Entwicklung von superparamagnetischen Eisenoxid- Nanopartikeln als Radiokatalysatoren in der Strahlentherapie

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1 Entwicklung von superparamagnetischen Eisenoxid- Nanopartikeln als Radiokatalysatoren in der Strahlentherapie Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Anja Nicole Sommer aus Sonneberg

2 Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Johannes Barth Gutachterin: Prof. Dr. Carola Kryschi Prof. Dr. Franziska Gröhn

3 Die hier vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von Januar 2009 bis August 2013 am Lehrstuhl für physikalische Chemie I der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen- Nürnberg.

4 Abkürzungsverzeichnis acac B D C DCF DCFH-DA DEG degas. DMEM D SP E A EDTA E Kin EtOH EXAFS FBS Fe octa Fe tetra FTIR Gy H h HRTEM HT k B LT MCF7 M S MTT NP Okta PBS RT Acetylacetonat magnetischen Flussdichte kritischer Durchmesser 2,7 -Dichlorofluorescein 2,7 -Dichlorofluoresceindiacetat Diethylenglykol entgasen [(englisch) degasify] Dulbecco's Modifizierte Medien Superparamagnetischer Durchmesser Anisotropieenergie Ethylendiamintetraessigsäure kinetische Energie Ethanol Röntgenabsorptionsspektroskopie [(englisch) extended X-ray absorption fine structure] Fetales Kälberserum [(englisch) fetal bovine serum] oktaedrisch koordiniertes Eisen tetraedrisch koordiniertes Eisen Fourier-Transformations Infrarotspektroskopie Gray magnetischen Feldstärke Plancksches Wirkungsquantum Hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopie hohe Temperatur Boltzmann-Konstante niedrige Temperatur Michigan Cancer Foundation 7 (Brustkrebszelllinie) Sättigungsmagnetisierung 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid Nanopartikel Oktaedrisch Phosphatpufferlösung Raumtemperatur IV

5 SPIONs Superparamagnetische Eisenoxid Nanopartikel SPM Superparamagnetismus SQUID supraleitende Quanteninterferenzeinheit T Temperatur T B T C TEM Tetra T K T N UV-vis V P XANES XPS XRD δ G f λ ν Blockierungstemperatur Curie-Temperatur Transmissionselektronenmikroskopie Tetraedrisch kritische Temperatur Néel-Temperatur Ultraviolett-sichtbar Partikelvolumen Röntgen-Nahkanten-Absorptions-Spektroskopie [(englisch) near-edge X-ray absorption fine structure] Röntgenphotoelektronenspektroskopie [(englisch) X-ray photoelectron spectroscopy] Röntgendiffraktion [(englisch) X-ray diffraction] Deformationsschwingung freie Bildungsenthalpie Wellenlänge Valenzschwingung Wellenzahl µ Permeabilität µ mag magnetisches Dipolmoment V

6 Inhaltsverzeichnis 1. EINLEITUNG MAGNETISCHE EISENOXID-NANOPARTIKEL UND DEREN EIGENSCHAFTEN Eisenoxide Magnetismus Nanopartikel allgemein und Eisenoxidnanopartikel Herstellungsverfahren und Stabilisierungsmöglichkeiten SPIONS IN DER BIOMEDIZIN Krebserkrankungen, Entstehung und Therapie Strahlentherapie und die Verwendung von SPIONs CHARAKTERISIERUNGSMETHODEN FÜR SPIONS Transmissionselektronenmikroskopie Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie Röntgendiffraktometrie Röntgenabsorptionsspektroskopie Röntgenphotoelektronenspektroskopie Supraleitende Quanteninterferenzeinheit IN VITRO UNTERSUCHUNGEN DER SYNTHETISIERTEN SPIONS Zytotoxizitätsstudien und ROS-Produktion ZIELSETZUNG ERGEBNISSE UND DISKUSSION SYNTHESEN UND STABILISIERUNGEN DER SPIONS Synthesen und Stabilisierungen von SPIONs in Wasser bei niedriger Temperatur Synthesen und Stabilisierungen von SPIONs in DEG bei hoher Temperatur CHARAKTERISIERUNGEN DER SPIONS SPIONs aus Mitfällung in Wasser bei niedriger Temperatur (LT-SPIONs) SPIONs aus Synthesen in DEG bei hoher Temperatur (HT-SPIONs) IN VITRO BIOKOMPATIBILITÄT DER SPIONS Thiazolylblaufärbung Trypanblaufärbung Aufnahme in die Zelle Bestrahlung und ROS Produktion in der Zelle mittels SPIONs Untersuchung zu möglichen Ursachen der ROS-Produktion durch die Bestrahlung ZUSAMMENFASSUNG SUMMARY EXPERIMENTELLER TEIL INSTRUMENTE UND METHODEN CHEMIKALIEN VI

7 5.3. SYNTHESETECHNIKEN Synthesevorschrift der LT-SPIONs Synthesevorschrift der HT-SPIONs LITERATUR APPENDIX LISTE DER VERÖFFENTLICHUNGEN VII

8 Einleitung 1. Einleitung Nanotechnologie gilt als die wichtigste Schlüsseltechnologie des 21. Jahrhunderts und wurde bereits 1959 von dem Nobelpreisträger Richard P. Feynman in seinem Vortrag "There s Plenty of Room at the Bottom" indirekt vorausgesagt. [1] Der Begriff Nanotechnologie wurde aber erstmals 1974 durch den Japaner Norio Taniguchi verwendet und ist bis heute allgegenwärtig. [2] Der Name dieser Technologie leitet sich von der Größendimension ab, mit der sie sich befasst, dem Nanometerbereich (1 nm = 10-9 m). Durch das ständige Streben nach Miniaturisierung in nahezu allen Bereichen des menschlichen Schaffens ist dieser Forschungszweig sowohl in akademischen als auch industriellen Einrichtungen stark vertreten. Es bedarf einer interdisziplinären Forschungszusammenarbeit, um all die neuen Eigenschaften, Einsatzmöglichkeiten und Risiken, welche die Nanotechnologie betreffen, erforschen und verstehen zu können. Der Anlass hierfür ist, dass die meisten Substanzen durch eine Reduzierung ihrer Dimensionen auf nm eine mitunter drastische Modifikation ihrer physikochemischen und biologischen Eigenschaften erfahren. [3] Die Palette an Einsatzmöglichkeiten von Nanotechnologien und Nanopartikeln ist breit. In Form von Verpackungen, Textilien, Auto- und Computerzubehör, Katalysatoren, Lebensmitteln, Kosmetika oder Biomedizin sind sie bereits ein fester und kaum mehr wegzudenkender Bestandteil unseres alltäglichen Lebens [4, 5] geworden. Durch einen Einsatz in der Medizin, was auch als Nanomedizin bezeichnet wird, wird laut Experten eine Revolution auf den Gebiete der gezielten Arzneistoffgabe, Krankheitsfindung und Therapie erzielt werden können. Neben all den Vorzügen, die Nanomaterialien der Menschheit bieten können, gibt es aber auch ungeahnte Risiken, die erst in jüngster Zeit erkannt wurden und erforscht werden [6, 7] müssen. Insbesondere haben magnetische Eisenoxidpartikel das Interesse der Forscher geweckt. Magnetit, Maghemit und Hämatit sind die bekanntesten Eisenoxide und werden, wenn sie mit superparamagnetischen Eigenschaften ausgestattet sind, zur Klasse der superparamagnetischen Eisenoxidnanopartikel, kurz SPIONs (englisch: superparamagnetic iron oxide nanoparticles) gezählt. Ebenfalls superparamagnetisches Verhalten zeigen die aus Eisen und anderen 1

9 Einleitung Übergangsmetallen wie zum Beispiel Kupfer, Kobalt und Nickel zusammengesetzten Ferrite.[7] Kennzeichnend für diese Partikel ist ihr großes magnetisches Moment, was zur ihrer außergewöhnlichen Fähigkeit führt, durch den Einsatz eines externen Magnetfeldes gezielt gesteuert werden zu können[8] (Abbildung 1.1). Da die Partikel superparamagnetisches Verhalten aufweisen, bleibt nach der Abschaltung des Magnetfeldes keine Magnetisierung zurück.[9] Deshalb sind technologische Anwendungen unter anderem auf dem Gebiet der magnetischen Datenspeicherung oder in Form magnetischer Flüssigkeiten (Ferrofluids) und magnetischer Tinten, sowie der Katalyse denkbar. Aber auch für medizinische und biotechnologische Anwendungen, wie den gezielten Wirkstofftransport, Kontrastmittel für die Magnetresonanztomographie und für die Tumortherapie, unter anderem durch Hyperthermie, bieten SPIONs vielversprechende Verbesserungen.[10, 11] Bevor SPIONs Einzug in diese Gebiete halten können, müssen sie aber intensiv auf ihre Bioverträglichkeit, Bioverteilung und ihren biologischen Abbau untersucht werden. Die Übergangsmetallferrite, welche über besonders hohe Sättigungsmagnetisierungen verfügen, sind aufgrund ihrer Toxizität von geringerem Interesse für biomedizinische Anwendungen.[12] Im biologischen oder medizinischen Bereich müssen Nanopartikel besonders hohe Anforderungen erfüllen. Sie müssen ungiftig und in wässrigen Medien bei neutralen ph-werten und unter physiologischen Salzbedingungen stabil sein und dürfen nicht agglomerieren. Aus diesem Grunde sind die weitverbreitetsten SPIONs Magnetit (Fe3O4) und Maghemit (γ-fe2o3). Sie sind größtenteils durch relativ simple Herstellungsverfahren in guten Qualitäten synthetisierbar und können vor oder nach der Synthese mit biokompatiblen Stoffen funktionalisiert werden, die zur Stabilisierung oder als Funktionalitäten für die gewünschten Einsatzgebiete dienen.[7] Abbildung 1.1: In Wasser dispergierte SPIONs (Ferrofluids). Links ohne den Einfluss eines externen Magnetfeldes und rechts im Einfluss des externen Magnetfeldes. 2

10 Einleitung Moderne Syntheseverfahren sollten die Schonung von Ressourcen und den Umweltschutz in ihrem Fokus rücken. Dies wird seit einiger Zeit mit dem Begriff "grünen Chemie" zusammengefasst und hat besonders mit Nachhaltigkeit und somit umweltbezogenen und ökonomischen Gedanken zu tun. Aufgrund dieser gebräuchlichen Überlegungen soll auch bei der Herstellung von SPIONs dieser Grundgedanke verfolgt werden. Es soll besonders der Energieaufwand gering gehalten werden und die verwendeten Reaktanten (Eisensalze und oberflächenaktive Substanzen) sowie speziell das verwendete Lösungsmittel sollten günstig und ungiftig sein. Auch während der gesamten Syntheseroute sollen keine schädlichen Nebenprodukte entstehen. Das Lösungsmittel, das in der Synthese und in den folgenden Aufreinigungsschritten eine besondere Position einnimmt, muss mit großem Bedacht gewählt werden. In "grünen" Methoden ist deshalb Wasser als nicht toxische Flüssigkeit und wegen seiner Verfügbarkeit äußerst beliebt. Dies und der gewünschte Einsatz der SPIONs im medizinischen Bereich spricht für Synthesen, die [13, 14] dem "grünen" Gedanken der Chemie Folge leisten. Solche biokompatiblen und abbaubaren SPIONs werden bereits in Kliniken als MRT- Kontrastmittel zur Diagnose oder für die Hyperthermie zur Überhitzung von Tumoren genutzt. Besonders die Behandlung von Tumorerkrankung ist aufgrund deren Häufigkeit im Fokus der Forschung. Die Haupttodesursache weltweit ist Krebs, eine Krankheit, die durch unkontrolliertes Wachstum von Zellen sowie deren Ausbreitung in gesundes Gewebe gekennzeichnet ist. Krebs ist der Oberbegriff für eine Reihe unterschiedlichster Erkrankung, die meist damit einhergehen, dass die ersten Symptome meist erst dann auftreten, wenn die Krankheit bereits weit fortgeschritten ist. Dies führt dazu, dass die meisten Menschen auch heute noch von enormer Angst befallen werden, wenn sie mit der Diagnose Krebs konfrontiert werden. Die wichtigsten Behandlungsformen dieser Krankheit sind Operationen, Chemotherapie und Strahlentherapie. Die beiden letztgenannten Methoden sind aufgrund ihrer mangelnden Tumorspezifität mit unerwünschten und meist schmerzhaften Nebenwirkungen sowie Schädigungen von gesundem Gewebe behaftet. Eine Verbesserung dieser Therapiemethoden ist deshalb unerlässlich, um die Situation der Patienten signifikant zu verbessern. Hierfür kommen besonders SPIONs mit ihren einzigartigen Eigenschaften in Frage. Sie können durch ihren superparamagnetischen Charakter mit Hilfe eines externen Magnetfeldes in die Tumorregion geleitet werden, um dort gezielt wirken zu können. Zum Beispiel durch 3

11 Einleitung angebundene Zytostatika oder durch die Strahlentherapie induzierte Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies. Die Strahlentherapie könnte damit entscheidend verbessert werden, da nur geringere Strahlendosen eingesetzt werden müssen und die zusätzlich gebildeten reaktiven Spezies ebenfalls zur Zerstörung von Tumoren [15, 16, 17, 18, 19a-c] beitragen können Magnetische Eisenoxid-Nanopartikel und deren Eigenschaften Metalloxide stellen wohl die gebräuchlichste und umfangreichste Klasse an Materialen mit besonderen strukturellen Merkmalen und überragenden chemischen und physikalischen Eigenschaften dar. Diese Materialen bieten aufgrund ihrer komplexen Strukturen bemerkenswerte elektrische, elektrochemische, mechanische, optische sowie magnetischen Eigenschaften. Diese ohnehin schon vielversprechenden Charakteristika, kombiniert mit den zusätzlichen Eigenschaften, welche eine Reduktion der Dimensionen von Stoffen hervorruft, macht diese Klasse zu einem bedeutenden Forschungsgebiet. Es gilt die Eigenschaften dieser Substanzklasse für einen Einsatz in diversen Bereichen des alltäglichen Lebens zu untersuchen. Besonders magnetische Eisenoxidnanopartikel, wie Fe 3 O 4 und γ- Fe 2 O 3, sind aufgrund der mannigfaltigen Eigenschaften und ihrer exzellenten Biokompatibilität seit geraumer Zeit Gegenstand vielfältiger Forschungen. [20] Eisenoxide Eisen tritt in chemischen Verbindungen hauptsächlich in seinen zwei- und dreiwertigen Oxidationsstufen auf. Mit Sauerstoff bildet Eisen mehrere Oxide sowie Hydroxide. [21] In der Natur kommen Eisenoxide in vielen verschiedenen Modifikationen als Mineralien vor, aber auch im Labor sind diese gut darstellbar. Die drei bekanntesten reinen Eisen-Sauerstoff-Verbindungen sind: Magnetit (Fe 3 O 4 ), sowie die beiden [4, 20] Formen des Dieisentrioxid: Maghemit (γ-fe 2 O 3 ) und Hämatit (α-fe 2 O 3 ). 4

12 Einleitung Eisen(III)-oxid [3, 22, 23, 24, 25] kommt in zwei natürlichen Modifikationen vor, dem α- Fe 2 O 3 und dem metastabilen γ-fe 2 O 3. Es existieren aber auch β-fe 2 O 3 und ε-fe 2 O 3. Das älteste bekannte Eisenoxid ist der in vielen Gesteinsarten vorkommende schwarz-graue Hämatit, wegen seiner blutroten Strichfarbe auch Blutstein genannt. Es ist unter natürlichen Bedingungen sehr stabil und somit meist das Endprodukt der Umwandlung der anderen Eisenoxide. Die γ-form des Eisen(III)-oxids wird als Maghemit bezeichnet, das durch Erhitzen in die stabile α-form überführt werden kann oder durch die Oxidation/Verwitterung von Fe 3 O 4 entsteht (Abbildung 1.2). [nach 21] Abbildung 1.2: Umwandlungsmechanismus der drei wichtigsten Eisenoxide. Das schwarze Mineral Magnetit ist eine gemischtvalente Verbindung (Eisen(II, III)- oxid) und wird auch Magneteisenstein genannt, da es den stärksten Magnetismus von allen Übergangsmetalloxiden zeigt. [3, 22, 23, 24, 25] Einige Eigenschaften dieser drei bedeutsamen Eisenoxide sind in Tabelle 1.1 zusammengefasst. 5

13 Einleitung Eigenschaften Eisenoxide Magnetit Maghemit Hämatit Formel Fe 3 O 4 γ-fe 2 O 3 α-fe 2 O 3 Dichte [g/cm3]] Schmelzpunkt [ C] Härte Magnetismus ferromagnetisch ferrimagnetisch schwach Curie-Temperatur [K] Ms bei 300 K [A-m 2 /kg] ferromagnetisch oder antiferromagnetisch G f [kj/mol] Kristallsystem kubisch kubisch, tetraedrisch rhomboedrisch, hexagonal Strukturtyp Inverser Spinell Defektspinell Korund Raumgruppe Fd3m P (kubisch), Gitterparameter [nm] P (tetragonal) a = a = (kubisch) a = , c = (tetragonal) R3c (hexagonal) a = , c = (hexagonal) a Rh = , α = 55.3 (rhomboedrisch) [nach 4] Tabelle 1.1: Physikalische und magnetische Eigenschaften der wichtigsten Eisenoxide. Die interessantesten und populärsten Vertreter sind Magnetit und Maghemit, da sie über eine exzellente bestätigte Bioverträglichkeit verfügen. [22] Auf die Kristallstrukturen von diesen Eisenoxiden, welche in der vorliegenden Arbeit von Bedeutung sind, wird im Folgenden ausführlicher eingegangen. 6

14 Einleitung [21, 23-31] Beide Eisenoxide kristallisieren in der inversen Spinellstruktur bzw. einer Defektvariante davon. Die Unterschiede in den Systemen resultieren aus den unterschiedlichen Valenzen der Eisenkationen. Spinelle werden vom Mineral Spinell (MgAl 2 O 4 ) abgeleitet und stehen im Allgemeinen für Verbindungen mit der Formel AB 2 X 4. Sie verfügen über eine kubisch flächenzentrierte Struktur (fcc-struktur), mit zwei unterschiedlich koordinierten Kationen, die in verschiedenen Oxidationsstufen vorliegen. Die häufigsten Vertreter sind die (2,3)-Spinelle, in denen Kationen der Oxidationsstufen zwei und drei existieren. Die Elementarzelle der Spinelle ist aus acht Formaleinheiten zusammengesetzt. Sauerstoff bildet eine kubisch dichteste Kugelpackung, in welcher die entstehenden 64 Tetraederlücken zu ⅛ von den A- Ionen und die ebenfalls existierenden 32 Oktaederlücken zur Hälfte von B-Ionen besetzt werden. Die normale Spinellstruktur hat die Formel (A) Tetra [B 2 ] Okta O 4. Aufgrund einiger Faktoren, wie der relativen Größen der Kationen, Madelung- Konstante oder der Ligandenfeldstabilisierungsenergie kann auch eine inverse Spinellstruktur entstehen. Der Unterschied zwischen normaler und inverser Spinellstruktur ist die Besetzung der Kationenuntergitter. Beim inversen Spinell sind ⅛ der Tetraederlücken von den B-Ionen besetzt und die Oktaederlücken werden sowohl von A-Ionen als auch von der anderen Hälfte der B-Ionen besetzt. Als Formel gilt hier: (B) Tetra [AB] Okta O 4. Neben diesen Varianten der Spinellstruktur, kann es auch zu Defektvarianten kommen. Magnetit - (Fe 3 O 4 ) Magnetit ist das älteste bekannte magnetische Material, gehört zur Gruppe der Ferrite und kristallisiert in einer, wie in Abbildung 1.3 dargestellten, inversen Spinellstruktur. Diese hat eine flächenzentrierte Einheitszelle, deren Gitterkonstante a = Å beträgt. Es wird zu den inversen (2,3)-Spinellen gezählt und hat die allgemeine Formel (Fe 3+ ) Tetra [Fe 2+ Fe 3+ ] Okta O 4. Sauerstoffanionen bilden entlang der [111]-Richtung eine kubisch dichteste Kugelpackung aus 32 O 2- -Ionen und die Eisenkationen besetzen die tetraedrischen und oktaedrischen Zwischenräume. Die beiden Eisenuntergitter entstehen durch die Besetzung von ⅛ der Tetraederlücken mit der Hälfte der Fe 3+ -Ionen und die restlichen Fe 3+ -Ionen sind zusammen mit den Fe 2+ -Ionen willkürlich auf der Hälfte (16) der oktaedrischen Plätzen verteilt. 7

15 Einleitung Aufgrund des schnellen Elektronenaustausches, der im oktaedrischen Untergitter zwischen den Eisenionen stattfinden kann, ist Magnetit ein guter elektrischer Leiter. Unterhalb einer Temperatur von T V ~ 120 K kommt es zu einem Verwey (Metall- Isolator)-Übergang, wodurch sich die Leitfähigkeit um zwei Größenordnungen verringert, da die Fe 2+ und Fe 3+ -Ionen nun in einer geordneten Struktur vorliegen und kein schneller Ladungsaustausch mehr stattfinden kann. Das Verwey-Modell für das Verständnis des Leitfähigkeitsverlustes unterhalb der Verwey-Übergangstemperatur (T V ) ist bis heute Gegenstand zahlreicher Forschungen und die verantwortlichen Strukturen oder Ursachen dafür werden immer noch stark diskutiert. Abbildung 1.3: Die kubisch flächenzentrierte Kristallstruktur von Fe 3 O 4. Die inverse Spinellstruktur ist in (a) dargestellt, sowie in (b) eine Vergrößerung von tetraedrisch koordinierten Eisenionen (rot) und oktaedrisch koordinierten Eisenionen (gelb). Die Sauerstoffanionen sind zur Übersichtlichkeit als kleine grüne Kugeln dargestellt. [32] Die magnetische Ordnung im Magnetit kann mit dem zwei-untergitter-modell nach Néel erklärt werden. Hierbei kommt es zu einer antiferromagnetischen Kopplung der tetraedrischen und oktaedrischen Untergitter untereinander, da die magnetischen Wechselwirkung (Superaustauschwechselwirkung) zwischen den Eisenkationen stark negativen sind. Die Wechselwirkungen zwischen Eisenionen des gleichen Untergitters hingegen ist schwach positiv, was eine ferromagnetische Kopplung innerhalb des jeweiligen Untergitters zur Folge hat. Aufgrund der Kompensation der Spins der trivalenten Eisenkationen auf tetraedrischen und oktaedrischen Positionen 8

16 Einleitung resultiert ein ferrimagnetisches Gesamtmoment im Magnetit, für das die Spins der Fe 2+ -Ionen verantwortlich sind. Maghemit - (γ-fe 2 O 3 ) Die Struktur des bräunlich schwarzen Maghemit kann von der Magnetitstruktur abgeleitet werden. Im Dieisentrioxid liegen alle Eisenkationen in der dreiwertigen Form vor, weshalb es zu einer kationenarmen Defektspinellstruktur kommt. Die Gitterkonstante der kubischen Einheitszelle beträgt etwa a = Å und sie besteht aus 32 Sauerstoffanionen, 21⅓ statistisch verteilten trivalenten Eisenkationen und 2⅔ Leerstellen. Die Besetzung der acht Tetraederplätze erfolgt wie im Magnetit mit Fe 3+ -Ionen. Die Fe 2+ -Ionen, die im Magnetit die Oktaederlücken besetzen, werden im Maghemit zu ⅔ mit Fe 3+ -Ionen regelmäßig besetzt, wodurch ⅓ der Plätze unbesetzt bleiben und es zu Leerstellen (Symbol: ) im oktaedrischen Untergitter kommt. Die chemische Formel kann als (Fe ) [ Fe / ] O geschrieben werden. Durch die beiden antiparallel ausgerichteten Eisenuntergitter zeigt Maghemit, [21, 23-31] genauso wie Magnetit, bei Raumtemperatur ferrimagnetisches Verhalten Magnetismus Die Herkunft des Magnetismus lässt sich mit zwei Erscheinungsformen zusammenfassen. Beim Kernmagnetismus entsteht ein magnetisches Feld durch die um den Atomkern laufenden Elektronen, die ein magnetisches Bahnmoment haben. Dies trifft auf p-, d-, f-, aber nicht auf s-elektronen zu, da diese einen Bahndrehimpuls besitzen. Die zweite Erscheinungsform betrifft den Magnetismus des Elektrons, das durch den Eigendrehimpuls (Spin) ein magnetisches Spinmoment besitzt. In Atomen, Ionen und Molekülen koppeln die Bahn- und Spindrehimpulse der Elektronen miteinander zu einem Gesamtdrehimpuls und in Folge dessen zu einem [21, 33] magnetischen Gesamtmoment. Wird ein Körper in ein Magnetfeld der magnetischen Flussdichte B (auch als Magnetfeld bezeichnet) gebracht, das durch einen Permanentmagnet oder eine 9

17 Einleitung stromdurchflossene Spule erzeugt werden kann, so erfährt er eine magnetische Polarisation. Die Magnetisierung M (magnetisches Moment pro Volumen) kann wie in Gleichung (1) mit der magnetischen Feldkonstante µ 0 = 4π 10-7 NA -2, der magnetischen Flussdichte und der magnetischen Feldstärke H beschrieben werden. =!" $ (1) Zwischen der Magnetisierung M und der magnetischen Feldstärke H existiert für viele Stoffe ein Proportionalitätskonstante, die magnetische Suszeptibilität χ (2), die Aussagen über die Aufnahmefähigkeit dieses Stoffes gibt. =&$ (2) Aus den beiden obigen Gleichungen lässt sich nun eine weitere Größe, die Permeabilität µ (Durchlässigkeit) wie folgt einführen: µ r ist dabei die relative Permeabilität. μ=μ ( 1+&=μ ( μ + (3) Sind die Suszeptibilitäten unabhängig von der Magnetfeldstärke, so lassen sich diese Stoffe in zwei Klassen einteilen. Wenn M der magnetischen Feldstärke H entgegen gerichtet ist, was zu einer negativen Suszeptibilität (χ < 0) führt, so spricht man vom Diamagnetismus. Hat M aber die gleiche Richtung wie H, so ist χ > 0 und man spricht vom Paramagnetismus. Wenn sehr große positive Werte von χ erhalten werden und die Suszeptibilität von der Feldstärke abhängig ist, so spricht man von [21, 29, 30, 34, 35] ferromagnetischem Verhalten. [21, 29, 30, 34, 35] Diamagnetismus Ihm unterliegen alle Atome, Ionen oder Moleküle mit abgeschlossenen Elektronenschalen. Denn hier kommt es zu einer gegenseitigen Kompensation aller magnetischen Momente der einzelnen Elektronen. Diese Stoffe verfügen über kein resultierendes magnetisches Moment. Dies ist bei Edelgasen oder edelgasähnlichen Ionen (wie K + und Cl - ) und edelgasähnlichen Atomen (wie die meisten organischen Verbindungen) der Fall. Man kann sich Diamagnetismus so vorstellen, dass beim 10

18 Einleitung Einbringen eines diamagnetischen Stoffes in ein äußeres Magnetfeld in den Orbitalen Zusatzströme induziert werden. Diese bedingen ein Magnetfeld, das der Lenzschen Regel folgend, dem äußeren Magnetfeld entgegen gerichtet sein muss. Damit bleibt das magnetische Moment solange erhalten, bis das äußere Magnetfeld wieder abgeschaltet wird. Die diamagnetische Suszeptibilität ist unabhängig von Temperatur und Feldstärke. [10, 21, 29, 30, 34-38] Paramagnetismus Atome, Ionen oder Moleküle, die ungepaarte Elektronen besitzen, werden als paramagnetische Stoffe bezeichnet. In paramagnetischen Stoffen, wie u. a. Sauerstoff, NO oder Metallen (außer Eisen, Nickel, Kobalt), ist χ > 0. Diese haben nach außen ein permanentes magnetisches Gesamtmoment. Liegt kein äußeres Magnetfeld an, so sind die magnetischen Momente entsprechend der stets vorhandenen Temperaturbewegung statistisch verteilt und die Magnetisierung ist gleich null. Bringt man einen solchen Körper in ein äußeres Magnetfeld, so richten sich die "Molekularmagnete" entsprechend aus und es kommt zu einer Gleichrichtung der beiden Magnetfelder. Die paramagnetische Suszeptibilität &, ist im Gegensatz zur diamagnetischen von der Temperatur abhängig und nimmt durch steigende Temperaturen mit 1/T ab. Diese Abhängigkeit lässt sich mit dem Curie- Gesetz (4) zusammenfassen. & - =. / (4) Hier ist C ist die Curie-Konstante und T die Temperatur. Dieses Gesetz ist aber nur im Fall einer Vernachlässigung von Wechselwirkungen zwischen den magnetischen Momenten aufrecht zu halten. Ist diese Wechselwirkungsenergie im Vergleich zur thermischen Energie nicht klein, so muss & - mit dem Curie-Weiss-Gesetz (5) ausgedrückt werden: & - =. /0, (5) wo die Wechselwirkung durch die paramagnetische Curie-Temperatur θ berücksichtigt wird. Um die Magnetisierung dieser Systeme zu berechnen, bedient 11

19 Einleitung man sich der Langevin-Funktion L(x). [10, 35, 37, 38] Die permanenten Dipole richten sich teilweise mit einem Winkel θ zwischen Feld B und dem Dipolmoment µ mag aus, wenn ein äußeres Feld angelegt wird (µ mag B<< k B T). Die potentielle Energie ist gegeben durch: 2= = :. (6) Hieraus ergibt sich unter Berücksichtigung der Boltzmann-Verteilung (k B ist die Boltzmann-Konstante) der Mittelwert 789: : 789: = =>?@0 ABC D E F HI =A BC D E F HI (7) mit dω dem Raumwinkelelement. Durch Integration mit der Variablen x ergibt sich schließlich die Langevin-Funktion L(x): 789: =cothn O QN mit N= R STU V E /. (8) Hieraus lässt sich durch Erweiterungen eine weitere wichtige Größe gewinnen, die Sättigungsmagnetisierung M S. Sie beschreibt den Zustand, bei dem eine parallele Ausrichtung aller magnetischen Momente im Feld vorliegt: = QN mit W X =3 456 Y Z. (9) [10, 11, 20, 29, 30, 34, 35,37] Ferro-, Ferri- und Antiferromagnetismus Von Ferro-, Ferri- und Antiferromagnetismus spricht man, wenn Proben, auch ohne den Beitrag eines äußeren Magnetfeldes, über ausgerichtete und regelmäßig angeordnete magnetischen Momente verfügen (kollektiver Magnetismus). Dies erfolgt aufgrund der Spin-Spin-Wechselwirkung unterhalb einer kritischen Temperatur und wird als spontane Magnetisierung bezeichnet. Sie verfügen über sehr große magnetische Suszeptibilitäten, die eine H Abhängigkeit aufweisen Die Unterscheidung der drei Arten dieses Magnetismus hängt dabei von der Orientierung der Momente ab, wie in Abbildung 1.4 gezeigt ist. 12

20 Einleitung Von Ferromagneten ist die Rede, wenn alle magnetischen Momente parallel ausgerichtet sind. Typische Vertreter sind aus Atomen mit unvollständig gefüllten d- und f-schalen aufgebaut, wie dem Eisen, welchem der Ferromagnetismus seinen Namen verdankt. Weitere Bespiele sind Nickel und Kobalt (3d-Metalle) aber auch Metalle der Seltenen Erden wie Gadolinium und Erbium. Unerlässlich sind dabei ungepaarte Elektronen in d- oder f-orbitalen, die mit benachbarten ungepaarten Elektronen koppeln können. Abbildung 1.4: Schematische Anordnungsmöglichkeiten der magnetischen Momente. Die ungeordnete paramagnetische Phase geht bei T C bzw. T N in die ferro-, antiferro- oder [nach 4] ferrimagnetische Phase über, in der die magnetischen Momente ausgerichtet sind. Ein Ferromagnet ist aus einzelnen kleinen Bereichen mit unterschiedlicher Form und Größe, den Domänen oder auch Weiss-Bezirken aufgebaut, wie in Abbildung 1.5 zu sehen ist. Innerhalb einer dieser Domänen liegt aufgrund der Spin-Spin- Wechselwirkung auch ohne äußeres Magnetfeld eine Parallelausrichtung aller Elementarmagnete vor. Die Domänen untereinander sind antiparallel angeordnet. Innerhalb eines Weiss-Bezirkes herrscht eine starke Magnetisierung, da sich alle magnetischen Momente eines Bereiches addieren. Allerdings kann man nach außen 13

21 Einleitung keine Magnetisierung beobachten, da die vielen Domänen eine völlig chaotische Orientierung zueinander aufweisen und sich ihre magnetischen Momente kompensieren (Gesamtmoment = Null). Der Übergangsbereich zwischen den Domänen wird als Bloch-Wand bezeichnet. Das ist keine scharfe Begrenzung, da innerhalb dieses kleinen Bereiches ein fließender Übergang zwischen den benachbarten Magnetisierungen erfolgt. Die Entstehung dieser Wände wird durch ein Gleichgewicht zwischen magnetostatischer Energie und der Energie der Domänenwände bestimmt. Die magnetostatische Energie steigt proportional zum Volumen an, ebenso wie die Energie der Domänenwand, die von den Grenzfläche unter den Domänen beeinflusst wird. Abbildung 1.5: Magnetische Domänen (Weiss-Bezirke) in einem magnetischen Festkörper. Wenn ein Magnetfeld angelegt wird, so wachsen die Domänen, deren Orientierung parallel zu der des äußeren Feldes ist, auf Kosten der anders orientierten Domänen an. Je stärker das äußere Magnetfeld wird, desto mehr Domänen erreichen die parallele Orientierung der magnetischen Momente und man erreicht die Plateauregion der Sättigungsmagnetisierung M S. Dieses Verhalten lässt sich durch eine, in Abbildung 1.6 dargestellte, Magnetisierungskurve (B-H-Auftragung oder M-H- Auftragung) darstellen. 14

22 Einleitung Abbildung 1.6: Hystereseschleife von ferro- und ferrimagnetischen Stoffen, hier aufgetragen als B-H-Magnetisierungskurve. [39] Wird nach dem Erreichen der M S die magnetische Feldstärke auf null reduziert, dann verläuft die Magnetisierungskurve nicht entlang der Neukurve, sondern erfährt eine Hysterese. Im System bleibt eine Remanenzmagnetisierung M R (entspricht B r in Abbildung 1.6) zurück. Erst bei einer negativen Koerzitivfeldstärke H C erreicht die Magnetisierung wieder einen Wert von Null. Die energetisch günstige Parallelstellung kann durch eine steigende Temperatur (hohe thermischen Energie) gestört werden und bricht bei T C, der Curie-Temperatur, zusammen. Oberhalb von T C kommt es zu einem dramatischen Abfall der Suszeptibilität (Abbildung 1.7) und der Ferromagnet geht in die paramagnetische Phase über. Dieses Temperaturverhalten en lässt sich mittels des Curie-Weiss- Gesetzes (5) darstellen. 15

23 Einleitung Abbildung 1.7: Temperaturabhängigkeit der magnetischen Suszeptibilität bei [nach 34] paramagnetischen, ferromagnetischen und antiferromagnetischen Stoffen. Beim Antiferro- und Ferrimagnetismus sind die antiparallelen magnetischen Momente auf zwei Untergitter aufgeteilt. Ähnlich den Ferromagneten tritt oberhalb einer kritischen Temperatur, eine Umwandlung in den Paramagnetismus auf (Curie-Weiss- Gesetz). Bei Antiferromagneten ist das die Néel-Temperatur T N und bei Ferrimagneten die T C, wie in Abbildung 1.4 oder Abbildung 1.7 dargestellt wird. Wenn die Spins eines Stoffes (wie zum Beispiel: α-fe 2 O 3 und MnO) paarweise antiparallel orientiert sind und diese sich kompensieren, so spricht man vom einem Antiferromagneten. Die χ-werte erreichen bei T N ihr Maximum. Sind die magnetischen Momente innerhalb der Domänen allerdings unterschiedlich groß, und findet keine vollständige Kompensation statt, so liegt ein ferrimagnetisches Material vor. Ferrimagneten haben ein ähnliches (abgeschwächtes) Verhalten der Suszeptibilität wie ferromagnetische Stoffe. Auch sie zeigen nach außen wegen der statistischen Verteilung der Spinmomente der Weiss-Bezirke keine Magnetisierung ohne äußeres Feld. Befindet sich ein solches System bei T = 0 K, so sind alle magnetischen Momente orientiert und man befindet sich in der Sättigungsmagnetisierung. Beispiele für diese Klasse sind Spinelle und Granate. Der bekannteste Ferrit (inverser Spinell) ist Fe 3 O 4. [6, 10, 11, 20, 37] Superparamagnetismus Die magnetischen Eigenschaften sind extrem von der Größe der Partikel abhängig. Wie in Abbildung 1.5 dargestellt ist, bestehen große magnetische Körper aus einer Mehrdomänenstruktur. Erfolgt nun eine Reduktion der Größe dieser Materialien in 16

24 Einleitung den Nanometerbereich, so werden deren Eigenschaften von Oberflächen- und Finit- Size-Effekten dominiert. Der Finit-Size-Effekt resultiert aus der geringen Größe der Teilchen und somit der Quantenbeschränkung der Ladungsträger. Die Oberflächeneffekte ergeben sich aus Symmetriebrüchen an der Oberfläche der Nanopartikel (NP). Wird die Partikelgröße unter einen kritischen materialabhängigen Durchmesser D C minimiert, so ist die Mehrdomänenstruktur energetisch ungünstig und dieser NP besteht nur noch aus einer Einzeldomäne (Abbildung 1.8). In Partikeln mit nur einer Domäne herrscht eine homogene Magnetisierung, da alle Spins in eine Richtung zeigen. Die Spinrotation führt zur Magnetisierungsumkehr. Abbildung 1.8: Schematische Darstellung der Abhängigkeit von Koerzitivfeldstärke und [nach 20] Partikeldurchmesser. Der kritische Durchmesser hat für sphärische Fe 3 O 4 -Nanopartikel etwa einen Wert von 128 nm und für entsprechende γ-fe 2 O 3 -Nanopartikel beträgt D C = 166 nm. Die D C -Werte sind von unterschiedlichen Anisotropiebeiträgen abhängig. Sowohl die Struktur als auch die chemische Zusammensetzung sorgen für Anisotropie im System. Man unterscheidet zwischen der magnetokristallinen Anisotropie, die durch die Kristallstruktur verursacht wird und der magnetostatischen Anisotropie, die durch die Form des Kristalls und dem damit verbunden Entmagnetisierungsfeld hervorgerufen wird. In NP tritt außerdem noch Oberflächenanisotropie auf, welche mit steigendem Oberfläche-zu-Volumenverhältnis steigt und von Wechselwirkungen zwischen den Oberflächenatomen und anderen adsorbierten chemischen Spezies beeinflusst wird. Ferner ist für die Anisotropie die Agglomeration der NP 17

25 Einleitung entscheidend, da die magnetische Anisotropieenergie E A individueller Partikel variiert und somit eine Art gewichteter Mittelwert der Partikelanisotropie bestimmt wird. Die Arbeit, die erforderlich ist, um einen ferromagnetischen Partikel aus dem nicht magnetischen Zustand zu M S zu bringen, wird im Körper als E A gespeichert. Sie stellt eine Energiebarriere dar, welche die Drehung der Magnetisierung aus der easy axes verhindert. Eindomänenpartikel haben eine bevorzugte Richtung ihres Magnetisierungsvektors, die easy axes, die durch Minima der E A bestimmt wird. E A steigt mit dem NP-Radius. Die Energie dieser magnetischen Partikel ist von der Richtung der Magnetisierung hinsichtlich ihrer easy axes abhängig und steigt mit dem Beugungswinkel zwischen den easy axes und dem Magnetisierungsvektor. Ihre Gleichgewichtsrichtungen werden durch die Energiebarriere E A getrennt, die sich aus dem Produkt des Partikelvolumens V P und der magnetischen Anisotropiekonstante K A ergibt (Gleichung 10). Das gilt für den einfachen Fall der uniaxiale Anisotropie. [ \ =]^_ \ (10) Werden die Dimensionen der NP kleiner als D SP in Abbildung 1.8, so übersteigt die thermische Energie k B T diese Energiebarriere und die Magnetisierung kann leicht gedreht werden. Diese Partikel verhalten sich somit wie ein Paramagnet (H C = 0), wobei in den Einzeldomänenpartikeln ein großes magnetisches Supermoment anstelle vieler einzelner Spins existiert. Diese Art des Magnetismus wird als Superparamagnetismus bezeichnet. Das Verhalten im äußeren Magnetfeld von Superparamagneten lässt sich ebenfalls mittels Langevin-Funktion beschreiben. Ein Superparamagnet zeigt keine Hysteresekurve, sondern aufgrund der schnellen Spin-Relaxation einen perfekten, umkehrbaren sigmoidalen Verlauf. Welche Prozesse für die Spin-Relaxation, also die Fluktuation der magnetischen Momente zwischen verschiedenen Richtungen der Magnetisierung verantwortlich sind, hängt vom Zustand des Systems ab. Liegen die superparamagnetischen NP in Pulverform vor, so wird die Rückkehr zum Gleichgewicht der Magnetisierung von der Néel-Relaxation τ N bestimmt. Sind die NP in einem Lösungsmittel suspendiert (Ferrofluid), wird zusätzlich noch die Brown- Relaxation τ B für die Rückkehr zum Gleichgewicht entscheidend. Die Néel- Relaxationszeit lässt sich mit Gleichung (11) beschreiben. 18

26 Einleitung a Y = a ( b cd e D E F f (11) Der vorexponentielle Faktor τ 0 liegt im Bereich zwischen s. Die Brown- Relaxationszeit, wird von der Viskosität η des Lösungsmittels und dem Volumen V bestimmt und ist durch folgende Gleichung definiert: a h = iz V E /. (12) Treten beide Relaxationsprozesse auf, ergibt sich die Gesamtrelaxation aus: = +. (13) j j k j E Die magnetischen Eigenschaften sind neben der Temperatur auch von der Messzeit abhängig. Ist die Relaxationszeit im Vergleich zur Messzeit außerordentlich schnell, befindet sich das Partikelsystem im superparamagnetischen Zustand und es tritt keine Hysterese auf. Wenn der Relaxationsprozess im Vergleich zur Messzeit sehr langsam ist, dann befindet sich das System im blockierten Zustand und man kann eine Hysteresekurve beobachten. Die Blockierungstemperatur T B trennt den superparamagnetischen vom blockierten Zustand und entspricht der Temperatur, bei der die Messzeit und τ gleich sind. Sie ist von der Anisotropiekonstante, Partikelgröße und der Messzeit abhängig. Zur Bestimmung der T B bedient man sich SQUID-Messungen, genauer gesagt ZFC-Messungen (Zero-Field-Cooled- Messungen) und FC-Messungen (Field-Cooled-Messungen). Für Erstere werden die Pulverproben ohne äußeres Magnetfeld auf T = 5 K abgekühlt, wodurch die magnetischen Spinmomente, die der easy axes folgen, eingefroren werden. Aus der willkürlichen Anordnung der Vorzugsrichtungen resultiert eine Durchschnittsmagnetisierung von etwa Null. Anschließend wird ein Magnetfeld angelegt und die Magnetisierung der Proben wird während des Aufwärmvorgangs gemessen. Bei steigender Temperatur können sich immer mehr magnetische Momente entsprechend dem anliegenden Feld ausrichten, bis ein Maximum erreicht wird, das der T B entspricht. Der folgende Abfall der Gesamtmagnetisierung resultiert aus der steigenden thermischen Energie, welche die magnetischen Momente springen lässt. Die Probe wird nun bei anliegendem Feld wieder abgekühlt und die FC-Kurve kann gemessen werden. Hierbei wird die Magnetisierung mit sinkender 19

27 Einleitung Temperatur immer mehr ansteigen, da die magnetischen Momente der Eindomänenpartikel in Richtung des anliegenden Magnetfeldes eingefroren werden Nanopartikel allgemein und Eisenoxidnanopartikel Seit mehr als 30 Jahren steht die Erforschung und Entwicklung von kristallinen Materialien, mit Größen im Bereich von 1 bis 100 nm, im Fokus der Wissenschaft. Dieses intensive Interesse resultiert nicht nur aus dem Bedürfnis der Wissenschaftler um ein Verständnis der Grundlagen dieser Nanoteilchen, sondern auch aus deren vielen Einsatzmöglichkeiten in unzähligen Gebieten. Diese Mannigfaltigkeit an Möglichkeiten resultiert aus den vielen einzigartigen physikalischen und chemischen Eigenschaften von NP, die signifikant vom Verhalten ihrer makroskopischen Pendants abweichen. Diese neuen Eigenschaften sind stark von der Größe, Form, Oberflächendefekten und der Zusammensetzung der Nanokristalle abhängig. Die enorme Größenabhängigkeit wird verständlich, da Oberflächeneffekte entscheidend durch das wachsende Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis (sinkende Partikelgröße) beeinflusst werden. Hierdurch kommt es zu Symmetriebrüchen an der Oberfläche der NP, und das kann zu Veränderungen in der elektronischen Struktur, Koordinationsunterschieden sowie zu veränderten Gitterkonstanten führen, was [6, 11, 40] schließlich in veränderten Eigenschaften resultiert. Die entscheidende, aber durchaus schwierige Aufgabe für eine künftige erfolgreiche Nutzung von Nanopartikeln und speziell magnetischer NP in technischen Anwendungen, ist die Entwicklung von Synthesemethoden. Diese Methoden müssen eine enge Größenverteilung (Monodispersität) der NP gewährleisten. Aber auch eine gezielte Kontrolle der Form, Zusammensetzung, Dispergierbarkeit und besonders der Stabilität ist wichtig für einen erfolgreichen Einsatz in diversen Anwendungen. [6] Auf die gebräuchlichsten Synthesemethoden sowie Stabilisierungsstrategien und die gängigsten Verbindungen zum Aufbau von Passivierungsschichten für magnetische Eisenoxid-NP wird im Kapitel umfangreicher eingegangen. Im Allgemeinen gibt es für die Herstellung von nanokristallinen Materialen zwei grundsätzliche Strategien, die sich aus entgegengesetzter Richtung dem Nanometerbereich nähern. Die "Top-Down"-Methode (engl. von oben nach unten), 20

28 Einleitung bedient sich physikalischer Prozesse und die "Bottom-Up"-Herangehensweise (engl. von unten nach oben), arbeitet mit chemischen Prozessen. Wie der Begriff schon verdeutlicht, wird bei der "Top-Down"-Methode mit großen Teilen begonnen und zum Beispiel durch Kugelmühlen und verschiedene lithographische Verfahren, werden schließlich nanoskalige Stoffe erhalten. Die Vorteile, die diese Synthesestrategien bieten, sind die hohe Reinheit, Reproduzierbarkeit und das Produktvolumen. Aber diese Verfahren sind, je kleiner die gewünschten Strukturen werden, mit hohen Kosten verbunden und auch die Herstellung von monodispersen Partikeln bzw. die Größenkontrolle ist schwierig. "Bottom-Up"-Prozesse bedienen sich chemischer Synthesewege zum Aufbau von nanokristallinen Materialen. Zu diesen zählen unter anderem Methoden wie Reduktionen metallorganischer Precursor, Mitfällungen, thermische Zersetzungen und mizellare Synthesen. Ein Nachteil ist die geringe Menge an Material, die mit den "Bottom-Up"-Methoden hergestellt werden kann. Aber diese Verfahren liefern zumeist sehr monodisperse Partikelgrößen und können je nach Reaktionsbedingungen auch die unterschiedlichsten Formen von nanokristallinen Materialen hervorbringen. Sie sind zumeist kostengünstig und liefern NP, die gut dispergierbar sind. Da wie bereits erwähnt eine enge Größenverteilung für den Einsatz der NP besonders wichtig ist, und chemische Methoden diesbezüglich besser geeignet sind, ist ein grundlegendes Verständnis über den Entstehungsprozess monodisperser NP in Lösung essentiell. [40-44] Viktor LaMer [45] und Mitarbeiter stellten bereits 1950 ein Modell über den Keimbildungs- und Wachstumsprozess zur Herstellung von monodispersen Schwefel-Hydrosolen auf. Die LaMer-Theorie [6, 22, 40, 41, 45-49] wird bis heute auch für die grundsätzliche Beschreibung von Kristallisationsprozessen und Fällungsreaktionen aus wässrigen Medien zur Herstellung von monodispersen NP herangezogen. Es lässt sich als Konzept der "Keimexplosion" beschreiben, bei dem Keimbildungs- und Wachstumsphase voneinander getrennt ablaufen müssen. Da das Modell aber für Mikropartikelsysteme entwickelt wurde, muss es kritisch betrachtet werden. Der Grund ist die hohe Oberflächenenergie der NP, also das hohe Verhältnis von Oberflächenatomen zu Festkörperatomen. Das führt dazu, dass die NP unkontrolliert wachsen und agglomerieren um die freie Oberflächenenergie zu minimieren. LaMer konnte in seiner Arbeit zeigen, dass die Keimbildung (Nukleation) kurz sein und ein langsamer Wachstumsprozess ohne weitere Nukleation stattfinden 21

29 Einleitung muss, um eine enge Größenverteilung der Partikel zu erreichen. Der gesamte Prozess kann in drei Phasen gegliedert werden (siehe Abbildung 1.9). Abbildung 1.9: Das LaMer-Diagramm ist die schematische Erklärung des Kristallisationsprozesses von NP. Es ist in drei Phasen (Vorstufe (I), Nukleation (II) und Wachstumsphase (III)) eingeteilt. C S ist die Übersättigung und C Krit die kritische Übersättigung der Monomerkonzentration. In der ersten Phase, der Vorstufe, steigt die Konzentration des Monomers durch eine chemische Reaktion mit der Zeit bis zu einem Punkt C S an, der die Übersättigung der Lösung angibt. Durch vorhandene Verunreinigungen, wie Staubpartikel, Blasen oder winzige Kristallite könnte eine heterogene Keimbildung ausgelöst werden. Ist dies nicht der Fall, so kann nur homogene Keimbildung erfolgen, wofür eine hohe Energiebarriere überwunden werden muss. So kann die Monomerkonzentration bis zur kritischen Konzentration (C Krit ) weiter ansteigen. Ist dieser Wert erreicht, hat das System genug Energie und der spontane Nukleationsprozess kann in Phase II aus der sehr stark übersättigen Lösung stattfinden. Das gleichzeitige Ausfallen unzähliger Kristallkeime entlastet die übersättigte Lösung, so dass die Geschwindigkeit der Keimbildung sofort auf null absinkt, falls die Startkonzentration ausreichend klein war. Durch diesen dramatischen Konzentrationsabfall ist die Keimbildungsphase kurz, so dass keine weitere Nukleation stattfinden sollte. Damit wird ein monodisperses Endprodukt erzielt. In der dritten Phase findet schließlich das diffusionskontrollierte Wachstum der nanokristallinen Partikel statt, was über einen längeren Zeitraum hinweg zu einem weiteren Absinken der Monomerkonzentration führt. Das Wachstum der Partikel findet solange statt, bis die Konzentration unter die Löslichkeitsgrenze 22

30 Einleitung fällt. Da alle Kristallkeime gleichzeitig wachsen, wird eine enge Größenverteilung der [6, 22, 40, 41, 45-49] resultierenden NP erhalten. Neben der besprochenen LaMer-Theorie unterliegen viele Systeme einem weiteren Wachstumsprozess oder Reifeprozess, der in der Phase III des LaMer-Diagramms [49, 50, 51] angesiedelt ist. Dieser Prozess wird als Ostwald-Reifung bezeichnet und kann mit der Kelvin-Gleichung (14) (oder Gibbs-Thomas-Effekt) beschrieben werden: l(m)= l b o T. (14) Hierbei steht C(a) für die Löslichkeit eines Partikels mit dem Radius a und C( ) für die Löslichkeit des Bulk. Der materialabhängige Parameter α hat typischerweise einen Wert von 1 nm. Während des Reifeprozesses kommt es aufgrund der hohen Oberflächenenergie der NP zu deren Auflösung und dieses Material gelangt durch Diffusion zu den größeren Teilchen. Hier lagert es sich an und trägt so zum Partikelwachstum bei. Somit wachsen über die Zeit größere Kristalle auf Kosten der kleineren, was zum Anstieg der Durchschnittsgröße der hergestellten NP führt und [49, 50, 51] mit einer Reduktion der Partikelanzahl einhergeht Herstellungsverfahren und Stabilisierungsmöglichkeiten Wie im letzten Kapitel bereits erwähnt wurde, sind die Eigenschaften von SPIONs von der Größe, Form, Oberflächendefekten und der Zusammensetzung abhängig, die wiederrum von der Herstellungsmethode bestimmt werden. Es gibt eine Vielzahl verschiedener Herstellungsverfahren für SPIONs, die in den vergangenen Jahrzehnten entwickelt und verbessert worden sind. Das grundlegende Ziel der diversen Verfahren sowie deren Weiterentwicklung oder Verbesserung ist die reproduzierbare Herstellung von hochqualitativen monodispersen NP. Diese sollen definierte Formen und Zusammensetzungen haben und es soll auf einen großtechnischen Maßstab ausweitbar sein [4]. Die gebräuchlichsten Syntheserouten sind Mitfällung, thermische Zersetzung, hydrothermische Methoden, Sol-Gel- Reaktionen, Microemulsionen, sonochemische Reaktionen sowie Gasphasenmethoden und biomimetische Synthesen durch Bakterien. [4, 7, 10, 11] Die meisten Synthesewegen können zur Herstellung von magnetischen NP in den 23

31 Einleitung verschiedensten Zusammensetzungen herangezogen werden. Neben den bereits besprochenen Eisenoxid-NP wurden auch Legierungen, reine Metalle und spinellartige Verbindungen aus Übergangsmetallen hergestellt. [11] Chemische Methoden, besonders Flüssigphasen-Reaktionen, sind meist kostengünstig sowie einfach durchführbar und liefern magnetische NP in hohen Ausbeuten. [4] Auf diese Verfahren soll im Folgenden etwas genauer eingegangen werden. Aufgrund der Vorteile, ist auch heute noch die klassische Mitfällung [4, 10, 11] die gebräuchlichste Methode zur Herstellung von SPIONs. Ein Nachteil ist allerdings die geringe Kontrollierbarkeit der Größenverteilung, was einen Einsatz solcher polydisperser SPIONs in Anwendungen, die ein exzellentes magnetisches Verhalten erfordern (z.b. Kontrastmittel für MRT), schwierig macht. In der klassischen alkalischen Mitfällung, die erstmals von Massart et al. [52] durchgeführt wurde, werden in einer Inertgasatmosphäre die Eisenoxide, Fe 3 O 4 oder γ-fe 2 O 3, aus wässrigen Fe 2+ -und Fe 3+ -Lösungen unter Zugabe einer Base hergestellt. Als Eisenquellen können die entsprechenden Chloride, Nitrate oder Sulfate eingesetzt werden und als Base können unter anderem NH 4 OH, NaOH oder CH 3 NH 2 genutzt werden. Die Reaktionsbedingungen wie Fe 2+ /Fe 3+ -Verhältnis, ph-wert, verwendete Gegenionen, Base, Temperatur und Ionenstärke steuern sowohl die Zusammensetzung des Eisenoxides sowie dessen Größe und Form. Besonders das Verhältnis der Fe 2+ /Fe 3+ -Ionen zueinander entscheidet über die Zusammensetzung der Eisenoxid- NP, deren Größe und die magnetischen Eigenschaften. [10, 53, 54] Jolivet et al. [55] konnten zeigen, dass das Verhältnis x = Fe 2+ /Fe die Entstehung einer Mischungen aus zwei Eisenspezies, Oxid und Hydroxidoxid begünstigt. Bei einem Wert von x = 0.5 werden nur die nichtstöchiometrischen Fe 3 O 4 -NP erhalten. [55] Mit steigender Temperatur nimmt die durchschnittliche NP-Größe ab. [53] Für die Größenverteilung der SPIONs ist neben den bereits erwähnt Parametern auch die Rührgeschwindigkeit und die Verwendung von Schutzgasdurchfluss in der Lösung entscheidend. Eine hohe Rührgeschwindigkeit minimiert die Größen der NP. Die Verwendung eines Schutzgases bei der Herstellung von SPIONs trägt zum Schutz der Magnetit-NP bei und reduziert ebenfalls die Partikelgröße. [10, 56] Die Reaktionsgleichung für die Bildung von Fe 3 O 4 kann wie folgt ausgedrückt werden: Fe Fe OH - Fe 3 O 4 + 4H 2 O (15) 24

32 Einleitung In einer sauerstofffreien Umgebung und bei ph-werten zwischen 8 und 14 sowie einem Fe 2+ /Fe 3+ -Verhältnis von 1:2 sollte die Reaktion, ihrer Thermodynamik folgend, unter der vollständigen Fällung von Fe 3 O 4 verlaufen. Da Magnetit ungeschützt sehr empfindlich gegenüber Oxidation ist (siehe Abbildung 1.2), kann es in Gegenwart von Sauerstoff in Maghemit umgewandelt werden (Gleichung 16) oder sich unter sauren Bedingungen auflösen. [10] Fe 3 O 4 + 2H + γ-fe 2 O 3 + Fe 2+ + H 2 O (16) Fe 3 O 4 -NP können gegen Oxidation oder Agglomeration über verschiedene Strategien geschützt werden. Durch elektrostatische oder sterische Modifikationen der Oberfläche können SPIONs stabilisiert werden. In der klassischen Methode nach Massart erfolgt die Stabilisierung nach der Synthese der SPIONs, gemäß der LaMer- Theorie, mit Hilfe einer Vielzahl unterschiedlicher Verbindungen. Die gängigsten sind α-hydroxysäuren wie Zitronen- und Weinsäure, aber auch Aminosäuren, Fettsäuren oder anorganische Schutzhüllen aus SiO 2. Ein Fortschritt für die Größenkontrolle der SPIONs durch Mitfällung wurde durch den Zusatz organischer Verbindungen während der Partikelbildung erzielt. Hierbei kommen unter anderem ebenfalls Carboxylate oder Hydroxycarboxylationen zum Einsatz. Insbesondere Ölsäure und Polymere wie Dextran, Stärke oder Polyvinylalkohol haben sich als hervorragende Kandidaten zur Stabilisierung von Fe 3 O 4 -NP herausgestellt. Diese organischen Ionen können abhängig von ihrem Verhältnis zu den Eisensalzen unterschiedliche Effekte auf die Größe der entstehenden Eisenoxid-NP haben. Die organischen Anionen können die Eisenkationen zum einen komplexieren und so die Nukleation verhindern, was aufgrund des begünstigten Wachstums zu großen Partikeln führt. Oder es werden zum anderen hauptsächlich kleine NP gebildet, da das Partikelwachstum wegen der [4, 7, 10, 11, 59] adsorbierten Moleküle gehemmt wird. Die Hydrothermalsynthese und thermische Zersetzung von Metallsalzen und organometallischen Precursoren liefert SPIONs in hoher kristalliner Qualität mit äußerst engen Größenverteilungen, was besonders für biologische Anwendungen entscheidend ist. Die wichtigsten Reaktionen bei Hydrothermalreaktionen sind Hydrolyse und Oxidation/Dehydrierung von Metallsalzen oder die Neutralisation von Metallhydroxiden. Diese Reaktionen werden in wässrigen Lösungen in Autoklaven 25

33 Einleitung oder Reaktoren durchgeführt, um die enormen Drücke und Temperaturen zu erreichen. Die Partikelgröße und Zusammensetzung wird bei diesen Reaktionen besonders von der Reaktionszeit, -druck und -temperatur beeinflusst. Die hohen Temperaturen führen dazu, das kleine NP entstehen, da die Keimbildung sehr schnell verläuft. Bei der thermischen Zersetzung werden Vorstufen wie Fe(acac) 3 (acac: Acetylacetonat), Fe(CO) 5 oder Fe(Cup) 3 (Cup: N-Nitrosophenylhydroxylamin) in hochsiedenden Lösungsmitteln wie Octylether, Phenylether, 2-Pyrrolidon oder Diethylenglykol in Gegenwart von stabilisierenden Verbindungen zersetzt. Um die toxischen Eisenvorstufen zu umgehen, wurden auch schon die entsprechenden Eisenchloride von verschiedenen Arbeitsgruppen in den Hochtemperatursynthesen verwendet. Als Stabilisatoren für die NP in der Reaktionsmischung kommen Oleylamin, Ölsäure und Stearinsäure zum Einsatz. Aber auch 2-Pyrrolidon kann aufgrund seiner Koordinationsfähigkeit mit Metallionen als Stabilisator dienen. Für die Zusammensetzung und Qualität der NP sind die Temperatur, Reaktionszeit, Lösungsmittel und das Verhältnis der Edukte zueinander besonders entscheidend. Nachteile dieser Synthesetechnik, für eine mögliche industrielle Herstellung, sind die benötigten extremen Temperaturen und der Einsatz der meisten Stabilisatoren, welche als umweltgefährdend eingestuft werden müssen. Ein weiterer Nachteil betrifft den Einsatz so hergestellter SPIONs für biomedizinische Anwendungen, da thermische Zersetzungen in unpolaren organischen Lösungsmitteln durchgeführt werden. Für biologische Anwendungen müssen die SPIONs stabil in Wasser dispergiert werden. Ähnlich zu den thermischen Verfahren verläuft die Herstellung mit sonochemischen Methoden. Hierbei wird eine Ultraschallquelle genutzt, um die [4, 7, 10, 11, 59] extrem hohen Temperaturen zu erzeugen. Den bisher genannten Problemen begegneten Qu et al. [57], indem sie die Vorteile der thermischen Zersetzung (monodisperse hochkristalline SPIONs) und die der Mitfällung (SPIONs direkt in Wasser dispergierbar) vereinten. In dieser Eintopfsynthese werden SPIONs aus den Eisenchloriden in DEG mittels NaOH bei hohen Temperaturen gefällt. Nach der Reaktionszeit findet im selben Reaktionskolben ein Ligandenaustausch statt. Hierbei wird die ursprüngliche DEG- Hülle gegen die gewünschten Funktionalitäten ersetzt, wodurch eine Überführung der SPIONs in Wasser möglich ist. Dank des Eintopfprozesses und der sofortigen Ligandenaustauschreaktion ohne zusätzliche Aufreinigung der gebildeten SPIONs kann eine partielle Oxidation der Oberfläche nahezu vollständig verhindert werden. 26

34 Einleitung Diese Synthese erfüllt die wesentlichen Voraussetzungen der "grünen Chemie", da [57, 58] der Verbrauch an Lösungsmitteln im Rahmen bleibt. Ein weiterer Vertreter der nasschemischen Synthesen sind die in Wasser stattfindenden Sol-Gel-Reaktionen. Hierbei entsteht bei Raumtemperatur das Sol von feinsten NP in Lösung durch Hydroxylierungen/Hydrolyse und Kondensationen aus Metallalkoxiden oder Alkoxidvorstufen. Falls die Vorstufen schlecht in Wasser löslich sind, können diese auch mit Säuren oder Basen versetzt werden. Das so entstandene Gel kann durch anschließende Wärmebehandlungen in die gewünschten kristallinen Partikel überführt werden. So können zum Beispiel 6-15 nm große γ-fe 2 O 3 NP hergestellt werden, wenn die Gele auf 400 C erhitzt werden. Die Geschwindigkeit der Hydrolyse und Kondensation bestimmen entscheidend die Eigenschaften des Endproduktes. Weitere Reaktionsbedingungen, welche die Struktur und Eigenschaften des Gels beeinflussen können, sind das Lösungsmittel, Temperatur, ph-wert sowie die Konzentration und Art der Vorstufen. Vorteile des Sol-Gel-Verfahren sind, dass in Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen Materialen mit definierten Strukturen erschaffen werden können. Des Weiteren ist eine gute Kontrolle über die Monodispersität möglich und es können amorphe Stoffe erzeugt werden. Nachteile sind allerdings die entstehenden Nebenprodukte und die Tatsache, dass die Produkte nachbehandelt werden müssen. Mit dieser Methode können auch Nanokomposite, wie zum Beispiel Fe 2 O 3 -SiO 2 -NP, erschaffen werden. Die zum Sol-Gel-Verfahren zählende Polyol-Methode bietet eine gute Kontrolle über Größe und Form der NP. Die Polyole, wie zum Beispiel Polyethylenglykol, Diethylenglykol und Triethylenglykol, dienen als Lösungsmittel für die anorganischen Vorstufen wie Fe(acac) 3 oder Eisenchloride. Außerdem sind sie das Reduktionsmittel und dienen in situ zur Stabilisierung der NP, was für ein kontrolliertes Partikelwachstum wichtig ist. Die hohen Temperaturen ermöglichen schließlich einkristalline SPIONs. Die Polyolliganden auf der Oberfläche führen dazu, dass die SPIONs gut in Wasser dispergiert werden können. Der Unterschied zwischen thermischer Zersetzung und Sol-Gel-Verfahren besteht darin, dass in Letzterem die Reaktionstemperatur zum Siedepunkt des Polyols erhöht wird, um die metallische Vorstufe in Lösung zu bringen. Durch die stattfindende Reduktion werden die Metalloxidkeime gebildet, die schließlich auf die gewünschte Größe zum NP [4, 7, 10, 11] anwachsen können. 27

35 Einleitung Eine weitere chemische Herstellungsmethode für Eisenoxide mit und ohne Silikathüllen ist die Mikroemulsionstechnik oder die Nutzung inverser Mizellen. Hierbei kommt es zur Anwendung der thermodynamisch stabilen Dispersionen, die aus zwei nicht mischbaren Flüssigkeiten gebildet werden, deren Grenzfläche durch Tenside stabilisiert wird. Als Tenside dienen unter anderem Natriumdodecylsulfat (SDS) und Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB). Sehr gebräuchlich ist die Wasser-in-Öl (w/o) Mikroemulsion, bei der die nm-großen Wassertropfen in der Öl- Phase dispergiert sind. Die Größe der Wassertropfen in der Mikroemulsion (inverse Mizelle) und damit der resultierenden NP werden durch das Wasser-zu-Tensid- Verhältnis bestimmt und liegen typischerweise zwischen 1 und 50 nm. Eine weitere Beeinflussung der Größe kann durch die Konzentration der Reaktanten erfolgen. Es können sowohl runde NP als auch Röhren gebildet werden. Die Entstehung der NP kann dabei auf unterschiedlichsten Wegen erfolgen. Es können zwei w/o- Mikroemulsionen gemischt werden, wobei in der Mizelle ein Niederschlag ausfällt, dessen Größe und Form durch die Tropfengröße bestimmt wird. Des Weiteren können sowohl gasförmige als auch flüssige Reduktionsmittel oder Fällungsagenzien zugesetzt werden. Zum Beispiel können Gase wie O 2 oder NH 3 durch die Microemulsion geleitet werden. Ein Problem dieser Technik ist eine zu kleine Ausbeute. Die Hochskalierung auf industrielle Maßstäbe ist unmöglich, da der d [4, 7, 10, 11] Lösungsmittelverbrauch enorm ist. Diese chemischen Methoden ermöglichen die Synthese von SPIONs in unterschiedlichen Größen, Formen und Zusammensetzungen. Diese müssen mittels geeigneter Strategien und Funktionalisierungen aufgrund ihrer hohen Reaktivität und Empfindlichkeit gegenüber Oxidation sowohl in biologischen Systemen als auch bei Einwirkung eines Magnetfeldes geschützt werden. Durch ein Gleichgewicht aus attraktiven und repulsiven Kräften wird die Stabilität von dispergierten SPIONs erzeugt. Die Partikelwechselwirkungen werden von vier Größen bestimmt. Den magnetischen Dipolwechselwirkungen, van der Waals Kräften sowie elektrostatischen und sterisch abstoßenden Kräfte. Besonders die letztgenannten sind für die Stabilisierungsstrategie bedeutend. Die Eisenatome der Oberfläche von SPIONs koordinieren aufgrund ihres elektrophilen-charakters besonders gut mit Elektronenpaaren, weshalb in wässrigen Ferrofluids Wasser an der Oberfläche koordiniert wird. Durch Dissoziation werden schließlich die amphoteren Hydroxylgruppen an der Außenseite der SPIONs erzeugt, die in Abhängigkeit vom 28

36 Einleitung ph-wert unterschiedliche Oberflächenladungen beeinflussen. Mit Hilfe von Polymeren, Monomeren und anorganischen Verbindungen können stabile Ferrofluids erzeugt werden. Diese Polymere verfügen meistens über zwei unterschiedliche Bausteine. Einen zur Anbindung an die SPION-Oberfläche, wohingegen der andere die Biokompatibilität und die Dispergierbarkeit in Wasser gewährleisten muss. Polymere wie Polyacrylsäure (PAA), Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Chitosan sind zur Stabilisierung geeignet. Besonders bekannt und häufig eingesetzt ist das biokompatible Polysaccharidpolymer Dextran und seine carboxylierten Formen, die oft in den kommerziell erhältlichen MRT-Kontrastmitteln zum Einsatz kommen. Seine reduzierte Form liefert besonders stabile Hüllschichten. Einen guten Verstärkungseffekt des MRT-Kontrastes liefert auch das hydrophile und biologisch abbaubare Chitosan. Das wasserlösliche PEG findet wegen seiner Fähigkeit zur Verbesserung der Bioverträglichkeit von SPIONs häufig Verwendung, da es auch unter physiologischen Bedingungen für eine ausgezeichnete Stabilität sorgt. Das hydrophile PVA ist dafür bekannt, Aggregation zu verhindern und sehr stark an der SPION Oberfläche zu binden. Desweitern werden auch Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Polyacrylsäure (PAA) als stabilisierende Hüllen genutzt. Außer Polymeren können auch deutlich kleinere Einheiten eine gute Stabilität der SPIONs in Lösung herbeiführen. Mit diesen können die SPIONs nicht nur in wässrigen Medien dispergiert werden, sondern auch in anderen Trägerflüssigkeiten. Carboxylate sind die gängigsten Gruppen zur Anbindung an die Eisenoxidoberfläche. Durch Carbonsäuren, wie Zitronensäure und Gluconsäure, kann in wässriger Umgebung eine hervorragende Stabilität erzeugt werden. Aber auch hydrophobe System lassen sich durch die Verwendung von Ölsäure und Laurinsäure erzeugen. Die Stabilität in Lösung ist dabei stark vom ph-wert und der Konzentration der Carbonsäuren auf der Oberfläche abhängig. Bei der Zitronensäure kann eine Koordination von einer oder zwei Carboxygruppen an die Oberfläche stattfinden, was von der Oberflächenkrümmung abhängt. Aufgrund der verbleibenden freien Säuregruppe bleibt die Oberfläche hydrophil und leicht negativ geladen. Zitronensäure beeinflusst den Bildungsprozesses von SPIONs, die Oberflächengeometrie und die Kristallinität. Neben Carbon- und Fettsäuren können auch Alkylphosphate und -phosphonate ausgezeichnet mit SPION-Oberflächen wechselwirken und durch Bildung einer Quasi-Doppelschicht stabilisieren. Eine weitere Möglichkeit zur Funktionalisierung ist die Bildung einer Kern-Hülle-Struktur mit anorganischen Materialien. Die Eisenoxid- 29

37 Einleitung Kerne können mit Gold- und Silica-Hüllen stabilisiert werden, wodurch zusätzlich die Möglichkeit zur Anbindung von biologisch aktiven Substanzen entsteht. Die Silica- Hüllen schirmen die magnetischen Dipolwechselwirkungen ab und generieren durch ihre negative Ladung repulsive Kräfte. Sie liefern auch Silanolgruppen an der [4, 7, 10, 11, 59] Oberfläche, die kovalent an aktive Liganden binden können SPIONs in der Biomedizin Nanomaterialien sind ein rasch wachsender Forschungszweig mit Anwendungen in allen Bereichen des Lebens. In Form von NP und nanostrukturierten Materialen haben sie auch Einzug in biologischen und biomedizinischen Anwendungen gefunden. Dabei gibt es eine Vielzahl von Effekten und Risiken, welche beispielsweise die biologische Sicherheit oder Toxizität betreffen, die immer noch gründlich erforscht werden müssen. Die Ursachen für das Interesse sind unter anderem die außergewöhnlichen Eigenschaften von NP, die völlig verschieden zu ihren Festkörper sind. [60] Aufgrund ihrer gesteigerten Reaktivität, und der damit verbundenen effizienteren Wechselwirkung mit der Zellmembran, zeigen NP eine höhere Toxizität als vergleichbare mikrometergroße Partikel SPIONs werden leicht über Endozytose aufgenommen und treten mit Zellbestandteilen in Wechselwirkung. [61] Unter physiologischen Bedingungen sind SPIONs, die größer als 10 nm sind, nicht in der Lage das Endothel zu durchdringen. Wenn es aufgrund von Tumorbefall oder Entzündungen zu einer Vergrößerung der Poren kommt, können jedoch auch größere SPIONs diese Barriere passieren. [62] Hauptsächlich NP mit Durchmessern bis zu 100 nm können die Zellmembran passieren, da sie auch kleiner als die Porengröße im Tumorgefäßsystem (typischerweise bis zu 400 nm) sind und somit Zugang zu Tumorzellen haben. [63] Durch Nanomaterialien könnten damit in der gezielten Krebstherapie ungeahnte Fortschritte erzielt werden. Deshalb ist ein wichtiges Ziel die Entwicklung kleiner SPIONs, die über eine hohe Selektivität, Stabilität, Flexibilität sowie die Eignung verfügen, in Zellen einzudringen. [64] In Abhängigkeit von Größe, Zusammensetzung und Funktionalisierung werden SPIONs für eine Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen bereits genutzt, oder werden intensiv daraufhin erforscht. SPIONs sind hierbei wegen ihrer geringen Toxizitäten im Vergleich zu den meist zwar stärker magnetisierbaren aber toxischen 30

38 Einleitung Übergangsmetallferriten von großem Interesse. [8] Aufgrund der schnellen Weiterentwicklungen in der Synthese sowie der Funktionalisierung der Oberflächen von SPIONs können diese schließlich effizienter für Diagnosetechniken und Therapien eingesetzt werden. [65] Die herausragende Eigenschaft von SPIONs ist, dass sie neben der Diagnose (z. B. mittels MRT) gleichzeitig auch zur Therapie durch den Wirkstofftransport genutzt werden können. Dies führte zu einer Wortschöpfung, die beide Funktionen der SPIONs in dem Term theragnostisch (= Therapie und diagnostisch) zusammenfasst. [7] Besonders entscheidend für den Einsatz in der Medizin ist es, dass die Partikel gut in einer Flüssigkeit, vorzugsweise in Wasser, dispergiert werden können. [62] Zudem müssen die SPIONs nach dem Einsatz im Körper ohne weitere schädliche Effekte aus dem biologischen System beseitigt werden. [65] Zu den vielversprechendsten in vivo Anwendungsmöglichkeiten von SPIONs in der Biomedizin zählt die Nutzung als Kontrastmittel in der Magnetresonanztomographie (MRT), magnetische Hyperthermie und der gezielte Wirkstofftransport nicht nur in Form von NP-basierenden Arzneistoffträger, sondern auch als Lieferantensystem für Gene und Radionukleide. [62] Des Weiteren werden SPIONs für die Zellmarkierung und Zelltrennung, für die Gewebereparatur oder für die Verbesserung der DNA- Technologie, gerade der Rekombinationstechnologie und Gentherapie eingesetzt. [65] Besonders nennenswert ist der Fortschritt der letzten Jahre in klinischen Studien der Krebsforschung, der sowohl in der Veterinärmedizin, als auch der Humanmedizin erzielt werden konnte. Hierbei konnten nicht nur Tumortherapien verbessert werden, sondern unter anderem auch kardiovaskuläre Krankheiten besser behandelt werden. [62] Auf die bisher am umfangreichsten erforschten Anwendungsbeispiele soll nun etwas genauer eingegangen werden. Aufgrund ihres superparamagnetischen Verhaltens eignen sind SPIONs für den Einsatz als Kontrastmittel. Hauptsächlich zur Untersuchung von Leber, Milz, Lymphknoten, Gehirntumoren und vielen weiteren Tumoren in der Magnetresonanztomographie. Die Bilder der untersuchten anatomischen Formen können qualitativ verbessert werden, wenn Kontrastmittel verabreicht werden. SPIONs oder andere magnetische NP können den lokalen magnetischen Charakter der Gewebe verzerren und haben so einen signalverstärkenden Effekt, der in der klinischen Bildgebung schon seit längerem 31

39 Einleitung bekannt ist. Man unterscheidet hierbei zwischen SPIONs mit einem hydrodynamischen Durchmesser >50 nm und den USPIONs (ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles) mit Durchmessern unterhalb von 50 nm. Kommerziell bereits erhältliche SPION-Kontrastmittel die zur Diagnose eingesetzt werden sind die Dextran-geschützten SPIONs, Endorem und Resovist, aber auch SPIONs mit Siliziumhüllen in Form von Lumirem sind bereits im Einsatz. Auch USPIONs zur Tumordiagnose sind schon auf dem Markt erhältlich, wie das aus 30 nm großen Partikeln bestehende Sinerem [8, 9, 66]. Nachdem beobachtet wurde, dass diverse Krebszellarten auf Temperaturen über 41 C empfindlicher als das entsprechende gesunde Umgebungsgewebe reagieren, wurde erstmals die Hyperthermie zur Krebstherapie empfohlen. Durch eine direkte Injektion von SPION-Lösungen in den Tumor oder in Arterien, die den Tumor versorgen, könnte man dem angestrebten Ziel, der Zerstörung von Krebszellen ohne Schädigung des umgebenden Gewebes, näherkommen. Das grundlegende Prinzip beruht darauf, dass in metallischen Objekten, die in alternierende Magnetfelder gebracht werden, Ströme induzierten werden und es infolge des Widerstandes der Metalle zu einer induktiven Erwärmung kommt. Wenn es sich wie bei SPIONs um ein magnetisches Material handelt, wird das Phänomen zusätzlich verstärkt. Bereits 1957 wurde von Gilchrist et al. die Nutzung von Eisenoxiden zur gezielten Erhitzung von Tumorgewebe empfohlen. Man unterscheidet abhängig von den genutzten Temperaturen zwischen der magnetischen Hyperthermie und der magnetischen Thermoablation. Beim ersten Verfahren wird mit Temperaturen bis zu C gearbeitet, was in Verbindung mit Chemo- und Strahlentherapie bereits getestet wurde. Bei der magnetischen Thermoablation ist der zytotoxische Effekt auf Tumore, aber auch auf normales Gewebe aufgrund der deutlich höheren Temperaturen (43-55 C) stärker ausgeprägt. Dieses Verfahren wird aber wegen der besseren [9, 62] Tumorzerstörung bevorzugt. Wie bei der gezielten Tumorzerstörung durch Temperatur ist auch beim gezielten Wirkstofftransport zurzeit die Bioverteilung der Pharmazeutika das Hauptproblem. Durch die mangelnde Medikamentenspezifität für bestimmte Orte im Organismus, müssen die meisten Medikamente in enormen Dosen gegeben werden, um in der zu therapierenden Region die benötigen lokalen Konzentrationen zu erhalten. Das führt leider zu einer unspezifischen Toxizität. Es kommt zusätzlich zu ungewollten und 32

40 Einleitung meist schwerwiegenden Nebenwirkungen. Eine Verbesserung sollte auch hier durch die Verwendung von SPIONs oder anderer magnetischer NP erzielt werden können. Mit einer gezielten Beladung der Oberflächen von NP mit Medikamenten und dem Einsatz externer Magnetfelder könnten die Pharmazeutika so an den gewünschten Ort im Körper gelenkt werden. Ein weiterer Vorschlag betrifft die zusätzliche Anbindung von Antikörpern auf der Oberfläche von SPIONs, die spezifisch in der gewünschten Zielregion erkannt werden können. Trotz all der Vorteile gibt es aber auch Herausforderungen, wie die ausreichende Aufkonzentration der wirkstoffbeladenen NP in der Wirkregion, die von der Stärke des äußeren Magnetfeldes und der Blutzirkulation abhängen. [9] Die strukturellen Eigenschaften der SPIONs sind nicht nur für ihr superparamagnetisches Verhalten verantwortlich, sondern sind auch von besonderer Wichtigkeit, was deren Stabilität und Verhalten in lebenden Systemen sowie deren Abbau betrifft. [8, 65] Die gute Biokompatibilität von SPIONs wird durch die Morphologie, die Zusammensetzung der Oberflächenfunktionalisierung, die Oberflächenladung sowie den hydrodynamischen Durchmesser und Oxidation beeinflusst. [61] Durch anorganische oder organische Liganden auf der Oberfläche, müssen die SPIONs in biologischen Suspensionen mit ph-werten um 7.4 und hohen Salzkonzentrationen stabilisiert werden. Die Modifikationen der Oberfläche sollten auch funktionelle Gruppen liefern, die für eine weitere Anbindung von pharmakologischen Einheiten verwendet werden können. Zudem sollten sie eine sofortige Aufnahme durch das körpereigenen Abwehrsystem, das retikuloendothelialen Systems (RES), verhindern. [62] Die Stabilität der SPION- Suspensionen wird dabei durch ein Gleichgewicht aus attraktiven und repulsiven Kräften bestimmt. Sterische Abstoßung kann durch Moleküle wie PEG, Dextran, PAA und PVA erzielt werden. Mittels Carboxylaten, Silikaten und Gold werden elektrostatische Effekte zur Stabilisierung genutzt. [61] In den Blutstrom injizierte SPIONs werden schnell von körpereigenen Substanzen wie Plasmaproteinen umhüllt und vom RES erkannt. [9] Werden Partikel verwendet, die kleiner als 4 µm sind, so werden diese hauptsächlich durch Zellen der Leber und Milz aufgenommen. [62] Deshalb sind für in vivo Anwendungen Oberflächenmodifikationen nötig, die nicht toxisch aber biokompatibel sind und vor 33

41 Einleitung allem stabil gegenüber dem RES. Das elementare Kriterium für die Aufnahme der SPIONs in die Zellen und die Toxizität ist deren Oberfläche, da diese von den Zellen wahrgenommen wird. [61] Allerdings bestimmt nicht nur die Oberfläche die Wechselwirkung mit dem RES, sondern auch die Partikelgröße. SPIONs, die größer als 200 nm und kleiner als 10 nm sind, werden vom RES aufgenommen. Geeignet sind deshalb besonders Größen unter 100 nm, da sie über geringere Sedimentationsraten sowie eine gute Diffusion durch das Gewebe verfügen. [7] SPIONs werden durch den komplexen Mechanismus der Endozytose aufgenommen, der je nach Art der Aufnahme und Fracht unterschieden wird. Man unterscheide zwischen Phagozytose, Macropinozytose, nichtspezifischer Endozytose und rezeptorunterstützter Endozytose. Der Stoffwechsel, der in der Zelle stattfindet und dem die SPIONs unterliegen, ist von deren chemischen Zusammensetzung abhängig. Intrazelluläre SPIONs werden typischerweise von Makrophagen der Leber (Kupfferzellen), Milz und dem Knochenmark aufgenommen. In Form von Hämosiderin, Ferritin und Transferrin sind sowohl Eisen als auch Eisenoxide im menschlichen Gewebe zu finden. Im gesamten menschlichen Körper beträgt der gespeicherte Eisenhaushalt etwa 3500 mg. Es konnte gezeigt werden, dass der Eisengehalt von SPIONs langsam in den körpereigenen Eisenhaushalt aufgenommen wird und das Eisen konnte schließlich in den roten Blutkörperchen nachgewiesen werden. Diese Abbaumechanismen konnten für Ferumoxtran-10 nachgewiesen werden. Aber es ist schwierig, von diesen Ergebnissen Rückschlüsse auf einen allgemeinen Abbauprozess aller anderen SPIONs zu schließen. Die Oberflächen der diversen SPIONs haben unterschiedliche Zusammensetzungen und werden somit von Zellen verschiedenartig wahrgenommen. Dies führt vermutlich zu Änderungen im Abbauprozess. Deshalb ist eine weitere und umfangreiche Untersuchung auf dem Gebiet unentbehrlich und besonders für deren definitiven [7, 8, Einsatz zur Verbesserung der Therapie- und Diagnosemöglichkeiten unerlässlich. 9, 61, 62, 66, 67] 34

42 Einleitung Krebserkrankungen, Entstehung und Therapie 2012 erkrankten weltweit rund 14.1 Millionen Menschen neu an Krebs, 32.6 Millionen leben mit einer dieser Erkrankung (in einem Zeitraum von fünf Jahren nach der Diagnose) und 8.2 Millionen Menschen starben aufgrund einer Krebserkrankung. Damit gehört Krebs zu den Haupttodesursachen auf der Welt. Die WHO rechnet innerhalb der nächsten beiden Jahrzehnte mit einem weiteren Anstieg der [16, 17] Neuerkrankungen auf 22 Millionen. In Deutschland stieg im Jahr 2010 die Anzahl an Krebsneuerkrankung weiter auf etwa Menschen an. Die Prognose des Robert-Koch-Instituts für 2014 sieht sogar noch drastischer aus, da mit einem weiteren Anstieg an Neuerkrankungen auf Fälle gerechnet wird. Ein entscheidender Faktor hierfür ist das stets ansteigende Alter der Bevölkerung. Die Häufigkeit von Krebs steigt immer weiter an, im Zeitraum von 2000 bis 2010 ist die Zahl der Neuerkrankungen bei Frauen um etwa 14 Prozent und die bei Männern um circa 21 Prozent angestiegen. Abbildung 1.10 gibt einen Überblick über die Häufigkeit und Verteilung der Krebsarten zwischen Männern und Frauen in Deutschland wieder. Die häufigste bösartige Tumorerkrankung bei Männern stellt dabei das Prostatakarzinom (26.1 %) dar und bei Frauen ist die Häufigkeit für das Mammakarzinom mit 31.3 % sogar noch höher. Gefolgt werden diese Erkrankungen bei beiden Geschlechtern vom Kolon- und Lungenkarzinom. [68] 35

43 Einleitung Abbildung 1.10: Prozentualer Anteil der häufigsten Tumorlokalisationen an allen Krebsneuerkrankungen in Deutschland 2010 (ohne nicht-melanotischen Hautkrebs). Angaben in Prozent. [69] Krebs ist der Oberbegriff für eine Vielzahl von Krankheiten, die in den verschiedensten Organen auftreten und von verschiedenen Zellarten ausgehen kann. Es genügt eine einzelne Zelle als Auslöser für diese bösartige Erkrankung. Diese Krankheiten werden auch als maligne Tumoren oder autonome, pathologische Neoplasien bezeichnet. Ein bestimmendes Merkmal von Krebs ist die rasche Entstehung von krankhaften Zellen aus gesunden Zellen. Dies passiert über einen Mehrstufenprozess. Die Veränderungen in den Zellen können durch ein Wechselspiel aus genetischen Veranlagungen und drei äußeren Faktoren (Karzinogenen) hervorgerufen werden. Diese Karzinogene sind: (a) physikalisch, wie UV-Strahlung, (b) chemisch, wie Asbestose oder Tabakrauch und (c) biologisch, zum Beispiel durch Infektionen mit bestimmten Viren, Bakterien oder Parasiten. Die Tumorzellen wachsen über ihre normalen Grenzen hinaus, wodurch angrenzendes gesundes Gewebe eingenommen wird und die Krankheit sich so in anderen Organen ausbreiten kann. Dieser Prozess wir Metastasierung genannt wobei Metastasen der [16, 17, 19a-c, 68] Hauptgrund für den Tod durch Krebs sind. 36

44 Einleitung Da jede Krebsart anders ist, müssen auch die Therapiemethoden entsprechend sorgefältig ausgewählt und dem Patienten und seiner Situation angepasst werden. Das Ziel einer jeden Behandlung muss es sein die Krankheit zu heilen, oder wenigstens das Leben des Patienten beträchtlich zu verlängern sowie die Verbesserung seiner Lebensqualität. Es gibt drei Säulen der Tumorbehandlung, wobei die Operation die wohl wichtigste Behandlungsform bei den meisten Krebsarten ist. Daneben sind die Chemotherapie und Strahlentherapie sehr wichtige Hilfsmittel der Onkologie. Es haben sich auch andere Verfahren immer weiter in der Krebstherapie verdient gemacht. Nur einige Beispiele: Antihormontherapie, [16, 17, 19a-c, 68] Hyperthermie, Immuntherapie und Blutstammzellentransplantation Strahlentherapie und die Verwendung von SPIONs Etwa 2/3 aller Tumorpatienten erhalten Strahlentherapie (Radioonkologie) als Therapiemaßnahme, aber auch gutartige Erkrankungen werden so behandelt. Die Strahlentherapie kann sowohl prä- als auch postoperativ stattfinden, aber auch als zusätzliche Maßnahme nach einer Chemotherapie. Sie kommt auch bei austherapierten Tumorleiden als palliative Behandlung zum Einsatz, um den Patienten eine mögliche Linderung ihrer Beschwerden zu verschaffen. Mittels geringeren Dosen werden auch seit mehr als 100 Jahren gutartige Erkrankungen wie Hautekzeme, Gelenkerkrankungen oder Entzündungen behandelt. In der Radioonkologie kommt ionisierende Strahlung zum Einsatz, die unter Verwendung hoher Dosen den Tumor zerstören soll. Verglichen mit anderen Zellgiften, wie Chemotherapeutika, Hitze oder UV-Strahlung, verursacht ionisierende Strahlung die stärksten Zellschäden. Die Dosis richtet sich nach der Art des Gewebes und des Tumors. Es wird typischerweise mit Gy oder bei empfindlichen Tumoren mit Gy bestrahlt. Die Nachteile der Therapie sind die zu hohen Dosen und außerdem ist die eingesetzte Strahlung nicht tumorzellenspezifisch. Deshalb wird nicht nur das Tumorgewebe angreifen, sondern auch schwerwiegende Schäden an benachbartem oder umgebenden gesunden Geweben werden hervorrufen. 37

45 Einleitung Ionisierende Strahlung gibt durch Wechselwirkung mit Materie Energie ab, wodurch Atomen ionisiert werden. [70, 71, 72, 73] Man unterscheidet zwischen verschiedenen Arten von ionisierender Strahlung in der Medizin, den hochenergetischen elektromagnetischen Wellen wie Röntgen- und γ-strahlung sowie der Partikelstrahlung wie z. B. Neutronenstrahlung. [64] Röntgenstrahlung, wie sie auch in dieser Arbeit verwendet wurde, besteht aus Photonen, die mittels Photo- und Comptoneffekt oder Paarbildung ionisierende Wirkung zeigt. Aufgrund ihrer Energieeinwirkung können Schäden in den Zellen hervorrufen werden. Es kann zur Ionisation der Bindungen in biologischen Molekülen kommen oder als indirekter Effekt können in wasserreichen Umgebungen (Zellen bestehen zu ~80 % aus Wasser) freie Radikale, wie Wasserradikale oder reaktive Sauerstoffspezies (ROS, englisch: reactive oxygen species) gebildet werden, welchen die biologischen Moleküle schädigen. Die Radikale können durch die Umgebung diffundieren und sind aufgrund ihrer extremen chemischen Reaktivität toxisch. Auf diese Weise kann die DNA des Tumors geschädigt werden. Wenn die Schäden, wie zum Beispiel Basenmodifikationen, Strangbrüche, oder Quervernetzungen, groß genug sind, können diese von den Zellen nicht mehr repariert werden. Es kommt zu Proliferationshemmung und Zelltod. Die Proliferationshemmung ist der Verlust der Teilungsfähigkeit. Der Zelltod tritt durch Apoptose und Nekrose ein, wodurch die [60, 64, 70, 71, 72, 73] Tumorzellen aufgelöst werden. Ein vielversprechender Ansatz zur Verbesserung der Strahlentherapie, was aufgrund einer Minimierung der schmerzhaften Nebenwirkungen für die Patienten eine Erleichterung darstellen würde, ist der Einsatz von Radiosensibilisatoren. Diese sollen die Empfindlichkeit des Tumorgewebes gegenüber der Strahlung erhöhen, um einen möglichst großen Schaden mit geringen Dosen und damit minimaleren Schäden für das gesunde Umgebungsgewebe zu erzielen. Bereits vor mehr als 20 Jahren wurde zum Beispiel die Verwendung von Elementen mit hohen Ordnungszahlen zur Erhöhung der Strahlendosis in Tumorgeweben von Matsudaira et al. vorangetrieben. [63, 73] Andere Forschungen konnten bereits, durch die Verwendung von Edelmetallnanopartikeln oder Halbleiter-Quantenpunkten, eine Verbesserung der therapeutischen Effizienz vorschlagen. [64] SPIONs, sowohl Fe 3 O 4 als auch γ-fe 2 O 3, stellen wegen ihrer Fähigkeit zur Generierung von zytotoxischen ROS eine mögliche Klasse an Radiosensibilisatoren dar. Dies wird besonders durch 38

46 Einleitung ihre ausgezeichnete Bioverträglichkeit ergänzt und lässt auf eine mögliche [60, 63, 64, 73] Anwendbarkeit in der Radioonkologie hoffen. Der oxidative Stress, der durch die stets gebildeten ROS in gesunden Zellen hervorgerufen wird, wird durch Antioxidantien, wie zum Beispiel Glutathion und Enzyme wie Katalase neutralisiert. In Studien konnte gezeigt werden, dass das natürliche ROS-Antioxidantien-Niveau durch eine erhöhte Eisenkonzentration in den Zellen gestört wird und es zu einer steigenden ROS-Produktion aufgrund der Fenton- und/oder Haber-Weiss-Reaktion kommt. Dabei wird vermutet, dass die mögliche Freisetzung von Fe 2+ -Ionen aus intrazellulären SPIONs die ROS-Produktion fördert. Eine weitere Ursache für die Steigerung der ROS-Konzentration in Tumorzellen wird auf die katalytische Wirkung der SPION-Oberflächen zurückgeführt. Es gibt verschiedene Mechanismen, die zur Bildung von schädlichen ROS-Spezies wie Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ), Hydroxylradikalen (OH ), Hydroperoxylradikalen (HOO ) und Superoxidradikalen (O 2 - ) führen. Hierbei ist zu erwähnen, dass sowohl Wasserstoffperoxid, als auch Superoxidradikale in biologischen Systemen durch Phagocyten, Endothelzellen, Fibroblasten oder die Elektronentransportkette hergestellt werden. Die Fenton-Reaktion kann in biologischen Systemen durch den Fe 2+ freisetzen: katalysierten Abbau von H 2 O 2 das besonders schädliche Hydroxylradikal Fe 2+ + H 2 O 2 Fe 3+ + OH - + OH (17) Auch Fe 3+_ Ionen können durch die sogenannte Haber-Weiss-Reaktion, langsamer als im Vergleich zur Fe 2+ abbauen: katalysierten Reaktion, Wasserstoffperoxid wie folgt Fe 3+ + H 2 O 2 FeOOH 2+ + H + (18) FeOOH 2+ Fe 2+ + HOO (19) Durch die neu entstandenen Fe 2+ -Ionen kann jetzt wieder Reaktion (17) einsetzen. Ein anderer möglicher Weg zur Herstellung dieser aggressiven Radikale ist Superoxid (O 2 - ) unterstützt: Fe 3+ + O 2 - Fe 2+ + O 2 (20) 2O H + H 2 O 2 + O 2 (21) 39

47 Einleitung Voinov et al. beobachteten, dass Fe 3 O 4 -NP aufgrund der enthaltenen Fe 2+ -Ionen effizienter in der Produktion der Hydroxylradikale sind als γ-fe 2 O 3 -NP. Sie konnten zeigen, dass die SPION-Oberfläche hauptsächlich für die Hydroxylradikalproduktion verantwortlich ist. Weiterhin berichteten diese Autoren, dass eine schützende Oleat- oder BSA-Hüllschicht um die SPIONs nur einen geringen Effekt auf die Produktion der ROS-Spezies hat, da kleine Moleküle wie H 2 O 2 oder O 2 - zur aktiven Oberfläche [60, 73] der SPIONs diffundieren können Charakterisierungsmethoden für SPIONs Dieses Kapitel beinhaltet einen kurzen Überblick und eine Zusammenfassung der wichtigsten Grundlagen und Techniken der in dieser Arbeit verwendeten Charakterisierungsmöglichkeiten für die synthetisierten SPIONs. Mittels Transmissionselektronenmikroskopie wurde die Größe und Form der Nanopartikel erforscht sowie erste Hinweise auf die Kristallinität des Materials erhalten. Durch Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie soll die Stabilisierung der SPIONs nachgewiesen werden. Röntgendiffraktometrie liefert schließlich Informationen über die Kristallstruktur und somit die Zusammensetzung des Eisenoxids. Des Weiteren konnte die Kristallitgröße berechnet werden. Durch Röntgenabsorptionsspektroskopie und Röntgenphotoelektronenspektroskopie sollte die jeweilige Struktur und Zusammensetzung komplementär nachgewiesen werden. Die magnetischen Eigenschaften der Nanopartikel wurden mittels supraleitende Quanteninterferenzeinheit untersucht Transmissionselektronenmikroskopie Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) [34, 74, 75, 76, 77] wurde entwickelt, da Lichtmikroskope ein zu geringes Auflösungsvermögen besitzen. Neben einigen anderen Spezialverfahren stellt das HRTEM (englisch: high resolution TEM), dass hochauflösende TEM ein effizientes Werkzeug in der Materialwissenschaft und in der Biologie zur Untersuchung atomarer Strukturen dar. Die Methode beruht darauf, dass 40

48 Einleitung Elektronen eine dünne Probe durchdringen und die gestreuten oder ungestreuten Elektronen detektiert werden. Die Entwicklung von Elektronenmikroskopen konnte durch die von de Broglie 1924 postulierte Wellennatur des Elektrons (Welle-Teilchen-Dualismus) beginnen. Durch de Broglie s Vermutung konnte dem Elektron eine kürzere Wellenlänge λ, als die des sichtbaren Lichtes, aufgrund seines Impulses p und des Planckschen Wirkungsquantums h wie folgt zugeordnet werden: q= ṟ (22) Der Impuls kann mit der Ruhemasse m e des Elektrons und dessen Geschwindigkeit v (Gleichung 23) berechnet werden. Die Geschwindigkeit wird mit der typischen Formel für die kinetischen Energie (E Kin ) beschrieben, die ein Elektron erhält, wenn es mit einer Spannung eu beschleunigt wird (siehe Formel 24).,=s A t [ uvw = 4 x y z (23) q= r {4 x }~ = r {4 x A (24) Aus Gleichung 24 geht hervor, dass die Wellenlänge der Elektronen abnimmt, je höher die Beschleunigungsspannung ist. So erzielen Beschleunigungsspannungen von 100 kv eine Wellenlänge von nm und 200 kv führen zu λ = nm. Diese Werte wurden nichtrelativistisch berechnet. Eine Berücksichtigung relativistischer Phänomene liefert geringfügig kleinere Wellenlängen. Aufgrund der Wellennatur der Elektronen kommt es sowohl zu Beugungserscheinungen als auch zu Interferenzen, die mit der Bragg-Beziehung erklärt werden können. Diese Phänomene werden in der Elektronenmikroskopie ausgenutzt, um eine Vergrößerung der beobachteten Objekte zu erzielen. Nachdem der hochenergetische Elektronenstrahl mit der elektronentransparenten Probe in Wechselwirkung getreten ist, werden sowohl die ungestreuten als auch die elastisch und inelastisch gestreuten Elektronen für die Erzeugung des Bildes genutzt. Abhängig vom Streuwinkel haben die elastisch oder inelastisch gestreuten Elektronen einen kohärenten oder inkohärenten Phasenzusammenhang. Die 41

49 Einleitung resultierenden nicht uniformen Verteilungen der Elektronen beinhalten die gewünschten strukturellen und chemischen Informationen. Der Strahlengang eines TEMs gleicht dem eines Lichtmikroskops, mit dem Unterschied, dass die Aufgaben der Glaslinsen hier von magnetischen Linsen erfüllt werden. Magnetische Linsen sind für die Fokussierung von Elektronen bestens geeignet, da sie nicht anfällig für Hochspannungsausfälle sind. Sie bestehen typischerweise aus zwei Teilen, einem zylindrischen symmetrischen Kern aus Weicheisen, der als Polschuh bezeichnet wird und einer Kupferspule. Der obere und untere Polschuh haben jeweils einen Polschuhspalt und sind durch eine Lücke getrennt. Wenn durch die Kupferspule Strom fließt, so wird ein inhomogenes aber achsensymmetrisches Magnetfeld erzeugt, durch das die Elektronen aufgrund der wirkenden Lorentzkraft fokussiert werden. Durch die Variation der Spannung kann die Brennweite eingestellt werden. Wie bei allen anderen Linsen, existieren auch im TEM Linsenfehler, die für Abbildungsfehler und unscharfe Bilder verantwortlich sind. Diese sind unter anderem die sphärische und chromatische Aberration und Astigmatismus. Die sphärische Aberration wird dadurch verursacht, dass nur achsennahe parallel einfallende Strahlen im Brennpunkt vereinigt werden. Das kann mittlerweile ausgeglichen werden, wohingegen die Fehler der chromatischen Aberration, die durch eine Wellenlängenverteilung und damit unterschiedliche Brennweiten verursacht werden, hingenommen werden müssen. Astigmatismus entsteht durch ein ungleichförmiges Magnetfeld, das die Elektronen in der Linse durchlaufen. Dies kann durch Stigmatoren ausgeglichen werden. Ein schematischer Aufbau eines TEMs ist in Abbildung 1.11 skizziert. Als Quellen für den Elektronenstrahl können thermischen Quellen (im verwendeten TEM vorhanden) oder Feldemissionsquellen dienen. Bei thermischen Quellen in einer Triodenkanone, ist die Kathode eine Wolframhaarnadel (Filament) oder ein LaB 6 -Kristall. Diese werden auf hohe Temperaturen erhitzt, so dass die Elektronen aus der Kathode austreten können, indem die Austrittsarbeit aufgebraucht wird. Gegenüber der Kathode befindet sich der Wehneltzylinder, an dem ein geringes negatives Potential anliegt, was somit als erste Linse zum fokussieren der Elektronen dient. Mittels Beschleunigungsspannung (kv) werden die Elektronen in Richtung der Anode beschleunigt. Es ist wichtig, dass im TEM ein gutes Vakuum von etwa 10-7 Torr herrscht, damit der emittierte kohärente Elektronenstrahl nicht mit Gasen wechselwirken kann bzw. die Probe sauber bleibt. 42

50 Einleitung Abbildung 1.11: Schematische Darstellung des TEM-Strahlengangs. [78] Durch die Verwendung der Kondensorlinse, die exakt justiert sein muss, wird die Probe mit einem parallelen Elektronenstrahl beleuchtet. Unterhalb dieser Linse befindet sich die Probe, die auf ein TEM-Grid aufgebracht wurde. Sie befindet sich in einem Probenhalter, der über eine Schleuse in das Gerät gebracht wird. Je nach Halterart kann die Probe gekippt, rotiert, beheizt oder gekühlt werden. Der scharfe Elektronenstrahl trifft auf die Probe, wodurch einige Elektronen gestreut werden und andere, der Primärstrahl, die Probe einfach durchdringen. Die wichtigsten Linsen im System sind die Objektivlinsen, die das Bild und das Beugungsbild erzeugt. Durch Elektronen, welche die Probe unter einem einheitlichen Winkel verlassen, entsteht das Beugungsbild hinter der Brennebene der Objektivlinse. Für die Bildentstehung ist es entscheidend, welcher Strahl mittels Blende gewählt wird, um das Zwischenbild in der Brennebene entstehen zu lassen. Wird der Primärstahl gewählt, so spricht man vom Hellfeld. Das Dunkelfeld entsteht, wenn mit gestreuten Elektronen gearbeitet 43

51 Einleitung wird. Mittels Blenden kann der Bildkontrast in Abhängigkeit von der Ordnungszahl der Probe verbessert und eine Winkeleinschränkung erzeugt werden. Die Projektorlinse sorgt schließlich für die Vergrößerung des Zwischenbildes, das auf dem Leuchtschirm dargestellt wird. Die Elektronen werden mittels eines Leuchtschirms sichtbar gemacht. Dafür regen die Elektronen Materialien auf dem Leuchtschirm an, die entsprechend der auftreffenden Intensität sichtbares grünes Licht emittieren. Zur Aufnahme von Bildern muss der Leuchtschirm aus dem Strahlengang geklappt werden. In älteren Geräten dienten Photoplatten zur Aufnahme der Bilder. Die Photoplatten werden inzwischen von slow scan Charge- Coupled-Device-Kameras verdrängt. Die CCD-Kameras können Ladung speichern, die sie durch Elektronenstrahlen erhalten haben. Ein wichtiger Aspekt für die Anwendung von TEM Untersuchungen ist ein möglicher Strahlenschaden der Probe durch die ionisierende Strahlung. Das Gerät muss einerseits für den sicheren Umgang ordnungsgemäß abgeschirmt sein, so dass kein Verwender mit der tödlichen Strahlung in direkten Kontakt kommt. Zum anderen kann es zu chemischen und strukturellen Defekten der Probe kommen. Aber auch sogenannte "Knock-on-Schäden" durch die Wegnahme von Atomen sind möglich. [34, 74, 75, 76, 77] 44

52 Einleitung Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie Die Infrarotspektroskopie (IR-Spektroskopie) [79, 80, 81] ist eine der wichtigsten Messmethoden für heutige analytische Wissenschaftler. Mit Hilfe der IR- Spektroskopie können sowohl qualitative als auch quantitative Analysen von Substanzen in den unterschiedlichsten Aggregatzuständen durchgeführt werden. Der bis heute größte Fortschritt in der IR-Spektroskopie wurde mit der Einführung von Fourier-Transform-Infrarotspektrometern (FTIR) erzielt. Hierbei wird als Spektralapparat ein Interferometer in Kombination mit der mathematischen Fourier- Transformation (Zusammenhang zwischen Frequenz und Zeitdomäne) benutzt. Der Name dieser Spektroskopie leitet sich von dem verwendeten Wellenlängenbereich der elektromagnetischen Strahlung, dem Infrarotbereich, ab. Dieser, für das menschliche Auge unsichtbare Bereich schließt sich an den sichtbaren Bereich zu längeren Wellenlängen hin an. Die Methode beruht auf der Wechselwirkung zwischen IR-Strahlung und Molekülen, die durch die Strahlungsabsorption zu Molekülrotationen und -schwingungen angeregt werden. Ein IR-Spektrum gibt den Anteil der durch die Probe bei einer bestimmten Wellenlänge absorbierten Strahlung an. Die Absorption kann mit der Transmission T beschrieben werden: = ". (25) Hierbei steht I 0 für die Intensität vor der Probe und I beschreibt die Intensität nach dem Probendurchgang. Im Spektrum wird ein Peak bei der Energie gemessen, die der Schwingungsenergie einer chemischen Bindung entspricht und ist somit charakteristisch für diese Probe. Die Position des Peaks wird in der Regel in Einheiten von Wellenzahlen ν [cm -1 ] angegeben (Gleichung 26). Ein IR-Spektrum wird meist in einem Bereich von 4000 bis 400 cm -1 gemessen. ν= ƒ (26) Ein IR-Spektrum kann nur für ein Molekül erhalten werden, dessen Dipolmoment sich während der Schwingung durch Absorption von IR-Strahlung ändert. Um die Entstehung eines IR-Spektrums verstehen zu können, kann man auf ein klassisches Beispiel der Mechanik, die Verbindung von zwei Massepunkten (Atome) mit einer 45

53 Einleitung elastischen Feder (Bindung) zurückgreifen. Durch Anwendung des Hook schen Gesetzes und der Energie des harmonischen Oszillators lässt sich die Schwingungsfrequenz ν X. als Funktion der Kraftkonstante k, als Maß für die Bindungsstärke und der reduzierten Masse µ eines zweiatomigen Moleküls wie folgt darstellen: ν = ˆ Š! mit 3= 4 4 z 4 4 z (27) Die Schwingungsfrequenz ist also umso größer, je stärker die Bindung ist und je kleiner die Atommassen sind. Diese klassischen Betrachtungen stimmen nicht mit der Wirklichkeit überein, da sich einige Phänomene in IR-Spektren und das Verhalten von Molekülen bei Absorption von IR-Strahlung damit nicht erklären lassen. Es muss auch die Quantentheorie mitberücksichtigt werden, was mit der Nutzung des anharmonischen Oszillators erfüllt wird. Durch seine asymmetrische Potentialkurve lassen sich die Phänomene der Dissoziation von Molekülen bei Absorption genügend hoher Energie sowie die Coulomb Abstoßungseffekte erklären. Die im Spektrum auftretenden Oberschwingungen lassen sich darauf zurückführen, dass die Schwingungsniveaus nicht mehr äquidistant sind und die spezielle Auswahlregel für die diskreten Energieniveaus des Morsepotentials gleich n = ±1, ±2, ±3 ist. Dabei wird der Übergang vom Grundniveau (n = 0) nach n = 1 als Grundschwingung und der Übergang von n = 0 nach n = 2 als erste Oberschwingung bezeichnet. Die Wahrscheinlichkeit und damit auch die Intensität der Obertöne nimmt mit steigendem n ab. Die FTIR-Spektrometer haben sich heutzutage gegen die konventionellen Geräte in der Nutzung durchgesetzt. Es kann mit viel kürzeren Messzeiten gearbeitet werden, da alle Wellenlängen gleichzeitig detektiert werden (Multiplex- oder Fellgett-Vorteil). Ein weiterer Vorteil resultiert in einem besseren Signal-Rausch-Verhältnis (Jacquinot- Vorteil) durch die stets vorhandenen gesamten Lichtleistung. Der Connes-Vorteil beschreibt die hohe Wellenzahlenstabilität, wenn ein HeNe-Lasers zur internen Eichung eingesetzt wird. Der Aufbau eines solchen Spektrometers ist in (Abbildung 1.12) mit seinem Spektralapparat, dem Interferometer, das dem klassischen Michelson-Interferometer nachempfunden ist, dargestellt. 46

54 Einleitung Abbildung 1.12: Prinzipieller Aufbau eines Interferometers nach Michelson. In einem Michelson-Interferometer wird von einer Quelle breitbandige IR-Strahlung emittiert und mittels eines Kollimator auf einen halbdurchlässigen Strahlteiler gelenkt, der 50 % des Lichtes auf einen festen Spiegel und den anderen Teil auf einen beweglichen Spiegel leitet. Nach Reflektion an den beiden Spiegeln laufen die Lichtstrahlen wieder zurück und treffen am Strahlteiler aufeinander, wo das Phänomen der Interferenz auftritt. Abhängig vom Gangunterschied der beiden Teilstrahlen, der durch die Position des beweglichen Spiegels bestimmt wird, kommt es zur konstruktiven oder zur destruktiven Interferenz. Das resultierende Signal wird maximal, wenn der Gangunterschied der Teilstrahlen einem ganzzahligen Vielfachen der Wellenlänge entspricht und minimal, wenn es sich beim Gangunterschied um ein halbzahliges Vielfaches der Wellenlänge handelt. Die so erhaltene Strahlung wird Interferogramm genannt und entsteht durch die Aufsummierung der einzelnen Interferogramme der enthaltenen Frequenzen der polychromatischen IR-Strahlung. Nachdem diese die Probe passiert hat, kommt es am Detektor zur Strahlungsintensitätsmessung, die aus der Absorption durch die Probe resultiert. Dieses Signal wird anschließend am Computer mittels Fourier-Transformation in das [79, 80, 81] Proben-IR-Spektrum umgewandelt. 47

55 Einleitung Röntgendiffraktometrie Die Röntgendiffraktometrie [23, 29, 34, 82-86, 90-97] oder Röntgenbeugung XRD (englisch: X-Ray Diffraction) ist eine zerstörungsfreie Technik, deren Hauptanwendungsgebiet die Strukturaufklärung von Einkristallen (Laue-Verfahren) ist. Mittels des Debye- Scherrer-Verfahrens können aber auch Untersuchungen an polykristallinen Pulvern erfolgen. Röntgenstrahlung kann genutzt werden, um die Eigenschaften von Kristallsystemen zu identifizieren, da die Atomabstände der dreidimensionalen periodischen Gitter im Wellenlängenbereich der Röntgenstrahlung von etwa 10-9 bis m liegen. Aufgrund dieser Eigenschaft vermutete Max von Laue, dass infolge der Streuung von Röntgenstrahlung an Streuzentren in Kristallen Beugungserscheinungen auftreten sollten. Man kann sich einen Kristall als eine periodische Anordnung von parallelen Netzebenen vorstellen, die mit den Miller Indizes (hkl-werten) bezeichnet werden und als gedachter Sitz der Gitteratome des Kristalls zu verstehen sind. Bragg analysierte 1912 die von Laue durchgeführten Experimente und konnte schließlich (siehe Abbildung 1.13) die Beugung der Röntgenstrahlung und deren resultierende Reflexion an den Gitterebenen mit einer geometrischen Überlegungen in Form der Bragg-Gleichung (28) beschreiben. Abbildung 1.13: Schematische Darstellung der Bragg-Bedingung (Beugung in Reflexion) an der Netzebenenschar eines Kristalls. [87] Die Bragg-Bedingung besagt, wenn Röntgenstrahlung der Wellenlänge λ unter dem Glanzwinkel θ (Einfallswinkel) in den Kristall eindringt, so wird sie an den benachbarten Netzebenen im Abstand d nur dann unter maximaler konstruktiver 48

56 Einleitung Interferenz im Austrittswinkel θ reflektiert, wenn der Gangunterschied (δ = 2d sinθ) zwischen den gestreuten Wellen ein ganzzahliges Vielfaches n der Wellenlänge ist: 2d sinθ=n λ n = 1, 2, 3,... (28) Aufgrund der Wellennatur der Strahlung kann die Interferenz konstruktiv oder destruktiv sein. Destruktive Interferenz tritt auf, wenn der Gangunterschied gleich (n+½)λ ist. Die zur Durchführung von Röntgenbeugungsmethoden notwendige Röntgenstrahlung wird in einer evakuierten Röhre (siehe Abbildung 1.14) erzeugt. Hierbei werden Elektronen aus einer Glühkathode mittels anliegender Beschleunigungsspannung in Richtung einer gekühlten Anode beschleunigt und beim Eindringen in diese abgebremst. Der klassischen Elektrodynamik folgend strahlen gebremste Elektronen senkrecht zur Beschleunigungsrichtung ab, weshalb die Anode meist zur Abstrahlrichtung hin abgeschrägt ist. Der Großteil der so erzeugten kinetischen Energie (E Kin ) wird beim Auftreffen auf die Anode als Wärme abgegeben. Es kommt jedoch mit einem Wirkungsgrad von rund 1 % zur Emission von Röntgenstrahlung. Diese besteht aus zwei Komponenten, dem kontinuierlichen Spektrum der Bremsstrahlung, die durch Energieverluste infolge des Abbremsvorgangs entsteht und der charakteristischen Strahlung, die nur vom Anodenmaterial abhängt. Letztere entsteht dadurch, dass bei genügend großer E Kin die aus der Kathode emittierten Elektronen in der Anode Elektronen kernnaher Schalen herausschlagen können. Die so entstandenen Löcher in der K-Schale werden durch höher liegende Elektronen der Nachbarschalen wieder aufgefüllt. Dabei sind nicht alle Übergänge erlaubt. Die dabei frei werdende Energie (= Energiedifferenz der beteiligten Schalen) wird als elektromagnetische Strahlung (Röntgenstrahlung der K-Serie) abgegeben. Die Notation α und β erfolgt gemäß der Übergänge zur Lochauffüllung aus L- und M-Schalen (Abbildung 1.14 rechts, Molybdän Kα- und Kβ-Strahlung). 49

57 Einleitung Abbildung 1.14:Schematische Darstellung einer Röntgenröhre (links). [88] Typisches Röntgenspektrum (rechts). [89] Es gibt verschiedene Verfahren zur Untersuchung der Röntgenbeugung an Kristallen. Dabei sei neben den schon erwähnten Laue- und Debye-Scherrer- Verfahren noch das Zählrohrinterferenzgoniometer-Verfahren zu nennen. Abhängig von der verwendeten Probenform unterscheidet man zwischen Einkristalldiffraktometern und Pulverdiffraktometern. Da die für das Laue-Verfahren benötigten Einkristalle entsprechender Größe schwer herzustellen sind, und diese für jeden Reflex so gedreht werden müssen, dass die Bragg-Bedingung Bedingung erfüllt ist, entwickelten Debye und Scherrer eine Methode, mit der kristalline Pulver untersucht werden können. Durch das Zermahlen von Kristallen entsteht ein polykristallines Pulver. Dieses ist aus vielen willkürlich verteilten Kristalliten zusammengesetzt, vergleichbar mit kristallinen Nanopartikeln. Trotz der ungeordneten Kristallitorientierung gibt es genügend Kristallite, welche die Bragg-Bedingung erfüllen und somit Beugungsreflexe erzeugen. Ein Nachteil der Pulver-XRDnoch kurz näher auf Methoden ist das große benötigte Probenvolumen. Es soll hier das Debye-Scherrer-Verfahren eingegangen werden. Für eine leichtere Umrechnung der Beugungsabstände auf dem in definiertem Abstand zusammengerollten Röntgenfilm wird der Umfang des Zylinders von 180 oder 360 mm gewählt. Die monochromatische Röntgenstrahlung gelangt über eine Blende in die Messkammer und wird auf die zentrierte Probe gelenkt, hinter der eine Austrittsblende angebracht ist. Die Probe sollte sorgfältig zentriert werden, dass beim Drehen der Proben während der Messung keine abnorme Beugung erscheint. Der aus der Probe austretende Röntgenstrahl wird auf den Mittelpunkt des Films fokussiert und die Messvorrichtung mit einem Deckel verschlossen. Auf dem Film sind die 50

58 Einleitung Beugungskegel als sichelförmige Reflexe zu beobachten. Eine Alternative zu diesem Verfahren ist das Zählrohrdiffraktometer (Abbildung 1.15). Die feinkristalline Probe wird als gepresstes Pellet vermessen. Hierbei befindet sich hinter der Probe ein Detektor (Zählrohr oder Szinitillationszähler), der während der Messung mit doppelter Winkelgeschwindigkeit zur planparallelen Probe gedreht wird. So kann ein winkelabhängiger Intensitätsverlauf der gebeugten Strahlung erfasst werden, woraus schließlich das Pulverdiffraktogramm erstellt wird. [nach 97] Abbildung 1.15: Schematische Darstellung eines Zählrohrdiffraktometers. Das Beugungsbild eines Einkristalls besitzt meist sehr scharfe Peaks, da der Kristall sehr groß ist und dementsprechend genügend parallele Netzebenen für Beugungsreflexe durch konstruktive Interferenz zur Verfügung stehen. Für die Untersuchung von polykristallinen Pulverproben wird häufig eine Zunahme der Halbwertsbreite des Peaks beobachtet, die invers zur Kristallitgröße ist. Als Faustregel gilt, je größer die Peak-Verbreiterung, desto kleiner ist die Kristallitgröße. Diese Verbreiterung ist neben der geringen Größe der Kristallite (< 100 nm) und möglicher Defektstrukturen auch auf Effekte des Messinstruments zurückzuführen. Wenn die Zunahme der Halbwertsbreite bei allen Peaks im Diffraktogramm zu beobachten ist, wird sie hauptsächlich von der Probe ausgelöst. Aufgrund dieser Beobachtung entwickelte Scherrer eine Beziehung (siehe Gleichung 29), um die Kristallitgröße ε aus der Halbwertsbreite des Beugungspeaks b zu berechnen: ε= ƒ (29) 51

59 Einleitung dabei ist λ die Wellenlänge der verwendeten Röntgenstrahlung (für Cu-Kα = nm), θ der Bragg-Winkel und K die Scherrer-Konstante. Die dimensionslose Konstante wird durch die Form der Partikel bestimmt und kann Werte zwischen 0.8 und 1.2 annehmen. Für sphärische Partikel wird in der Literatur K als 0.9 angegeben. Die Beugungsreflexe entstehen aufgrund von konstruktiver Interferenz der Wellen von unterschiedlichen Streuzentren. Je mehr parallele Streuzentren (n) zu einer positiven Interferenz beitragen, desto schärfer erscheint ein Signal. Je kleiner n ist, desto breiter erscheint das Signal. Ebenso wie die konstruktive trägt auch die destruktive Interferenz zu scharfen Beugungsreflexen bei, indem gestreute Wellen, welche nicht dem Bragg-Gesetz folgen, ausgelöscht werden. Für die endlichen kristallinen Nanopartikelproben bedeutet dies, dass nicht genügend Streuzentren für eine ausreichend scharfe konstruktiven Interfenz zur Verfügung stehen, beziehungsweise nur unvollständige destruktive Interferenz aufgrund mangelnder Partnerwellen stattfinden kann. Obwohl die verwendete Kupfer-Kα-Strahlung die meist genutzte Strahlung ist, ist sie für Untersuchungen von eisenbasierten Materialen ungünstig. Aufgrund der aus den Eisenzentren resultierenden Fluoreszenzstrahlung, sind die Spektren mit einem hohen Hintergrundrauschen behaftet. Dadurch fällt die Peakintensität sehr gering aus. Um dennoch aussagekräftige Spektren zu erhalten, wurden die Messungen sehr langsam durchgeführt (2-80 im 2θ-Winkelbreich mit Schritten/ 10 sec). [23, 29, 34, 82-86, 90-97] Röntgenabsorptionsspektroskopie Röntgenabsorptionsspektroskopie [83, 85, , 103, ] XAS (englisch: X-Ray absorption spectroscopy) fasst als Überbegriff verschiedene Röntgenabsorptionsmethoden zusammen. Die leistungsfähigste und universell einsetzbarste Quelle für kontinuierliche Strahlung ist die Synchrotronstrahlung. Sie liefert Strahlung vom IR-Bereich bis hin zur harten Röntgenstrahlung. Heute gibt es weltweit mehr als 50 Synchrotronquellen (Speicherringe), die Röntgenstrahlung für XAS liefern. Ein typischer Messaufbau für die XAS-Spektroskopie an einem Synchrotron ist in Abbildung 1.16 dargestellt. 52

60 Einleitung [nach 102] Abbildung 1.16: XAS-Messaufbau am ESRF für Messung in Fluoreszenzdetektion. Die polychromatische Synchrotronstrahlung wird in einen Doppelkristallmonochromator gelenkt. Der Vorteil des Doppelkristallmonochromators ist die geringe Versetzung des resultierenden monochromatischen Strahls zum einfallenden Weißlichtstrahl. Die Verwendung von Spiegeln erfolgt nicht in allen Messaufbauten. Sie können einerseits zur Strahlfokussierung und damit der Erhöhung der Flussdichte sowie zur Unterdrückung von höheren Harmonischen dienen, die einen starken Hintergrund im Spektrum produzieren würden. Die Intensität I 0 der einfallenden Strahlung wird vor der Probe in einem röntgentransparentem Detektor ermittelt. Anschließend trifft der Strahl auf die Probe und kann über die Transmission direkt gemessen oder als Röntgenfluoreszenz detektiert werden, die beim Zerfall des durch Absorption erzeugten angeregten Zustandes entsteht. Für eine Transmissionsmessung müssen die Proben homogen und ausreichend dünn sein. Die resultierende Intensität I trans wird von einem Detektor direkt hinter der Probe registriert. Die Fluoreszenzmessung ist experimentell Aufwändiger, aber problemloser, da die Probe keine bestimmte Dicke aufweisen muss und auch stark verdünnte Proben gemessen werden können. Bei dieser Messung wird ein Detektor für die Erfassung der Röntgenfluoreszenzintensität (I fluo ) erforderlich, der hohe Zählraten ( 100 kcps) verarbeiten kann, eine gute Energieauflösung (< 500 ev) und eine ausgezeichnete Raumwinkelabdeckung hat. So kann aus dem Logarithmus des Intensitätsverhältnisses, in Abhängigkeit von der Energie, ein XAS ermittelt werden. Diese Messmethode beruht darauf, dass die inneren Elektronen von K- und L- Schalen durch Absorption von Röntgenstrahlung angeregt werden können. Die nötige Energie, um ein kernnahes Elektron ins Kontinuum anzuregen, wird durch die Elektronenbindungsenergie bestimmt und ist für jedes Element charakteristisch. Das 53

61 Einleitung so erzeugte Photoelektron hat eine kinetische Energie (E kin ), die der Differenz der absorbierten Röntgenenergie E und der Bindungsenergie E 0 entspricht. [ Vvw =[ [ ( (30) Durch die Photoabsorption über der Ionisationsschwelle kann ein abrupter, stufenförmiger Anstieg des Röntgenabsorptionskoeffizienten µ [in cm -1 ] beobachtet werden, der zu elementspezifischen Absorptionskanten führt. Die Höhe der Kante ist proportional zur Menge des untersuchten Elements in der Probe. Somit kann XAS sowohl für qualitative als auch quantitative Untersuchungen genutzt werden. Die nach der Absorption, vom Absorberatom ausgehende niederenergetische Photoelektronenwelle, wird an der Elektronenhülle des Nachbaratoms gestreut. Diese vom Absorber ausgesandten und an den Nachbarn zurückgestreuten sphärischen Photoelektronenwellen können aufgrund ihrer Natur konstruktiv oder destruktiv interferieren, was zu Oszillationen (µ-schwingungen) oberhalb der Absorptionskante führt. Die Messung des Absorptionskoeffizienten kann bei bekannter Probendicke (d) leicht über die Messung der Intensität des einfallenden monochromatischen Lichtes (I 0 ) sowie der Intensität hinter der Probe (I) nach Gleichung 31 erfolgen: 3 = " oder š=š ( b µh. (31) In einem XAS (Abbildung 1.17), wird die Änderung des Absorptionskoeffizienten als Funktion der Röntgenphotonenenergie dargestellt. Es besteht aus zwei kollidierenden Energiebereichen, dem XANES-Bereich und dem EXAFS-Bereich. Der Bereich der Röntgen-Nahkanten-Absorptions-Spektroskopie, XANES (englisch: X- Ray absorption near-edge structure spectroscopy) startet bei den niedrigsten möglichen Übergängen und schließt den Vorkantenbereich sowie mögliche Vorkantenpeaks mit ein. Der Bereich geht bis über die Absorptionskante zum Beginn der erweiterten Röntgenabsorptionsfeinstruktur, EXAFS (englisch: Extended X-Ray absorption fine structure) deren Oszillationen etwa ev oberhalb der Absorptionskante beginnen und bis zu ev reichen können. 54

62 Einleitung Abbildung 1.17: Schematische Darstellung eines XAS mit eingezeichnetem XANES- und EXAFS-Bereich. Konstruktive und destruktive Interferenz der Photoelektronenwellen von Absorberatom (A) und Nachbaratom (S) an dem Streuung erfolgt. [103] Mit Hilfe dieser elementspezifischen Methoden lassen sich strukturelle Informationen über die lokale Umgebung wie Natur, Anzahl, und Abstand zu nächsten Nachbaratomen sowie die Koordination und der Oxidationszustand des röntgenabsorbierenden Atoms untersuchen. Dabei reicht das Portfolio von Lithium bis Uran. Die Feinstruktur direkt nach der Kante ist dabei einzigartig für jede Verbindung. Die beiden Energiebereiche liefern unterschiedliche Informationen und müssen separat ausgewertet werden. So lassen sich aus dem XANES-Bereich Informationen über Koordination und Valenz des Elementes gewinnen. Die µ- Modulationen der EXAFS-Oszillationen entstehen aus Interferenzen die aus Streueffekten mit den Nachbaratomen resultieren. Hieraus können schließlich Informationen über die lokale Struktur, also die Abstände zu den nächsten Nachbaren erhalten werden. Bereits 1920 wurde das EXAFS-Phänomen, die kurzreichweitige Ausbreitung und Streuung der Photoelektronenwelle an den Nachbaratomen, erstmals beschrieben (Abbildung 1.18). Aber erst in den 70er Jahren erfolgte eine theoretische Beschreibung. 55

63 Einleitung Abbildung 1.18: Schematische Darstellung des XAFS-Prozess. Von links nach rechts: Absorption des Röntgenquants durch das Absorberatom, auslaufende Photoelektronenwelle und schließlich Streuung und Interferenz an den Nachbaratomen, auch Mehrfachstreuung. [104] Die Energie des Photoelektrons, welches das Atom verlässt, hängt mit der Energie des absorbierten Röntgenphotons (E) zusammen. Für die weitere theoretische Charakterisierung dieses Prozesses ist es vorteilhaft, die Energieskala in den entsprechenden Wellenvektor (k) umzurechnen. œ= 4 x ħ z [ [ ( (32) Hierbei ist k der Betrag des Wellenvektors, m e die Ruhemasse des Elektrons, ħ = h/2π und E 0 die Bindungsenergie des Photoelektrons. Für die Auswertung der gemessenen Spektren ist es sinnvoll die EXAFS-Feinstrukturfunktion χ(e) zu normieren und den glatten Untergrund µ 0 (E), der durch die Abwesenheit von Nachbarn entsteht, abzuziehen: &[=!! "! " " (33) Hierbei ist µ(e) der gemessene Absorptionskoeffizient und µ 0 (E 0 ) ist die Höhe des Kantensprungs. Durch die Absorption des Röntgenphotons gelangt man vom Grundzustand in den angeregten Zustand. Der angeregte Zustand, entsteht durch Interferenzen der ausgehenden Photoelektronenwelle mit rückgestreuten Wellen, die entweder der Einfachstreuung gehorchen oder Mehrfachstreuprozessen unterliegen. Mit Hilfe der short range single electron scattering theory lassen sich alle Feinstrukturbeiträge mathematisch in der EXAFS-Gleichung (34) zur Modulation χ zusammenfassen: 56

64 Einleitung w &(œ)= Ÿ ( œ œb z V z b + V V+ ~ V V+ z (34) mit n Anzahl der Absorber-Rückstreupaare N j S 0 2 F j (k) Koordinationszahl Amplitudenreduktionsfaktor (Mehrfachanregung berücksichtigt) Betrag der Rückstreuamplituden σ j Debye-Waller-Faktor r j Distanz λ j (k) ϕ ij (k) mittlere freie Weglänge des Photoelektrons gesamte Phasenverschiebung des Photoelektrons. Diese Gleichung stellt das Kernstück der EXAFS-Auswertung dar und ist aber nur für Einfachstreuprozesse gültig. Die sind zwar dominant, aber in der Realität kann das Photoelektron eine Vielzahl von Mehrfachstreuprozessen durchlaufen. Für die Analyse der Spektren gibt es deutliche Differenzen zwischen diesen beiden Bereichen in Verständnis und Komplexität. Die EXAFS-Ergebnisse können mittels Kurvenanpassung und entsprechenden mathematischen Funktionen angepasst werden, wohingegen die XANES-Spektren theoretisch aufwendiger sind und nur mittels ab initio-simulationen ausgewertet werden können. Die Datenanalyse wurde in dieser Arbeit mit den frei zugänglichen Softwarepaketen Athena und Artemis durchgeführt. Die Programme nutzen die IFEFFIT-Bibliothek ( Matt Newville), die Analysealgorithmen enthält und zur allgemeinen Datenmanipulation verwendet werden kann. Mit Hilfe von Athena, einem vielseitigen Programm zur Verarbeitung von EXAFS- Daten, können Anpassungen und Fourier-Transformationen von Rohspektren erfolgen. Aber auch die Entfernung des Hintergrundes sowie die Zusammenfügung von mehreren Messsätzen kann durchgeführt werden. Nach dem Import und der Konvertierung in µ(e) erfolgt die Normierung (Gleichung 33), um eine direkte Vergleichbarkeit der Daten zu erzielen. Die meisten, im Programm enthaltenen 57

65 Einleitung Standardparameter liefern gute Ergebnisse. Aber bei stark verrauschten oder komplexen Daten ist ein Nutzereingriff erforderlich. Die E 0 -Bestimmung erfolgt mittels Wendepunktmethode. Hierzu wird das erste Maximum der ersten Ableitung von µ(e) als E 0 bestimmt. Das ist als Standardprozess durch den IFEFFIT-Algorithmus vorgegeben, liefert aber meist etwas zu hohe Werte. Die weitere Korrektur der Rohdaten durch Subtraktion der Hintergrundfunktion, die durch Streustrahlung hervorgerufen wurde, ist von besonderer Bedeutung für die weitere Datenanalyse und wird von diversen Parametereinstellungen (Rbkg-Wert, Spline Bereich, k- Wichtung) beeinflusst. Schließend wird das Spektrum auf einen Kantensprung von eins normiert. Die Abschwächung der Interferenz mit steigenden k-werten wird durch eine Wichtung von k n χ(k) mit n = 2 erzielt. Das Programm liefert nun die Umrechnung von χ(e) in den Wellenvektor und die erforderliche Fourier-Transformation von χ(k), so dass sofort eine Auswirkungen der vorherigen Eingaben auf die resultierenden Daten erkannt werden kann. Die Maxima der so erhaltenen FT-Funktion entsprechen, mit einer Reduktion der Werte um ~ Å, den Abständen der Nachbaratome. Diese Verschiebung resultiert aus der E 0 -Bestimmung und der Phasenverschiebung. Da mehrere Spektren von einer Probe gemessen wurden, um einen sicheren Wert zu generieren, erfolgt nun die Zusammenfügung der identisch vorbehandelten Spektren. Die Einzeldaten müssen gut ausgerichtet sein und zusammenpassen, da sonst eine starke Abschwächung der Feinstruktur im Gesamtspektrum resultieren würde. Dieser Datensatz wird schließlich für die EXAFS- Simulation mittels Artemis verwendet. Artemis, das mit dem zusätzlichen Tool Atoms ausgestattet ist, ist ein graphisches Fitprogramm, das mit Hilfe von theoretischen Standardmodellen des FEFF- Programmpakets zur ab initio-berechnungen von Mehrfachstreuprozessen (auch Einfachstreuprozesse werden berücksichtigt) verwendet wird. Die Kurvenanpassung erfolgt, nach Eingabe von Parametern wie zum Beispiel S 0 2, σ 2 und E 0, durch das interaktive Programm. Es kann entsprechend der Literatur, möglicher Erfahrung und [83, 85, , 103, ] Charakter der erhaltenen Ergebnisse noch bearbeitet werden. 58

66 Einleitung Röntgenphotoelektronenspektroskopie Eine der wichtigsten Methoden zur Untersuchung von Oberflächen ist die Röntgenphotoelektronenspektroskopie [85, ] XPS (englisch: X-ray photoelectron spectroscopy). Mittels XPS lassen sich die chemische Zusammensetzung von Oberflächen, der chemische Zustand (z.b. Bindungs- und Oxidationszustand) sowie die elektronische Struktur von Grenz- und Oberflächen analysieren. Durch die Einstrahlung von Photonen einer bestimmten Energie E = hν, werden Elektronen von Atomen, Molekülen und Festkörpern, die eine definierte Bindungsenergie E B besitzen, angeregt und als Photoelektron aus der Probe ins Vakuum emittiert (Abbildung 1.19). Abbildung 1.19: Links: XPS-Prozess mit Erzeugung eines Photoelektrons aus der K-Schale. Rechts: Relaxationsprozess mit Emission eines Augerelektrons der KLL-Serie. Die Energie der Anregungsquelle ist verantwortlich für die Unterscheidung zwischen der UV-Photoelektronenspektroskopie (UPS), hier erfolgt die Anregung durch UV- Strahlung (5-100 ev) und XPS, die mit Röntgenstrahlung mit Energien größer 100 ev arbeitet. Aufgrund der niedrigeren Photonenenergie, die in der UPS Verwendung findet, können nur Valenzelektronen anregen werden, wohingegen durch die Nutzung von Röntgenstrahlung mittels XPS zusätzlich noch tieferliegende Kernelektronen angeregt werden können. In einem XP-Spektrum wird die Zahl der Elektronen gegen die Bindungsenergie (E B ) oder gegen die kinetische Energie (E Kin ) aufgetragen. Hierfür kann durch Messung 59

67 Einleitung der E Kin der Photoelektronen bei bekannter Anregungsenergie und Austrittsarbeit des Spektrometers ϕ SP die Bindungsenergie mit Gleichung (35) berechnet werden: [ uvw =h [ h «X^ (35) E B wird aufgrund des leitenden Kontaktes zwischen Probe und Spektrometer auf dessen Fermi-Niveau bezogen, oder im Fall freier Atome oder Moleküle auf das Vakuum-Niveau. Für die Kalibrierung des Messinstruments wird eine Referenzmessung unter Verwendung von Metallen wie Gold oder Kupfer durchgeführt und die gemessenen Fermi-Kante auf eine Bindungsenergie von 0 ev gesetzt. Die Bindungsenergien sind elementspezifisch und liefern Informationen über die chemische und elektronische Struktur der Oberfläche. Zur Untersuchung der chemischen Bindung oder des Oxidationszustandes eines Elements können die Rumpfelektronen genauer analysiert werden. Es gilt, je stärker positiv der Oxidationszustand eines Atoms ist, desto höher ist dessen E B. Eine chemische Bindung ist mit einer Elektronendichteverschiebung verbunden, welche die E B der Kernelektronen beeinflusst und eine Verschiebung der XP-Signale bewirkt. Mit Hilfe dieser sogenannten chemischen Verschiebung lassen sich die effektive Ladung am Atom sowie der Einfluss der Nachbaratome bestimmen. Neben der qualitativen Analyse kann mit XPS auch eine quantitative Analyse durchgeführt werden, da die Signalfläche proportional zur Atomkonzentration ist. Scharfe elementspezifische Signale werden nur von emittierten Elektronen erzeugt, die die Probe ohne Energieverlust durch Stöße verlassen. Da der Augerprozess ein Relaxationsvorgang der Photoemission sein kann, erscheinen häufig auch sogenannte Augersignale im Spektrum. Die durch Bremsstrahlung angeregten Photoelektronen tragen hauptsächlich Elektronen, die durch inelastische Stöße verlangsamt wurden. Das ergibt den Hintergrund des Spektrums. Die Oberflächensensitivität wird durch die mittlere freie Weglänge λ M von Elektronen in Materie bestimmt und liegt bei einigen Nanometern. Dies ist auch der Grund für die Verwendung eines Ultrahochvakuum-System (UHV). Die zwingend erforderlichen Vakuumdrücke von < 10-7 Pa werden mittels mehrerer hintereinandergeschalteter Pumpen (z. B. Drehschieberpumpe, Turbomolekularpumpe, Ionengetterpumpe) erreicht. In einem typischen Messaufbau (siehe Abbildung 1.20), ist die Probe im Brennpunkt der Photonenquelle und des Energieanalysators auf dem 60

68 Einleitung Manipulatorarm befestigt. Als Lichtquelle dient für UPS eine Gasentladungslampe und eine Röntgenröhre für XPS. Für beide Methoden kann auch Synchrotronstrahlung verwendet werden. Die Röntgenstrahlung wird mittels Aluminium-Fenster und Einkristallmonochromatoren von Bremsstrahlung befreit, die Satelliten im Spektrum hervorrufen und die Auflösung der Signale verschlechtern würde. Abbildung 1.20: Schematischer Aufbau einer XPS-Anlage. Den abschließenden Teil des Messaufbaues bildet ein Energieanalysator. Der gebräuchlichste ist der hemisphärische Analysator, der aus einem Vorverzögerer, zwei konzentrisch angeordneten Halbkugeln und einem Elektronendetektor besteht. Die aus der Probe emittierten Elektronen durchlaufen den Vorverzögerer und gelangen über einen kleinen Eintrittsspalt in den hemisphärische Teil des Analysator. Durch die angelegte konstante Potentialdifferenz zwischen den beiden Halbkugeln werden die Elektronen auf eine Kreisbahn abgelenkt. Die Elektronen mit einer kinetischen Energie, die der Passenergie (E Pass ) entspricht, erreichen den Detektor. Eine Dispersion wird durch Variation der Vorverzögererspannung erhalten. Damit werden selektiv Elektronen verschiedener kinetischer Energie detektiert. Die Detektion erfolgt meist digital und erfordert eine Verstärkung der geringen Signale mittels Dynoden oder Channeltrons. Die Datenauswertung erfolgt mittels eines Auswertprogramm (z. B. Origin). Die Untergrund-Korrektur wird nach der Shirley- oder der aufwendigeren Tougaard- 61

69 Einleitung Methode durchgeführt. Als Fitfunktion für die Detailspektren wurde in dieser Arbeit eine Gauss-Lorentz-Funktion (30 % Lorentzanteil) benutzt. Ebenfalls essentiell für die Zuordnung aller gemessener Peaks zu Elementen ist die Nutzung von [85, ] Spektrenkatalogen, in denen die Bindungsenergien tabellarisiert sind Supraleitende Quanteninterferenzeinheit Die Abkürzung SQUID [23, 35, ] steht für supraleitende Quanteninterferenzeinheit (englisch: superconducting quantum interference device). Das SQUID dient zur Messung kleinster Magnetfeldänderungen und damit zur Untersuchung der magnetischen Eigenschaften von Proben. Diese Magnetometer sind aus einem supraleitenden Ring aufgebaut, in dem an einer oder zwei Positionen Josephson- Kontakte vorhanden sind. Man unterscheidet deshalb zwischen rf-squid oder dc- SQUID. Als Supraleitung wird die Eigenschaft einiger Materialien bezeichnet, da deren elektrischen Widerstand R auf nichtmessbar kleine Werte absinkt, wenn diese unter eine Sprungtemperatur T K abgekühlt werden. Man kann unter bestimmten Bedingungen annehmen, dass R faktisch verschwindet. Anders ausgedrückt, wenn ein supraleitender Ring auf eine T < T K abgekühlt wird, wird durch Wegnahme eines in der Öffnung befindlichen Magnetfeldes ein Dauerstrom im Ring induziert, der solange fließt, wie der supraleitende Zustand anhält. Weitere, von den Randbedingungen abhängige Eigenschaften sind das ideale diamagnetische Verhalten und die Existenz quantisierter magnetischer Flusswirbel. Abbildung 1.21: Schaltschema einer Sandwichstruktur von zwei Supraleitern (SL), mit nichtsupraleitender dünner Barriere die Cooper-Paare durchtunneln [nach 35] können. 62

70 Einleitung Josephson konnte aufgrund des quantenmechanischen Tunneleffekts theoretisch vorhersagen, dass in einer aus zwei gleichen Supraleitern aufgebauten Sandwichstruktur (Abbildung 1.21), in der diese durch eine wenige Nanometer dicke isolierende Schicht getrennt sind, Elektronen von einem Supraleiter zum andern gelangen können (Josephsoneffekt). Das ist möglich, da die Wellenfunktionen der metallischen Bereiche etwas überlappen und somit die Supraleiter miteinander koppeln, weshalb Elektronen oder Cooper-Paare die dünne Barriere überwinden können und ein sogenannter Josephsonstrom fließt. Die Barriere wird als "weak-link" bezeichnet und kann aus einer Oxidschicht, normalleitendem Material, einem Punktkontakt oder einer dünnen Brücke bestehen. Für das Verständnis der Supraleitung konnten Bardeen, Cooper und Schrieffer 1957 die BCS-Theorie aufstellen, die von der Bildung sogenannter Cooper-Paare ausgeht. Cooper-Paare sind aus zwei Elektronen zusammengesetzt und tragen die Ladung q = 2e. Die beiden Elektronen beeinflussen die positiven Atomrümpfe eines Gitters, indem sie sie anziehen. Das führt zu deren Polarisation, da es zu einer Steigerung der positiven Ladung in der Umgebung der Elektronen kommt. Wegen der Polarisation des ersten Elektrons wird das zweite Elektron angezogen und fliegt dabei in der Polarisationsspur des Ersten. Dieser Effekt tritt auf, da die Elektronen entgegengesetzte Impulse und Spins haben (, =, ), was als Bedingung für die Cooper-Paarbildung gilt. Es konnte gezeigt werden, dass der magnetische Fluss ϕ durch einen supraleitenden Ring quantisiert ist und nur ganzzahlige Vielfache n des elementaren Flussquants (n*ϕ 0 ) annehmen kann. Die erlaubten, diskreten Werte werden durch das elementare Flussquant ϕ 0 bestimmt, das durch das Plancksche Wirkungsquantum h und die Elementarladung e gegeben ist: «( = r A =2, Tm 2. (36) Mit der Quantisierung des magnetischen Flusses im supraleitenden Ring geht ebenfalls eine Quantisierung des Stromes einher. Das resultiert aus der Phasendifferenz der Wellenfunktion, die nach einem Ringdurchlauf im Supraleiter nur ganzzahlige Vielfache von 2π annehmen kann. Josephson postulierte, dass, wenn keine Spannung U an der Sandwichstruktur anliegt, dennoch ein Strom fließt (Josephson-Gleichstrom-Effekt). Dieser ist gegeben durch die erste Josephson- 63

71 Einleitung Gleichung (37), die zeigt, dass der Josephsonstrom I S proportional zum kritischen Strom I C und der Phasendifferenz γ ist: š X = š > 9³ = š > sin µ µ (37) mit š. = u A ħ ] X = u " ] X (38) µ und µ sind die Phasen der makroskopischen Wellenfunktionen der Supraleiters 1 und 2. K ist eine Konstante, welche die Stärke des Austausches der Cooper-Paare angibt, V ist das Volumen und n S ist die Cooper-Paar-Dichte. Wird nun eine Gleichspannung U = const angelegt, so steigt die Phasendifferenz mit der Zeit linear an. Die Phasendifferenz und die angelegte Spannung kann mit der zweiten Josephson-Gleichung wie folgt in Beziehung gebracht werden: H µ H¹ µ = " 2 (39) Der auftretende hochfrequente Wechselstrom hat eine Frequenz, die durch Gleichung (40) gegeben ist. Dieser Effekt wird als Josephson-Wechselstrom-Effekt bezeichnet. º» = " =2 A r (40) In einem Gleichstrom-SQUID (dc-squid, direct current) werden zwei gleichartige Josephson-Kontakte (a und b Abbildung 1.22) zur Messung der Magnetfeldänderungen in einem supraleitenden Ring parallel geschalten. Ein äußeres Magnetfeld ¼½½½½ 5 wird senkrecht zur Ringfläche angelegt und ein zusätzlicher konstanter Biasstrom I wird aufgeprägt, der sich einheitlich auf die beiden Ringarme aufteilt (I 1 und I 2 ). Die Phasendifferenz aller Cooper-Paar-Wellenfunktionen, die durch die beiden Kontaktstellen verursacht wird, wird durch den Magnetfluss ϕ bestimmt. Somit oszilliert der maximale Suprastrom I S,max mit dem angelegten magnetischen Feld in der Periode ϕ 0, gleiches gilt für die Spannung über die Kontakte. 64

72 Einleitung Abbildung 1.22: Schematisches Schaltbild eines dc-squids mit Stromfluss (links), Spannungsmodulation mit dem magnetischen Feld (Mitte), Schaltbild eines rf-squids [nach 112, 115, 116] (rechts). Einen einfacheren Aufbau hat das etwas unempfindlichere Radiofrequenz-SQUID (rf- SQUID, radio frequency), das über einen einzelnen Josephson-Kontakt verfügt (Abbildung 1.22, rot). Es gibt keinen direkten Stromkreis. Der supraleitende Ring ist mit einem Schwingkreis induktiv gekoppelt, der mit Wechselspannung/-strom hoher Frequenzen betrieben wird und so im Ring einen oszillierenden magnetischen Fluss erzeugt. Als Messgröße dient, ähnlich dem dc-squid, eine periodische Änderung der Wechselspannung des Schwingkreises mit dem äußeren angelegten [23, 35, ] magnetischen Fluss In Vitro Untersuchungen der synthetisierten SPIONs Die in dieser Arbeit hergestellten SPIONs sollen zur Verbesserung der nebenwirkungsärmeren Strahlentherapie dienen und wurden deshalb mit verschiedenen in vitro Methoden untersucht. Die Analysen über die Bioverträglichkeit der hergestellten SPIONs und einer möglichen ROS-Produktion durch diese SPIONs wurden an der humanen Mammakarzinomzelllinie MCF7 durchgeführt. Zur Überprüfung der Nanotoxizität wurden sowohl Trypanblaufärbungen vorgenommen als auch MTT-Assays durchgeführt. Die Aufnahme der SPIONs in die Krebszellen wurde mittels TEM-Aufnahmen nachgewiesen. Der wichtige Nachweis über die ROS- Produktion wurde mittels DCFH-DA-Assay erbracht. Eine exakte Beschreibung der Zelllinie sowie der diversen Tests wird in den folgenden Kapiteln gegeben. 65

73 Einleitung Zytotoxizitätsstudien und ROS-Produktion Die enorme Häufigkeit von Brustkrebs bei Frauen und die ungeheuren Anzahl an Neuerkrankungen in Deutschland (etwa jährlich) sowie deren steigende Tendenz, waren Grund genug für die Untersuchung der Zytotoxizität der synthetisierten SPIONs eine Brustkrebszelllinie zu wählen. [118, 119, 120] Die verwendete humane Mammakarzinomzelllinie MCF7 (Abkürzung: Michigan Cancer Foundation-7) stammt aus dem malignen Pleuraerguss einer 69-jährigen Patientin und wurde im Jahr 1970 angelegt. Die epithelialen MCF7-Zellen (Abbildung 1.23) verfügen über einen hohen Differenzierungsgrad und wachsen als Monolage auf geeigneten Wachstumsoberflächen. Die Generationszeit (= Verdopplung der Zellzahl) liegt bei etwa 50 h. [120] Abbildung 1.23: MCF7-Zellen im TEM mit SPIONs. Die konfluente Zellkultur wird unter Verwendung von Trypsin/EDTA alle 3-4 Tage passagiert und in DMEM-Zellzuchtmedium kultiviert. Das DMEM-Zellzuchtmedium enthält folgende Zusätze: FBS (10 %), Penicillin-Streptomycin-Lösung (1 %), nichtessentielle Aminosäuren (1 %), Natriumpyruvat (1 %) und Glutamax-I- Supplement (1 %). Die in Klammern angegebenen Werte entsprechen dem Prozentanteil im Medium. 66

74 Einleitung Trypanblaufärbung Zur Untersuchung der Toxizität der unterschiedlichen SPIONs (nicht-stabilisiert sowie stabilisiert) dient die Trypanblaufärbung, da dieser Farbstoff gezielt tote Zellen anfärbt. Die Zellmembran toter Zellen ist stark geschädigt, so dass Trypanblau in die Zelle eindringen und diese färben kann. Die Farbstoffaufnahme ist vom ph-wert abhängig. Für eine exakte Vergleichbarkeit der Ergebnisse muss die Temperatur, die Färbedauer und die Konzentration, auch aufgrund der Zytotoxizität des Farbstoffes, in allen Messungen konstant sein. Für die Durchführung dieses Tests werden die Zellen mit SPIONs enthaltendem Medium über 1, 24, 48 und 72 Stunden inkubiert. Eine Zelldichte von 10 5 Zellen je ml wird in einem Eppendorfgefäß mit Trypanblau-Lösung (0.4 % in 0.81 % NaCl und 0.06 % Kaliumphosphat) versetz, gründlich gemischt und einige Minuten ruhen gelassen. Anschließend werden die Zellen, die ungefärbten als auch die blauen toten Zellen in einer Neubauerzählkammer ausgezählt. Die Berechnung des Prozentsatzes an lebenden Zellen erfolgt gemäß: ¾ 8Àb Á bâb b Ãb b = ÄÅ5ÆAw ÇAÅÅAw Æw6AÈä+ĹA ÇAÅÅAwÄÅ5ÆA ÇAÅÅAw 100. (41) Thiazolylblaufärbung (MTT-Assay) Eine weitere Methode zur Messung der Toxizität ist die Thiazolylblaufärbung, da mittels MTT die Aktivität der mitochondrialen Dehydrogenase von lebenden Zellen bestimmt werden kann. MTT ist die Abkürzung für den gelben Farbstoff 3-(4,5- Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid der von vitalen Zellen in dessen dunkelblaue Form, dass wasserunlösliche MTT-Formazan reduziert wird. Hierfür diffundiert MTT ins Zellinnere, wo es zum Bindungsbruch innerhalb des Tetrazoliumrings durch die mitochondriale Dehydrogenase stoffwechselaktiver Zellen kommt und das dunkelblaue MTT-Formazan entsteht. Über die Intensität des Blautones lassen sich Informationen über die Zellzahl und die Vitalität der behandelten Zellen gewinnen. Hierfür wird in einem Elisa Reader bei 550 nm die Absorption der Formazanlösung in der Wellplatte gemessen. 67

75 Einleitung Die Zellen werden mit einer Dichte von 10 3 Zellen pro Well in 96-Wellplatten kultiviert, bis eine konfluente Monolage gewachsen ist. Nun wird das Zellmedium durch die im Medium dispergierten SPIONs (Konzentration: 0.1 mg Fe/ml) ersetzt, um die SPION-Wells zu präparieren. Eine Probenreihe dient als Kontrollwells und bleibt frei von SPIONs. Die SPION-Wells werden aufgeteilt in Probenwells, denen MTT zugesetzt wird und Referenzwells, die unbehandelt bleiben. Das dient als weitere Kontrolle, um störende Effekte der schwarzen bis dunkelbraunen SPIONs auf die Absorption des MTT-Formazans zu eliminieren. Nach 1, 24, 48 und 72 Stunden wird das Medium der entsprechenden SPION- und Kontrollwells mit 50 µl einer MTT-Lösung (0.5 mg/ml in PBS) versetzt (Referenz-Wells bleiben unbehandelt). Nach einer Stunde Inkubation im Brutschrank wird die überstehende Lösung entfernt und die etwa entstanden MTT-Formazankristalle werden mit DMSO (100 µl) in Lösung gebracht. Nach Abschluss des Versuches, wird die Absorption der 96- Wellplatte gemessen. Zur Auswertung der Ergebnisse und damit zur Bestimmung der relativen Zellviabilität (%), dient die folgende Formel: Ãb t³mâ³ ³ÁäÁ= Ë\ ÌÍÎÏxÐxÑÑ\ ÒxÓxÍxÔÐxÑÑ Õ \ }ÎÖÍÎÑÑÐxÑÑ 100. (42) Zellfixierung für TEM Zur Überprüfung der Aufnahme von SPIONs durch die verwendete Brustkrebszelllinie, wurden TEM-Aufnahmen angefertigt. Damit wird einerseits die Aufnahme in die Zellen untersucht, um eventuell Informationen über den Aufnahmemechanismus zu erhalten. Andererseits erhält man Informationen über die Verteilung der SPIONs in der Zelle. Letzteres lässt weitere Rückschlüsse auf die Biokompatibilität beziehungsweise deren Abbau durch die Zellen zu. Die Zellen werden mit einem SPIONs enthaltenden Medium, dessen Konzentration bei 0.1 mg Fe/ml, liegt über 24 Stunden im Brutschrank inkubiert. Anschließend werden die Zellen mit PBS gewaschen und aus der Zellkulturflasche gelöst. Diese Zellen werden über Nacht bei 4 C mit 2.5 %iger Glutaraldehydlösung fixiert, um eine Vernetzung bzw. Verhärtung der Proteine zu erreichen. Es folgt ein weiterer Fixierschritt bei Raumtemperatur, um die Lipide mittels 1 %iger 68

76 Einleitung Osmiumtetroxidlösung und 3 % Kaliumferricyanid schwarz zu färben. Die so behandelten Zellen werden dehydriert, in Epon-Harz eingebettet und schließlich mittels Ultra-Mikrotom in dünne Scheiben geschnitten. Zur negativ-kontrastierung werden die auf einem TEM-Grid aufgebrachten Zell-Epon-Scheiben mit Uranylacetat behandelt. Das führt dazu, dass ein stärkerer Kontrast die Zellstrukturen besser sichtbar macht. Die Untersuchung erfolgt mit einem Zeiss EM 906 TEM. Es wurden Proben von Zellen die SPIONs enthalten untersucht, aber auch Negativkontrollen in Form von reinen Zellen erstellt Intrazelluläre ROS-Messung (DCFH-DA-Assay) Die Zellen werden in 96-Wellplatten mit einer Dichte von 10 3 Zellen pro Well für drei Tage kultiviert, bis eine konfluente Monolage gewachsen ist. Das Zuchtmedium wird durch Medium ersetzt, das SPIONs (0.1 mg Fe/ml), Eisensalze (0.1 mg Fe/ml) oder die verschiedenen Surfactantverbindungen in entsprechender Konzentration enthält und für 24 Stunden inkubiert. Die Wells werden mit PBS gewaschen und für 30 Minuten mit 100 µm DCFH-DA in DMEM, einem zellpermeablen Farbstoff beladen. Anschließend werden 100 µl PBS zugesetzt und die halbe 96-Wellplatte wird mit einer Einzeldosis von 3 Gy Röntgenstrahlung aus einer 120 kv Röntgenröhre bestrahlt. In den Zellen wird der Farbstoff von ROS-Spezies zu dem Fluoreszenzfarbstoff DCF oxidiert. Die Intensität des entstanden DCF- Fluoreszenzfarbstoffes ist direkt proportional zur ROS-Konzentration, welche in den Zellen aufgrund von SPIONs und Bestrahlung entstanden ist. Die Messung erfolgt mittels Fluoreszenzspektroskopie ( nm) mit einer Anregungswellenlänge von 480 nm an einem Jobin-Yvon FluoroMax 3 Spektrofluorometer. Durch die Auswertung der gemessenen Spektren werden die relativen Fluoreszenzintensitäten dank Integration erhalten und Intensitätswerte der "behandelten" Zellen, werden mit [73, 121] den Werten der Zellen in purem Medium in Beziehung gesetzt. 69

77 Zielsetzung 2. Zielsetzung Ziel dieser Arbeit ist die Darstellung hydrophiler superparamagnetischer Eisenoxidnanopartikel für biomedizinische Anwendungen. Ein besonderer Schwerpunkt liegt auf deren Verwendung als Radiokatalysator in der Strahlentherapie. Die Synthese der SPIONs soll mit Hilfe einfacher und zuverlässiger Herstellungsverfahren erfolgen, deren Reaktionsbedingungen den Prinzipien der grünen Chemie entsprechen. Das heißt, dass möglichst keine toxischen Edukte und Nebenprodukte enthalten sein sollen und der Gebrauch von großen Lösungsmittelmengen vermieden werden soll. Die Moleküle zur Stabilisierung der höchstempfindlichen Oberflächen der SPIONs sollen sehr klein sein, um den hydrodynamischen Durchmesser so gering wie möglich zu halten. Des Weiteren sollen die Oberflächenstabilisatoren nicht toxisch sein, und jede Modifikation der Oberfläche muss in physiologischer Umgebung äußerst stabil sowie biologisch Abbaubar sein. Die Charakterisierung der ungeschützten sowie der stabilisierten SPIONs soll mittels moderner chemischer und physikalischer Methoden erfolgen. Ob die hergestellten SPIONs über ein superparamagnetisches Verhalten verfügen, kann durch SQUID-Messungen untersucht werden. Mittels TEM und HRTEM können die Größe, Form, Agglomerationsverhalten und Kristallinität untersucht werden. Die Kristallstruktur soll schließlich mittels XRD genauer bestimmt werden. Durch Untersuchungen mit XPS und XAS sollen schließlich weitere Informationen über die Zusammensetzung der SPION-Oberfläche gewonnen werden. Da für den Einsatz der SPIONs in der Biomedizin besonders deren Oberflächen von Interesse sind, ist die FTIR-Spektroskopie eine bevorzugt Charakterisierungsmethode. Die so erhaltenen SPIONs werden schließlich für deren möglichen Einsatz in der Biomedizin in einer Zelllinie untersucht. Für die Untersuchungen zur Biokompatibilität sollen die verwendeten MCF7-Zellen mit SPIONs inkubiert und die Aufnahme von SPIONs durch die Zelllinie mittels TEM-Aufnahmen überprüft werden. Um Aussagen über die Zytotoxizität treffen zu können, werden Trypanblaufärbung und Thiazolylblaufärbung durchgeführt. Die zentrale Fragestellung der vorliegenden Arbeit über eine mögliche Verwendung der SPIONs als Radiokatalysator in der Strahlentherapie soll nach erfolgter Bestrahlung mit der intrazellulären ROS-Messung untersucht werden. 70

78 Ergebnisse und Diskussion 3. Ergebnisse und Diskussion Der erste Teil dieses Kapitels beschäftigt sich mit den beiden Synthesemethoden, die für die Herstellung der biokompatiblen SPIONs genutzt wurden. Anschließend werden die Ergebnisse der diversen Untersuchungsmethoden, die zur umfangreichen und ausführlichen Charakterisierung für die LT- uns HT-SPIONs durchgeführt wurden dargestellt und diskutiert Synthesen und Stabilisierungen der SPIONs Moderne Syntheseverfahren sollten besonderen Wert auf die Schonung von Ressourcen und den Umweltschutz legen und sich somit nach den Kriterien der "grünen Chemie" richten. Abgesehen von Reaktionen, bei denen keine schädlichen Nebenprodukte entstehen, sind neben einem geringen Energieaufwand auch die Wahl günstiger und nicht toxischer Reaktanten sowie insbesondere die Wahl des verwendeten Lösungsmittels entscheidend. Wasser ist in "grünen" Reaktionsführungen das Lösungsmittel der Wahl. Aber auch andere Lösungsmittel wie zum Beispiel Diethylenglykol haben aufgrund ihrer Fähigkeiten sowohl als Lösungsmittel, wie auch als Chelatisierungsagenz für Eisenoxid zu wirken, ihre [13, 14, 58] Vorteile. In dieser Arbeit wurden zwei Verfahren zur Herstellung der biokompatiblen SPIONs durchgeführt, die beide eine Mitfällung von Eisensalzen enthalten. Die erste der beiden Methoden folgt dem Syntheseweg von Massart et al. [52], wobei die SPION- Synthese in einem Eisbad durchgeführt wurde. Die so erhaltenen SPIONs werden als LT-SPIONs bezeichnet. Der Herstellung folgt die Stabilisierung der Oberflächen der LT-SPIONs. Die zweite Syntheseroute folgt der Methode von Qu et al. [57], wobei sowohl die Synthese der SPIONs als auch deren Stabilisierung bei hohen Temperaturen in einer Eintopfreaktion durchgeführt wird. Die somit erhaltenen Eisenoxidnanopartikel werden als HT-SPIONs bezeichnet. 71

79 Ergebnisse und Diskussion Synthesen und Stabilisierungen von SPIONs in Wasser bei niedriger Temperatur Die Apparatur sowie alle verwendeten Lösungen wurden entgast und auch während der gesamten Synthese wurde eine Schutzgasatmosphäre (Ar) aufrechterhalten, um die höchst oxidationsempfindlichen SPION-Oberflächen zu schützen. Insbesondere das verwendete Millipore Wasser (18.2 MΩ/cm) wurde für mindestens eine Stunde mit Argon gesättigt. Als Eisenquellen kamen die beiden kostengünstigen Eisenchloride FeCl 2 x 4H 2 O und FeCl 3 x 6 H 2 O zum Einsatz, die in einem Molverhältnis Fe 2+ : Fe 3+ = 1 : 2 verwendet wurden. Dieses Molverhältnis wurde aufgrund der Ergebnisse von Jolivet et al. [55] gewählt, da mit diesem exakten Verhältnis nur die nichtstöchiometrischen Fe 3 O 4 -NP erhalten werden. Beide Eisenchloride werden zusammen in entgastem Wasser unter Anwendung von Ultraschall vollständig gelöst und schließlich für mindestens 10 Minuten mit Argon gesättigt. Im entgasten Rundkolben, wird eine 2 %ige NH 4 OH-Lösung, die mit Argongesättigtem Millipore Wasser hergestellt wurde, vorgelegt und in einem Eisbad abgekühlt. Bei einer konstanten Rührgeschwindigkeit wird schließlich die Fe 2+ / Fe 3+ - Lösung schnell eingespritzt, um den Nukleationsprozess kurz zu halten. Ein sofortiger Farbumschlag von farblos nach schwarz zeigt die Bildung der LT-SPIONs an, die für weitere drei Stunden in der Kälte anwachsen. Nach vollendeter Reaktionszeit werden die LT-SPIONs mittels Permanentmagnet mehrfach sedimentiert und mit sorgfältig entgastem Wasser gewaschen. Dieser Waschvorgang wird solange wiederholt, bis der anfängliche ph-wert von 11 auf ph = 7 gesunken ist. Die so erhaltenen LT-SPIONs werden aufgeteilt, um die verschiedenen Stabilisierungen durchzuführen. Ein Teil der Reaktionsmischung wird für die Charakterisierung der nicht-stabilisierten Partikel genutzt. Diese nicht-stabilisierten SPIONs werden je nach vorgesehener Charakterisierungsmethode getrocknet oder in Lösung untersucht. Für den Schutz der Oberflächen werden Moleküle gewählt, die klein sind, um einen möglichst geringen hydrodynamischen Durchmesse zu erhalten, da nur NP bis 100 nm Durchmessern die Zellmembran gut passieren können. [63] Erfolgreiche Stabilisierungen der SPION-Oberflächen konnten sowohl mit den 72

80 Ergebnisse und Diskussion Hydroxycarbonsäuren Zitronensäure, DL-Wein- und DL-Äpfelsäure als auch mit Gluconsäure erzielt werden. Auch die Stabilisierung wird unter Einhaltung von Schlenkbedingungen durchgeführt. Die frisch hergestellten LT-SPIONs werden mit Argon gesättigten wässrigen Surfactant-Lösungen versetzt, so dass die Endkonzentration der oberflächenaktiven Substanz der Fe 3+ -Konzentration im Kolben entspricht. Die einzelnen Reaktionsmischungen werden über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die so erhaltenen stabilen Dispersionen wurden von überschüssigen Hydroxycarbonsäuren durch magnetisches Sedimentieren und anschließendes mehrfaches Waschen mit Wasser befreit und schließlich für deren Einsatz in Zellversuchen mit NH 4 OH auf ph ~7 eingestellt. Die so stabilisierten LT-SPIONs werden ebenfalls je nach vorgesehener Charakterisierungsmethode getrocknet oder in Lösung untersucht Synthesen und Stabilisierungen von SPIONs in DEG bei hoher Temperatur Die zweite Synthese liefert die sogenannten HT-SPIONs, da das Partikelwachstum in diesem Fall bei erhöhter Temperatur (220 C) in hochsiedenden Lösungsmitteln stattfindet. Diese leicht modifizierte Syntheseroute folgt der von Qu et al. [57] vorgestellten Eintopfreaktion, die auf der von Caruntu et al. [122] entwickelten Komplexierung von Übergangsmetallferriten mit langkettigen Carboxylatanionen in DEG beruht. Mittels dieser Methode sollen die Herausforderungen der reinen Mitfällung über die Kontrolle der Größe sowie deren Verteilung umgangen werden, aber der Vorteil der großen Synthesemenge im Vergleich zur thermischen Zersetzung erhalten bleiben. [58] Die Reaktion besteht aus drei Schritten: der Komplexierung des Metallions, gefolgt von dessen Hydrolyse/Kondensation und schließlich dem Ligandenaustausch am Ende der Reaktion. Als Lösungsmittel dient aufgrund seines hohen Siedepunktes sowie seiner Fähigkeit zur Komplexierung Diethylenglykol. Die kostengünstigen und nicht toxischen Eisenchloride FeCl 2 x 4H 2 O und FeCl 3 x 6 H 2 O dienen als Eisenquellen und werden wie bei der Mitfällung im Molverhältnis Fe 2+ : Fe 3+ = 1 : 2 eingesetzt. Ein weiterer Grund für diese Metallprecursor ist die Tatsache, dass sie 73

81 Ergebnisse und Diskussion wie die meisten Übergangsmetallchloride der ersten Reihe in DEG löslich sind. Als alkalisches Fällungsmittel wird das ebenfalls in DEG lösliche NaOH verwendet. Für die Reaktion werden die in DEG gelösten Fe 2+ /Fe 3+ -Salze in der Argongeschützten Reaktionsapparatur vorgelegt und mit einer äquivalenten Menge des alkalischen Fällungsmittels versetzt. Diese Mischung wird auf 220 C erhitzt und für vier Stunden bei dieser Temperatur konstant gehalten. Durch die erhöhte Temperatur kommt es zur nukleophilen Substitution der Eisen-DEG-Komplexe durch die OH- Ionen. Diese reaktive Zwischenstufe bildet in der Folge durch eine Kondensationsreaktion die Fe 3 O 4 -NP. Im Anschluss an den Heizvorgang wird die, in einer Mischung aus Wasser und DEG gelöste, oberflächenaktive Substanz in die noch heiße Reaktionsmischung eingebracht und über Nacht auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Hierbei kommt es durch den Austausch der ursprünglichen DEG- Schutzhülle gegen die neue oberflächenaktive Substanz zur Stabilisation der SPIONs. Zur Stabilisierung kommen wie schon bei den LT-SPIONs die Hydroxycarbonsäuren Zitronensäure, DL-Wein- und DL-Äpfelsäure sowie Gluconsäure zum Einsatz. Neben dem eigentlichen Ligandenaustausch wird vermutet, dass ein weiteres, dem Prozess der Ostwaldreifung folgendes Partikelwachstum stattfindet. Die winzigen Partikel lösen sich infolge ihrer hohen Oberflächenenergie auf und das freiwerdende Material wird an größere Teilchen anlagert. Zur Charakterisierung wird vor der Ligandenaustauschreaktion eine adäquate Menge der mit DEG-stabilisierten HT-SPIONs als Probe entnommen. Die abgekühlte Reaktionsmischung werden schließlich magnetisch sedimentiert, um den DEG-Überstand zu entfernen und anschließend mehrfach mit Argon gesättigten Ethanol gewaschen. Die von überschüssigem DEG/Surfactant befreiten HT-SPIONs werden in Wasser resuspendiert und für die vorgesehene [57, 58, 122] Charakterisierungsmethode getrocknet oder in Lösung aufbewahrt. 74

82 Ergebnisse und Diskussion 3.2. Charakterisierungen der SPIONs Eine ausführliche Charakterisierung der unterschiedlichen LT- sowie HT-SPIONs wurde mit modernen chemischen und physikalischen Methoden durchgeführt. Durch TEM-Messungen können Informationen über die Größe, Form und das Agglomerationsverhalten sowie über die Kristallinität gewonnen werden. Eine genaue Untersuchung der Kristallstruktur fand mittels XRD statt. Die Ergebnisse über die Zusammensetzung der Eisenoxide wurde schließlich mit XPS- und XANES- Messungen vervollständigt, wobei hier insbesondere die Oberflächen der SPIONs untersucht werden. Die genaue Beschaffenheit der Oberflächen der SPIONs wurde mittels FTIR-Spektroskopie untersucht. Durch SQUID-Untersuchen wurde das wichtige magnetische Verhalten untersucht SPIONs aus Mitfällung in Wasser bei niedriger Temperatur (LT- SPIONs) LT-SPIONs ohne zusätzliche Stabilisierung Die Morphologie der nicht-stabilisierten LT-SPIONs wurde mittels TEM untersucht, was in Abbildung 3.1 dargestellt ist. In dem TEM-Bild lassen sich NP mit nahezu sphärischer oder ellipsoider Form erkennen. Da die LT-SPIONs über keine zusätzliche Stabilisierung der Oberfläche verfügen, wird ihr Dispergierungsverhalten nur durch die adsorbierten amphoteren Hydroxylionen bestimmt. Deshalb kann eine starke Neigung zur Aggregatbildung beobachtet werden. [123] Ein weiterer Grund für die Agglomerate resultiert aus dem Verdampfen des Lösungsmittels während der Trocknung der TEM-Proben. [124] Für die Bestimmung des durchschnittlichen Partikeldurchmessers wurden 100 SPIONs ausgezählt (siehe rechtes Histogramm in Abbildung 3.1) wobei sich ein Wert von 13.8±3.1 nm ergab. Dafür wurde die Größe bei ellipsoiden Partikeln entlang der längsten Achse bestimmt. Diese Daten zeigen den Nachteil einer breiten Größenverteilung im Falle der LT-SPIONs. 75

83 Ergebnisse und Diskussion Partikelanzahl Partikelgröße [nm] Abbildung 3.1: TEM-Bild und Partikelgrößenverteilung der nicht-stabilisierten LT-SPIONs. Um Aussagen über den kristallinen Charakter treffen zu können, wurden HRTEM- Aufnahmen (siehe Abbildung 3.2) angefertigt. Auf dem hochaufgelösten Bild der nicht-stabilisierten LT-SPIONs sind sehr deutlich die Netzebenen der kristallinen und nahezu sphärischen NP zu sehen, die bis zur Oberfläche der NP reichen. Auf der Aufnahme können keine Korngrenzen erkannt werden, was die Einkristallinität der Partikel zeigt. [125] Auch in dieser Vergrößerung wird die breite Größenverteilung der Partikel erkennbar. 76

84 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3.2: HRTEM-Bild der nicht-stabilisierten LT-SPIONs. Um die Informationen aus den HRTEM-Aufnahmen über die Kristallinität der LTSPIONs zu bestätigen, wurden Röntgendiffraktogramme angefertigt. Aus diesen Diffraktogrammen kann ferner die Größe der Kristallite mit Hilfe der ScherrerGleichung (Gleichung 29) aus der Peakverbreiterung berechnet werden. Das liefert aber nur sinnvolle Werte, wenn die Verbreiterung nur durch die Probe verursacht wird und instrumentelle Effekte ausgeschlossen werden können. Da die Linienverbreiterung, bei allen Peaks im Diffraktogramm in Abbildung 3.3 auftritt, kann ein Effekt durch das Messinstrument ausgeschlossen werden. Ein weiteres Problem, resultiert aus der verwendeten Cu-Kα-Strahlung zur Messung der SPIONs. Dadurch sind die Spektren mit einem hohen Hintergrundrauschen und einer niedrigen Intensität behaftet, da die Primärstrahlungsenergie sehr nahe am Eisenabsorptionsband liegt. Die Linienverbreiterung ist auch der Grund dafür, dass die Unterscheidung der beiden Eisenoxidphasen, Fe3O4 und γ-fe2o3 mittels XRD nahezu unmöglich ist. Die ohnehin schon minimalen Unterschiede in den beiden Spinellstrukturen sind durch die Verbreiterung der Reflexe kaum voneinander zu trennen, was eine exakte Strukturanalyse nahezu unmöglich macht.[126, 127, 130] Die Reflexpositionen sowie die relativen Intensitäten der beiden Eisenoxide sind in Tabelle 3.1 zusammengefasst. 77

85 Ergebnisse und Diskussion Zur besseren Übersicht wurden nur die intensivsten Standardwerte aufgelistet, die in den intensitätsschwachen XRD-Spektren der LT- und HT-SPIONs beobachtet werden konnten. Fe 3 O 4 (JCPDS No ) γ-fe 2 O 3 (JCPDS No ) Reflex (hkl) 2θ[ ] rel. rel. Reflex (hkl) 2θ[ ] Intensität Intensität Tabelle 3.1: Standardwerte der Reflexe und relative Intensitäten von Magnetit und Maghemit. Abbildung 3.3 zeigt, dass in dem XRD-Spektrum der ungeschützten LT-SPIONs neun Reflexe auftreten. Alle Reflexe konnten entsprechend der hkl-werten der inversen Spinellstruktur benannt werden. [128] Es konnten die folgenden Reflexpositionen sowie relativen Intensitäten ermittelt werden: 2θ = (0.12), (0.37), (1), (0.24), (0.14), (0.35), (0.43), (0.08), (0.12). Eine Untersuchung der Peakpositionen zeigt, dass es sich hauptsächlich um Positionen in der Nähe zur Maghemit-Reflexposition handelt. Der Vergleich der relativen Intensitäten liefert zumeist höhere Werte als für Magnetit erwartet werden. Auch der Intensitätsvergleich mit Maghemit weist ein ähnliches Verhalten auf, mit Ausnahme des Reflexes bei 62.57, welcher schwächer ist. [128] Da Eisenionen sehr empfindlich gegenüber Oxidation sind, kann nicht ausgeschlossen werden, dass die Probenpräparation unter Umgebungsbedingungen zur Bildung von γ-fe 2 O 3 an der Oberfläche der nicht-stabilisierten LT-SPIONs 78

86 Ergebnisse und Diskussion führte. [129] Aus den Ergebnissen der Röntgendiffraktometrie lässt sich schlussfolgern, dass die durch Mitfällung hergestellten LT-SPIONs aus einer Mischung von Maghemit und Magnetit bestehen. Abbildung 3.3: Röntgendiffraktogramm der ungeschützten LT-SPIONs. Für die Berechnung der Gitterkonstante (a), die für kubische Systeme aus der Reflexposition und den zugehörigen hkl-werten [23] nach Gleichung (43) erhalten werden kann, wurden die vier stärksten Reflexe (311, 440, 220 und 511) benutzt. 9³ := z 5 zh +œ + (43) Aus diesen Werten wurde der Mittelwert gebildet, der sich für die LT-SPIONs zu a = Å ergibt. Dieser Wert entspricht keiner der Gitterkonstanten der beiden Eisenoxide exakt (Fe 3 O 4 : a = Å und γ-fe 2 O 3 : a = Å) [128]. Dies bestätigt die Vermutung, dass es sich bei den LT-SPIONs um eine Mischung aus Magnetit und Maghemit handelt, mit einer leichten Dominanz der γ-fe 2 O 3 -Phase. Für die Berechnung der Kristallitgröße (d) wurden neben den in Tabelle 3.2 angegebenen Werten, der gemittelte Wert der Kupfer-Kα-Strahlung ( nm) sowie die Scherrer-Konstante für sphärische NP (K = 0.9) genutzt. 79

87 Ergebnisse und Diskussion Reflex 2θ[ ] FWHM [ ] d [nm] Mittelwert d [nm] Tabelle 3.2: Kristallitgrößenberechnung der nicht-stabilisierten LT-SPIONs aus XRD. Der aus den TEM-Aufnahmen bestimmte Wert (13.8±3.1 nm) stimmt gut mit den 12 nm der Kristallitgröße überein, die aus den XRD-Ergebnissen erhalten wurde. Die geringen Unterschiede in der durchschnittlichen Größe lassen sich durch die stark hintergrundbehafteten XRD-Messungen erklären. Außerdem basieren die aus XRD und TEM erhaltenen Werte auf unterschiedlichen Statistiken (Volumen und Anzahl- [3, 130] gewichtete Verteilung). XPS Messungen wurden durchgeführt, um die chemische Zusammensetzung der Oberflächen der SPIONs zu untersuchen. In Abbildung 3.4 ist das Übersichtsspektrum der nicht-stabilisierten LT-SPIONs dargestellt, die einige Zeit im trockenen Zustand gelagert wurden. Es sind deutlich die Signale von Fe und O aus dem Eisenoxidkern zu beobachten, sowie ein sehr kleines C-Signal, welches aus der Atmosphäre resultiert. Neben den Fe-Auger Signalen bei etwa 898, 848 und 786 ev können in der Fe2p-Region die Signale von Fe2p 1/2 bei ~726 ev und bei einer Bindungsenergie von ~712 ev das des Fe2p 3/2 identifiziert werden. Die Aufspaltung in Fe2p 1/2 und Fe2p 3/2 beruht auf der Spin-Bahnkopplung. Bei niedrigeren Energien existieren schließlich noch die Signale von Fe3s (~92 ev) sowie Fe3p (~55 ev). Sauerstoff zeigt sowohl ein Signal bei etwa 976 ev, was als O KLL -Peak identifiziert werden kann und bei rund 530 ev, was dem O1s-Peak entspricht. [ ] 80

88 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3.4: Übersichtsspektrum der nicht-stabilisierten LT-SPIONs. In Abbildung 3.5 ist die Fe2p-Region der LT-SPIONs vergrößert dargestellt. Bereits die Position des Fe2p 3/2 -Signals (712 ev) lässt eher auf einen 3-wertigen Zustand des Eisens schließen, da die Bindungsenergie von Elementen mit steigendem Valenzzustand zunimmt. Dies kann laut Grosvenor et al. [133] mit den Bindungsenergien des Fe2p 3/2 -Signals für Fe 2+ (709 ev) und Fe 3+ (711 ev) bestätigt werden. 81

89 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3.5: Spektrum der Fe2p 3/2 -Region von LT-SPIONs nach Shirley- Hintergrundentfernung. Die Einhüllende (rot) ist die Summe aus den einzelnen Gauss-Lorentz- Profilfunktionen für den 2p 3/2 -Peak. Es liefert für den Fit mit dem Oberflächenpeak (rosa), den Fe 3+ -Multipletts (grün) und den Fe 2+ -Multipletts (blau) ein Ergebnis, das sowohl in Form als auch Intensität beinahe deckungsgleich mit dem gemessenen Spektrum ist. Das beide Multipletts (Fe 3+ und Fe 2+ ) für eine sehr gute Übereinstimmung von Einhüllender und Spektrum benötigt werden, zeigt an, das beide Oxidationsstufen in der Probe vorhanden sind. Der Fe 3+ -Satellit um 720 ev ist [133, 134] charakteristisch für γ-fe 2 O 3. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass sowohl Magnetit, als auch Maghemit in den LT-SPIONs vorhanden sind. Das ist konsistent mit den vorherigen Beobachtungen. Durch die lange Lagerung der Probe kam es teilweise zur Oxidation und somit zur Umwandlung von Fe 3 O 4 in γ-fe 2 O 3. Durch die sphärischen als auch ellipsoiden Formen und die Größen der LT-SPIONs, wurde aufgrund der maximalen XPS-Informationstiefe (~3 nm) nicht nur die Oberflächen der SPIONs vermessen. Es wurden neben den oberflächlichen Fe 3+ -Ionen vermutlich auch die innen liegenden Bereiche (Fe 2+ -Ionen) der SPIONs detektierte, womit beide Eisenoxidspezies erklärt werden könnten. 82

90 Ergebnisse und Diskussion Das magnetische Verhalten der pulverförmigen Proben wurde mit einem Magnetometer untersucht. Wie im oberen Graphen in Abbildung 3.6 zu erkennen ist, zeigt die bei konstantem magnetischen Feld von 5 T bei 300 K gemessene Magnetisierungskurve der nicht-stabilisierten LT-SPIONs den typischen Verlauf eines superparamagnetischen Eisenoxides. Die Abwesenheit einer Hystereseschleife bedeutet somit eine Koerzitivkraft und Remanenz von Null. Auch bei einer vergrößerten Darstellung des Koordinatenursprungs kann keine Hysterese erkannt werden, wie in der kleinen Ausschnittsvergrößerung der Magnetisierungskurve zu sehen ist. Aus der perfekten Sättigung dieser M-H-Kurve konnte eine Sättigungsmagnetisierung (M S ) von emu/g ermittelt werden. Dieser Wert stimmt gut mit SPIONs vergleichbarer Größe überein. Er bleibt aber unter den bekannten Werten für Fe 3 O 4 -Festkörper zurück (M S = emu/g) und liegt im Bereich der M S -Werte von γ-fe 2 O 3 -Festkörpern (60-80 emu/g). [135, 136] Aus den M S - Werten können keine Rückschlüsse auf die Zusammensetzung der SPIONs gezogen werden. Die Größe der Partikel und die chemische Zusammensetzung und Struktur der Oberfläche bestimmen die Sättigungsmagnetisierung. [137] 83

91 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3.6: Magnetisierungskurve der ungeschützten LT-SPIONs bei 300 K (oben) und unten ihre ZFC/FC-Kurve. Das temperaturabhängige Verhalten der Magnetisierung wurde mit ZFC/FC- Messungen bei 0.02 T untersucht. Die Proben wurden ohne äußeres Magnetfeld auf zwei K abgekühlt und unter dem Einfluss des Magnetfeldes bis auf 300 K erwärmt, um schließlich bei anliegendem Feld wieder abgekühlt zu werden. Im unteren 84

92 Ergebnisse und Diskussion Graphen der Abbildung 3.6 kann nach der anfänglich sehr geringen Gesamtmagnetisierung ein relativ schwacher Anstieg der ZFC-Kurve bis zu einem gering ausgeprägtem Maximum bei 252 K beobachtet werden. Diese Temperatur entspricht der Blockierungstemperatur T B und trennt den superparamagnetischen vom blockierten Zustand. Die ZFC- und FC-Kurven laufen ab einer Gabelung bei etwa 265 K zusammen und zeigen einen nur minimalen Abfall der Gesamtmagnetisierung, da die thermische Energie wahrscheinlich nicht hoch genug ist um die einzelnen magnetischen Momente umzukehren. Der einheitliche Verlauf der ZFC/FC-Kurven zeigt die Bildung von Agglomeraten in der Probe an, was vermutlich ein Resultat der Trocknung ist. [114, ] Während des erneuten Abkühlprozesses steigt die ohnehin schon hohe Magnetisierung (~ 19 emu/g) kaum an weiter an. Abbildung 3.7: FTIR-Spektrum der nicht-stabilisierten LT-SPIONs gegen KBr. In Abbildung 3.7 ist das FTIR-Spektrum von nicht-stabilisierten LT-SPIONs dargestellt, die als KBr-Pressling vermessen wurden. Die dominante Bande bei 570 cm -1 stammt von der typischen (Fe-O)-Streckschwingung der Eisenoxidpartikel. Die etwas schwächere Band bei 388 cm -1 sowie die Schulter bei 611 cm -1 sind ebenfalls charakteristisch für die Spinelleisenoxide. Die Schulter kann vermutlich der (Fe-O)-Schwingung des Maghemit aus kationischen Leerstellen, welche die 85

93 Ergebnisse und Diskussion Struktursymmetrie erniedrigen, zugeordnet werden. [58, 126, 135, 142, 143] Das Spektrum zeigt im Bereich von 2285 bis 2387 cm -1 eine kleine Bande, die der typischen CO 2 - Schwingung zugeordnet werden kann, da das verwendete Gerät ohne Schutzgas in der Probenkammer arbeitet. Die breite Bande bei 3318 cm -1 stammt von der (O-H)- Streckschwingung und kann, ebenso wie die (O-H)-Deformationsschwingung bei 1629 cm -1 den amphoteren Hydroxylgruppen zugeordnet werden, die an der Oberfläche der LT-SPIONs adsorbiert sind LT-SPIONs Stabilisierung mit Zitronensäure Die TEM-Aufnahme in Abbildung 3.8 zeigt LT-SPIONs die mit Zitronensäure stabilisiert wurden. Durch diese oberflächenaktive Substanz wurde das Dispergierungsverhalten in Wasser deutlich verbessert. Es konnten im Vergleich zu den anderen, zur Stabilisierung verwendeten Hydroxycarbonsäuren, die stabilsten Suspensionen erhalten werden. Auch nach mehreren Monaten Aufbewahrung waren die Suspensionen noch stabil. Die Morphologie der SPIONs ist zumeist sphärisch und ellipsoid, aber auch polygonale Formen sind erkennbar. Die sichtbaren Agglomerate entstanden vermutlich während des Herstellungs- und Trocknungsprozesses der TEM-Proben durch das Verdampfen des Lösungsmittels. Auch interpartikulären Kräfte in der Dispersion können die Aggregatbildung noch begünstigen. Für die Bestimmung der durchschnittlichen Teilchengröße wurden 100 SPIONs ausgemessen und es konnte ein Wert von 11.5 nm mit einer Standardabweichung von 2.7 nm ermittelt werden. Trotz dieser guten Werte für die Größenverteilung wurden auch einzelne Partikel mit Größen bis zu 23 nm beobachtet. Der mittlere Kerndurchmesser ist im Vergleich zu den ungeschützten LT- SPIONs etwas verringert, was mit dem nachträglichen Stabilisierungsschritt und einem dabei möglichen Materialabtrag von den ursprünglichen Partikeln erklärt werden kann. 86

94 Ergebnisse und Diskussion Partikelanzahl Partikelgröße [nm] Abbildung 3.8: TEM-Aufnahme und Partikelgrößen-Histogramm der Zitronensäurestabilisierten LT-SPIONs. Die Zitronensäure-stabilisierten LT-SPIONs wurden auch in der Hochauflösung, (siehe Abbildung 3.9) untersucht. Auch in dieser HRTEM-Aufnahme lässt sich, wie in der hochaufgelösten Aufnahme der nicht-stabilisierten LT-SPIONs (Abbildung 3.2) die Einkristallinität der Teilchen zweifelsfrei erkennen. In diesem individuellen sphärischen Partikel können sehr schön die Netzebenen des inversen Spinells bis an den äußeren Rand des Teilchens beobachtet werden. 87

95 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3.9: HRTEM-Aufnahme der mit Zitronensäure stabilisierten LT-SPIONs. Aus dem Röntgendiffraktogramm (Abbildung 3.10) wird der nanokristalline Charakter der Probe deutlich. Die unterschiedlichen Peaks sind charakteristisch für inverse Spinell-Eisenoxide und konnten entsprechend mit den hkl-werten bezeichnet werden. Es wurden die folgenden Reflexpositionen sowie relativen Intensitäten ermittelt: (0.12), (0.35), (1), (0.23), (0.14), (0.34), (0.46), (0.07), (0.11). Die Stabilisierung der LT-SPIONs mit Zitronensäure ändert die Position der Reflexe nur minimal. Die auch in diesem XRD beobachtbare Peakverbreiterung macht eine ausführliche Unterscheidung zwischen Fe 3 O 4 und γ-fe 2 O 3 nahezu unmöglich. Aus der Betrachtung der Peakpositionen, ist bei acht Reflexen, ein deutlicher Trend für eine Maghemit- Zusammensetzung erkennbar (vgl. Tabelle 3.1). Nur die Position des 533-Reflexes entspricht mehr der Fe 3 O 4 -Zusammensetzung. Auch die relativen Intensitäten sind meist identisch bis geringfügig erhöht, im Vergleich zu den Standardwerten für Maghemit. Einzig der Reflex bei ist etwas schwächer. Es ist bekannt, dass die Mitfällung zumeist eine Mischung der beiden Eisenoxidspezies liefert. Des Weiteren wurden die Proben meist längere Zeit gelagert und waren während der XRD- Probenpräparation Luftsauerstoff ausgesetzt. Während dieser langen Exposition 88

96 Ergebnisse und Diskussion kann auch eine vollständige Stabilisierung keinen dauerhaften Schutz gegenüber Oxidation der empfindlichen SPION-Oberflächen bieten. Abbildung 3.10: XRD-Spektrum der Zitronensäure-stabilisierten LT-SPIONs. Die Berechnung der Gitterkonstante erfolgte auch für dieses System mit den vier stärksten Reflexen (311, 440, 220 und 511) nach Gleichung (43). Es konnte ein Mittelwert von a = Å erhalten werden. Dieser Wert entspricht keiner der Gitterkonstanten von Fe 3 O 4 oder γ-fe 2 O 3 genau, er ist aber ähnlicher zum Wert von Maghemit (a = Å). Dieses Ergebnis zeigt das Vorhandensein einer Mischung aus beiden Eisenoxidspezies, wobei Maghemit als dominante Spezies vorliegt. Wie bereits erläutert, wurden auch für die Berechnung der Kristallitgröße die dominanten XRD-Reflexe (311, 440, 220 und 511) genutzt, aus denen schließlich ein Mittelwert für d gebildet wurde. Die Messwert und Ergebnisse sind in Tabelle 3.3 zusammengefasst. (Kupfer-Kα-Strahlung = nm, K = 0.9 für sphärische NP). 89

97 Ergebnisse und Diskussion Reflex 2θ[ ] FWHM [ ] d [nm] Mittelwert d [nm] 9.47 Tabelle 3.3: Berechnung der Kristallitgröße der Zitronensäure-stabilisierten LT-SPIONs aus den XRD-Spektren. Für diese stabilisierten LT-SPIONs wurden gute Übereinstimmungen mit den TEM- Ergebnissen (11.5±2.7 nm) erhalten, was dafür spricht, dass es sich um einkristalline SPIONs handelt. Das magnetische Verhalten der Zitronensäure-stabilisierten LT-SPIONs ist vergleichbar zu den nicht-stabilisierten LT-SPIONs (siehe Abbildung 3.11). Die Abwesenheit einer Hysterese in der Magnetisierungskurve, was zusätzlich mit der Vergrößerung des Koordinatenursprungs verdeutlicht wird, zeigt das superparamagnetische Verhalten dieser Partikel. Diese SPIONs konnten in dem anliegenden magnetischen Feld gut gesättigt werden und erreichen einen M S -Wert von emu/g. Dieser Wert ist etwas niedriger als der für die nicht-stabilisierten LT-SPIONs. Das kann sehr gut mit der etwas kleineren Partikelgröße und der Stabilisierungsschicht aus nichtmagnetischen Molekülen erklärt werden. 90

98 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3.11: Magnetisierungskurve (oben) und Temperaturabhängigkeit der magnetischen Eigenschaften von Zitronensäure umhüllten LT-SPIONs (unten). Auch das temperaturabhängige Verhalten der Magnetisierung der Zitronensäurestabilisierten LT-SPIONs ist vergleichbar zu den nicht-stabilisierten LT-SPIONs. Nach der Abkühlung der Probe auf 2 K steigt die ZFC-Kurve mit steigender Temperatur stetig an, bis beide Kurven ab etwa 225 K zusammen verlaufen. Die ZFC- und FC- 91

99 Ergebnisse und Diskussion Kurve verlaufen deckungsgleich ab 292 K. Dieser Zusammenschluss der Kurven zeigt, dass Agglomeration in der Probe stattgefunden hat. Es konnte kein deutliches Temperaturmaximum beobachtet werden. T B entspricht dem Wert des Zusammenschlusses von ZFC- und FC-Kurve und liegt damit sehr hoch. Der Sprung um 180 K ist durch eine Messungenauigkeit verursacht. Nachdem eine Temperatur von 300 K erreicht wurde, wird das System unter Einfluss des Magnetfeldes wieder abgekühlt, wobei der Magnetisierungswert nahezu unverändert bleibt (~ 18 emu/g). Abbildung 3.12: FTIR-Spektrum der Zitronensäure-stabilisierten LT-SPIONs sowie das Reinspektrum der Zitronensäure in Rot (gegen KBr). Das FTIR-Spektrum der mit Zitronensäure stabilisierten LT-SPIONs ist in Abbildung 3.12 dargestellt. Die breite Bande bei 588 cm -1 mit der Schulter bei 629 cm -1 sowie die kleinere Bande bei niedrigen Wellenzahlen sind typisch für die (Fe-O)- Schwingungen in Magnetit und Maghemit. Die erfolgreiche Stabilisierung der SPION- Oberfläche wird durch die zusätzlichen Banden der Zitronensäure im Spektrum bewiesen. Diese sind im Referenzspektrum der nicht-stabilisierten LT-SPIONs nicht vorhanden. Zur besseren Veranschaulichung ist das Spektrum der Zitronensäure als verkleinerte Einblendung gezeigt (rot). Am auffälligsten sind die beiden starken Banden bei 1626 und 1398 cm -1, welche von (C=O)-Streckschwingungen und der (C- OH)-Deformationsschwingung der tertiären Alkoholgruppen des Surfactants 92

100 Ergebnisse und Diskussion stammen. Ein Nachweis für die erfolgreiche Anbindung kann durch die Verschiebung der Streckschwingung nach kleineren Wellenzahlen (freien Säure: ν(c=o) bei 1635 cm -1 ) erbracht werden. Des Weiteren kann in der Region > 3000 cm -1 die charakteristische Form der (O-H)-Streckschwingung der Zitronensäure erfasst werden. Diese breite Bande kann auch durch ebenfalls an der Oberfläche adsorbierte Wassermoleküle erklärt werden. Es kann eine sehr schwache Schulter bei 2998 cm -1 erkannt werden, die von den CH 2 -Gruppen der Zitronensäure stammt. Die kleine Bande von 2294 bis 2387 cm -1 stammt aus der CO 2 -Schwingung. Ebenfalls wenig ausgeprägt ist die Bande auf der rechten Seite des Spektrums um 1200 cm -1, welche der (C-O)-Streckschwingung der tertiären Alkohole zuzuschreiben sind. Die anderen Banden bei 951 und 906 cm -1 können der δ(o-h)-schwingung einer freien Carbonsäuregruppe zugeordnet werden, da die Anbindung dieser Hydroxytricarbonsäure meist nur uni- oder bidental ist. Die scharfe Bande bei 851 cm -1 kann (C-C)- oder (C-H)-Streckschwingungen zugeordnet werden LT-SPIONs Stabilisierung mit DL-Weinsäure Abbildung 3.13 zeigt die frisch gefällten und mit DL-Weinsäure stabilisierten LT- SPIONs. Sie zeigen eine deutlich geringere Aggregation als die entsprechend nichtstabilisierten LT-SPIONs. Die hauptsächlich kugelförmigen Partikel tendieren trotz der, für die Probenvorbereitung verwendeten, niedrigen Konzentration und der beobachteten guten Stabilität in Lösung geringfügig zur Aggregatbildung. In diesen assoziierten Formen sind aber individuelle SPIONs gut erkennbar. Diese Tendenz zur Aggregation ist mit der Größe der Weinsäuremoleküle und der damit verbunden geringen sterischen Abstoßung, zu erklären. Weitere Gründe für dieses Verhalten sind interpartikuläre Kräfte innerhalb der Dispersion sowie das Verdampfen des Lösungsmittels bei der TEM-Grid-Präparation. Die durchschnittliche Größe (100 NP) konnte mit 13.7±4.3 nm bestimmt werden. Die gestiegene Standardabweichung wird vermutlich durch ein weiteres Partikelwachstum während des Stabilisierungsschrittes hervorgerufen, aber die mittlere Größe ist nahezu unverändert zu den nichtstabilisierten LT-SPIONs. 93

101 Ergebnisse und Diskussion Partikelanzahl Partikelgröße [nm] Abbildung 3.13: TEM-Bild der DL-Weinsäure-stabilisierten LT-SPIONs (links) und das Histogramm der durchschnittlichen Größenverteilung (rechts). Die DL-Weinsäure-stabilisierten LT-SPIONs weisen in der Magnetisierungskurve in Abbildung 3.14 keine Remanenz oder Koerzitivität auf. Somit kann keine Hysterese beobachtet werden und das Partikelsystem ist superparamagnetisch. Auch diese SPIONs konnten unter dem anliegenden Feld mit einem erreichten M S = emu/g magnetisch gut gesättigt werden. Im Vergleich zu den nicht-stabilisierten LT-SPIONs, kam es zu einer Reduktion der Sättigungsmagnetisierung. Das kann mit der minimal gesunkenen Partikelgröße sowie der Änderung in der chemischen Zusammensetzung der Oberfläche, durch die Weinsäurestabilisierung erklärt werden. Auch die ZFC/FC-Kurven bestätigen das superparamagnetische Verhalten der Partikel. Die Magnetisierung der ZFC-Kurve steigt allmählich mit der Temperatur bis zu einem Maximum bei 202 K an. Dies entspricht der Blockierungstemperatur und gibt damit den Übergang in den superparamagnetischen Zustand an. Die thermische Energie ist nicht hoch genug, um nach der erreichten T max einen echten Abfall der beiden Kurven zu verursachen. Der kongruente Verlauf der ZFC/FC-Kurven spricht dafür, dass während der Probentrocknung Agglomerate entstanden sind. Auch in 94

102 Ergebnisse und Diskussion dieser FC-Kurve kann während des Abkühlprozesses nahezu kein Anstieg in der etwa 20 emu/g hohen Gesamtmagnetisierung beobachtet werden. Abbildung 3.14: Magnetisierungskurven (M-H-Auftragung und ZFC-Kurve) der LT-SPIONs mit DL-Weinsäure als Surfactant. 95

103 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3.15: FTIR-Spektrum der mit DL-Weinsäure stabilisierten LT-SPIONs sowie das Reinspektrum der DL-Weinsäure in Rot (gegen KBr). Das Spektrum der DL-Weinsäure-stabilisierten LT-SPIONs sowie der freien Säure ist in Abbildung 3.15 gezeigt. Es besitzt, ähnlich wie das Spektrum der citratumhüllten LT-SPIONs, nur wenige dominante Banden der DL-Weinsäure. Dies liegt an der geringen Menge Surfactant, bezogen auf Eisenoxid. Bei 394, 586 und 617 cm -1 liegen die charakteristischen Banden der (Fe-O)-Schwingungen aus tetraedrischen und oktaedrischen Stellen in Magnetit und Maghemit. Neben diesen Banden kann eine sehr starke (O-H)-Streckschwingung bei 3434 cm -1 detektiert werden, welche von der DL-Weinsäure (freie Säure: 3412 cm -1 ) sowie adsorbierter Wassermoleküle stammt. Die ebenfalls recht starke Bande bei 1636 cm -1 kann der (C=O)- Streckschwingung zugeordnet werden, die aufgrund des gestiegenen C-O- Einfachbindungscharakters im Vergleich zur freien Säure (ν(c=o) bei 1742 cm -1 ) verschoben ist. Dies kann als Nachweis für die erfolgreiche Anbindung an die SPION-Oberfläche gewertet werden. Die etwas kleiner Bande bei 1395 cm -1 stammt von der (C-H)-Deformationsschwingung der sekundären Alkoholfunktion. Die deutlich ausgeprägte Bande bei 1089 cm -1 ist typisch für die (C-O)-Streckschwingung der sekundären Alkoholgruppen des Surfactants. Die schwache Bande bei 990 cm -1 kann der (C-H)-Deformationsschwingung zugeordnet werden und kann, ebenso wie 96

104 Ergebnisse und Diskussion die (C-H)-Deformationsschwingung bei 814 cm -1 detektiert werden. auch in der freien Weinsäure LT-SPIONs Stabilisierung mit DL-Äpfelsäure Auch die Stabilisierung der LT-SPIONs mit DL-Äpfelsäure führte zur deutlichen Verbesserung der Dispergierbarkeit in Wasser und lieferte Suspensionen, die auch nach längerer Aufbewahrungszeit noch stabil waren. Diese Beobachtung konnte mit TEM-Messungen (siehe Abbildung 3.16) bestätigt werden. Es lassen sich in den Agglomeraten, welche vermutlich eine Resultat der Probenvorbereitung sind, individuelle Partikel erkennen. Die Partikel haben, wie die bisher schon untersuchten LT-SPIONs eine annähernd sphärische Form, mit Tendenz zur ellipsoiden Form Partikelanzahl Partikelgröße [nm] Abbildung 3.16: TEM-Bild und Größenverteilung der LT-SPIONs mit DL-Äpfelsäure als Surfactant. Es lassen sich hauptsächlich magnetische Partikel mit Größen zwischen 6 und 16 nm erkennen, sowie einzelne 20 nm große NP. Die anzahlgemittelte Größe, welche nach dem Ausmessen der individuellen SPIONs ermittelt werden konnte beträgt 11.9 ±3.1 nm. 97

105 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3.17: Magnetisierungskurve (oben) und Temperaturabhängigkeit der magnetischen Eigenschaften von DL-Äpfelsäure umhüllten LT-SPIONs (unten). Das magnetische Verhalten der DL-Äpfelsäure-stabilisierten LT-SPIONs ist in Abbildung 3.17 dargestellt und zeigt den typischen Verlauf einer superparamagnetischen Verbindung. Auch bei Vergrößerung des Koordinatenursprungs kann keine Hysterese erkannt werden. Das zeigt die 98

106 Ergebnisse und Diskussion Abwesenheit von Koerzitivkraft und Remanenz. Aus der Sättigung der Magnetisierungskurve in Richtung des 5 T-Wertes konnte ein M S -Wert vom emu/g bestimmt werden. Dieser Wert bleibt wie die bisher ermittelten Sättigungswerte unterhalb des Wertes der nicht-stabilisierten LT-SPIONs. Ein fast identisches Verhalten zu den vorher behandelten superparamagnetischen ZFC/FC-Kurven zeigen die mit Malationen-stabilisierten LT-SPIONs in Abbildung Der flache Anstieg der ZFC-Kurve führt zu einer relativ schwachen T max von 212 K, welche bereits im Zusammenschlussbereich der beiden Kurven liegt. Der identische Verlauf der ZFC/FC-Kurven spricht dafür, dass während der Probenvorbereitung (Trocknung) Agglomerate in der Probe entstanden sind. Auch für diese Probe bleibt die FC-Kurve mit sinkender Temperatur nahezu linear bei einem Wert von etwa 18 emu/g. Abbildung 3.18: FTIR-Spektrum der DL-Äpfelsäure-stabilisierten LT-SPIONs sowie das verkleinerte Reinspektrum der DL-Äpfelsäure in Rot (gegen KBr). In Abbildung 3.18 sind die IR-Spektren der DL-Äpfelsäure sowie der damit stabilisierten LT-SPIONs gezeigt. Auch in diesem Spektrum sind nur sehr schwache Charakteristika des Surfactants zu finden. Die dominanten Banden im Bereich kleiner Wellenzahlen (397, 592, 623 cm -1 ) stammen von den tetraedrisch und oktaedrisch 99

107 Ergebnisse und Diskussion koordinierten Fe-O-Bindungen der Eisenoxide. Eine starke Bande konnte bei 3431 cm -1 detektiert werden und ist der (O-H)-Streckschwingung von DL-Äpfelsäure und adsorbiertem Wasser zuzuordnen. Die zu kleinen Wellenzahlen verschobenen (C=O)-Streckschwingungen bei 1636 cm -1 und 1398 cm -1 (freie Säure: ν(c=o) bei 1740 cm -1 und 1696 cm -1 ) dienen dem Nachweis der angestrebten Anbindung an die SPION-Oberfläche. Die restlichen Banden, welche der DL-Äpfelsäure zugeordnet werden können sind sehr schwach. Neben der (C-H)-Deformationsschwingung bei 1254 cm -1 kann die typische (C-O)-Streckschwingung der sekundären Alkoholgruppe im Bereich zwischen 1100 und 1000 cm -1 detektiert werden LT-SPIONs Stabilisierung mit Gluconsäure In Abbildung 3.19 sind die LT-SPIONs gezeigt, die zum Schutz mit Gluconsäure umhüllt worden sind. Die frisch hergestellten NP zeigen im Vergleich zu den bisher besprochenen stabilisierten Partikeln das stärkste Agglomerationsverhalten, welches sehr ähnlich zu dem der nicht-stabilisierten LT-SPIONs ist. Neben diesem unerwünschten Verhalten haben die kugelförmigen Partikel auch noch eine sehr breite Größenverteilung. Es konnten SPIONs von 7 bis 26 nm beobachtet werden. Aus der Anzahlmittelung der Größen über 100 Teilchen konnte ein mittlerer Kerndurchmesser von 11.9 nm mit einer Standardabweichung von 3.1 nm ermittelt werden. 100

108 Ergebnisse und Diskussion Partikelanzahl Partikelgröße [nm] Abbildung 3.19: TEM-Aufnahme und Größenverteilung der Gluconsäure-stabilisierten LT- SPIONs. Auch die mit Gluconsäure stabilisierten LT-SPIONs zeigen superparamagnetisches Verhalten (keine Hysterese) in ihrer Magnetisierungskurve in Abbildung Der M S -Wert beträgt emu/g und ist der niedrigste Wert der magnetischen Sättigung, welcher in den unterschiedlich stabilisierten Systemen der LT-SPIONs erhalten wurde. Die ZFC/FC-Kurven im unteren Teil der Abbildung 3.20 bestätigen ebenfalls den Superparamagnetismus der Probe. Die ZFC-Kurve stiegt mit der Temperatur nur langsam an und hat ein Maximum bei 222 K. Dieser Wert ist vergleichbar mit den Werten aller anderen LT-SPIONs. Ab dieser Temperatur gibt es keine Remanenz und Koerzitivkraft mehr. Beide Kurven laufen nach der T max zusammen, was für 101

109 Ergebnisse und Diskussion Aggregation in der getrockneten Probe spricht. In der FC-Kurve kann während der Abkühlung kein Anstieg der Magnetisierung beobachtet werden (300 K mit emu/g hin zu 2 K und emu/g). Abbildung 3.20: Magnetisierungskurve (oben) und ZFC-Kurve (unten) der magnetischen Eigenschaften von geschützten LT-SPIONs mit Gluconsäure als Stabilisierungsagenz. 102

110 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3.21: FTIR-Spektrum der Gluconsäure-stabilisierten LT-SPIONs sowie das verkleinerte Reinspektrum der Gluconsäure in Rot (gegen KBr). In Abbildung 3.21 ist das FTIR-Spektrum der Gluconsäure und der damit stabilisierten LT-SPIONs dargestellt, die als KBr-Pressling vermessen wurden. Die dominante Bande bei 583 cm -1 stammt von der typischen (Fe-O)-Streckschwingung der Eisenoxidpartikel, genauso wie die etwas schwächere Band bei 395 cm -1 sowie die Schulter bei 622 cm -1. Die breite Bande über 3000 cm -1 stammt von der (OH)- Streckschwingung und kann der Gluconsäure und amphoteren Hydroxylgruppen auf der Oberfläche zugeordnet werden. Der Nachweis für die erfolgte Anbindung dieser Zuckersäure an die SPION-Oberfläche geschieht über die Verschiebung der Carbonylbanden. Diese können bei 1628 und 1387 cm -1 detektiert werden. Im Vergleich dazu, liegen die beiden Carbonylbanden in der freien Säure bei 1632 und 1471 cm -1. Die anderen Banden bei 1100, 1083 und 950 cm -1 stammen aus der (C- O)-Streckschwingung des Zuckers. 103

111 Ergebnisse und Diskussion SPIONs aus Synthesen in DEG bei hoher Temperatur (HT-SPIONs) HT-SPIONs SPIONs Stabilisierung mit DEG Der Vorteil der von Caruntu et al.[122] entwickelten Eintopfreaktion über die wässrige Mitfällung wird in Abbildung 3.22 deutlich. Die Partikel verfügen über eine ein äußerst enge Größenverteilung, wie im Histogramm deutlich wird. Für die Bestimmung der Größenverteilung ng wurden wieder 100 SPIONs ausgemessen und daraus konnte ein Wert von 5.6 nm mit einer Standardabweichung von nm ermittelt werden. 45 Partikelanzahl Partikelgröße [nm] Abbildung 3.22: TEM-Bild Bild und Partikelgrößenverteilung Partikelgrößenverte der HT-SPIONs (DEG-Stabilisierung). (DEG Aufgrund der synthesebedingten DEG-Stabilisierung DEG dieser HT-SPIONs, SPIONs, sind bei diesen quasi-sphärischen sphärischen Teilen kaum ka m Aggregate beobachtbar. Die individuellen Partikel sind gut voneinander getrennt und es können, k, wie bei den LT-SPIONs sowohl sphärische als auch ellipsoiden Formen erkannt werden. Auch einige HT-SPIONs SPIONs wurden wurde mit hochauflösenden Aufnahmen hinsichtlich ihrer Einkristallinität untersucht. In Abbildung 3.23 sind die Netzebenen der im Vergleich zu den LT-SPIONs SPIONs deutlich kleineren Partikel erkennbar, die bis zur Oberfläche der 104

112 Ergebnisse und Diskussion SPIONs reichen. Aufgrund des etwas schlechteren Kontrastes und wegen dem Kohlestoffrauschen des Grid-Untergrundes sind sie allerdings nicht so deutlich erkennbar. Aber es kann dennoch beobachtet werden, dass auch in diesen SPIONs keine Korngrenzen vorhanden sind und es sich tatsächlich um magnetische Einkristalle handelt. Abbildung 3.23: HRTEM-Aufnahme der DEG-stabilisierten HT-SPIONs. Im Vergleich zu den Röntgendiffraktogrammen der LT-SPIONs kann man in den Diffraktogrammen der HT-SPIONs (Abbildung 3.24) den Effekt der Linienverbreiterung der Reflexe durch die sinkende NP Größe deutlich erkennen. Das macht eine sichere Unterscheidung zwischen den möglichen Eisenoxidphasen aber noch problematischer. Die neun gut erkennbaren Reflexe konnten entsprechend der inversen Spinellstruktur benannt werden und besitzen die folgenden Reflexpositionen und relative Intensitäten: (0.15), (0.44), (1), (0.25), (0.20), (0.36), (0.44), (0.14), (0.16). Die meisten Reflexpositionen können besser den Maghemit-Reflexen zugeordnet werden. Aber die111- und 400-Reflexe stimmen mit den erwarteten Werten für Magnetit überein. Die relativen Intensitäten sind höher als im Vergleich zu Fe 3 O 4 und auch im Vergleich zu den Werten von γ-fe 2 O 3 lässt sich bis auf eine Ausnahme (440-Reflex) dieser Trend beobachten. 105

113 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3.24: Röntgendiffraktogramm der DEG-stabilisierten HT-SPIONs. Die nach Gleichung (43) ermittelten Gitterkonstanten der Reflexe 311, 440, 220 und 511 führten zu einem mittleren Wert von a = Å für die HT-SPIONs. Diese Gitterkonstante ist weder identisch mit dem Wert von Magnetit noch mit dem von Maghemit, aber er zeigt eine leichte Tendenz zum Fe 3 O 4. Dies lässt, wie die nicht eindeutige Zugehörigkeit der Reflexe im gemessenen Diffraktogramm, die Schlussfolgerung zu, dass es sich um einen Mischung aus Magnetit und Maghemit handelt. Die Berechnung der Kristallitgröße aus der Scherrer-Gleichung ist in Tabelle 3.4 zusammengefasst. Das Ergebnis von 5.5 nm ist nahezu identisch mit dem aus den TEM-Bildern ermittelten Wert von 5.6 nm. Diese Übereinstimmung spricht dafür, dass die HT-SPIONs einkristallin sind. 106

114 Ergebnisse und Diskussion Reflex 2θ[ ] FWHM [ ] d [nm] Mittelwert d [nm] 5.54 Tabelle 3.4: Berechnung der Kristallitgröße aus dem Röntgendiffraktogramm der DEGstabilisierten HT-SPIONs (λ Cu-Kα-Strahlung = nm, K = 0.9). In Abbildung 3.25 ist der Übersichtscan der frisch hergestellten DEG-stabilisierten HT-SPIONs dargestellt. Auch in diesem XP-Spektrum sind die Signale von Fe und O zu beobachten, sowie ein kleines C-Signal, dass durch den Herstellungsprozess verursacht wird. Als Fe-Signale können neben den Fe-Auger Signalen bei 905, 845 und 783 ev auch die Signale von Fe2p 1/2 bei 725 ev und das Fe2p 3/2 Signal bei 711 ev beobachtet werden. Wie auch schon in dem entsprechenden Spektrum der LT-SPIONs können bei niedrigen Bindungsenergien die Signale von Fe3s (93 ev) sowie Fe3p (56 ev) zugeordnet werden. Das Sauerstoff-Auger-Signal hat eine Bindungsenergie von 975 ev und der entsprechende O1s-Peak kann bei 530 ev beobachtet werden. Abbildung 3.25: Übersichtsspektrum der frisch hergestellten HT-SPIONs. 107

115 Ergebnisse und Diskussion Aus einem Fit der Fe2p-Kernniveauregion, für den mittels Shirley-Methode der Hintergrund entfernt wurde, lassen sich Aussagen über die Zusammensetzung der SPIONs treffen. In der folgenden Abbildung 3.26 ist das Fe2p 3/2 Spektrum vergrößert dargestellt. Die Einhüllende (rot) ist das Resultat aus den einzelnen Gauss-Lorentz- Profilfunktionen für den 2p 3/2 -Peak. Diese Multipletts im Fit beruhen auf Endzustandseffekten wie bei Grosvenor et al. [133] beschrieben. Der Fit mit den Fe 3+ - Multipletts (grün), Fe 2+ -Multipletts (blau) sowie dem Fe 3+ -Oberflächenpeak und dem Fe 2+ -Satellit (rosa) führt zu einer Einhüllenden, die in Form und Intensität nahezu deckungsgleichen mit dem gemessenen Spektrum ist. Das deutet auf das Vorhandensein des multivalenten Fe 3 O 4 hin. Abbildung 3.26: XP-Spektrum der Fe2p 3/2 -Region von HT-SPIONs mit eingezeichneten Profilfunktionen. Das magnetische Verhalten der pulverförmigen HT-SPIONs ist im oberen Graphen in Abbildung 3.27 dargestellt. Die bei einem konstanten magnetischen Feld von 5 T und 300 K gemessene Magnetisierungskurve der mit DEG stabilisierten HT-SPIONs zeigt, wie alle bisher vorgestellten Proben superparamagnetisches Verhalten. Die Abwesenheit einer Hysterese ist in der kleinen Darstellung des vergrößerten Koordinatenursprungs deutlich zu erkennen. Die Sättigungsmagnetisierung geht gegen emu/g und ist damit deutlich niedriger als alle für LT-SPIONs ermittelten 108

116 Ergebnisse und Diskussion Werte. Diese Reduktion des M S -Wertes resultiert aus der viel geringeren Größe der HT-SPIONs (~5 nm) gegenüber der LT-SPIONs (~12 nm). Auch verfügen die ungeschützen HT-SPIONs über eine andere chemische Zusammensetzung der Oberfläche, da hier DEG als Stabilisator vorhanden ist. Das Verhalten der ZFC/FC-Kurven in der unteren Darstellung in Abbildung 3.27 ist etwas anders als in den bisher beschriebenen LT-SPION-Systemen. Der Anstieg der ZFC-Kurve ist bis 100 K deutlich steiler und besitzt ein Maximum bei einer Temperatur von 112 K in dem Bereich, wo die ZFC- und FC-Kurve zusammen laufen. Nach einem leichten Plateau in beiden Kurven kommt es zu einem Abfallen der Gesamtmagnetisierung mit steigender Temperatur bis hin zu 8.56 emu/g bei 300 K. Dieses Sinken der Kurven resultiert aus der thermischen Energie, die ausreichend ist um die magnetischen Spinmomente umzukehren. Das beide Kurven oberhalb T max so gut zusammen liegen zeigt, dass einige Aggregate in der getrockneten Probe vorliegen. In der FC-Kurve kann schließlich ein Anstieg der Magnetisierung mit sinkender Temperatur auf emu/g beobachtet werden. 109

117 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3.27: Magnetisierungskurve bei 300K (oben) und Temperaturabhängigkeit der magnetischen Eigenschaften von HT-SPIONs (unten). 110

118 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3.28: FTIR-Spektrum der DEG-stabilisierten HT-SPIONs gegen KBr. Das typische Spektrum der DEG-stabilisierten HT-SPIONs ist in Abbildung 3.28 gezeigt. Das Spektrum zeigt im Vergleich zum entsprechenden Spektrum der LT- SPIONs deutlich mehr Banden. Dies ist auf die vorhandene DEG-Schicht auf der Partikeloberfläche zurückzuführen. Die charakteristischen (Fe-O)-Schwingungen der tetraedrischen und oktaedrischen Positionen der Spinelleisenoxide sind in den Banden bei 397 und 582 cm -1 und einer Schulter bei 618 cm -1 zu finden. Die starken Banden bei 3448 und 1636 cm -1 können der (O-H)-Streck- bzw. Deformationsschwingung aus adsorbiertem DEG und Wasser zugeschrieben werden. Weitere Indizien für eine DEG-Schutzhülle sind die schwachen Banden bei 2981, 2873, 1453 und 1369 cm -1, welche von Streck- und Deformationsschwingungen der CH 2 -Gruppen stammen. Darüber hinaus kann bei 1068 cm -1 die typische (C-O)-Streckschwingung des DEG beobachtet werden. Auch dieses Spektrum besitzt die CO 2 -Bande bei cm

119 Ergebnisse und Diskussion HT-SPIONs Stabilisierung mit Zitronensäure Durch die Stabilisierung der ohnehin schon gut dispergierten HT-SPIONs mit den gewählten Hydroxycarbonsäuren konnten die wässrigen Dispersionen noch verbessert werden. Dieses Verhalten kann in Abbildung 3.29 gut beobachtet werden. Die kugelförmigen Partikel liegen getrennt voneinander auf der Grid-Oberfläche und lassen keine Aggregate erkennen. Auch durch die zusätzliche Stabilisierung der SPION-Oberfläche mit Zitronensäure konnte eine sehr enge Größenverteilung beibehalten werden. Es konnten SPIONs mit Größen zwischen 3 und 9 nm erfasst werden, woraus sich eine anzahlgewichtete Teilchengröße (100 NP) von 5.7±1.1 nm berechnen lässt. Partikelanzahl Partikelgröße [nm] Abbildung 3.29: TEM-Bild und Größenverteilung der HT-SPIONs mit Zitronensäure als Surfactant. Auch für diese HT-SPIONs konnte eine HRTEM-Aufnahme angefertigt werden (siehe Abbildung 3.30). Die beiden kleinen individuellen Partikel zeigen die bestehende Einkristallinität gut an. Des Weiteren kann eine leicht polygonale Form beobachtet werden. 112

120 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3.30: HRTEM-Aufnahme Aufnahme der mit Zitronensäure geschützten HT-SPIONs. SPIONs. Aus dem Diffraktogramm in Abbildung 3.31 konnten die folgenden Reflexpositionen sowie relativen Intensitäten ermittelt werden: (0.19), (0.39), (1), (0.29), (0.1 17), (0.34), (0.37), (0.13), (0.14). Die deutlich verbreiterten Reflexe Reflex konnten entsprechend der Spinellphasen von Maghemit und Magnetit benannt werden. Eine ausführliche Untersuchung der Peakpositionen zeigt, dass die Anzahl der Reflexe die Fe3O4 und γ-fe2o3 zugeschrieben werden können ausgeglichen ist, mit einem Reflex mehr für Fe3O4. Wie bei den vorherigen rherigen XRD-Spektren XRD Spektren sind die relativen Intensitäten im Vergleich zu den Standardwerten meistens erhöht, erhöht wobei der 440-Peak Peak immer etwas schwächer erscheint. Bei dieser Zitronensäure geschützten Probe der HT-SPIONs, SPIONs, scheint der Hauptbestandteil aus Magnetit Magneti zu bestehen. Das ist ein Indiz für die guten Passivierungseigenschaften eigenschaften der Zitronensäure gegen Oxidation der sehr empfindlichen Eisenoxidoberflächen. Eisenoxidoberfläche 113

121 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3.31: XRD-Spektrum der HT-SPIONs mit Zitronensäure als Surfactant. Der Mittelwert für die Gitterkonstante aus den dominanten Reflexen 311, 440, 220 und 511 beträgt a = Å für die in Abbildung 3.31 dargestellten, Zitronensäurestabilisierten HT-SPIONs. Ebenso wie bei den bisher betrachteten SPION-Systemen liegt dieser Wert zwischen den Werten der Gitterkonstanten von Magnetit und Maghemit. Der Trend geht, wie bei den ungeschützten HT-SPIONs in Richtung Fe 3 O 4. Diese Beobachtung in Kombination mit den Reflexpositionen aus dem Diffraktogramm bestätigen, dass Magnetit als dominierende Phase in diesen HT- SPIONs vorkommt. Reflex 2θ[ ] FWHM [ ] d [nm] Mittelwert d [nm] 6.01 Tabelle 3.5: Kristallitgrößenberechnung mit Hilfe der Scherrer-Gleichung von Zitronensäure geschützten HT-SPIONs. (λ Cu-Kα = nm, K = 0.9) 114

122 Ergebnisse und Diskussion In Tabelle 3.5 sind die Daten und Ergebnisse der Bestimmung der Kristallitgröße nach Scherrer zusammengefasst. Der Mittelwert, der für die mit Zitronensäure stabilisierten HT-SPIONs bestimmt werden konnte beträgt 6.0 nm. Dies stimmt sehr gut mit den TEM-Durchmessern überein, wie in dem Histogramm in Abbildung 3.29 gesehen werden kann. Diese Übereinstimmung spricht für die äußerst gute kristalline Qualität dieser SPIONs. In Abbildung 3.32 sind die ermittelten magnetischen Eigenschaften der Zitronensäure-stabilisierten HT-SPIONs dargestellt. Die Magnetisierungskurve zeigt den superparamagnetischen Charakter der Probe durch die Abwesenheit jeglicher Remanenz und Koerzitivkraft. Es konnte ein M S -Wert von emu/g aus dem Sättigungsbereich der M-H-Auftragung ermittelt werden. Dieser Wert ist bei nahezu identischer NP-Größe geringer als im Fall der DEG-stabilisierten HT-SPIONs. Dies lässt vermuten, dass die Partikel über eine dichte Schicht aus Citratmolekülen an der Oberfläche verfügen, was zum Sinken des M S -Wertes beiträgt. Der bestimmte Wert ist vergleichbar mit Beispielen aus der Literatur [57, 58] für Partikel vergleichbarer Größe. Die aufgenommenen ZFC/FC-Kurven zeigen ein anderes Verhalten als die bisher besprochenen Messungen. Der scharfe Peak in der ZFC-Kurve sowie die Spaltung der ZFC/FC Kurve nahe dieser Position deuten auf eine enge Größenverteilung hin, was mit den TEM-Daten bestätigt werden kann. Die ZFC-Kurve steigt steil bis zu einem Maximum bei 82 K an und vereinigt sich mit der FC-Kurve bei etwa 140 K, was schon im Bereich einer sinkenden Magnetisierung liegt. Die rückläufige Magnetisierung resultiert aus der hohen thermischen Energie, welche die magnetischen Spinmomente umkehrt und somit die Ausrichtung der Einzelmomente in Feldrichtung verhindert. Dieser Zusammenschluss der Kurven ist ein Hinweis auf Aggregation die womöglich während der Trocknung der Proben aufgetreten ist. Bei 300 K wird mit etwa 6 emu/g ein sehr niedriger Wert erreicht. Während der Messung der FC-Kurve kann ein leicht sigmoidaler Verlauf der steigenden Magnetisierung beobachtet werden, bis hin zu emu/g bei einer Temperatur von 2 K. 115

123 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3.32: Magnetisierungskurve bei 300 K (oben) und ZFC/FC-Kurven (unten) von Zitronensäure-stabilisierten HT-SPIONs. 116

124 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3.33: FTIR-Spektrum der Zitronensäure-stabilisierten HT-SPIONs sowie das verkleinert dargestellte Reinspektrum der Zitronensäure (rot). Im FTIR-Spektrum in Abbildung 3.33 sind die Zitronensäure-stabilisierten HT- SPIONs sowie das Zitronensäurespektrums dargestellt. Die schwachen Banden bei 400 und 446 cm -1, sowie die breite Bande bei 592 cm -1 und deren markante Schulter bei 629 cm -1 sind die charakteristischen (Fe-O)-Schwingungen der beiden Spinelleisenoxide. Das eine erfolgreiche Oberflächenpassivierung mit Zitronensäure erfolgt ist, kann besonders an den starken Banden bei 1628 und 1395 cm -1 erkannt werden. Die Verschiebung der Carbonylbande (freie Säure: ν(c=o) bei 1635 cm -1 ) zu niedrigeren Wellenzahlen zeigt die Abschwächung des Doppelbindungscharakters. Die hohe Intensität der Surfactantbanden resultiert aus der größeren Partikeloberfläche und dem damit verbundenen verbesserten Verhältnis von Surfactant zu Eisenoxid. Des Weiteren stammt die Bande bei 3446 cm -1 von der (O-H)-Streckschwingung der Zitronensäure. Die kleinen Bande um 1100 cm -1 stammen hauptsächlich von (C-O)-Streckschwingung der tertiären Alkohole sowie (O-H)-Deformationsschwingung einer freien Carbonsäuregruppe (911 und 954 cm -1 ), da die Hydroxytricarbonsäure meist nur uni- oder bidental angebunden wird. Die scharfe Bande bei 852 cm -1 kann der (C-C)- oder (C-H)-Streckschwingungen zugeordnet werden. 117

125 Ergebnisse und Diskussion HT-SPIONs Stabilisierung mit DL-Weinsäure Die deutlich engste Größenverteilung der stabilisierten HT-SPIONs konnte mit DL- Weinsäure als oberflächenaktiver Substanz beobachtet werden. In der kontraststarken TEM-Aufnahme in Abbildung 3.34 sind nicht agglomerierte Partikel zu erkennen. Diese, wie alle bisherigen SPIONs, kugelförmigen Teilchen haben einen durchschnittlichen Durchmesser von 4.5 nm und die Standardabweichung beträgt nur ±0.8 nm. Partikelanzahl Partikelgröße [nm] Abbildung 3.34: TEM-Aufnahme und Histogramm (100 NP ausgemessen) der DL-Weinsäurestabilisierten HT-SPIONs. Wie im oberen Teil der Abbildung 3.35 erkennbar ist, zeigen diese Partikel ebenfalls superparamagnetisches Verhalten. Der Sättigungsbereich ist nicht so deutlich ausgeprägt, wie in den vorangegangen Proben, aber der Wert der Sättigungsmagnetisierung geht gegen emu/g. Dies ist der niedrigste M S -Wert, der für die in dieser Arbeit hergestellten SPIONs (LT und HT) gemessen wurde. Eine Ursache dafür kann in der sehr geringen Partikelgröße (4.5 nm) gesehen werden, aber dennoch ist dieser Wert im Vergleich zu ähnlich großen SPIONs aus der Literatur zu niedrig. 118

126 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3.35: Magnetisierungskurve (oben) und Temperaturabhängigkeit der magnetischen Eigenschaften (unten) von geschützten HT-SPIONs mit DL-Weinsäure als Surfactant. Die ZFC/FC-Kurven der mit DL-Weinsäure stabilisierten HT-SPIONs sind ähnlich zu denen mit Zitronensäurestabilisierung. Es kann ein, nach einem sehr steilen Anstieg der ZFC-Kurve, scharfer Peak bei 32 K detektiert werden, welcher zusammen mit der Spaltung der ZFC/FC-Kurve bei dieser Position auf eine enge Größenverteilung 119

127 Ergebnisse und Diskussion hindeutet. Dies kann durch die TEM-Ergebnisse bestätigt werden. Die Vereinigung der beiden Kurven erfolgt etwa bei 70 K und hat eine stark fallende, fast exponentielle Tendenz bis zu einem Wert der Magnetisierung von etwa 1.36 emu/g bei 300 K. Grund für die nachlassende Gesamtmagnetisierung ist wieder der temperaturbedingte Spinflip. Der identische Verlauf der ZFC- und FC-Kurve zeigt das Vorhandensein von Aggregaten in der Probe an. Die Magnetisierung steigt im Verlauf des Abkühlungsprozesses bei der FC-Messung bis auf einen Wert von 5.69 emu/g an. Abbildung 3.36: FTIR-Spektrum der DL-Weinsäure-stabilisierten HT-SPIONs sowie das verkleinert dargestellte Reinspektrum der DL-Weinsäure (rot). Im Spektrum in Abbildung 3.36 sind die DL-Weinsäure-stabilisierten HT-SPIONs sowie die freie Säure dargestellt. Im Vergleich zum entsprechenden LT-SPIONs- Spektrum lassen sich sehr viele Charakteristika des Surfactants finden. Wie in allen SPION-IR-Spektren lassen sich die kennzeichnenden Banden der (Fe-O)- Schwingungen aus den Spinelleisenoxiden bei 393, 555, 634 cm -1 beobachten. Der Beweis für eine erfolgreiche Anbindung der DL-Weinsäure zum Schutz der Oberfläche kann mit den dominanten (C=O)-Streckschwingungsbanden bei 1628 und 1570 cm -1 erbracht werden. Diese sind im Vergleich zur ungebundenen Säure deutlich zu kleineren Wellenzahlen verschoben. Neben diesen Banden kann auch 120

128 Ergebnisse und Diskussion die breite Bande der (O-H)-Streckschwingung über 3000 cm -1 gemessen werden. In diesem liegt die schwache Schulter der (C-H)-Streckschwingung bei 2879 cm -1. Die Bande bei 1367 cm -1 kann der Deformationsschwingung der C-H-Gruppe von sekundären Alkoholen zugeordnet werden genauso wie die Bande um 800 cm -1. Für die existenz der Weinsäure an der Partikeloberfäche sprechen auch die Banden zwischen 1100 und 1000 cm -1, der (C-O)-Streckschwingungen der sekundären Alkohole. Auch in diesem Spektrum kann die CO 2 -Bande beobachtet werden HT-SPIONs Stabilisierung mit DL-Äpfelsäure Nach der Stabilisierung der HT-SPIONs mit DL-Äpfelsäure wurden die Proben mit TEM untersucht. Die kontrastreichen SPIONs liegen in Agglomeraten vor, welche vermutlich während der Probenherstellung entstanden sind. Es lassen sich dennoch die individuellen nahezu sphärischen Partikel erkennen, die wie alle anderen HT- SPIONs über eine schmale Größenverteilung verfügen. Es konnten bei den 100 ausgemessenen SPIONs Größen von 3 bis 11 nm ermittelt werden. Aus den Ergebnissen konnte schließlich ein mittlerer Durchmesser der magnetischen Teilchen von 5.3±1.3 nm ermittelt werden. Somit verfügen diese DL-Äpfelsäure-stabilisierten HT-SPIONs über die breiteste Größenverteilung. 121

129 Ergebnisse und Diskussion Partikelanzahl Partikelgröße [nm] Abbildung 3.37: TEM-Aufnahme und Histogramm der DL-Äpfelsäure-stabilisierten HT-SPIONs. Die in Abbildung 3.38 dargestellte Magnetisierungskurve zeigt ein deutlich besseres Verhalten in der Sättigung als die vorherigen Proben. Diese mit Malationen umhüllten HT-SPIONs verfügen trotz ihrer geringen Größe über einen recht hohen Sättigungswert von M S = emu/g. Mit diesen Messergebnissen kann auch das superparamagnetische Verhalten gesichert werden, da keine Hysterese auftritt. 122

130 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3.38: Magnetisierungskurve bei 300 K von DL-Äpfelsäure-stabilisierten HT-SPIONs (oben) und ZFC/FC-Kurve (unten). Das Peakmaximum in der ZFC-Kurve der DL-Äpfelsäure-stabilisierten HT-SPIONs ist deutlich breiter als das der vorher besprochenen. Der Anstieg der ZFC-Kurve ist aber dennoch steil im Vergleich zu den LT-SPIONs und hat einen T max -Wert von 82 K. Dies entspricht immer noch einer recht engen Größenverteilung. Die ZFC- und FC- 123

131 Ergebnisse und Diskussion Kurve laufen ab etwa 145 K deckungsgleich, mit einer stark fallenden Tendenz der Magnetisierung mit steigender Temperatur. Es wird ein Wert von 6.49 emu/g bei 300 K erhalten. Die FC-Kurve steigt dementsprechend bis etwa 85 K stark an und wird bis zum Ende des Abkühlens bei 2 K etwas flacher. Der maximale Wert der Magnetisierung liegt bei emu/g. Abbildung 3.39: FTIR-Spektrum der DL-Äpfelsäure-stabilisierten HT-SPIONs sowie das verkleinert dargestellte Reinspektrum der DL-Äpfelsäure (rot). Das in Abbildung 3.39 dargestellte Spektrum der DL-Äpfelsäure-stabilisierten HT- SPIONs ist wesentlich unausgeprägter als die vorher besprochenen HT-SPION- Spektren. Es erscheint in der Intensität der Surfactantbanden eher wie das entsprechende LT-SPION-Spektrum. Die Charakteristika der (Fe-O)-Schwingungen der SPIONs sind bei 398, 444, 592 und 627 cm -1 zu finden. Die starke Bande bei 3396 cm -1 kann der (O-H)-Streckschwingung von DL-Äpfelsäure und adsorbiertem Wasser zugeordnet werden. Es lassen sich wieder die zu kleineren Wellenzahlen verschobenen (C=O)-Streckschwingungen bei 1631 cm -1 und 1387 cm -1 erkennen (freie Säure: 1740 und 1696 cm -1 ), was für die erfolgreiche Anbindung der DL- Äpfelsäure an die SPION-Oberfläche spricht. Neben diesen stärker ausgeprägten Banden sind die typischen (C-O)-Streckschwingungen der sekundären Alkoholgruppe im Bereich zwischen 1100 und 1000 cm -1 zu finden. Die Schultern bei 124

132 Ergebnisse und Diskussion 1297 und 1255 cm -1 stammen von den (C-H)-Deformationsschwingung dieser Gruppen HT-SPIONs Stabilisierung mit Gluconsäure Aufgrund der starken Verdünnung für die TEM-Probenherstellung (siehe Abbildung 3.40) konnten für die Bestimmung der mittleren Partikelgröße nur 80 NP ausgemessen werden, da nie mehr Teilchen auf einer Aufnahme abgebildet waren. Es konnten Größen von 3 bis 8 nm beobachtet werden, woraus ein durchschnittlicher Teilchendurchmesser von 5.4±1.1 nm ermittelt werden konnte. Die dargestellten, mit Gluconsäure stabilisierten HT-SPIONs liegen stark vereinzelt vor und besitzen eine näherungsweise sphärischer Morphologie, wie die übrigen HT-SPIONs Partikelanzahl Partikelgröße [nm] Abbildung 3.40: TEM-Aufnahme und Größenverteilung der Gluconsäure-stabilisierten HT- SPIONs. Das Magnetisierungsverhalten der Partikel in Abbildung 3.41 ist superparamagnetisch, da weder Remanenz noch Koerzitivkraft beobachtet werden konnte. Die SPIONs lassen sich mit einem Wert der M S von emu/g in dem 5 T großen Magnetfeld gut sättigen. Diese stabilisierten HT-SPIONs verfügen über eine 125

133 Ergebnisse und Diskussion ähnliche Größe wie die DEG-stabilisierten HT-SPIONs, weshalb die Ursache für diesen etwas minimierten Wert wohl in der veränderten Zusammensetzung der Oberfläche zu suchen ist. Abbildung 3.41: Magnetisierungskurve bei 300 K (oben) und ZFC/FC-Kurve (unten) der magnetischen Eigenschaften von mit Gluconsäure geschützten HT-SPIONs. 126

134 Ergebnisse und Diskussion Die ZFC/FC-Kurven verlaufen ähnlich zu denen der DL-Äpfelsäure-stabilisierten HT- SPIONs. Nach einem steilen Anstieg der ZFC-Kurve wird ein T max -Wert von 82 K erreicht. Der Peak deutet eine enge Größenverteilung an, wie auch aus den TEM- Daten abgelesen werden kann. Die beiden Kurven laufen ab etwa 105 K zusammen und die Magnetisierung sinkt mit steigender Temperatur bis auf 5.80 emu/g ab. Die Magnetisierung steigt während der Abkühlphase der FC-Kurve bis zu 70 K und gelangt schließlich in eine Sättigung mit einem Wert von etwa 12 emu/g. Abbildung 3.42: FTIR-Spektrum der mit Gluconsäure stabilisierten HT-SPIONs sowie das verkleinert dargestellte Reinspektrum der Gluconsäure (rot). Ähnlich dem IR-Spektrum der vorher besprochenen, DL-Äpfelsäure-stabilisierten HT- SPIONs sind in Abbildung 3.42 weniger ausgeprägte Banden des Surfactants (Gluconsäure) zu beobachten. Neben den typischen (Fe-O)-Schwingungsbanden der SPIONs bei 400, 592 und 625 cm -1 sind auch Banden der Gluconsäure zu detektieren. Es ist eine sehr starke Bande der (O-H)-Streckschwingung bei 3414 cm -1 vorhanden, die sowohl der Gluconsäure als auch amphoteren Hydroxylgruppen auf der Oberfläche zugeordnet werden kann. Aufgrund der Verschiebung der Carbonylbanden zu kürzeren Wellenzahlen (1633 und 1395 cm -1 ), im Vergleich zu denen der freien Säure bei 1632 und 1471 cm -1, kann man von einer erfolgten Anbindung an die Oberfläche der HT-SPIONs sprechen. Bei etwa 2900 cm -1 kann 127

135 Ergebnisse und Diskussion eine sehr schwache Bande beobachtet werden, die einer (C-H)-Streckschwingung entspricht und vermutlich von der starken OH-Bande überdeckt wird. Zusätzlich zu den bereits besprochenen, aus der Stabilisierung stammenden Banden, treten auch die typischen (C-O)-Streckschwingungen des Zuckers im Bereich zwischen 1100 und 900 cm -1 auf. 128

136 Ergebnisse und Diskussion 3.3. In vitro Biokompatibilität der SPIONs Durch die Nanotoxikologie soll ein umfassendes Verständnis über die diversen Wechselwirkungen zwischen NP und Zellen erhalten werden. Das ist für biologische und biomedizinische Anwendungen wichtig, da die biologische Sicherheit oder Toxizität der verwendeten NP essentiell ist. SPIONs sind wegen ihrer magnetischen Eigenschaften und vergleichsweise geringen Toxizitäten für diese Anwendungen von besonderem Interesse. Für eine sorgfältige Untersuchung der Bioverträglichkeit und -verteilung der in dieser Arbeit hergestellten SPIONs wurden diese unterschiedlichen in vitro Biokompatibilitätsstudien unterzogen. Neben der Stoffwechselaktivität, die mittels Thiazolylblaufärbung (MTT-Assay) erforscht wurde, konnte auch durch die Trypanblaufärbungen die Zellvitalität der verwendeten MCF7-Zellen untersucht werden. Ein guter Einblick über die zelluläre Aufnahme sowie den möglichen Transportmechanismus durch die Zellmembran konnte mit TEM-Aufnahmen gewonnen werden. Der Nachweis über eine mögliche Verwendung der SPIONs als Radiokatalysator in der Strahlentherapie wurde über die ROS-Produktion in der Zelle durch den DCFH-DA-Assay erbracht Thiazolylblaufärbung Messungen der Toxizität der LT- und HT-SPIONs wurden unter anderem mit der Thiazolylblaufärbung durchgeführt. Dieser Farbstoff kann von vitalen Zellen in das dunkelblaue MTT-Formazan reduziert werden. Somit kann die Aktivität der mitochondrialen Dehydrogenase von lebenden Zellen bestimmt werden. Dies erlaubt Aussagen über die Stoffwechselaktivität der Zellen. Um den Einfluss der unterschiedlich oberflächenbehandelten SPIONs auf die Stoffwechselaktivität von Tumorzellen zu untersuchen, wurden MCF7-Zellen, über 24, 48, 72 und 96 Stunden mit den unterschiedlichen SPIONs inkubiert. Die SPIONs- Werte sind auf einen Kontrollzellwert ohne SPIONs (100 %) bezogen, die unter Standardzellbedingungen (37 C, 5 % CO 2, DMEM) kultiviert wurden. 129

137 Ergebnisse und Diskussion Es kann bei allen LT-SPIONs (Abbildung 3.43) ein vernachlässigbarer Einfluss auf die Stoffwechselaktivität der MCF7-Zellen beobachtet werden. Die nicht-stabilisierten LT-SPIONs zeigen eine geringfügige Auswirkung auf die MCF7-Zellen. Während der kurzen Inkubationszeiten (24 Stunden (112 %) und 48 Stunden (120 %)) konnte eine Erhöhung der Stoffwechselaktivität durch das zusätzliche Eisen beobachtet werden. Nach 96 Stunden sinkt dieser Wert auf etwa 75 % ab, was aber immer noch als vernachlässigbarer Effekt angesehen werden kann. Ein anfänglich etwas negativer Effekt der DL-Äpfelsäure-stabilisierten LT-SPIONs auf die Zellen, erkennbar durch die Abnahme auf 85 %, gleicht sich im weiteren Verlauf des Tests wieder aus. Die Ergebnisse dieser Toxikologiestudie zeigen somit die durchweg gute Biokompatibilität der nicht-stabilisierten sowie der stabilisierten LT-SPIONs. Diese bleibt auch über einen längeren Zeitraum erhalten, da alle Werte stets im Bereich der Standardzellbedingungen liegen. Abbildung 3.43: Einfluss der unterschiedlichen LT-SPIONs auf die Stoffwechselaktivität der MCF7-Zellen. 130

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