Produktinformation Saturn-2D REDOX Labeling Kit

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1 Saturn-2D REDOX Labeling Kit Produktinformation Saturn-2D REDOX Labeling Kit Produkt-Nr. PR34, PR35 NH DyeAGNOSTICS GmbH Weinbergweg 23 D Halle Deutschland Technischer Support Fon: +49 (0) Kit-Inhalt Pack 1 (Lagerung bei -20 C): S-Dye200 (8S - 2 Reaktionsgefäße; 12S - 3 Reaktionsgefäße) S-Dye300 (8S - 2 Reaktionsgefäße; 12S - 3 Reaktionsgefäße) 1 Reaktionsgefäß mit S-Dye Solvent Cysteine interacting Compound (CinC; 8S - 2 Reaktionsgefäße, 12S - 3 Reaktionsgefäße) 1 Reaktionsgefäß mit CinC Solvent 1 Reaktionsgefäß mit TCEP (Tris-(2carboxyethyl)phosphinhydrochlorid), lyophilisiert 1 Reaktionsgefäß mit Redox Stop Solution 1 Reaktionsgefäß mit ddh 2 O, steril Pack 2 (Lagerung bei 2-8 C): Redox-Matrix (ready-to-use, 50%ig) Wash Buffer Redox Labeling Buffer REDOX copyright NH DyeAGNOSTICS 2014 Stand 02/2014 S-Dye Low-Retention Pipettenspitzen zur Vermeidung von Pipettierverlusten (Massenspektrometrie kompatibel) S-Dye Reaktionsgefäße (Massenspektrometrie kompatibel) Spin-Säulen (inkl. Kappe und Deckel; 8S - 10 Stück; 12S - 14 Stück) Saturn-2D REDOX ist eine Neuentwicklung für die einfache Visualisierung der komplexen Antwort im Proteom von Zellen auf Stress. Mit Saturn-2D REDOX werden Probenspezies mit unterschiedlichem Redox-Potential spezifisch markiert und nachfolgend miteinander verglichen. Die neue CinC -Technologie (Cysteine interacting Compound) löst das Problem, dass durch die unterschiedliche Anzahl Farbstoff-markierter Cysteine in den zu vergleichenden Proben ein Spotmatching nicht oder nur begrenzt möglich war. S-Dye200 und S-Dye300 sind etablierte Maleimid-aktivierte Hochleistungs-Fluoreszenzfarbstoffe für die Proteinmarkierung (Labeling). Die S-Dyes binden an reduzierte Cysteine von Proteinen. Diese können dann elektrophoretisch oder chromatografisch aufgetrennt und durch die spezifischen S-Dye-Fluoreszenzen detektiert werden. In Kombination mit einer 2D-Auswertungssoftware ( dyeagnostics.com/site/technology/software/) sind die S-Dyes ideal für die Verwendung von Multiplex-Fluoreszenz 2D-Gelanalysen geeignet. Dabei können mit einem Saturn-2D REDOX 8S Kit 8x 5 µg Protein (Saturn-2D REDOX 12S Kit 12x 5µg) mit S-Dye200 und mit S-Dye300 markiert werden. Genereller Ablauf von Saturn-2D REDOX Analysen 1. Experimentelles Design 2. Lösen der Proteine in einem kompatiblen Puffer 3. Herstellung der S-Dye Working Solution 4. Herstellung der CinC Working Solution 5. Herstellung der TCEP-Reduktionslösung 6. Direktes Labeling 7. Indirektes Labeling 8. S-Dye bzw. CinC Moleküle 9. Herstellung des Internen Standards (IS) 10. Massenspektrometrische Analysen 11. Fluoreszenz-Imaging Für weitere Informationen, Hinweise und Tipps kontaktieren Sie uns unter 1. Experimentelles Design Für die Vergleiche von zwei Proben (z.b. Probe A Kontrolle, Probe B gestresst) benötigen Sie vier 2D Gele plus entsprechende Replikate. Jede Probe sollte sowohl direkt als auch indirekt gelabelt werden (vgl. Übersicht 1). Das direkte Labeling zeigt alle ursprünglich reduzierten Cysteine der Proteinprobe und das indirekte Labeling alle oxidierten Cysteine der Probe. Pro Gel tragen Sie eine Probe (direkt oder indirekt gelabelt) und den internen Standard (IS) auf. Der IS repräsentiert eine Mischung aus allen Proteinproben (vollständig reduziert) Ihres Experimentes im gleichen Verhältnis und ermöglicht Ihnen eine einfache gelübergreifende Auswertung. Ein Dye-Swap ist nicht erforderlich. Achtung: S-Dye Solvent und CinC Solvent enthalten Dimethylformamid (DMF, HCON(CH 3 ) 2 CAS No: ), das beim Einatmen, beim Verschlucken oder bei Hautkontakt gesundheitsschädlich ist. Hinweis: Zur Vermeidung von Pipettierverlusten empfehlen wir, die im Kit enthaltenen Pipettenspitzen und Reaktionsgefäße zu verwenden.

2 Übersicht 1: Experimentelles Design für Saturn-2D REDOX Analysen Proteinprobe A z.b. Kontrolle SH S S SH SH S S direktes Labeling indirektes Labeling Labeling reduzierter Blockierung reduzierter S-Dye-Moleküle CinC-Moleküle Blockierung oxidierter Labeling oxidierter Gel 1 Gel 2 mix interner Standard Labeling der Cysteine mit S-Dye200 Gel 3 Proteinprobe B z.b. gestresst SH S S S S S S direktes Labeling indirektes Labeling Labeling reduzierter Blockierung reduzierter S-Dye-Moleküle CinC-Moleküle Blockierung oxidierter Labeling oxidierter Gel 4 2

3 2. Lösen der Proteine in einem kompatiblen Puffer Um eine optimale Markierung der Proteine mit den S-Dyes zu gewährleisten, empfehlen wir, die Proteinproben in einem Saturn-2D REDOX kompatiblen Probenpuffer (z.b. basierend auf mm Tris oder mm HEPES) zu lösen. Vermeiden Sie die Verwendung von Thiolen oder primären Aminen. Achten Sie darauf, dass der ph-wert der Probe kleiner als 8,0 ist (optimal ph 7,5). Weiterhin sollte die Proteinkonzentration der Proben mindestens 1 µg/µl betragen. Hinweis: Sollte die Proteinkonzentration kleiner sein, fällen Sie die Probe und nehmen Sie diese anschließend in einem geringeren an Probenpuffer auf. 6. Geben Sie für die Cysteine 2,5 µl TCEP-Reduktionslösung zu Ihrem Ansatz. Nach kurzem Vortexen und anschließender Zentrifugation inkubieren Sie den Ansatz für 1 Stunde bei. 7. Zentrifugieren Sie den Reaktionsansatz kurz. Geben Sie für die Blockierung oxidierter Cysteine 5 µl CinC Working Solution zu Ihrem Reaktionsansatz, vortexen und zentrifugieren Sie kurz. Inkubieren Sie den Ansatz für 1 Stunde bei. 8. Zentrifugieren Sie den Ansatz kurz. 9. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 6 µl Redox Stop Solution. Inkubieren Sie den Ansatz für 10 min bei. Durch Zugabe des entsprechenden s Rehydratisierungspuffers kann die Probe direkt auf den IPG-Steifen aufgetragen werden. 3. Herstellung der S-Dye Working Solution 1. Erwärmen Sie die S-Dye Reaktionsgefäße auf Raumtemperatur. 2. Zentrifugieren Sie die Reaktionsgefäße kurz. 3. Lösen Sie die S-Dyes in 17 µl S-Dye Solvent pro 4S Reaktionsgefäß. 4. Mischen (Vortex) und zentrifugieren Sie kurz. Die S-Dye Working Solution ist nun für die weitere Verwendung bereit. 4. Herstellung der CinC Working Solution 1. Erwärmen Sie das CinC Reaktionsgefäß auf Raumtemperatur. 2. Zentrifugieren Sie das Reaktionsgefäß kurz. 3. Lösen Sie den CinC in 17 µl CinC Solvent pro Reaktionsgefäß. 4. Mischen (Vortex) und zentrifugieren Sie kurz. Die CinC Working Solution ist nun für die weitere Verwendung bereit. 5. Herstellung der TCEP-Reduktionslösung 1. Geben Sie 400 µl steriles ddh 2 O in das TCEP-Reaktionsgefäß. 2. Vortexen und zentrifugieren Sie das Reaktionsgefäß kurz. 3. Ihre TCEP-Reduktionslösung ist nun für die weitere Verwendung bereit. Hinweis: Für die Reduktion der Proteine empfehlen wir die Verwendung des mitgelieferten TCEP anstelle von DTT. DTT interagiert mit den S-Dyes und muss bei Verwendung vor der eigentlichen Labelingreaktion wieder entfernt werden (z.b. durch Dialyse). 6. Direktes Labeling (vgl. Tabelle 1) 1. Stellen Sie die Proteinkonzentration Ihrer Probe auf 0,55 µg/µl ein. Verwenden Sie hierfür den Redox Labeling Buffer. 2. Geben Sie für das Labeling der reduzierten Cysteine zu 9 µl Proteinprobe (entsprechend 5 µg Protein) 3 µl S-Dye300 Working Solution. Nach kurzem Vortexen und anschließender Zentrifugation inkubieren Sie den Ansatz für 1 Stunde bei. 3. Zentrifugieren Sie den Reaktionsansatz kurz. 4. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 3 µl Redox Stop Solution. Inkubieren Sie den Ansatz für 10 min bei. 5. Entfernen Sie überschüssige S-Dye300 Moleküle (vgl. Punkt 8). 7. Indirektes Labeling (vgl. Tabelle 1) 1. Stellen Sie die Proteinkonzentration Ihrer Probe auf 0,55 µg/µl ein. Verwenden Sie hierfür den Redox Labeling Buffer. 2. Geben Sie für die Blockierung der reduzierten Cysteine zu 9 µl Proteinprobe (entsprechend 5 µg Protein) 3 µl CinC-Working Solution. Nach kurzem Vortexen und anschließender Zentrifugation inkubieren Sie den Ansatz für 1 Stunde bei. 3. Zentrifugieren Sie den Reaktionsansatz kurz. 4. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 3 µl Redox Stop Solu- tion. Inkubieren Sie den Ansatz für 10 min bei. 5. Entfernen Sie überschüssigen CinC (vgl. Punkt 8). 6. Geben Sie für die Cysteine 2,5 µl TCEP-Reduktionslösung zu Ihrem Ansatz. Nach kurzem Vortexen und anschließender Zentrifugation inkubieren Sie den Ansatz für 1 Stunde bei. 7. Zentrifugieren Sie den Reaktionsansatz kurz. Geben Sie für das Labeling oxidierter Cysteine 5 µl S-Dye300 Working Solution zu Ihrem Reaktionsansatz, vortexen und zentrifugieren Sie kurz. Inkubieren Sie den Ansatz für 1 Stunde bei. 8. Zentrifugieren Sie den Ansatz kurz. 9. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 6 µl Redox Stop Solution. Inkubieren Sie den Ansatz für 10 min bei. Durch Zugabe des entsprechenden s Rehydratisierungspuffers kann die Probe direkt auf den IPG-Steifen aufgetragen werden. 8. S-Dye bzw. CinC Moleküle Achtung: Die Redox-Matrix enthält Konservierungsstoffe (ätzend). Vorbereitung der Säule: 1. Mischen Sie die Redox-Matrix gründlich, so dass eine homogene Suspension entsteht. 2. Beladen Sie die leere Spin-Säule. Verwenden Sie die in Tabelle 2 aufgeführten an Matrix je nach Größe Ihres Ansatzes. Teilen Sie ggf. Ihren Ansatz und verwenden Sie mehrere Säulen. 3. Setzen Sie die beladene Säule auf ein 2 ml Reaktionsgefäß und zentrifugieren Sie für 2 min bei 800 x g. 4. Verwerfen Sie den Durchlauf. Equilibrieren der Säule: 1. Geben Sie 500 µl Wash Buffer auf die Säule. 2. Zentrifugieren Sie für 1 min bei 800 x g. 3. Verwerfen Sie den Durchlauf. 4. Wiederholen Sie den Equilibriervorgang zweimal und verlängern Sie dabei den letzten Zentrifugationsschritt auf 2 min. 3

4 Laden der Probe: 1. Setzen Sie die Säule auf ein frisches 2 ml Reaktionsgefäß. 2. Geben Sie Ihre Probe langsam und mittig auf die Matrix. Eluieren der Probe: 1. Zentrifugieren Sie für 2 min bei 800 x g. 2. Vereinigen Sie ggf. die Durchläufe geteilter Ansätze. 3. Bestimmen Sie das genaue Durchlaufvolumen (z.b. mit einer Pipette). 9. Herstellung des Internen Standards (IS; vgl. Tabelle 1) Der interne Standard (IS) ist eine Mischung aus allen Proteinproben (vollständig reduziert) Ihres Experimentes im gleichen Verhältnis. Der IS sollte parallel zu Ihren anderen Ansätzen hergestellt werden und wird wie die eigentliche Probe behandelt (inkl. Dye- bzw. CinC-Removal). Pro Gel benötigen Sie 5 µg Proteingemisch als IS. 1. Mischen Sie für die Herstellung des IS alle Proben des Experimentes im gleichen Verhältnis. 2. Stellen Sie die Proteinkonzentration des IS auf 0,55 µg/µl mit Redox Labeling Buffer ein. Pro Gel benötigen Sie 5 µg (entsprechend 9 µl) Proteingemisch. 3. Inkubieren Sie den Ansatz für 1 Stunde bei 4. Zentrifugieren Sie den Ansatz kurz. 5. Führen Sie, wie in Abschnitt 8 beschrieben, das Dye- bzw. CinC- Removal durch. Teilen Sie ggf. Ihren Ansatz auf und verwenden Sie mehrere Säulen. Vereinigen Sie im Anschluss die Durchläufe. 6. Geben Sie für die Reduktion der Cysteine zu 9 µl Proteinprobe (entsprechend 5 µg Protein) 1,5 µl TCEP-Reduktionslösung. 7. Nach kurzem Vortexen und anschließender Zentrifugation inkubieren Sie den Ansatz für 1 Stunde bei. 8. Zentrifugieren Sie den Reaktionsansatz kurz und geben Sie für das Labeling der Cysteine 3 µl S-Dye200 Working Solution (je 5 µg Protein) dazu. Nach kurzem Vortexen und anschließender Zentrifugation inkubieren Sie den Ansatz für 1 Stunde bei. 9. Zentrifugieren Sie den Ansatz kurz. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 4 µl Redox Stop Solution (je 5 µg Protein). Inkubieren Sie den Ansatz für 10 min bei. Durch Zugabe des entsprechenden s Rehydratisierungspuffers kann die Probe direkt auf den IPG-Steifen aufgetragen werden. Belichtungszeit der CCD-Kamera für den Fluoreszenz-Farbstoff bei der geringsten Auflösung ermitteln. Beachten Sie dabei, dass die Signalintensität der stärksten Proteinspots knapp unterhalb der Sättigung liegt (Sättigung: Graustufen bei 16-Bit). Saturn-2D Gele können fixiert und gelagert werden, ohne das das Imaging beeinträchtig wird. Gele können vor dem Scannen bis zu 24 h in den Glaskassetten aufbewahrt werden. Für eine längere Lagerung fixieren Sie das Gel für 30 min in einer Lösung aus 40% Ethanol und 10% Essigsäure. Lagern Sie Ihre Gele in einer Lösung aus 25% Ethanol und 3% Glycerol. Für ein erneutes Scannen, inkubieren Sie Ihr Gel vorher für 15 min in Wasser. Bei Verwendung von Fertiggelen beachten Sie bitte die Hersteller-Angaben. Weitere Informationen finden Sie online unter www. im Bereich Weitere Informationen. S-Dye Anregungs- und Emissions-Eigenschaften Dye max. Anregung [nm] max. Emission [nm] S-Dye S-Dye Lagerung Lagern Sie das Saturn-2D REDOX Pack 1 unter Lichtausschluss bei -20 C bis -80 C. Lagern Sie das Saturn-2D REDOX Pack 2 bei 2-8 C. Markieren Sie die Proteine innerhalb von drei Wochen nach dem Lösen der S-Dyes bzw. CinC. Markierte Proteine können bis zu drei Monate bei -80 C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden. Mindesthaltbarkeit: Siehe Aufdruck Kitverpackung 10. Massenspektrometrische Analysen Die Markierung von Cysteinen hat keinen Einfluss auf die spätere Identifizierung durch massenspektrometrische Analysen. Es beeinflusst weder die Effizienz enzymatischer Verdaue noch die Sequenzabdeckung im Vergleich zu unmarkierten Proteinen. Zur Identifizierung redox-sensitiver Proteine nach Saturn-2D RE- DOX-Analysen empfehlen wir die Anfertigung eines präparativen Gels (Verwenden Sie hierfür den Saturn-2D Labeling Kit 8S + 40; PR33). 11. Fluoreszenz-Imaging Jeder Fluoreszenzfarbstoff benötigt für seine optimale Leistung eine spezifische Anregungsenergie. Des Weiteren beeinflussen die Beschaffenheit Ihrer Probe und Gele die notwendige Anregungsenergie. Um eine bestmögliche Fluoreszenz-Detektion zu erreichen, sollten Sie vor dem eigentlichen Scan einen Vorscan durchführen, bei dem Sie die optimale Detektionsspannung des Photomultipliers (PMT) bzw. die 4

5 Dye- bzw. CinC-Removal Reduktion Labeling II Labeling I Stop Solution S-Dye200 S-Dye300 CinC TCEP- Reduktionslösung Matrix Stop Solution S-Dye300 Ansatz Protein CinC Lösung Probe - direkt (1 Gel) , ,5 Probe - indirekt (1 Gel) , ,5 IS (2 Gele) für 10 min bei für 10 min bei Tabelle 1: Pipettierschema für Saturn-2D REDOX Analysen 1S 2S 3S 4S 5S 6S 7S 8S 9S 10S 11S * 112* 128* 144* 160** 176** Ansatz Probe Matrix pro Säule Säulen 1S 2S 3S 4S 5S 6S 7S 8S 9S 10S 11S * 90* 99* Ansatz interner Standard Matrix pro Säule Säulen Tabelle 2: Dye- bzw.cinc-removal * Ansatz auf 2 Säulen aufteilen ** Ansatz auf 3 Säulen aufteilen 5

Saturn-2D Labeling Kit Page 1

Saturn-2D Labeling Kit Page 1 2 Lagerung und Haltbarkeit Produktinformation Labeling Kit Product no. PR31, PR32, PR33 Weinbergweg 23 D-06120 Halle Technical Support Fon: +49 (0) 345-2799 6413 e-mail: service@dyeagnostics.com www.dyeagnostics.com

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