yfp hingegen kodiert für ein Fusionsprotein des Ionenkanals TRPV4 der Maus (transient receptor potential vanilloid 4) und YFP (yellow fluorescent protein) und führt in transfizierten Zielzellen zu einer gelben Fluoreszenz. 12

13 Über die Eigenfluoreszenz der Zielproteine kann die Transfektionseffizienz h nach Transfektion am Fluoreszenzmikroskop überprüft werden. Achtung: Steriles Arbeiten unter einer Laminarbox Desinfektionsmittel und Handschuhe benutzen! Vorbereitung der Zellen Kontrolle der HEK293 Zellen am Lichtmikroskop. Die Zellen sollten zu einem 60-80% geschlossenen Zellrasen (subkonfluent) ausgewachsen sein. Mit Hilfe einer serologischen Pipette wird das Kulturmedium vorsichtig abgesaugt und verworfen. Die Zellen nun zügig (um ein Austrocknen zu vermeiden) mit 1 ml frischem Erhaltungsmedium überschichten und durch sanftes Schwenken der Kulturplatte waschen. Die Waschlösung anschließend wieder entfernen und die Zellen mit jeweils 2 ml / well frischem Erhaltungsmedium überschichten. Bis zum Aufbringen des Transfektionsgemisch werden die Zellen weiter im Zellkulturbrutschrank inkubiert Herstellung des Transfektionsgemisches Als Transfektionsmittel wird Polyethylenimin (PEI) eingesetzt, welches in wässriger Lösung als Polykation vorliegt und in der Lage ist, DNA zu komplexieren. Die zu transfizierende Plasmid-DNA und PEI sollen hierbei im Verhältnis 1:2 verwendet werden. Für die beiden Plasmid-Lösungen werden 2 µg pegfp-n1 bzw. pcdna- TRPV4-YFP in 100 µl serumfreiem Medium in 1,5 ml Eppendorfgefäßen gemischt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Parallel werden vom Transfektionsmittel PEI jeweils 4 µg (Verhältnis DNA:PEI = 1:2) in 100 µl serumfreiem Medium in 1,5 ml Eppendorfgefäßen gemischt und gleichfalls 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Für die Komplexbildung werden nun die beiden DNA-Lösungen mit jeweils 100 µl PEI-Lösung versetzt. Die Reaktionen werden vorsichtig gemischt und für weitere 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. 13

14 Anschließend werden die Transfektionsgemische vorsichtig über je ein gesamtes well verteilt aufgetropft und die Kulturplatte durch sanftes Kreisen gemischt. Die Zellen werden über Nacht im Brutschrank inkubiert. Die Transfektionseffizienz soll am folgenden Tag am Fluoreszenzmikroskop überprüft und die Expression der beiden Zielproteine diskutiert werden Benötigte Medien und Lösungen Versuch 2: serumfreies Medium: entspricht DMEM (Dulbecco s modified eagle medium) Erhaltungsmedium für Zellen: 237,5 ml DMEM (Dulbecco s modified eagle medium) 12,5 ml fetales Kälberserum Polyethylenimin Stocklösung: 1 µg / µl pegfp-n1 Plasmid-Lösung: 1 µg / µl 14

15 pcdna TRPV4 YFP Plasmid Lösung: 1 µg / µl Abb. 6. Aufbau der verwendeten Vektoren mit Schnittstellen für Restriktionsenzyme, codierenden Sequenzen, Promotoren und anderen Elementen. 15

16 4. Spezifischer Nachweis von Proteinen durch SDS-PAGE und Western Blot Der Western Blot (oder Immunoblot) stellt eine in der Molekularbiologie weit verbreitete Methode zum gezielten Nachweis spezifischer Proteine dar. Hierbei werden zunächst alle Proteine eines Gewebe- oder Zelllysats in einem Polyacrylamidgel durch SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel elektrophorese) entsprechend ihres Molekulargewichts aufgetrennt. Die Proteine werden anschließend auf eine Nitrozellulosemembran transferiert (geblottet), wobei das erhaltene Bandenmuster erhalten bleibt. Die über hydrostatische und hydrophobe Wechselwirkungen fest an die Membran gebundenen Proteine können anschließend mit spezifischen Antikörpern gezielt nachgewiesen werden. Die Detektion gebundener Antikörper erfolgt in der Regel über die Bindung eines für den Primärantikörper spezifischen zweiten Antikörpers, welcher mit dem Enzym Peroxidase gekoppelt ist (Konjugat) und eine Chemilumineszenzreaktion vermittelt. Auftrennung aller Proteine in einem Polyacrylamidgel Immobilisierung aller Proteine auf einer Nitrozellulosemembran Bindung des Zielproteins durch einen spezifischen Primärantikörper Bindung des Primärantikörpers durch ein spezifisches Sekundärantikörper-Konjugat Detektion des Immunkomplexes über den Enzym vermittelten Umsatz eines Substrats 16

17 4.1. Versuch 1: Herstellung von Lysaten von Gewebeproben einer Maus Im ersten Versuch sollen aus den Geweben Herz, Niere und Gehirn einer Maus frische Lysate hergestellt werden. Von den gewonnen Rohproteinextrakten soll anschließend der Proteingehalt bestimmt werden und die Proben für eine anschließende SDS-PAGE aufgearbeitet werden. Gewebe 1x Herz, 1x Niere und 1x Großhirn wird eingefroren (-80 C) zur Verfügung gestellt. Achtung: Alle Arbeiten erfolgen auf Eis (4 C). Es müssen Handschuhe getragen werden Herstellung der Gewebelysate: Je Gewebeprobe ein 2 ml Eppendorfgefäß mit Schraubdeckel und Dichtungsring mit jeweils drei sterilen Stahlkugeln bestücken und auf Eis vorkühlen. In einem 15 ml Falconröhrchen 10 ml RIPA Lysispuffer mit 1 Tablette complete mini Proteaseinhibitor versetzen und auf Eis inkubieren, bis die Tablette vollständig gelöst ist (ca. 10 min). Direkt vor Gebrauch den Lysispuffer mit 10 µl PMSF (200 mm) versetzen und durch Schwenken mischen. Die gefrorenen Gewebeproben (1x Herz, 1x Niere, 1x Hirn) mit einer desinfizierten Pinzette in die mit Stahlkugeln präparierten Röhrchen geben und mit 1 ml gekühltem Lysispuffer versetzten. Die Röhrchen sorgfältig verschließen und sofort 2 min in der Speedmill homogenisieren. Nach Ablauf des Programms die Proben auf Eis stellen und den Grad der Gewebezerkleinerung beurteilen. Sind noch deutliche Gewebestücken zu erkennen, das Programm wiederholen. Bei ausreichender Homogenität die Proben liegend auf Eis 60 min wippen. Die Lysate in neue 2 ml Eppendorfgefäße überführen (ohne Stahlkugeln) und unter Eis 3x 15 Stöße Schallen (anleitendes Personal, Gehörschutz!). Die Proben werden anschließend durch 45-minütige Zentrifugation bei rpm und 4 C von Zelltrümmern geklärt. 17

18 Die Überstände in neue 1,5 ml Eppendorfgefäße überführen, kurz mischen und ein 100 µl Aliquot für die Konzentrationsbestimmung in 0,5 ml Eppendorfgefäße abfüllen. Die Proben werden bis zur weiteren Verwendung bei -20 C eingefroren Bestimmung des Proteingehalts von Lysaten mit BCA (Bicinchoninic acid) Bicinchoninsäure (BCA) ist eine heterozyklische Dikarbonsäure aus zwei Karboxylsubstituierten Chinolinmolekülen. Durch die sogenannte BCA-Reaktion kann der Protein-gehalt von Lysaten photometrisch quantifiziert werden. Der Nachweis beruht darauf, das Cu 2+ Ionen mit Proteinen bei alkalischem ph-wert einen Komplex bilden (Biuret-Reaktion), wobei die Kupferionen reduziert werden. Einwertige Kupferionen bilden mit BCA einen violetten Farbkomplex, dessen Absorbtion bei 562 nm bestimmt wird. Der Proteingehalt einer Lösung kann nach dem Lambert Beer schen Gesetz anhand der Extinktionen definierter Eichlösungen ermittelt werden. Achtung: Einmalplastik und Handschuhe benutzen! Für die Reaktionslösung werden in einem 15 ml Falconröhrchen 10 ml BCA mit 200 µl 4% CuSO 4 gemischt (Verhältnis 50:1). Die Aliquots der Lysate (1.1) und eine BSA-Lösung (bovine serum albumin) von 1µg/µl für die Eichkurve auf Eis auftauen und gründlich mischen. Anschließend werden die Proben nach folgendem Schema pipettiert, gemischt und 40 min bei 60 C im Heizblock inkubiert: BSA Eichlösungen: EK in µg/ml BSA (1µg/µl) 0 µl 1 µl 2,5 µl 5 µl 10 µl 15 µl 20 µl 25 µl BCA-Lösung 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 18

19 Lysat-Lösungen: (Parallelbestimmungen) Probe Herz Niere Gehirn Lysat 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl BCA-Lösung 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl Die Proben nach der Inkubation auf Raumtemperatur abkühlen lassen und nochmals gründlich mischen. Anschließend wird die Extinktion der Proben bei 562 nm gegen den Leerwert (BSA 0 µg/ml) photometrisch bestimmt und die Proteinkonzentrationen anhand der BSA-Eichkurve ermittelt. Benötigte Lösungen und Materialien Versuch 1: RIPA Lysispuffer (ph 7.4): 50 mm Tris HCl (ph 7.4) 150 mm NaCl 5 mm EDTA 0,5 % NP40 (v/v) 1 % Desoxycholsäure (w/v) 1 % Triton X100 (v/v) 0,1 % SDS (sodium dodecyl sulfate) (w/v) vor Gebrauch mit Proteaseinhibitoren versetzen PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) Stocklösung: 200 mm PMSF in Ethanol complete mini Proteaseinhibitor Tabletten (Roche) 1 Tablette 10 ml RIPA Lysispuffer BCA-Reaktionslösung: 10 ml BCA (bicinchoninic acid) 200 µl 4% CuSO 4 sterile Stahlkugeln 19

20 4.2. Versuch 2: SDS-PAGE und Western Blot von Gewebelysaten der Maus Von den in Versuch 1 gewonnen Lysaten sollen nun jeweils 25 µg Protein in 12%igen Polyacrylamidgelen aufgetrennt werden. Zur Veranschaulichung des entstehenden Bandenmusters soll ein Gel mit dem Farbstoff Coomassie Brilliant Blau gefärbt werden, der Proteine unspezifisch blau färbt. Zum spezifischen Nachweis eines Proteins soll ein paralleles Gel auf Nitrozellulose geblottet werden und anschließend im Western Blot analysiert werden. Als Zielprotein soll das ca. 43 kda große Actin- Protein mit Hilfe eines monoklonalen Mausantikörpers nachgewiesen werden. Achtung: Handschuhe benutzen! Vorbereitung der Lysatproben Die gefrorenen Lysate (Versuch 1) auf Eis auftauen und mischen. Anhand der Proteinbestimmung (Versuch 1.2) werden die Lysate mit 2x SDS- Probenpuffer verdünnt und auf eine Konzentration von 1 µg/µl eingestellt. Die verdünnten Proben gründlich mischen und 5 min bei 95 C im Heizblock denaturieren. Sofort im Anschluß werden die Proben 3 min bei rpm zentrifugiert und hiernach mit jeweils 25 µl / lane (entspricht 25 µg) im Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die restlichen Lysatproben und Verdünnungen können erneut bei -20 C eingefroren werden. Lysat Konzentration in µg / µl Volumen Lysat 200 µg Volumen PBS ad 100 µl Volumen 2xSDS- Probenpuffer Gesamtvolumen 1 µg/µl Herz 100 µl 200 µl Niere 100 µl 200 µl Hirn 100 µl 200 µl 20

21 4.2.2 SDS-PAGE (Polyacrylamidgelelektrophorese) Die Gele werden zwischen zwei mit Methanol entfettete Glasplatten (Spacerplatte, Deckplatte) gegossen. Hierbei wird zunächst das eigentliche Trenngel bis ca. 1,5 cm unter die obere Glasplattenkante gegossen und zur Polymerisation 20 min stehen gelassen. Zur Auftragung der Proben wird anschließend ein Sammelgel aufgegossen, in welches ein Plastikkamm eingesetzt wird, dessen Zähne die späteren Taschen formen. Nach der Polymerisation des Gels wird der Kamm gezogen und das Gel unter PAGE-Laufpuffer in die Gelelektrophoresekammer eingespannt und kann mit den Proben beladen werden. Die Glasplatten für zwei kleine Minigele (1 mm) mit Methanol polieren und in den Gelgießhalter einspannen Das Trenngel bis 1,5 cm unter die obere Glasplattenkante aufgießen und vorsichtig mit 1 ml A.dest überschichten. Anschließend die Gele 20 min polymerisieren lassen. Trenngel (12%): 3,6 ml A.dest 2,5 ml Trenngelpuffer 4,0 ml Acrylamidlösung (30:1) direkt vor dem Gießen hinzufügen: 50 µl 10% APS 10 µl TEMED Das Wasser abgießen und die obere Gelkante vorsichtig mit A.dest (Spritzflasche) spülen. Restwasser mit einem Papiertuch sorgfältig abziehen. Anschließend das Sammelgel bis zur oberen Glasplattenkante aufgießen und sofort einen Plastikamm (1 mm) mit 10 Zähnen einsetzen. Die Gele weitere 20 min polymerisieren lassen. Sammelgel (4%): 3,15 ml A.dest 1,25 ml Sammelgelpuffer 0,65 ml Acrylamidlösung (30:1) direkt vor dem Gießen hinzufügen: 25 µl 10% APS 5 µl TEMED 21

22 Nach Polymerisation der Gele vorsichtig den Kamm ziehen und die entstanden Taschen mit PAGE-Laufpuffer spülen. Die beiden Gele nun in den Elektrophoresehalter einspannen, die innere Kammer mit PAGE-Laufpuffer auffüllen und das Inlay in die Elektrophoresekammer einstellen. Die äußere Kammer bis zur Markierung mit PAGE-Laufpuffer auffüllen Die Gele können nun mit den in SDS-Probenpuffer verdünnten und zuvor denaturierten Proben beladen werden. Zur Abschätzung des Molekulargewichts der Proteine werden auf jedes Gel 5 µl eines definierten Größenstandards aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgt bei konstant 200 V bis die farbige Lauffront gerade die unter Glasplattenkante erreicht hat (ca. 45 min) Coomassie Brilliant Blau Färbung eines Polyacrylamidgels Nach der Gelelektrophorese die beiden Gele aus dem Gelhalter ausspannen. Die kleine Deckplatte vorsichtig von der Spacerplatte abheben und das Trenngel mit einem Skalpell von den Glasspacern und dem Sammelgel trennen Eines der Trenngele wird nun 30 min in der Coomassie Brilliant Blau Färbelösung auf einer Wippe sanft bewegt. Anschließend wird die Färbelösung abgekippt und das Gel in Entfärberlösung so lange auf der Wippe entfärbt, bis sich die blauen Proteinbanden deutlich vom entfärbten Gelhintergrund abheben (ca. 1h). Den Entfärber hierbei alle 15 min wechseln. Das entfärbte Gel kurz in mehreren Wechseln A.dest spülen (maximal 5 min) und luftblasenfrei auf ein angefeuchtetes Filterpapier legen. Das Gel kann nun im Geltrockner bei 80 C unter Vakuum für 40 min getrocknet werden Transfer von durch SDS-PAGE aufgetrennten Proteinen auf Nitrozellulose Die im zweiten Trenngel aus Versuch 2.2 aufgetrennten Proteine sollen nun durch eine weitere Elektrophorese auf Nitrozellulose geblottet werden. 22

23 Das vom Sammelgel getrennte Trenngel 15 min in Transferpuffer equilibrieren. Pro zu blottendem Gel 2x Schwämme und 4x Blottingfilter ebenfalls 15 min in kaltem Transferpuffer equilibrieren. Mit einem Skalpell eine 6 x 8,3 cm große Nitrozellulosemembran zurechtschneiden und 15 min in A.dest wässern. Nun das Blotting-Sandwich laut Schema luftblasenfrei zusammenbauen und in einer Blottingkassette fixieren: 1. Kathode (schwarz) 2. Schwamm 3. Filter (2x) 4. Polyacrylamidgel 5. Nitrozellulose 6. Filter (2x) 7. Schwamm 8. Anode (weiss) Die Kassetten in die Blottingkammer einbauen, ein Kühlelement sowie einen Rührmagneten hinzufügen und die Kammer mit kaltem Transferpuffer auffüllen. Der Blot erfolgt nun bei konstant 100 V für 1 h auf einem Magnetrührgerät. Nach Abschluss der Elektrophorese wird das Blotting-Sandwich vorsichtig auseinander gebaut und die Membran 2 min in Ponceau Rot eingelegt, um die auf die Membran transferierten Proteine anzufärben. Der Größenstandard ist bereits vorgefärbt. Die Färbelösung abgießen und die Membran kurz in 2-3 Wechseln TBST- Puffer spülen, bis sich die Proteinbänderung deutlich von der Membran abhebt. Die Membran zweimal 10 min in TBST-Puffer auf einer Wippe bis zum vollständigen Auswaschen des Farbstoffs inkubieren. Bis zu Behandlung mit den Antikörpern kann die Membran in TBST-Puffer eingelegt bei 4 C im Kühlschrank gelagert werden. 23

24 4.2.5 Nachweis von Proteinen mittels spezifischer Antikörper (Immunoblot) Beispielhaft für die Methode des Western Blots soll in den Gewebelysaten enthaltenes Actin (ca. 43 kda) mit einem Actin-spezifischen monoklonalen Mausantikörper nachgewiesen werden. Achtung: Sofern nicht anders angegeben erfolgen alle Inkubationen auf einer Linearwippe. Die Membran 1 h in Blocking-Lösung bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend wird die Membran 1 h mit dem 1:5000 in Blocking-Lösung verdünnten anti-actin Antikörper weiter inkubiert. Die Membran 3 x 10 min in TBST-Puffer waschen. Hiernach wird die Membran für ca. 1 h mit dem 1: in TBST-Puffer verdünnten Sekundärantikörper Ziegen-anti-Maus IgG-Peroxydase-Konjugat inkubiert. Die Membran nochmals 3 x 10 min in TBST-Puffer waschen. Für die Detektion wird die kurz abgetropfte Membran stehend in einer Schale für ca. 5 min mit dem Chemilumineszenzsubstrat inkubiert. Sofort im Anschluss die Membran kurz ablaufen lassen und luftblasenfrei unter einer Klarsichtfolie in eine Fotokassette einlegen. Im abgedunkelten Labor unter Rotlicht werden nun ECL-Fotofilme jeweils für 1 min, 5 min bzw. 10 min in der Kassette exponiert und entwickelt. Die Filme werden anschließend im Trockenschrank bei 60 C getrocknet und der Größenstandard von der Membran übertragen. Die Größe detektierter Banden auf den Filmen soll schließlich anhand des mitgeführten Größenstandards abgeschätzt und die Ergebnisse diskutiert werden. Benötigte Lösungen und Materialien Versuch 2: PBS (phosphat buffered saline, ph 7.4): 140 mm NaCl 6,5 mm Na 2 HPO 4 1,5 mm KH 2 PO 4 2,7 mm KCl 24

25 PAGE-Laufpuffer: 200 mm Glycin 25 mm Tris 0,1 % SDS (w/v) Transferpuffer: 200 mm Glycin 25 mm Tris 20 % Methanol (v/v) 0,01 % SDS (w/v) TBST-Puffer: 150 Mm NaCl 10 mm Tris HCl (ph 8.0) 0,25 % Tween20 (v/v) Blocking-Lösung: 5 % Magermilchpulver (w/v) in TBST-Puffer Polyacrylamid Gelentfärber: 40 % Methanol (v/v) 10 % Essigsäure (v/v) Trenngelpuffer: 1,5 M Tris HCl (ph 8.8) 0,4 % SDS (w/v) Sammelgelpuffer: 0,5 M Tris HCl (ph 6.8) 0,4 % SDS (w/v) 10 % APS (Ammoniumpersulfat): 10 % APS (w/v) in A.dest weitere kommerzielle Lösungen: Coomassie Brillian Blau Färbelösung Ponceau Rot Färbelösung TEMED (Tetramethylethylendiamin) 2x SDS-Probenpuffer Proteinstandard Kaleidoscope prestained Polyacrylamid / Bisacrylamid (30:1) Chemilumineszenzsubstrat Antikörper: monoklonal anti-actin-maus-antikörper polyklonal goat-anti-maus-igg-peroxydase-konjugat 25

26 1R. Reserve-Versuch, Muskelkraft-Messung, ev. per Demonstration Alle willkürlichen Bewegungen des Menschen werden von Muskeln ausgeführt, deren Fasern sich in Längsrichtung verkürzen können. Die Skelettmuskulatur wird durch die spinalen -Motoneuronen im Vorderhorn des Rückenmarks innerviert (Abb. R1). Diese Neurone werden auch als periphere oder 2. Motoneurone bezeichnet, um sie von den übergeordneten, zentralen Motoneuronen des Gehirns zu unterscheiden, die dem Rückenmark den Input liefern. Nur die peripheren Motoneuronen steuern direkt die Muskelkontraktion. Sherrington sprach im Zusammenhang mit diesen Neuronen von der gemeinsamen Endstrecke des Verhaltens (modifiziert nach Bear et al., Neurowissenschaften, Spektrum, Heidelberg, 2009). Abb. R1: Innervation der Muskeln durch spinale Motoneurone. Im Vorderhorn des Rückenmarks befinden sich die Motoneurone, welche die Skelettmuskelfasern innervieren. 26

27 Muskelverkürzung und/oder Muskelkraft lassen sich beim Menschen in vivo und auch an isolierten Muskeln, Muskelfaserbündeln und einzelnen Fasern von Versuchstieren studieren. Dabei ist es ist technisch einfacher, den Parameter Kraft zu erfassen, da sogenannte Transducer entwickelt wurden, welche Zugkräfte in elektrische Spannungen wandeln. Die elektrische Spannung bzw. Spannungsänderung kann dann mittels geeigneter Geräte wie Oszilloskop oder Computer aufgezeichnet und dargestellt werden. Um Muskeln und Muskelfasern unabhängig vom ZNS zu aktivieren, werden zwischen 2 Badelektroden elektrische Spannungen angelegt, welche die Muskelfasern depolarisieren, zur Generierung von Aktionspotenzialen und zur Kontraktion (Kraftentwicklung) veranlassen. Der isolierte M. Soleus der Maus eignet sich für die Messung der Muskelkraft nach Elektrostimulation. Wegen seines geringen Durchmessers ist die Versorgung mit Glukose und Elektrolyten (Homöostase) auch im Organbad sichergestellt. Ziel des Versuchs: Aufnahme und Beschreibung der Kraft-Antworten des M. Soleus der Maus nach Elektrostimulation. Es sollen die Antworten auf einzelne (Einzelzuckungen) und mehrfache Stimuli (Tetani) in Abhängigkeit von Muskellänge, Reizstärke und Frequenz aufgezeichnet und ausgewertet werden. Zu Erfassen sind Amplitude und Zeitverlauf von Einzelzuckungen, Tetani sowie das Abklingen der Kraft bei repetitiver Reizung (Ermüdung). 1R.1. Durchführung Der Soleus-Muskel des einen Beins der Maus wird von einem Assistenten präpariert, in eine Carbogen (95% O 2, 5 % CO 2 )-begaste Präparationskammer gegeben und die Sehnen fixiert. Der erste Muskel wird in die Messkammer eingespannt. Den Muskel des 2. Beins können Sie versuchen, selbst zu präparieren. Er kann für einige Stunden in einer Carbogen-begasten Kammer gelagert werden. 27

28 Stimulieren Sie den Muskel in der Messkammer mit einzelnen elektrischen Spannungspulsen (50 V, Voreinstellung) und verändern Sie die Muskellänge mittels der Mikrometerschraube. Tragen Sie Kraftamplitude in Abhängigkeit von der Länge in einem Diagramm auf. Bei optimaler Muskellänge wird nun die Amplitude des Spannungspulses variiert. Beginnen Sie mit 5 V und erhöhen Sie die Amplitude in 5-Volt Schritten. Tragen Sie Kraftamplitude in Abhängigkeit von der Höhe des Spannungspulses in einem Diagramm auf. Aus praktischen Gründen erfolgen nun einige tetanische Stimulationen (50 Hz, 500 ms oder 120 Hz, 500 ms) und eine 2. Längenoptimierung. Stimulieren Sie nun mit 5 Hz, 10 Hz, 20, 50, 80, 100, 120 Hz und beobachten die Summation und den Anstieg der Kraftamplitude. Tragen Sie das Ergebnis in ein Diagramm ein. Muskeln ermüden bei lang anhaltender Belastung. Stimulieren Sie den Muskel mit 50- Hz Tetani (je 500 ms) alle 2 s. Beurteilen Sie den Verlauf der Ermüdung und ermitteln die Zeit bis zum Abfall der Kraft auf 50%. Je nach Zeit, die noch zur Verfügung steht: - Wiederholen Sie die Messungen in Ca 2+ -freier Lösung. - Spannen Sie den 2. Muskel in die Messvorrichtung ein und prüfen Sie Einzelzuckung und Tetanus. Drucken Sie Beispiele der abgespeicherten Aufnahmen aus. Einzelzuckung, Tetanus, Verlauf der Ermüdung. Notieren Sie grundlegende biologische und technische Fragen, sowie aufgetretene Probleme für spätere Besprechungen/Diskussionen. 28

29 1R.2. Verwendete Lösungen Badlösung (nach Krebs-Henseleit, in mm): 137 NaCl, 24 NaHCO 3, 5 KCl, 2 CaCl 2, 1 NaH 2 PO 4, 1 MgSO 4, and 11 D-Glukose, Carbogen-begast, ph 7,3-7,4. Carbogben: 95% O 2, 5% CO 2. (zu beachten: Lösung ist CO 2 -gepuffert, d.h. der angegebene ph gilt nur bei 5% CO 2 ) Institut für Pathophysiologie, Karlsburg, Greifswalder Str. 11c Karlsburg Tel /