Molekulargenetische Blutgruppen-Diagnostik - Klinische Indikationen. The Nobel Prize in Chemistry 1993
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- Klaudia Huber
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1 JUSTUS-LIEBIG UNIVERSITY GIESSEN Title MEDICAL FACULTY - Klinische Indikationen Gregor Bein Institut für Klinische Immunologie und Transfusionsmedizin Justus-Liebig-Universität Gießen Zentrum für Transfusionsmedizin und Hämotherapie Universitätsklinikum Gießen und Marburg The Nobel Prize in Chemistry 1993 Kary B. Mullis Michael Smith jointly with one half to Kary B. Mullis "for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method" and with one half to Michael Smith "for his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based, site-directed mutagenesis and its development for protein studies" Saiki RK et al., Science 239:487 (1988) Mullis KB, Faloona FA, Methods Enzymol 155:335 (1987) Saiki RK et al., Science 230:1350 (1985) 1. Grundlagen 2. Fetomaternale Inkompatibilität 3. Transfusion von Blutkomponenten 1
2 1. Grundlagen 2. Fetomaternale Inkompatibilität 3. Transfusion von Blutkomponenten Blutgruppen (1) Spender (Fetus) Empfänger (Schwangere) Blutgruppen (2) Genetische Grundlagen Proteinantigene Aminosäure-Austausch (z.b. Duffy) Kohlenhydrat-Antigene Glykosyltransferase: Aktivität, Substratspezifität, Expressionsprofil (z.b. ABO) 2
3 Blutgruppen (3), Zusammenfassung Eine Blutgruppe ist durch einen Antikörper definiert. Der Antikörper ist klinisch relevant (nicht die genetisch definierte Blutgruppe) Molekulargenetische Untersuchungen: Vorhersage eines Phänotyps (Wahrscheinlichkeit?) Fallstricke Phänotyp-Vorhersage Falsch positive Ergebnisse: Gensequenz vorhanden, Antigen nicht exprimiert Inaktivierende Mutation(en) (Stop-Codon, Frameshift, Splice-Site, Promotor) z.b. null-allele des ABO-Systems Die Expression des Antigens wird von einem anderen Gen gesteuert z.b. RHAG, Bombay-Phänotyp Falsch negative Ergebnisse Unbekannte/neue Varianten an Primer-, Sonden-Bindungsstellen etc. Unbekannte/neue Allele Cis/trans Lokalisierung (Haplotyp-Bestimmung) Fallstricke Phänotyp-Vorhersage: Beispiel ABO-Blutgruppe Wagner FF, Expert Opin Med Diagn 4:411 (2010) 3
4 Gliederung 1. Grundlagen 2. Fetomaternale Inkompatibilität 3. Transfusion von Blutkomponenten Fetomaternale Inkompatibilität fetus mother Courtesy; K. Fischer, Hamburg in der Pränatal-Medizin Hämolytische Erkrankung des Feten/Neugeborenen (RHD) Diagnostik schwacher D-Varianten (Mutter) Rhesus-Prophylaxe erforderlich? RHD Zygotie (Vater) Risikoschwangerschaft? RHD-Status des Feten (mütterliches Plasma) Immunisierung der Mutter: Risikoschwangerschaft? Rhesus D negative Mutter: Rhesus-Prophylaxe erforderlich? Neonatale Alloimmunthrombozytopenie Neonatale Alloimmunneutropenie Modifiziert, Sektion Immunhämatologie der DGTI
5 32jährige Patientin (Gravida 4, Para 3) Gestationsalter 21+1, Anti-D Titer 128 Blutgruppe der Patientin 0 Rhesus neg. (ccddee) Blutgruppe des Ehemannes RHD Zygotie Dd (heterozygot) Fetale Blutgruppenbestimmung aus mütterlichem Plasma*: CT (mean) Albumin RHD Exon RHD Exon SRY Diagnose: Rhesus D inkompatible Schwangerschaft *Scheffer P et al., BJOG 118:1340 (2011) Molekulargenetische Blutgruppenbestimmung aus Plasma Verdünnungsstufe Zellfreies Plasma einer RHD positiven Person wurde in zellfreiem Plasma einer RHD negativen Person verdünnt. Die Abbildung zeigt 4 biologische Replikate; X-Achse: Verdünnungsstufe Y-Achse: Ct (mean, drei technische Replikate) Fröhner V et al., unpublished Säugling, geb , postpartal Thrombozytopenie Befund der Mutter: Crossmatch gegen väterliche Thrombozyten (indirekter MAIPA): Glykoprotein IIb/IIIa schwach positiv Glykoprotein Ia/IIa negativ Glykoprotein Ib/IX negativ CD109 negativ PECAM-1 negativ Genotypisierung: HPA 1a (Pl A1, Zw a ) 1b (Pl A2, Zw b ) 2a (Ko b ) 2b (Ko a ) 3a (Bak a ) 3b (Bak b ) 5a (Br b ) 5b (Br a ) 15a (Gov b ) 15b (Gov a ) Kind pos. neg. pos. pos. pos. neg. pos. neg. pos. pos. Mutter pos. pos. pos. pos. pos. neg. pos. neg. pos. pos. Vater pos. neg. pos. neg. pos. pos. pos. neg. neg. pos. Sequenzierung, kodierende Region GP IIb (ITGA2B, CD41): heterozygote Mutation Verdachts-Diagnose: Neonatale Alloimmunthrombozytopenie durch neues Antigen (Lap) 5
6 Säugling, geb , 10 Tage alt, Omphalitis Milz, Leber, Lymphknotenstatus unauffällig Thrombozyten Erythrozyten Hb Leukozyten /µl 4.5 Mio/µl 15.1 g/dl 5000/µl Differentialblutbild: Stabkernige 0 Segmentkernige 2 Eosinophile 6 Basophile 0 Lymphozyten 71 Monozyten 21 Säugling, geb , 10 Tage alt, Omphalitis Befund der Mutter: Granulozytenimmunfluoreszenztest (GIFT) mit 4 von 4 Testzellen stark positiv Granulozytenagglutinationstest (GAT) mit 2 von 4 Testzellen grenzwertig positiv Lymphozytenimmunfluoreszenztest (LIFT) mit 4 von 4 Testzellen negativ. Genotypisierung Mutter und Kind: Allel Phänotyp FCGR3B *1 HNA-1a (NA-1) FCGR3B *2 HNA-1b (NA-2) FCGR3B *3 HNA-1c (SH) CTL2 *461G CTL2 *461A ITGAM/ CD11B *230G HNA-3a HNA-3b HNA-4a (Mart) ITGAM CD11B *230A HNA-4bw ITGAL/ CD11A *2466G HNA-5a (Ond) ITGAL/ CD11A *2466C HNA-5bw Kind pos. pos. neg. pos. pos. pos. pos. pos. neg. Mutter pos. pos. neg. neg. pos. pos. pos. pos. neg. Glykoproteinspezifischer Enzymimmuntest: negativ mit FcgRIIIb, CD11a, CD11b, CD18, b-2-mikroglobulin positiv mit CD177 (HNA-2, NB1) Diagnose: Neonatale Alloimmunneutropenie durch Isoantikörper gegen CD177 in der Pränatal-Medizin Hämolytische Erkrankung des Feten/Neugeborenen (RHD) Diagnostik schwacher D-Varianten (Mutter) Rhesus-Prophylaxe erforderlich? RHD Zygotie (Vater) Risikoschwangerschaft? RHD-Status des Feten (mütterliches Plasma) Immunisierung der Mutter: Risikoschwangerschaft? Rhesus D negative Mutter: Rhesus-Prophylaxe erforderlich? Neonatale Alloimmunthrombozytopenie Neonatale Alloimmunneutropenie Modifiziert, Sektion Immunhämatologie der DGTI
7 1. Grundlagen 2. Fetomaternale Inkompatibilität 3. Transfusion von Blutkomponenten Transfusion von Erythrozyten 1. Zellen sind nicht verfügbar oder nicht geeignet 1. Vortransfusionen (chronische Transfusion, Massivtransfusion) 2. Positiver direkter Coombstest (Auto-, Alloimmunhämolysen) 2. Low copy number oder schwach exprimierte Antigene 1. schwach exprimierte RHD-Allele, FY*X 3. Seren zur Antigenbestimmung nicht geeignet/verfügbar 1. Dombrock-Typisierung, seltene Antigene (Fehlen hochfrequenter Antigene) 2. weak D 4. Zygotie-Bestimmung, Gendosis 1. Typisierung von Testzellen (Dosis-Effekte) 5. Hochdurchsatz-Screening 1. Suche nach Spendern mit negativem Status für hochfrequente Antigene 2. Suche nach Spendern mit seltener Antigen-Kombination 3. In silico matching Modifiziert nach Wagner FF, Expert Opin Med Diagn 4:411 (2010); Sektion Immunhämatologie der DGTI 2008 Patientin: weibl., 11 Jahre alt Diagnose: histiozytäres Sarkom Leukozytenzahl: < 0,1 G/l HLA-Genotypisierung aus Wangenschleimhautabstrich (Sequencing-based Typing, SBT) 7
8 Blutgruppen Spender (Fetus) Empfänger (Schwangere) Red blood cell alloimmunization in transfused patients with MDS or CML (n=272) Kumulative Inzidenz: Plateau bei 19,5 % nach 130 Transfusionen Inzidenz: 1 Antikörper je 10,5 Personenjahre (unabhängig von Geschlecht, Alter, Diagnose) Häufigste Antikörper: Anti-K, E, c, Jk a 62 % der Antikörper: Rhesus und Kell-System Sanz C et al., Transfusion 53:710 (2013) Immunogenität von Blutgruppen-Antigenen Antigen Immunogenicity (traditionel) K 1,00 E 0,35 V 0,21 C w 0,19 Le a 0,15 c 0,11 Lu a 0,094 Fy a 0,090 C 0,080 Jk a 0,077 P 1 0,074 M 0,073 e 0,071 Le b 0,062 S 0,025 s 0,014 N 0,007 Fy b 0,005 Jk b 0,004 Antigen Immunogenicity (Tormey) K 1,00 Lu a 0,40 Jk a 0,37 E 0,35 Le a 0,16 P 1 0,12 C w 0,70 Le b 0,089 M 0,090 c 0,097 Fy a 0,064 C 0,055 S 0,013 V e s N Fy b Jk b Tormey CA & Stack G, Blood 114:4279 (2009) 8
9 Antikörper gegen hochfrequente Antigene Spender-Screening: negativ für hochfrequente Antigene? Seltsam A et al., Transfusion 43:1563 (2003) Hochdurchsatz-Screening z.b. Gassner C et al., Transf Med Rev 27:2 (2013) Erythrozytäre Alloantikörper Risikofaktor (1) weibliches Geschlecht? Female-to-male random RR estimates for RBC alloimmunization incidence in patients without hemoglobinopathy Verduin EP et al., Transf Med Rev 26:342 (2012) Erythrozytäre Alloantikörper Risikofaktor (2) Massivtransfusion? Kaplan-Meier estimate of alloimmunization in intensively transfused ( 10 units within 48 h) and nonintensively transfused patients Zalpuri S et al., Transfusion, in press 9
10 Erythrozytäre Alloantikörper Risikofaktor (3) stattgehabte Immunisierung Kaplan-Meier estimate of the rate of additional antibody formation after transfusion in alloimmunized hematooncology patients. Schonewille H et al., Transfusion 49:453 (2009) Erythrozytäre Alloantikörper Risikofaktor (4) Inflammation? Transfusion in the absence of inflammation induces antigen-specific tolerance to murine RBCs Anti-hGPA response in FVB recipients (10 total) after each of 3 hgpa transfusions given 3 weeks apart in the presence or absence of poly(i:c). Six weeks after hgpa or wild-type FVB RBC transfusion, recipients were challenged with hgpa RBCs in the presence of poly(i:c) Smith NH et al., Blood 119:1566 (2012) Transfusion von Erythrozyten Risikofaktoren für Alloantikörper-Bildung Inkompatible Transfusion (Exposition bei ethnischer Heterogenität; z.b. Fy(a-b-) bei Afrikanischen Patienten mit Sichelzellanämie) Kumulative Zahl der Transfusions-Ereignisse Patienten, die einmal einen Blutgruppen- Alloantikörper gebildet haben, sind high-responder 10
11 Extended matching: Sichelzellanämie 99 Patienten, 6946 Transfusionen (mean 70, range 1-519) Matching: ABO, Rhesus, Kell, Kidd, Fy a Sieben Patienten bildeten 7 Allo-Antikörper: Le a, Kp a, M (2x), D (3x, D Mosaik ) LaSalle-Williams M et al., Transfusion 51:1732 (2011) Extended matching Zusammenfassung 1. Patienten mit Hämoglobinopathien (zusätzlich null-phänotypen beachten) 2. Patienten, die den 1. Alloantikörper gebildet haben 3. Chronisch transfusionspflichtige Patienten Transfusion von Erythrozyten 1. Zellen sind nicht verfügbar oder nicht geeignet 1. Vortransfusionen (chronische Transfusion, Massivtransfusion) 2. Positiver direkter Coombstest (Auto-, Alloimmunhämolysen) 2. Low copy number oder schwach exprimierte Antigene 1. schwach exprimierte RHD-Allele, FY*X 3. Seren zur Antigenbestimmung nicht geeignet/verfügbar 1. Dombrock-Typisierung, seltene Antigene (Fehlen hochfrequenter Antigene) 2. weak D 4. Zygotie-Bestimmung, Gendosis 1. Typisierung von Testzellen (Dosis-Effekte) 5. Hochdurchsatz-Screening 1. Suche nach Spendern mit negativem Status für hochfrequente Antigene 2. Suche nach Spendern mit seltener Antigen-Kombination 3. In silico matching Modifiziert nach Wagner FF, Expert Opin Med Diagn 4:411 (2010); Sektion Immunhämatologie der DGTI
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