Die elektrische Leitfähigkeit als Diagnoseparameter für die Rindfleisch-Reifung

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1 Aus dem Zentrum für Lebensmittelwissenschaften, Zentrumsabteilung für Lebensmittelkunde, Fleischhygiene und technologie und dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover Die elektrische Leitfähigkeit als Diagnoseparameter für die Rindfleisch-Reifung INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Stefanie Schmidtke geb. Bähr aus Rendsburg Hannover 2002

2 Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. med. vet. L. Szentkuti Priv. Doz. Dr. med. vet. F. Feldhusen 1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. med. vet. L. Szentkuti 2. Gutachter: Priv. Doz. Dr. med. vet. M. Kühne Datum der mündlichen Prüfung: Diese Arbeit wurde aus Mitteln der Fritz Ahrberg Stiftung gefördert.

3 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Wissenschaftliches Schrifttum Morphologische und physiologische Grundlagen Morphologie der Skelettmuskulatur Ultrastruktur der Muskelfasern Kontraktion Sarkotubuläres System Kompartimentierung und Ionenverteilung im Muskel Permeabilität der Zellmembran für Ionen Das Ruhepotential Die Na K Pumpe Potentialabhängige Membrankanäle und das Aktionspotential Struktur der potentialabhängigen Ionenkanäle Physikalische Grundlagen der Leitfähigkeit Definition der elektrischen Leitfähigkeit iii

4 iv INHALTSVERZEICHNIS Die elektrische Leitfähigkeit von Elektrolytlösungen Beziehung zwischen Äquilvalentleitfähigkeit und Konzentration Passiv-elektrisches Verhalten von Fleisch Die Messung der elektrischen Leitfähigkeit Ergebnisse anderer Untersucher Untersuchungen über die Leitfähigkeit von Rindfleisch Biochemische Abläufe während der Fleischreifung Postmortale ultrastrukturelle Veränderungen Flüssigkeitshaushalt und Ionenverteilung Wasserbindungsvermögen Einfluß des ph-wertes auf das WBV Einfluß von Sarkomerenverkürzung, ATP Wert und Rigor mortis auf das WBV Einfluß der Proteinlöslichkeit Die Entstehung des Tropfsaftes Die Zusammensetzung des Tropfsaftes Die Bildung des Tropfsaftes Die Vergrößerung des extrazellulären Raumes WBV von erhitztem Fleisch und Kochverlust Zartheit Methoden zur Messung der Zartheit Sensorische Erfassung der Zartheit Mechanische Meßmethoden

5 INHALTSVERZEICHNIS v Analytische Methoden Myofibrilläre Fragmentation Sarkomerenlängen Fleischfarbe Methoden zur Messung der Fleischfarbe Eigene Untersuchungen Material Versuchsplan Versuchsdurchführung Probengewinnung Probenbearbeitung Muskelproben Serum Untersuchungsmethoden Chemikalien Messungen der elektrischen Leitfähigkeit Analyse der Elektrolyte ph-wert Tropfsaftverlust Extrazellulärer Raum Zartheitsparameter Farbe Statistische Auswertung

6 vi INHALTSVERZEICHNIS 4 Ergebnisse Ergebnisse der Leitfähigkeitsmessungen Flüssigkeits- und Elektrolyt-Haushalt Tropfsaft-Verluste Vergrößerung des extrazellulären Raumes Beziehung des LF-Wert-Anstiegs zur Zunahme von Tropfsaft und ECR Elektrolyt-Konzentrationen Fleischreifungs Parameter ph-werte MFI Sarkomerenlänge Scherkraft Kochverluste Fleischfarbe: Lab-Werte Reflexionsmessungen Korrelationen zwischen den Fleischreifungs Parametern Besprechung der Ergebnisse Leitfähigkeitsmessungen Zur Ätiologie des LF-Anstieges Flüssigkeits- und Elektrolytverschiebungen Modell-Berechnungen Ergebnisse der Modellrechnungen Diskussion der Modellberechnungen

7 INHALTSVERZEICHNIS vii Abschließende Betrachtung LF Anstieg und Fleischreifungsparameter Schlußfolgerungen Zusammenfassung Summary Anhang Modell-Berechnungen Schrifttumsverzeichnis Wissenschaftliches Schrifttum Rechtliches Schrifttum und amtliche Verlautbarungen

8 viii ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS Abkürzungsverzeichnis Abb. ATP c C ca. C e C i cm dest. DIN dpi EDTA ECR Fa. F Abbildung Adenosintriphosphat Konzentration Coulomb circa extrazelluläre Konzentration intrazelluläre Konzentration Zentimeter destillata Deutsche Industrienorm dots per inch Ethylendiamintetraessigsäure Extrazellularraum Firma Faraday Konstante g Erdbeschleunigung (9,81 m/s 2 ) G h H.E. ICR kg LF m M MB elektrischer Leitwert Stunden Hämalaun-Eosin Intrazellularraum Kilogramm Leitfähigkeit molar Molekular-Gewicht Megabyte

9 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ix MFI mg min ml Myofibrillärer Fragmentationsindex Milligramm Minute Milliliter M. long. dorsi Musculus longissimus dorsi mm mm ms ms/cm mv Millimeter Millimol Milli-Siemens Milli-Siemens pro Zentimeter millivolt µm Mikrometer n nm Ω PC p.m. R R REM RZB S s sec T U/min x Z Stichprobenumfang Nanometer Ohm Personal Computer post mortem allgemeine Gaskonstante elektrischer Widerstand Raster-Elektronen-Mikroskop relative Zentrifugenbeschleunigung Siemens Standardabweichung Sekunde Temperatur Umdrehungen pro Minute arithmetischer Mittelwert Impedanz

10 x ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

11 Kapitel 1 Einleitung In den letzten Jahren versucht man zunehmend, dem Wunsch des Verbrauchers nach besserer Fleischqualität nachzukommen. Voraussetzung für entsprechende Qualitätssicherungsprogramme sind schnelle, praktikable und zuverlässige Meßmethoden, um nach der Schlachtung Qualitätsmerkmale zu erfassen, die es gestatten, Aussagen über den Verlauf der Fleischreifung zu machen. Die postmortale Fleischbeschaffenheit ergibt sich aus der Geschwindigkeit und Intensität der postmortalen biochemischen, strukturellen und physikalischen Abläufe (Feldhusen 1987). Um diese Abläufe zu erfassen, finden zusätzlich zur bewährten Messung des ph Wertes in zunehmendem Maße auch Geräte Verwendung (Schmitten et al. 1984, Schwägele 1992, Beck et al. 1992), die die elektrische Leitfähigkeit (LF) des Muskelgewebes messen. Diese Leitfähigkeitsmeßgeräte haben gegenüber den ph Meßgeräten den Vorteil, nahezu wartungsfrei und sehr viel praktischer in der Anwendung zu sein. Die LF Messung hat sich an Schweinefleisch als praktikable, schnelle und wenig störanfällige Methode bewährt (Sack 1988). Aufgrund enger Korrelationen mit 1

12 2 KAPITEL 1. EINLEITUNG dem ph Wert bietet sich die Möglichkeit, vor allem Schweinefleisch mit überstürzter Glykolyse zu selektieren (Reul et al. 1984, Feldhusen 1987). Die Ursachen der postmortalen LF Veränderungen im Fleisch sind bisher weitgehend unklar, ihr zeitlicher Verlauf im Rahmen der Fleischreifung und die ätiologischen Zusammenhänge wurden noch nicht genauer untersucht. So ist über die postmortalen Veränderungen der Verteilung freier Elektrolyte (Na +, K +, Cl usw.) zwischen den extra und intrazellulären Räumen des Skelettmuskels bisher sehr wenig bekannt. Nach dem Zusammenbruch der energieabhängigen Ionenpumpen treten Konzentrationsverschiebungen der Elektrolyte auf, die sich dann durch Denaturierungserscheinungen und Membranschäden weiter verstärken. So wird ein freier Austausch von intra und extrazellulärer Flüssigkeit und den darin enthaltenen freien Elektrolyten ermöglicht. Darüber, wie diese Elektrolytverschiebungen zusammen mit den bekannten strukturellen Veränderungen des Fleisches post mortem zu einem veränderten passiv elektrischen Verhalten und damit zu einer erhöhten Leitfähigkeit im Fleisch führen, liegen noch keine ausreichenden Kenntnisse vor. Nach Feldhusen (1987) sind bei Messungen der LF über längere Zeiträume aber Aussagen zum Fleischreifungszustand und zur Zartheit des Rindfleisches möglich, da zwischen der LF und Zartheitsparametern hohe Korrelationen nachgewiesen wurden, die Ursachen dieser Zusammenhänge konnten in seiner Arbeit jedoch nicht geklärt werden. Ziele der vorliegenden Arbeit waren es, 1. zu ergründen, wie Flüssigkeits- und Elektrolytverschiebungen in den Kompartimenten der Muskulatur neben den anderen Strukturveränderungen des reifenden Muskels zu einem veränderten elektrischen Verhalten des Fleisches und damit zu einer LF Erhöhung führen,

13 3 2. die Elektrolytkonzentrationen und die LF der intra- und extrazellulären Flüssigkeit im Rindfleisch sowie im austretenden Tropfsaft zu verschiedenen Zeitpunkten p.m. für einzelne Kompartimente des Muskels durch Messung und Berechnung zu ermitteln und 3. die Beziehung zwischen dem Anstieg der elektrischen Leitfähigkeit des Rindermuskels und dem Verlauf der Fleischreifung aufzuzeigen. Dazu wurden die folgenden Zartheitsparameter an den Proben gemessen: Der Myofibrilläre Fragmentationsindex, die Sarkomerenlänge, die Scherkraft unter Beachtung des Wasserbindungsvermögens, die Fleischfarbe und die Myoglobinanteile.

14 4 KAPITEL 1. EINLEITUNG

15 Kapitel 2 Wissenschaftliches Schrifttum 2.1 Morphologische und physiologische Grundlagen Morphologie der Skelettmuskulatur Der quergestreifte Skelettmuskel besteht aus einem Gefüge von Bindegewebe und bis zu 20 cm langen, zylindrischen, vielkernigen Zellen von µm Durchmesser, den Skelettmuskelfasern. Von der äußeren bindegewebigen Hülle des Muskels, dem Epimysium, dringen Bindegewebssepten in das Muskelinnere ein und grenzen als Perimysium externum die Sekundär Muskelfaserbündel voneinander ab, die ihrerseits aus Gruppen von Primärbündeln zusammengesetzt sind. Diese sind vom Perimysium internum umgeben, im Perimysium verlaufen Gefäße und Nerven. Die einzelne Muskelzelle wird von feinsten Bindegewebsfasern, dem Endomysium umhüllt (Asghar und Pearson 1980, Schiebler et al. 1986, Sielaff und Thiemig 1990). 5

16 6 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM Ultrastruktur der Muskelfasern Das Sarkolemm der Muskelfaser ist lichtmikroskopisch nicht sichtbar. Die Muskelfasergrenzschicht ist eine Hülle aus Bindegewebsgrundsubstanz, Basallamina und feinsten Retikulinfäserchen (Leonhardt 1985). Bargmann (1977) definiert als Sarkolemm das Plasmalemm der Muskelfaser, als Myolemm die Umhüllung aus Basallamina und Gitterfaserstrumpf. Dieses Myolemm stellt die Verbindung zu dem jede Muskelfaser umgebenden Endomysium dar, das die benachbarten Muskelzellen miteinander verbindet. Jede Muskelzelle enthält mehrere subplasmalemmal gelegene Kerne und steht über eine myoneurale Synapse mit einem innervierenden α Motoneuron in Verbindung, dessen Soma sich im Ventralhorn des Rückenmarkes befindet. Die wesentlichen Strukturelemente und Organellen der Muskelfaser sind in Abbildung 2.1 dargestellt. Die Hauptmasse der Muskelfaser wird von den Myofibrillen gebildet, von denen jede periodisch durch die sogenannten Z Scheiben in 2,2 3,6 µm lange Fächer, die Sarkomere, unterteilt ist. Die Myofibrillen sind zylindrisch, haben einen Durchmesser von ca. 1µm und verlaufen in Längsrichtung durch die Muskelzelle (Schiebler et al. 1986). Die Sarkomere einer Myofibrille lassen bei lichtmikroskopischer Betrachtung abwechselnd helle und dunkle Bänder erkennen daher die Bezeichnung quergestreifte Muskulatur, die durch die Anordnung der kontraktilen Proteine Myosin und Aktin zustandekommen (Leonhardt 1985). Es zeigt sich die helle I Bande (bleibt im polarisierten Licht dunkel, isotrop) und die dunkle A Bande (leuchtet im polarisierten Licht auf, anisotrop). Die stärkere Vergrößerung zeigt, daß die Streifung an die Myofibrillen gebunden ist und bringt noch eine zusätzliche, feinere Querstreifung ans Licht, inmitten des I Streifens liegt die Z-Scheibe (Zwischenscheibe, Telophragma), in der Mitte der A Bande liegt die H Zone (helle Zone, Hensensche Zone), die von dem feinen

17 2.1. MORPHOLOGISCHE UND PHYSIOLOGISCHE GRUNDLAGEN 7 Abbildung 2.1: Aufbau einer Skelettmuskelzelle und kontraktile Proteine, die Z-Streifen begrenzen ein Sarkomer ( Peiper 1994). dunklen M Streifen durchzogen wird. Diese Streifung kehrt in gleicher Folge periodisch wieder, eine Periode reicht von Z-Scheibe zu Z-Scheibe und bildet die kleinste Struktureinheit der Myofibrille, das Sarkomer (Hamm 1972, Sielaff und Thiemig 1990). Die Myofibrillen sind in einer Muskelfaser parallel zueinander angeordnet, so daß gleiche Abschnitte nebeneinander zu liegen kommen. So wird ihre individuelle Streifung zur Streifung der Faser (Leonhardt 1985). Die Myofibrillen sind aus kurzen Proteinfäden, den Myofilamenten, zusammengesetzt. Man unterscheidet dünne (6 nm) Aktin Filamente aus Aktin, Troponin und Tropomyosin, die ca. 1 µm lang sind, und dicke (12 nm) Myosin-Filamente von ca. 1, 5 µm Länge. Die Aktinfilamente sind in der Mitte an der Z Scheibe fixiert, jeweils eine Kettenhälfte der etwa 2000 Aktin Filamente ragt in zwei be-

18 8 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM nachbarte Sarkomere. In der Nähe der Z Scheiben besteht das Sarkomer nur aus Aktin Filamenten und bildet die I Bande. Die Region, in der sich die Aktin und Myosin Filamente überlappen, ist als A Bande sichtbar, diejenige, in der sich nur Myosin Filamente befinden, als H Zone. Im Zentrum des Sarkomers sind die Myosin Filamente durch Gerüst Eiweiße verbunden und verdicken sich zur M Linie. Myosin Filamente sind stabförmig und aus zwei Peptid Helices gewunden, am Ende des Moleküls befindet sich ein kleiner globulärer Kopf an einem beweglichen Hals. Dieser Kopf ist Träger der ATPase Aktivität und für die Bindung des Aktins verantwortlich. Das Myosinmolekül besteht aus HMM S1 und HMM S2 (Heavy Meromyosin), die Kopf und Hals des Myosins bilden, und dem Schaft aus LMM (Light Meromyosin). Aktin ist eine lange Filamentstruktur aus zwei Ketten globulärer G Aktin Moleküle. Weitere Bestandteile dieser Filamente sind Tropomyosin und Troponin. Das langgestreckte, starre Tropomyosin Molekül liegt in den Rinnen zwischen den gewundenen F Aktin Ketten, die Tropomyosinmoleküle sind untereinander durch je einen Troponin Komplex verbunden. Er besteht aus drei Untereinheiten: TN T, das Troponin und Tropomyosin verbindet, TN C, das Calcium Ionen bindet, und TN I, das in Ruhe die Brückenbildung zwischen Aktin und Myosin hemmt, indem es die Bindungsstelle für Myosin blockiert (Leonhardt 1985, Schiebler et al. 1986). Abbildung 2.2 zeigt schematisch den Aufbau der dicken Myosin und der dünnen Aktin Filamente eines Sarkomers Kontraktion Bei der Verkürzung der Muskelfaser gleiten die Aktin Filamente tiefer zwischen die Myosin Filamente.

19 2.1. MORPHOLOGISCHE UND PHYSIOLOGISCHE GRUNDLAGEN 9 Abbildung 2.2: Schematische Darstellung der Myosinfilamente (oben) und der Aktinfilamente (unten) ( Peiper 1994). Beim Eintreffen des Aktionspotentials wird die Membran Leitfähigkeit des Sarkoplasmatischen Reticulums (SR) für Calcium Ionen für einige Millisekunden erhöht, so daß die Konzentration freier Ca- 2+ Ionen im Sarkoplasma (im Ruhezustand etwa M/l) auf etwa 10 6 M/l 10 5 Mol/l steigt. Bei einer Konzentration von über 1 µmol/l im Sarkoplasma werden freie Ca 2+ Ionen durch Troponin C gebunden ( Calcium Schalter ), wodurch sich die räumliche Anordnung der Troponin Untereinheiten so ändert, daß das Tropomyosin Molekül tiefer in die Rinne zwischen den Aktin Filamenten verlagert wird und die Myosin Bindungsstelle freigibt. Aufgrund der hohen Affinität der Myosin Köpfchen zum Aktin kommt es spontan zu einer Querbrückenbildung zwischen Myosin und Aktin. Die Myosinköpfe werden durch Aktin und durch Mg 2+ Ionen aktiviert und binden je ein ATP Molekül. Da die Myosinköpfe an das Aktin gebunden sind,

20 10 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM schieben sie bei der Bewegung das Aktin über das Myosin Molekül hinweg, es kommt zur Kontraktion des Muskels. Der nach der ATP-Spaltung vorhandene Actomyosin-Komplex ist stabil, zum Lösen der Bindung und für den Ablauf weiterer Aktin Myosin Brückenbildungen ist erneut ATP notwendig (sogenannte Weichmacher Wirkung des ATP). Nach Ablauf der Kontraktion werden Calcium Ionen mit Hilfe der ebenfalls ATPabhängigen Calciumionenpumpe, der Ca ATPase, wieder ins SR zurückbefördert. Ist die Ca 2+ Konzentration im Sarkoplasma dann wieder auf einen niedrigen Wert gesunken, übt der Tropomyosin Troponin-Komplex wieder seine hemmende Wirkung auf die Myofilamente aus und die Muskelfaser geht in den Ruhezustand über und relaxiert. Ist post mortem das ATP in der Muskelzelle weitgehend verbraucht, können weder Calcium Ionen ins SR zurückgepumpt werden noch kann der Aktomosin Komplex gelöst werden, der Rigor mortis tritt ein (Hamm 1979, Peiper 1994) Sarkotubuläres System Mit der regelmäßigen Anordnung der Myofilamente in den Myofibrillen korrespondiert eine periodische Einfaltung des Plasmalemms, das T System, sowie eine periodische Anordnung des sarkoplasmatischen Reticulums, das L System. Die Tubuli des T Systems umgeben als transversale, schlauchförmige Einfaltungen des Sarkolemms auf Höhe der Grenze zwischen A und I Streifen die Myofibrillen und bilden ein anastomosierendes Kanälchensystem über den gesamten Querschnitt der Muskelzelle. Das Sarkoplasmatische Reticulum umhüllt als L System zwischen zwei periodisch aufeinanderfolgenden T Systemen jede Myofibrille mit Zisternen, die insgesamt ein in longitudinaler Richtung gestrecktes Netz bilden. Das L System ist in sich geschlossen, steht also weder mit dem Intra noch mit

21 2.1. MORPHOLOGISCHE UND PHYSIOLOGISCHE GRUNDLAGEN 11 dem Extrazellulär Raum in Verbindung und dient als intrazelluläres Reservoir für Calcium Ionen. Über das T System wird die von der myoneuralen Synapse ausgehende Depolarisation des Plasmalemms sehr schnell dem gesamten Faserquerschnitt mitgeteilt und springt dann auf das L System über, wo sie eine Erhöhung der Membran- Leitfähigkeit für Calcium Ionen und damit ihre Freisetzung in das die Myofibrillen umgebende Sarkoplasma bewirkt. So wird eine gleichzeitige Kontraktion aller Myofibrillen ermöglicht (elektromechanische Kopplung) (Leonhardt 1985, Bechtel 1986) Kompartimentierung und Ionenverteilung im Muskel Für die Beurteilung der Frage, inwieweit für Ionen durchlässige Membrankanäle bei den Leitfähigkeitsveränderungen in der Muskulatur eine Rolle spielen, ist das Verständnis darüber von Bedeutung, wie das Membranpotential und die Ionenverteilungen in den Kompartimenten des Muskels zustande kommen Permeabilität der Zellmembran für Ionen Durch das Sarkolemm wird das intrazelluläre Kompartiment des Muskels die Gesamtheit der intrazellulären Flüssigkeitsräume der Muskelfasern mit Sarkoplasma und darin gelegenen Organellen und Strukturelementen vom extrazellulären Kompartiment, das sich in elektrolythaltige interstitielle Räume und den intravasalen Raum unterteilt, getrennt (Heckmann 1989). Durch die sarkolemmalen Einstülpungen des T Systems entsteht eine große Oberfläche, über die die Muskelzelle in einem ständigen Stoffaustausch mit der extrazellulären Gewebsflüssigkeit steht.

22 12 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM Tabelle 2.1: Intra- und extrazelluläre Ionenkonzentrationen in der Muskelzelle eines Warmblüters (nach Dudel 2000). Intracellulär Extracellulär Na + 12 mmol/l Na mmol/l K mmol/l K + 4 mmol/l Ca mmol/l Ca 2+ 2 mmol/l Cl 4 mmol/l Andere Kationen 5 mmol/l HCO 3 8 mmol/l HCO 3 27 mmol/l Große Anionen 155 mmol/l Cl 120 mmol/l Das Ruhepotential Die Elektrolyt Zusammensetzung des Sarkoplasmas unterscheidet sich wesentlich von der des interstitiellen Mediums (vgl. Tab. 2.1). Aufgrund dieser ungleichmäßigen Ionenverteilung zwischen intra und extrazellulärer Flüssigkeit und den isolierenden elektrischen Eigenschaften des Plasmalemms kann über der Zellmembran eine Potentialdifferenz von etwa mv gemessen werden, wobei das Zellinnere gegenüber der Außenfläche der Membran negativ geladen ist. Diese Potentialdifferenz wird als Ruhemembranpotential bezeichnet (Heckmann 1989, Greger 1994). Die ungleiche Ionenverteilung in den Kompartimenten und das Ruhemembranpotential werden dadurch aufrecht erhalten, daß die Membran der ruhenden Zelle für K + Ionen relativ gut permeabel ist, für Na + Ionen dagegen kaum. Trotz des hohen Konzentrationsgefälles für Na + Ionen können diese daher kaum in die Zelle eindringen, ebensowenig wie Cl Ionen, die ihnen zum Ladungsausgleich folgen würden. K + Ionen dagegen diffundieren in großer Menge aus der Zelle in den extrazellulären Raum. Aufgrund ihrer positiven Ladung entsteht sehr schnell

23 2.1. MORPHOLOGISCHE UND PHYSIOLOGISCHE GRUNDLAGEN 13 ein Diffusionspotential an der Membran, da der überwiegende Teil der intrazellulären Anionen, im wesentlichen Protein und Phosphat Anionen, aufgrund seiner Größe nicht folgen kann und, wie erwähnt, ein Ausgleich durch eine Diffusion von Na + Ionen in die entgegengesetzte Richtung nicht stattfindet. (Döring et al. 1983). Als Resultat lädt sich die Membran außen positiv und innen negativ auf. Diese Potentialdifferenz konkurriert nun mit dem Konzentrationsgradienten der K + Ionen und steigt solange weiter, bis sich die elektrostatischen Kräfte mit den osmotischen die Waage halten und das Gleichgewichtspotential, das für Skelettmuskelzellen bei etwa -90 mv liegt, erreicht ist. Das Gleichgewichtspotential E x eines Ions zwischen der Innenseite und der Außenseite der Zellmembran läßt sich nach der Nernstschen Gleichung berechnen: E x = R T F z lnc e c i. (2.1) R ist dabei die allgemeine Gaskonstante (R = 8, 314J K 1 ), T die absolute Temperatur (Körpertemperatur 310 K), F die Faraday Konstante (96, o C/mol), z gibt die Valenz und die Vorzeichen der Ionen an, c e und c i sind die extra und intrazellulären Ionenkonzentrationen (Neumcke 1982). Setzt man die Ionenkonzentrationen von Natrium, Kalium und Chlorid Ionen aus Tabelle 2.1 in die Nernstsche Gleichung ein, so erhält man: E K = 97mV, E Na = +67mV, E Cl = +91mV. (2.2) Beim Ruhepotential dominiert die Kalium Permeabilität, wodurch das Ruhepotential (ca. -90mV) nahe E K liegt. Die geringe bleibende Differenz zum Kalium Gleichgewichtspotential kommt zustande, weil die Membran während des Ruhepotentials auch noch eine geringe Leitfähigkeit für andere Ionen besitzt, die Zellmembran hat also für jede Ionensorte eine bestimmte Permeabilität P und bestimmtes Gleichgewichtspotential E, aus deren Summe sich dann insgesamt das

24 14 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM Ruhepotential E m zusammensetzt. Dieser Zusammenhang wird durch die constant field -Theorie von Goldmann (1943) berücksichtigt, nach der Hodgkin und Katz (1949) die folgende Gleichung zu seiner Beschreibung fanden: E m = R T [ F z ln PK [K + ] e + P Na [Na + ] e + P Cl [Cl ] ] i P K [K + ] i + P Na [Na + ] i + P Cl [Cl ] e (2.3) Diese Gleichung entspricht der Nernst Gleichung in erweiterter Form, in der gewählten Darstellung berücksichtigt sie nur drei Ionensorten, könnte aber zur genaueren Berechnung um beliebig viele andere einwertige Ionen erweitert werden. Die Permeabilitäten beschreiben die Permeation durch spezifische Ionenkanäle, bei der Gleichung wird vorausgesetzt, daß das Potential innerhalb der Membran gleichmäßig abfällt, als ob die Ionenkanäle die Membran wie ein Rohr durchspannten (dv/dl = konstant). Diese Voraussetzung wird in der Realität kaum jemals erfüllt, dennoch führt die Goldman Hodgkin Katz Gleichung zu recht guten Vorhersagen des Potentials (Greger 1994) Die Na K Pumpe Während des Ruhepotentials besteht für Natrium Ionen ein starker elektrochemischer Gradient ins Zellinnere (E Na = +67mV). Deswegen findet trotz der niedrigen Permeabilität immer eine Diffusion von Natrium-Ionen ins Sarkoplasma statt (Heckmann 1989). Durch diesen Leckstrom, durch den wieder positive Ladungsträger ins Zellinnere gelangen können, würden sich zumindest die intrazellulären Konzentrationen von Natrium und Kalium Ionen allmählich den extrazellulären angleichen. Um das Membranpotential dennoch stabil zu halten, sind aktive Transportprozesse erforderlich (Dudel 2000). Der wichtigste aktive Transportprozeß ist die Na K Pumpe, die an praktisch allen Plasmamembranen der Zellen Natrium aus der Zelle und im Austausch dagegen Kalium hineinschafft und so intrazellulär die

25 2.1. MORPHOLOGISCHE UND PHYSIOLOGISCHE GRUNDLAGEN 15 hohe K + und die niedrige Na + Konzentration und damit das Ruhemembranpotential aufrechterhält. Es handelt sich bei diesem Transportmechanismus um eine ATPase, deren Aktivität von der K + und der Na + Konzentration gesteuert wird. Sie spaltet an der Innenseite der Zellmembran ATP in ADP und Phosphat und transportiert mit Hilfe der freiwerdenden Energie netto 3 Na + aus der Zelle und gleichzeitig 2 K + hinein. Die Pumpe ist also elektrogen, sie befördert bei jedem Transportvorgang eine positive Ladung aus der Zelle, wodurch sie zur Erniedrigung des Membranpotentials um etwa 10mV beiträgt (Frömter 1982). So wird mit Hilfe der Na/K ATPase zum einen das Ruhemembranpotential, zum anderen der osmotische Druck und damit das Zellvolumen konstant gehalten, beides sind wichtige Faktoren für die Betrachtung der Muskulatur als elektrischer Leiter insgesamt Potentialabhängige Membrankanäle und das Aktionspotential Während Wasser, gelöste Gase wie O 2 oder CO 2, lipidlösliche Stoffe und kleine polare Moleküle wie zum Beispiel Harnstoff leicht durch die die Muskelzelle umgebende Lipidmembran diffundieren, ist sie für geladene Moleküle und auch für die kleinen anorganischen Ionen undurchdringlich. Dennoch können Ionen durch die Plasmamembran diffundieren, dies wird durch Ionenkanäle ermöglicht. Das sind Poren, bei denen es sich um in die Plasmamembran eingelagerte Proteine handelt, die von einem wassergefüllten Kanal von weniger als einem Nanometer Durchmesser durchzogen werden. Durch diese Kanäle bewegen sich die Ionen ihrem Konzentrationsgradienten und als geladene Teilchen dem herrschenden Membranpotential entsprechend.

26 16 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM Diese potentialabhängigen Membrankanäle sind für die Muskulatur von fundamentaler Bedeutung, durch sie wird es erregbaren Membranen ermöglicht, zeit und potentialabhängig ihre Ionen Leitfähigkeit zu verändern. So kommt es während eines Aktionspotentials nach einer Vordepolarisierung zu einer Erhöhung der Na + Leitfähigkeit, was zu einer raschen Depolarisation und Potentialumkehr auf Werte über 60mV führt. Nach kurzer Zeit gehen die Na + Kanäle in einen inaktiven beziehungsweise refraktären Zustand über. Hierdurch sowie durch eine verzögerte Zunahme der K + Leitfähigkeit repolarisiert das Membran-Potential wieder (Dudel 2000). Das Verständnis dieser Vorgänge ist durch die patch clamp oder Membranfleck Klemmen Technik verbessert worden (Neher u. Sakmann 1976). Damit wurde es möglich, Membranströme von etwa 1 µm 2 kleinen Membranflecken zu messen und zum Beispiel auch den einzelnen kurzen Stromstoß von 1,6 pa, der für 0,7ms durch einen einzelnen geöffneten Natrium-Kanal fließt, zu identifizieren. Es kommt dabei zu Ionen-Transportraten von über 10 7 Ionen/s. So wurde deutlich, wie die molekularen Reaktionen der Kanäle, ihr Öffnen und Schließen, die Grundlage für die Potential und Zeitabhängigkeit der Ionenströme bilden (Darnell et al. 1990, Catterall 1986). Um darüberhinaus aber die genauen molekularen Mechnismen der Funktion der potentialabhängigen Ionenkanäle zu verstehen, vor allem wie ihre Ionen Selektivität zustandekommt und welche spannungsabhängigen Konformationsänderungen die Kanalaktivierung bewirken, mußte ihre Struktur aufgeklärt werden Struktur der potentialabhängigen Ionenkanäle Das Natrium Kanal Protein ist bisher am besten erforscht worden. Bei einem Molekulargewicht um ist seine Hauptkomponente, die Alpha Unter-

27 2.1. MORPHOLOGISCHE UND PHYSIOLOGISCHE GRUNDLAGEN 17 einheit (engl.: α subunit ), ein einzelnes großes Polypeptid mit einem Molekulargewicht von Die α subunit wurde mit Hilfe bio- chemischer Aufreinigungsmethoden und rekombinanter Gentechnologie in ihrer kompletten Aminosäuresequenz von 1820 Aminosäuren (beim Zitteraal) aufgeschlüsselt (Barchi 1991, Greger 1994). Anhand der Aminosäuresequenz wurden dann Modelle der Tertiärstruktur des Kanalproteins entwickelt. Diese basierten hauptsächlich auf Vergleichen der Aminosäuresequenzen des Kanalproteins verschiedener Tierarten und bei diesen verschiedener Gewebe, die einen hohen Grad an Homologie aufwiesen. Es stellte sich heraus, daß die Aminosäuresequenz aus vier homologen Untereinheiten besteht, die wiederum aus sechs Segmenten aufgebaut sind, die sich in jeder Untereinheit weitgehend entsprechen (vgl. Abb. 2.3). Abbildung 2.3: Vereinfachte Darstellung des Aufbaus der α subunit des Na + - Kanalproteins aus 4 Untereinheiten (I IV), von denen wiederum jede aus sechs sich weitgehend entsprechenden Segmenten S 1 S 6 aufgebaut ist (Aus: Greger 1994). Aus Überlegungen darüber, welche dieser Segmente aufgrund ihrer hydrophoben Eigenschaften die Membran überbrücken könnten, und welche aufgrund der vorherrschenden Ladung ihrer Seitenketten geeignet wären, die Ionen Selektivität in der Pore zu gewährleisten oder aber auf das Membranpotential im Sinne ei-

28 18 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM nes Spannungs Sensors zu reagieren, wurden hypothetische Modelle für die Tertiärstruktur des Proteins entwickelt. Sie wurden durch Experimente überprüft, bei denen mit Hilfe rekombinanter Gentechnologie gezielt einzelne Aminosäuren in einer bestimmten Zielregion verändert wurden, wodurch sich die Eigenschaften des Proteins in der erwarteten Weise änderten. Auf diese Art konnte zum Beispiel die Sensitivität des Natrium Kanalproteins für die Kanal Blocker Tetrodotoxin und Saxitoxin aufgehoben werden (Guy 1988, Imoto 1993). Abbildung 2.4 zeigt ein auf diesen Vorstellungen basierendes Modell der funktionellen Komponenten des Na + Kanals. Abbildung 2.4: Links: Modellvorstellung, wie die viermal sechs Segmente des Na + Kanals um eine zentrale Pore herum angeordnet sein könnten ( Greger 1994). Rechts: Modell der funktionellen Komponenten eines Na + Kanals ( Greger 1994). Danach durchspannt das Kanalprotein die Lipiddoppelschicht der Membran und ist an der Innenseite am Zytoskelett der Zelle verankert. In seinem Inneren verläuft eine wassergefüllte Pore. Das für die hohe Ionen Selektivität verantwortliche Filter befindet sich am äußeren Eingang dieser Pore. Der Öffnungszustand

29 2.1. MORPHOLOGISCHE UND PHYSIOLOGISCHE GRUNDLAGEN 19 des Kanals wird durch ein Tor kontrolliert, das durch einen im Inneren des Proteins befindlichen Potentialsensor gesteuert wird. Durch verschiedene Toxine und Lokalanästhetika kann der Kanal blockiert werden. Wie diese funktionellen Komponenten in der Primärstruktur des Kanalproteins exprimiert sind, ist noch nicht vollständig erforscht. Die Natrium, Kalium und Calcium Kanäle sind sich jedoch in ihren wesentlichen Strukturmerkmalen insofern ähnlich, daß vier homologe Untereinheiten die Kanalpore umgeben, die aus jeweils sechs Segmenten bestehen, von denen eines als Potential-Sensor fungiert (Imoto 1993). Diese Gemeinsamkeiten sind trotz struktureller Unterschiede zwischen den Kanälen deutlich zu erkennen. Abbildung 2.5 zeigt ein Modell der Struktur des Ca 2+ Kanals im Skelettmuskel. Die größte Untereinheit dieses Moleküls, α 1, weist in der Sequenz ihrer Primärstruktur einen erstaunlich hohen Grad an Homologie zur α subunit des Na + Kanalproteins auf (Barchi 1991). Trotz funktioneller Unterschiede sind diese Kanalproteine im Laufe der Evolution offensichtlich aus derselben ursprünglichen Struktur entstanden. Abbildung 2.5: Modell der Struktur des Ca 2+ -Kanals im Skelettmuskel, der sich aus den α 1, α 2, β, γ und δ Untereinheiten zusammensetzt. ( McCleskey 1993)

30 20 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM Einen guten Überblick über die Struktur des Na + Kanalproteins und anderer spannungsabhängiger Membrankanäle bieten Guy (1988), Barchi (1991) und McCleskey et al. (1993).

31 2.2. PHYSIKALISCHE GRUNDLAGEN DER LEITFÄHIGKEIT Physikalische Grundlagen der Leitfähigkeit Definition der elektrischen Leitfähigkeit Biologische Gewebe sind, genauso wie Flüssigkeiten und Metalle, in der Lage, elektrischen Strom durch die Bewegung von Ladungsträgern in ihrem Inneren zu leiten. Die Fähigkeit eines Stoffes, den Strom zu leiten, wird durch seinen Widerstand R, gemessen in Ω (Ohm), charakterisiert. Das Ohmsche Gesetz R = U I (2.4) gilt bei Anliegen einer Gleichspannung. Bei Anlegen einer Wechselspannung wird stattdessen die Impedanz Z verwendet: Z = U(t) I(t). (2.5) Der Kehrwert des Widerstandes ist der elektrische Leitwert G, gemessen in S (Siemens). Daraus folgt G = 1 R. (2.6) Der tatsächliche Widerstand eines Leiters hängt vom Material und seiner Form ab. Der Widerstand ist der Länge l des Leiters direkt und seinem Querschnitt A umgekehrt proportional: R = ϱ l A (2.7) Die Proportionalitätskonstante ϱ [Ωm] wird spezifischer Widerstand genannt und ist eine elektrische Materialkonstante: ϱ = R A l. (2.8) Analog zum Verhältnis des Leitwertes zum Widerstand ist die elektrische Leitfähigkeit als Kehrwert des spezifischen Widerstandes definiert: κ = 1 ϱ. (2.9)

32 22 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM Auch die elektrische Leitfähigkeit κ [S/m] ist eine spezifische Materialkonstante, sie ist dem Querschnitt des Leiters direkt und seiner Länge umgekehrt proportional: G = κ A l. (2.10) Die elektrische Leitfähigkeit wird daher auch als spezifischer Leitwert bezeichnet (Brdička 1990). Unmittelbar meßbar sind nur der Widerstand R oder der Leitwert G. Die Elektrische Leitfähigkeit κ erhält man aus dem Leitwert bei bekannten geometrischen Abmessungen der Probe oder nach Kalibirierung der Meßanordnung: κ = G l a. (2.11) Der Faktor l A wird Zellenkonstante genannt und läßt sich im Falle gewöhnlicher Leitfähigkeits Meßzellen nicht hinreichend genau aus ihren geometrischen Abmessungen ermitteln. Er muß daher durch Kalibrierung bestimmt werden (WTW 1993) Die elektrische Leitfähigkeit von Elektrolytlösungen In metallischen Leitern (Leiter 1. Klasse) erfolgt die Stromleitung durch freie Elektronen, während sie in Elektrolyten (Leiter 2. Klasse) durch die Wanderung freier Ionen ermöglicht wird (Brdička 1990). Dies ist auch in biologischem Gewebe mit seinem hohen Wasseranteil der Fall. Elektronen fließen nicht durch die wäßrige Lösung. Erzwingt man einen Stromfluß durch das wäßrige Medium, erfolgt an der Phasengrenze zwischen Elektroden und der Lösung eine Reduktion oder Oxidation von Elektroden und Elektrolyt (Prinzip der Elektrolyse). Eine Leitwertmessung mit Gleichstrom verändert daher die Elektrodenoberflächen und die Zusammensetzung der zu messenden Lösung und erfaßt nicht den ursprünglichen Zustand der Probe. Bei der Verwendung von Wechselstrom treten diese

33 2.2. PHYSIKALISCHE GRUNDLAGEN DER LEITFÄHIGKEIT 23 Veränderungen nicht auf. Im Inneren des Elektrolyten schwingen Anionen und Kationen im Rhythmus der angelegten Frequenz der Wechselspannung hin und her. Jede Ionenart transportiert dabei jedoch eine unterschiedliche Ladungsmenge pro Zeiteinheit. Um die Wertigkeit der Ionen mit zu berücksichtigen, verwendet man bei Salzlösungen die Äquivalentleitfähigkeit Λ. Sie ist die Leitfähigkeit einer einfachen Salzlösung dividiert durch die Äquivalentkonzentration c eq [ mol cm 3 ]: Λ = λ S cm2 [ ]. (2.12) c eq mol Der Beitrag jedes einzelnen Ions in der Salzlösung wird durch die Ionen Äquivalentleitfähigkeit λ charakterisiert. Sie ist ein Maß für die Leitfähigkeit eines Ions bezogen auf seine Äquivalentkonzentration. Die Äquivalentleitfähigkeit Λ setzt sich dann additiv aus den Ionen-Äquivalentleitfähigkeiten zusammen: Λ = X λ(x). (2.13) Befinden sich mehrere Ionenarten in beliebigen Konzentrationen in einer Lösung, wird der Begriff der Äquivalentleitfähigkeit sinnlos. Es gilt: κ = c eq (X) z(x) λ(x). (2.14) (Christen 1985, Brdička 1990) Beziehung zwischen Äquilvalentleitfähigkeit und Konzentration Die Leitfähigkeit einer Lösung nimmt mit steigender Konzentration zu. Der Anstieg ist für geringe Konzentrationen linear, zu hohen Konzentrationen hin steigt die Leitfähigkeit langsamer an. Dieser Effekt wirkt sich bei starken Elektrolyten nur wenig, bei schwachen jedoch sehr viel stärker aus. Schwache Elektrolyte

34 24 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM sind solche, die neben freien Ionen auch undissoziierte Moleküle enthalten, wobei diese in einem chemischen Gleichgewicht miteinander stehen. Da der Dissoziationsgrad mit zunehmender Verdünnung zunimmt, nähert sich die Leitfähigkeit dem Grenzwert Λ 0 der unendlichen Verdünnung. Lösungen starker Elektrolyte enthalten dagegen ausschließlich Ionen und keine undissoziierten Moleküle, sodaß sich hier keine Veränderungen des Dissoziationsgrades mit der Konzentration ergeben. Die geringere Zunahme der Leitfähigkeit mit steigender Konzentration rührt hier daher, daß sich die Ionen untereinander in ihrer Beweglichkeit beeinflussen (interionische Wechselwirkungen) und sich bei der Wanderung gegenseitig behindern. Dieser Effekt nimmt mit steigender Konzentration zu. Debye, Hückel, Onsager und Falkenhagen formulierten dazu die Theorie der starken Elektrolyte und fanden die Beziehung Λ = Λ o k c (2.15) für den Zusammenhang zwischen Leitfähigkeit und Konzentration bei starken Elektrolyten. Dabei ist Λ 0 die molare Leitfähigkeit bei unendlicher Verdünnung, c die molare Konzentration und k eine für den entsprechenden Elektrolyten charakteristischer Faktor (Christen 1985). Anhand dieser Beziehung lassen sich Leitfähigkeiten von bekannten Salzlösungen gut berechnen. In der Praxis muß man jedoch bei der Ermittlung der Leitfähigkeit realer Lösungen auf umfangreiche Tabellenwerke der Leitfähigkeit in Abhängigkeit von Konzentration und Temperatur zurückgreifen (WTW 1993). 2.3 Passiv-elektrisches Verhalten von Fleisch Die Umwandlung der tierischen Muskulatur in das Lebensmittel Fleisch ist ein komplexer Vorgang, der metabolische, physikalische und strukturelle Veränderun-

35 2.3. PASSIV-ELEKTRISCHES VERHALTEN VON FLEISCH 25 gen beinhaltet. Die resultierende Fleischbeschaffenheit hängt von der Geschwindigkeit und der Intensität ab, mit der diese Veränderungen erfolgen, also von zahlreichen inneren und äußeren Faktoren. Zunächst stehen in der frühpostmortalen Phase physikalisch chemische Veränderungen im Vordergrund, während im weiteren Verlauf enzymatisch autolytische Prozesse dominieren (ASGHAR und PEARSON, 1980). Zur Erfassung einiger physikalischer Veränderungen macht man sich das passivelektrische Verhalten des Fleisches zunutze. Im Gegensatz zum aktiv elektrischen Verhalten, bei dem ein biologisches Objekt als Spannungsquelle betrachtet wird, bezeichnet man mit passiv elektrischem Verhalten das Leitfähigkeitsverhalten eines biologischen Objektes, also die Leitfähigkeit bei einer bestimmten, von außen angelegten Spannung und Frequenz. Schon seit längerem werden neben den bekannten Parametern zur Erfassung des Reifegrades von Fleisch wie ph-wert, Helligkeit, Farbe und Zartheitsmessungen auch Verfahren angewendet, die das passiv-elektrische Verhalten des Fleisches messen. Sie basieren im Prinzip alle auf einer Messung des Leitwertes. Am häufigsten wird die Messung der elektrischen Leitfähigkeit bei einer festen Frequenz angewendet, wie sie auch in der vorliegenden Arbeit untersucht wird. Weitere Verfahren sind die Messung des dielektrischen Verlustfaktors, die Impulsimpendanzspektroskopie und darauf basierend die Messung des Py-Wertes. In der vorliegenden Arbeit wird die Messung der elektrischen Leitfähigkeit betrachtet. Ausführliche Darstellungen zur Messung des dielektrischen Verlustfaktors und des Py-Wertes finden sich bei Pliquett (1979), Kleibel et al. (1983), Pliquett und Pliquett (1992), Pliquett et al. (1995), Pliquett und Pliquett (1998), sowie bei Schöberlein et al. (1999).

36 26 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM Das passiv elektrische Verhalten wird von folgenden nach der Schlachtung ablaufenden Veränderungen bestimmt: Nach dem Tode kommt es durch das Einsetzen der anaeroben Glykolyse zu einem raschen Abfall des ph-wertes und zu einem Anstieg der Temperatur in der Muskulatur. Gleichzeitig werden nach dem Versagen der Ca 2+ Pumpe Calcium Ionen aus den Speicherstrukturen in der Zelle wie Mitochondrien und sarkoplasmatischem Retikulum freigesetzt. (Auf diese biochemischen Veränderungen unmittelbar postmortem wird in Kapitel 2.4 dieser Arbeit noch ausführlich eingegangen). So kommt es zu einer Zunahme an freien Ladungsträgern, vor allem der Ca 2+ und H + Ionen. Der niedrige ph-wert und das Ansteigen der Fleischkerntemperatur führen dann zu Schädigungen der Membransysteme der Zellen durch Proteindenaturierung. Dies ermöglicht zunehmend einen freien Austausch zwischen intra und extrazellulärer Flüssigkeit, hinzu kommt ein verändertes dielektrisches Verhalten der Membransysteme, die wie Kondensatoren wirken. Diese Punkte führen zu einem sich während der Fleischreifung stetig ändernden passiv elektrischen Verhalten: Durch die Zunahme an frei beweglichen Ladungsträgern kommt es zu einer Erhöhung des Leitwertes (Reul et al. 1984, Feldhusen et al. 1987, Schwägele1992 a, Reichert 1996). Fleisch ist ein relativ schlechter elektrischer Leiter, intra und extrazelluläre Flüssigkeiten werden von Membranen, die wie Kondensatoren wirken, voneinander getrennt. Die Flüssigkeit in den Extrazellulärspalten kann hingegen praktisch als homogener Elektrolyt betrachtet werden. Die Leitfähigkeit des Fleisches ist abhängig von der angelegten Frequenz. Bei niedrigen Frequenzen fließt der Strom durch den Extrazellularraum, mit zunehmender Frequenz kommt ein zunehmender Strom durch die Zellen hinzu. Die Leitfähigkeit geht damit mit zunehmender Frequenz einem Maximalwert entgegen. Es sind also zwei Strompfade durch die Muskulatur zu beachten. Der Pfad durch den extrazellulären Raum geht durch

37 2.3. PASSIV-ELEKTRISCHES VERHALTEN VON FLEISCH 27 einen homogenen Elektrolyten, dessen Leitfähigkeit frequenzunabhängig ist, dagegen hängt die Leitfähigkeit auf dem Weg durch die Zellen von der Frequenz ab. (Pliquett 1979, Pliquett und Pliquett 1992, Pliquett und Pliquett 1998). Der Leitwert hat in der Muskulatur also zwei Anteile, die durch normale ohmsche und durch kapazitive Widerstände (Zellmembranen wirken wie Kondensatoren) in der Muskulatur erzeugt werden. Durch die kapazitiven Anteile des Meßobjektes kommt es zu einer Phasenverschiebung von Strom und Spannung. Dies führt zu einem frequenzabhängigen Meßergebnis. Daneben hängt die gemessene Leitfähigkeit auch noch von der Meßzellenkonstanten ab, die die Geometrie der Meßelektroden berücksichtigt (vgl. Kap ), und von äußeren Bedingungen wie Temperatur und Einstichwinkel und tiefe in die Muskulatur. LF Meßgeräte, die bei nur einer, empirisch festgelegten Frequenz arbeiten, also nicht das gesamte durch das Meßgut beeinflußte Frequenzspektrum erfassen, finden in der Fleischwirtschaft breite Anwendung. Auch das in der vorliegenden Untersuchung verwendete Meßgerät LF Digi 191 der Fa. WTW gehört in diese Gruppe Die Messung der elektrischen Leitfähigkeit Ergebnisse anderer Untersucher Seit vielen Jahren ist man in der Fleischforschung bemüht, schnelle und zuverlässige Methoden für die Bestimmung der Fleischqualität zu finden, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Schlachten angewandt werden können. Eine Möglichkeit ist die ph Wert Messung 45 Minuten p.m., besonders, um PSE Fleisch beim Schwein zu erfassen. Über den früh postmortalen Zeitraum hinaus

38 28 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM ist die ph Wert Messung zur Erfassung von PSE Fleisch jedoch nicht sinnvoll, weil schon wenige Stunden nach dem Schlachten der End ph erreicht ist, an dem sich normales und verändertes Fleisch nicht mehr unterscheiden. Für die Erkennung von DFD Eigenschaften beim Rindfleisch eignet sich hingegen die ph Messung nach 24 Stunden. Unter Laborbedingungen bereitet die ph Messung keine Probleme, in der Praxis sieht es jedoch anders aus. Die Messung exakt 45 Minuten p.m. ist im Schlachtbetrieb oft aus räumlichen Gründen oder wegen des Arbeitsablaufes nicht möglich. Zudem sind die Glaselektroden der ph Meßgeräte für den Routine Einsatz im Schlachtbetrieb zu empfindlich, die Messung dauert recht lange und die Geräte müssen häufig geeicht werden. (Feldhusen 1987, Sack 1988, Schwägele 1992 a, Honikel 1995, Honikel, et al. 1995). Andere Meßgrößen zur Erfassung der Fleischqualität, wie z.b. die Farb und die Farbhelligkeitsmessung (mit dem Göfo Gerät, Minolta o.ä.), sind unmittelbar nach dem Schlachten ebenfalls nicht geeignet, da sich die zu messenden Eigenschaften erst als Folge des ph Wert Abfalls und der gleichzeitig herrschenden Temperatur Verhältnisse in Zeitversetzung ergeben. Zudem steht die Farbhelligkeit in keiner besonders engen Beziehung zu wichtigen Qualitätseigenschaften des Fleisches wie dem Wasserbindungsvermögen (Honikel 1995). Dies ist bei der Messung der elektrischen Leitfähigkeit anders, weil diejenigen postmortalen Veränderungen wie Membranschädigungen und Proteindenaturierung, die auch das Ansteigen der LF bedingen, gleichzeitig auch die Herabsetzung des Wasserbindungsvermögens verursachen. Zudem ist die Messung der elektrischen Leitfähigkeit in der Praxis auf dem Schlachthof problemloser durchzuführen, weil die Meßelektroden stabil und unempfindlich sind und die Geräte nur in größeren Zeitabständen geeicht zu werden brauchen. Von Nachteil ist bisher noch, daß bei einem recht großen Angebot von Meßgeräten auf dem Markt Geräte mit gleichen Meßprinzipien und Meßeinheiten unterschiedliche Meßwerte

39 2.3. PASSIV-ELEKTRISCHES VERHALTEN VON FLEISCH 29 anzeigen. Auch hinsichtlich Meßlokalisation und zeitpunkt gibt es noch keine Standardisierung. Meßwerte sind daher schlecht vergleichbar. Bisher ist nur der Einsatz der Leitfähigkeitsmessung zur Diagnose von PSE Fleisch beim Schwein gut untersucht, die Ergebnisse verschiedener Untersucher sollen im Folgenden einander gegenübergestellt werden. Über LF Messungen an Rindfleisch gibt es bisher nur wenige Untersuchungen, sie werden dann im Anschluß besprochen. Fischer (1986) fand bei Untersuchungen des M. semimembranosus und des M. longissimus dorsi beim Schwein Korrelationen von 0,83 und höher zwischen den wichtigsten Glykolyse-Parametern (ATP, R-Wert, Lactat) und dem Leitfähigkeitswert und schloß daraus, daß die durch Leitfähigkeitsveränderungen zutage tretenden Membrandefekte zur Geschwindigkeit der postmortalen Glykolyse in engem Kausalbezug stehen. Sack (1988), Honikel und Garrido (1993), Honikel (1995) und Kirchheim et.al. (2001) fanden ebenfalls gute Korrelationen zwischen dem LF Wert und der ph Messung 45 Minuten p.m., wobei Honikel allerdings herausstellt, daß der LF Anstieg erst bei ph Werten unter 5,6 stattfindet, was frühestens 45 Minuten p.m. der Fall sei. Er empfiehlt eine LF Messung 150 Minuten p.m. Dies ist sinnvoll, weil der LF Anstieg strukturelle Veränderungen der Muskulatur widerspiegelt, die durch den ph Abfall und den Temperatur Anstieg verursacht wurden und er daher zeitlich versetzt zu ihnen auftritt. Schwägele (1992 a) betont, daß unmittelbar p.m. die Meßwerte der LF in der Muskulatur aller Schlachtkörper sehr eng beieinander liegen, so daß außer in Extremfällen keine präzise Zuordnung in Fleischqualitätsklassen erfolgen könne, daher solle der früheste Meßzeitpunkt nicht unter 60 min. p.m. liegen. Nur wenn zu einem früheren Zeitpunkt sehr hohe LF-Werte von über 15mS/cm festgestellt würden, könne dies zu diesem frühen

40 30 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM Zeitpunkt ein Hinweis auf das Vorliegen von PSE-Fleisch sein. Auch Feldhusen (1987) stellt heraus, daß bei einer frühen LF Messung keine gute Übereinstimmung mit dem ph 45 Wert festzustellen sei, 2 48 Stunden p.m. die LF-Messung aber zu 90% im Kotelett und zu 80% im Schinken eine Bewertung des Fleisches wie nach dem ph 50 -Wert als Normalfleisch ergibt. Obwohl die meisten Autoren eine spätere Messung empfehlen, wurden Grenzwerte für die Diagnose von PSE Fleisch hauptsächlich für den LF 40 Wert oder den LF 50 Wert erarbeitet. Eine Übersicht gibt Tabelle 2.2. Tabelle 2.2: LF Grenzwerte zur Differenzierung von Normal- und PSE-Fleisch (in ms/cm) gut fraglich schlecht (PSE) Reul et al. (1984) LF 50 <5,5 5,51-10,49 >10,0 Schmitten et al. (1984) LF 40 <5,0 5,01-8,99 >9,0 Schmitten et al. (1986) LF 40 <4,3 4,4-8,2 >8,3 LF 50 <4,8 4,9-9,7 >9,8 Feldhusen (1987) LF 50 <5,0 5,0-7,0 >7,0 Sack (1988) LF 50 <4,8 4,9-9,7 >9,8 Der Grenzwert der LF, der PSE von Normalfleisch trennt, schwankt von Tier zu Tier und Muskel zu Muskel (Honikel und Garrido 1993). Daher seien Messungen des ph 45 zusammen mit anderen Qualitätsparametern wie LF oder Farbhelligkeit zur Festlegung der Grenzwerte nötig. Reichert (1996) kritisiert in diesem Zusammenhang, daß bisherige Untersuchungen zum LF Wert zu wenig auf die Fleischqualitäten des Endproduktes ausgerichtet gewesen seien. Die Meßwerte seien meist mit dem ph Wert und dem Tropfsaftverlust frühpostmortal korreliert worden, was er jedoch im Hinblick auf Aussagen die Fleischqualität des

41 2.3. PASSIV-ELEKTRISCHES VERHALTEN VON FLEISCH 31 Endproduktes betreffend für wenig signifikant hält. Er bezieht sich dabei auch auf die Arbeit von Jaud et al. (1992), die die dargestellten engen Korrelationen zwischen ph 45, LF und anderen Fleischqalitätsparametern nicht bestätigen konnten. Sie bemerken zwar einschränkend, daß die Ergebnisse bei einer späteren LF-Messung (ab 2 Stunden p.m.) besser seien, eine Messung zu diesem späten Zeitpunkt sei aber aufgrund der Arbeitsabläufe am Schlachthof kaum zu verwirklichen. Neumann Fuhrmann (1987) schreibt ebenfalls, daß sich bisherige Einstufungsvorschläge zur Fleischqualität hauptsächlich am ph 45 Wert orientierten, da er entscheidende ursächliche Zusammenhänge im postmortalen Verlauf der Fleischreifung charakterisiere. Sie stellte jedoch bei ihren Untersuchungen fest, daß diese Zusammenhänge nicht immer bestätigt werden konnten. Sie empfiehlt daher ebenfalls zur objektiven Erfassung der Veränderungen während der Fleischreifung den gemeinsamen Einsatz der Parameter ph Wert, LF Wert, Farbe und Wasserbindungsvermögen Untersuchungen über die Leitfähigkeit von Rindfleisch Untersuchungen zur elektrischen Leitfähigkeit als Diagnoseparameter für den Verlauf der Fleischreifung beim Rindfleisch führten Feldhusen (1987) und Beck et. al. (1992) durch. Feldhusen (1987) untersuchte den Verlauf der Fleischreifung von Rindern über 18 Tage p.m., wobei er in 2 3tägigen Abständen neben der LF den ph Wert, die Gesamtkeimzahl, die Penetration und die Scherkraft maß. Die Leitfähigkeit des untersuchten Rindfleisches nahm in Abhängigkeit von der Lagerungsdauer kontinuierlich zu, und zwar um ca. 1 ms/cm pro Tag. Das galt für Fleisch mit normaler Glykolyse und DFD Fleisch gleichermaßen. Zu den anderen Fleisch-

42 32 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM reifungsparametern in Beziehung gesetzt, ergab sich, daß ein Abfall der Muskelscherkräfte und ein Anstieg der Penetrationswerte mit steigenden LF-Werten einherging, also mit zunehmender Zartheit stieg die Leitfähigkeit an. Bei LF Werten über 16 ms/cm waren keine weiteren Zartheitszunahmen mehr zu beobachten. Eine Beziehung zwischen den LF Werten und dem ph Wert konnte nicht ermittelt werden, ebenso nicht zur Gesamtkeimzahl. Ein Zusammenhang zwischen GKZ und LF deutete sich bei LF Werten von mehr als 11 ms/cm an, ist aber auf durch Mikroorganismen verursachte enzymatische Fleischreifungsvorgänge zurückzuführen. Zusammenfassend kommt Feldhusen zu der Aussage, daß beim Rindfleisch die LF-Messung eine Diagnose des Fleischreifungszustandes unabhängig vom Fleischreifungstyp ermöglicht. Beck et al. (1992) führten bei Rindfleisch 1 Tag p.m. Messungen von ph, Leitfähigkeit, intramuskulärem Fettgehalt (IMF) und Fleischfarbe durch, mit dem Ziel, anhand dieser Meßergebnisse Voraussagen über die spätere sensorische Qualität des Fleisches zu machen. Dazu verglichen sie die Ergebnisse beziehungsweise die Voraussagen mit Untersuchungen an Proben desselben Fleisches 20 Tage p.m. Dabei wurden Scherkraftmessungen und sensorische Evaluation durch ausgebildete Testpersonen durchgeführt. Sie kamen zu dem Ergebnis, daß sich anhand von Fettgehalt und Fleischfarbe sichere Voraussagen betreffend der späteren Fleischqualität treffen lassen und bezogen die Ergebnisse von ph und LF Messungen leider nicht in ihre statistischen Auswertungen mit ein, da sie zu keiner weiteren Verbesserung der statistischen Sicherheit der Aussagen führten. Daher stehen aus dieser sonst interessanten Arbeit leider keine Daten zum Verlauf der LF über die Fleischreifungszeit beim Rind zur Verfügung. Untersuchungen über die Veränderungen der elektrischen Leitfähigkeit im Verlauf der Fleischreifung bei anderen Tierarten gibt es für Putenfleisch von Slowinski und Stolarski (1998) und für Schaffleisch von Funk Eisele et al. (2001).

43 2.4. BIOCHEMISCHE ABLÄUFE WÄHREND DER FLEISCHREIFUNG Biochemische Abläufe während der Fleischreifung Durch den Vorgang des Schlachtens wird die Blutzirkulation unterbrochen, mit der Folge eines Sauerstoffmangels in der Muskulatur, ihr Stoffwechsel läuft jedoch weiter. Für die Resynthese von ATP werden nun zunächst die Creatininphosphat Reserven verbraucht, dann setzt die anaerobe Glykolyse ein, die die Glykogen- Reserven im Muskel abbaut. Die Glykolyse ist aber, was die ATP Ausbeute betrifft, sehr viel ineffektiver als die oxidative Zellatmung und setzt statt dessen sehr viel mehr Energie in Form von Wärme frei, dies führt zum Ansteigen der Muskeltemperatur. Das Endprodukt der anaeroben Glykolyse, das Lactat, kann nach dem Aussetzen der Blutzirkulation nicht mehr aus der Muskelzelle abtransportiert werden und reichert sich in ihr an es kommt zum Absinken des ph-wertes (Lawrie 1980, Greaser 1986). Gleichzeitig dringen p.m. Calcium Ionen aus den Mitochondrien und bei Versagen der Ca 2+ Pumpe aus dem Sarkoplasmatischen Retikulum in das Sarkoplasma ein. Sie führen zu einer Aufhebung des die Interaktion zwischen Myosin und Aktin blockierenden Troponin Tropomyosin Systems und zu einer Aktivierung der Myosin ATPase. So wird weiter ATP abgebaut. Ist schließlich nicht mehr genug ATP vorhanden, um den Actomyosin Komplex zu lösen, der während der Kontraktion entsteht, kommt es zum Rigor mortis. Dies geschieht sogar in dem Falle, daß noch Glykogen Reserven vorhanden sein sollten, weil durch den sinkenden ph Wert von in vivo etwa 7,2 bis auf unter 5,6 die Enzyme der anaeroben Glykolyse inaktiviert werden und die ATP Resynthese zum Stillstand kommt (hamm 1979, Lawrie 1992).

44 34 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM Durch den erniedrigten ph Wert und die erhöhte Temperatur kommt es neben der Inaktivierung von Enzymen auch zur Denaturierung und Schädigung von Struktur und Membranproteinen, das Wasserbindungsvermögen der Muskulatur wird erniedrigt. Muskeleigene Enzyme bewirken im Verlauf der Reifung eine Proteolyse der Strukturproteine und damit eine Zunahme der Zartheit. Nach Lawrie (1992) ist die gleichzeitig auftretende Zunahme des NPN Gehaltes der Muskelzelle auf den Zerfall löslicher Proteine im Sarkoplasma zurückzuführen und nicht etwa auf die Dissoziation der Actomyosin Verbindungen oder eine weitergehende Proteolyse der kontraktilen Proteine. Es komme hingegen unter Einwirkung der Proteasen zu definiertem und spezifischen Aufbrechen der Peptidbindungen der Strukturproteine an bestimmten Punkten wie zum Beispiel den Z Scheiben. Es treten also Degradationen von Desmin auf, weiterhin von Nebulin und Titinfilamenten. Koohmaraie (1994) betont, daß diese zunehmende Fragmentation der Myofibrillen mit der Zartheit stark korreliert (dieser Umstand soll in dieser Arbeit später genauer besprochen werden) und daß daher die Veränderungen, die zu einer Verbesserung der Fleischqualität führen, hauptsächlich durch endogene Proteasen verursacht werden. Hauptsächlich werden zwei proteolytische Enzymsysteme diskutiert, die Calcium aktivierte Protease (CAP, Calpain mit ihrem endogenen Inhibitor Calpastatin) und die lysosomalen Kathepsine (Lee 1984, Sielaff und Thiemig 1990, Dransfield 1992). Koohmaraie (1994) erwähnt außerdem den Multicatalytischen Proteinase Komplex (MCP), der allerdings unter den bei der Fleischreifung herrschenden Bedingungen keinen Einfluß auf die Proteolyse der Myofibrillen haben soll. Das Calpain System und die lysosomalen Kathepsine ergänzen sich abhängig von ihren ph und Temperatur Optima. Die Calcium-aktivierten Proteasen, Calpain I und II, haben ihr Optimum bei einem ph 6 und werden durch

45 2.5. POSTMORTALE ULTRASTRUKTURELLE VERÄNDERUNGEN 35 den bereits erwähnten Calcium Einstrom ins Sarkoplasma aktiviert. Sie zerstören Z Streifen Strukturen (Desmin), was zur Fragmentation von Myofibrillen führt, und bewirken eine Degeneration von Troponin T, Connectin und Proteinen der M Linie. Mit weiterem Fallen des ph Wertes kommt es zu Membranschäden an den Lysosomen, aus denen die Kathepsine B, D und L freigesetzt werden, die bei niedrigen ph Werten ihre optimale Wirkung entfalten. Sie führen zu einer relativ schnellen Degeneration von Troponin T und I und des C Proteins, während Myosin, Aktin, Nebulin, Titin und α Actinin langsamer angegriffen werden (Lawrie 1992, Halloran et al. 1997). Koohmaraie (1994) sieht die CAP im Vordergrund, da sie durch Calcium Ionen aktiviert werden und sich die Fleischreifung experimentell durch Infusionen von CaCl stark beschleunigen ließe, im Gegensatz dazu werde die Aktivität von Kathepsin B durch Calcium-Ionen stark gehemmt. Das Calpain sei zudem im Cytosol hauptsächlich an seinem spezifischen Angriffspunkt, den Z-Scheiben lokalisiert, während die Kathepsine im Cytosol verteilt in den Lysosomen eingeschlossen seien. Es sei zu bezweifeln, daß die Membranen dieser Organellen zu einem frühen Zeitpunkt der Fleischreifung soweit degeneriert seien, daß diese Enzyme austreten könnten. Außerdem habe die Lagerung p.m. keinen Effekt auf Actin und Myosin, obwohl diese das Hauptsubstrat für die lysosomalen Kathepsine sein müßten, wenn diese schließlich aus den zerstörten Lysosomen austreten. 2.5 Postmortale ultrastrukturelle Veränderungen Die postmortal auftretenden strukturellen Veränderungen an der Muskelfaser lassen sich in initiale Vorgänge unmittelbar p.m., wie Störungen an Mitochondrien,

46 36 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM am Sarkoplasmatischen Retikulum und an Zellmembranen, und in Spätfolgen wie Filament und Fibrillendenaturierung unterteilen. Diese strukturellen Alterationen werden durch die bereits beschriebenen biochemischen und physikalischen Vorgänge bedingt, die mit dem Begriff der Fleischreifung verbunden sind: Durch die p.m. eintretende Gewebsanoxie, den fehlenden Abtransport von Stoffwechselschlacken, das Einsetzen der anaeroben Glykolyse und des Rigor mortis und schließlich durch die enzymatischen autolytischen Prozesse (Bergmann 1976). Mit den morphologischen Veränderungen am Skelettmuskel des Rindes haben sich u.a. Stromer und Goll (1967), Davey und Dickson (1970), Davey und Graafhuis (1975), Varriano-Marston et al. (1976), Gann und Merkel (1977), Will et. al. (1980) Kieslich (1983), Katsaras et al. (1984) und Rowe (1989) beschäftigt. Varranio Marston et al. (1976) fanden unmittelbar p.m. Zerreissungen des die Faser umgebenden Membrankomplexes, die durch starke Kontraktion der Muskelfasern entstanden waren. Gann und Merkel (1977) fanden beim Rind Unterschiede zwischen hellen Muskelfasern, an denen sie schon 1 Stunde p.m. einen leichten Verlust von Z Scheiben Material feststellten, und roten Muskelfasern, deren Z-Scheiben zu diesem Zeitpunkt unverändert sind. Das Sarkolemm liegt unmittelbar p.m. direkt auf den Myofibrillen u. weist keine strukturellen Veränderungen auf und ist von unverletzten kollagenen Fasern umgeben. Will et al. (1980) fanden dagegen Zusammenhangstrennungen der Zellmembran schon 1 Stunde p.m., weiterhin Risse in den Membranen des Sarkoplasmatischen Retikulums, das allerdings erst 24 Stunden p.m. ausge-

47 2.5. POSTMORTALE ULTRASTRUKTURELLE VERÄNDERUNGEN 37 dehnte Degenerationen aufwies, sowie hydropische Schwellungen und Aufreißen der Mitochondrien. Katsaras et al. (1984) fanden bei transmissions elektronenmikroskopischen Untersuchungen an Rindermuskulatur unmittelbar nach der Schlachtung intakte Muskelfasern mit typischer Myofibrillenstruktur und deutlich unterscheidbaren A- und I-Banden, gut erkennbaren Z Linien und H Zonen mit deutlich sichtbarer M-Linie. An der Grenze zwischen A und I Bande waren die Triaden der T Tubuli gut erkennbar. Mit dem Einsetzen des Rigor mortis kommt es dann zu einer je nach Tierart, Muskeltyp, Lagerungsart und -temperatur unterschiedlich starken Verkürzung der Sarkomere (Stromer et al. 1967, Greaser 1986). Katsaras et al. (1984) stellen sie am 2. Tag p.m. fest. Die Kontraktion führt zu einem elektronenmikroskopisch veränderten Erscheinungsbild der Sarkomeren. Die Z-Scheiben erscheinen verdickt, während die I Bande schmal wird oder kaum noch zu erkennen ist, genau wie die M und H Streifen. Stark kontrahierte Sarkomere bekommen sogar eine sanduhrähnliche Form, wenn die Z Streifen länger sind als der Querdurchmesser eines Sarkomers (Kieslich 1983). Varranio Marston et al. (1976) fanden ähnliche, die Z Scheiben repräsentierende Strukturen, die sie als Transverse Ridges bezeichneten. Der degenerative Prozeß schreitet nun in der spät postmortalen Phase fort. Rowe (1989) fand mit Hilfe von REM Aufnahmen 24 Stunden p.m. ein Sarkolemm, das sich von zusammengeklumpten Myofibrillen abgehoben hatte, sodaß große subsarkolemmale Hohlräume entstanden waren. Sowohl er selbst als auch Varranio Marston et al. (1976) beobachteten bei einer Lagerung des Rindfleisches bei 2 o C an den Membranstrukturen 24 Stunden p.m. einen beginnenden Abbau, wobei die Oberfläche des Sarkolemms dort, wo sie den Myofibrillen noch

48 38 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM aufliegt, relativ glatt ist, aber zahlreiche kleine Löcher aufweist. Die Basalmembran unterliegt einer strukturellen Desintegration, es treten Defekte an Basalmembran und Endomysium auf, sodaß die einzelnen Myofibrillen unterscheidbar werden. Nach 4 Tagen liegt dann schließlich eine schwere Schädigung des Sarkolemms vor. An den Myofibrillen macht sich post rigor eine fortschreitende Degradation der Z Scheiben bemerkbar, die zunächst mit Brüchen der dünnen Filamente an ihrer Verbindung zur Z Scheibe beginnt (myofibrilläre Fragmentation). Am 6. Tag p.m. sind dann durch den partiellen Zerfall der Z Scheiben und der anderen transversal verlaufenden Strukturen, der T Tubuli, intermyofibrilläre Räume entstanden. Die Triaden der T Tubuli sind zu diesem Zeitpunkt nicht mehr zu erkennen. Die Degradation der Z Scheiben tritt bei weißen Muskelfasern früher auf als bei roten. Bei roten Muskelfasern sind zwar Brüche der dünnen Filamente am Z Streifen zu finden, wodurch die ganze Faser in Querrichtung verschoben werden kann, eine Zersetzung der Z Scheibe trat bei Typ 1 Fasern jedoch auch am 9. Tag p.m. noch nicht auf. Eine Lösung der Aktinfilamente aus ihrer Verankerung an der Z Scheibe ist zu diesem Zeitpunkt jedoch deutlich sichtbar. Mit fortschreitender Reifung nehmen dann Querbrüche der Myofibrillen, die Bildung von interfilamentären Räumen und der Abbau der äußeren Schichten des Sarkolemms zu (Gann und Merkel 1977, Katsaras et al. 1984). 2.6 Flüssigkeitshaushalt und Ionenverteilung Wie bereits oben erwähnt, kommt es post mortem durch Temperaturveränderungen, sinkenden ph Wert und die Muskelverkürzung beim Eintritt des Rigor mortis zu Veränderungen in der Biochemie und Ultrastruktur des Muskels, durch die Enzymsysteme inaktiviert und Membransysteme geschädigt werden. Dies hat

49 2.6. FLÜSSIGKEITSHAUSHALT UND IONENVERTEILUNG 39 zur Folge, daß sich der Flüssigkeitshaushalt des Muskels gegenüber dem Zustand in vivo verändert. Durch Veränderungen des Wasserbindungsvermögens (WBV) kommt es zum Austreten von Gewebsflüssigkeit aus dem Fleisch, dem sogenannten Drip. Mit dieser Umverteilung der flüssigkeitsgefüllten Räume im Fleisch geht eine Vergrößerung des extrazellulären Raumes (ECR) einher und frei bewegliche Ionen können sich neu verteilen. All dies hat auf das dielektrische Verhalten des Fleisches und damit auf seine elektrische Leitfähigkeit wesentlichen Einfluß Wasserbindungsvermögen Die Bedeutung des Wasserbindungsvermögens für das Lebensmittel Fleisch wird aus dessen Zusammensetzung deutlich: Muskeln bestehen zu 70 75% aus Wasser, zu etwa 20% aus Proteinen und zu nur 1,5 3% aus Fett. Das Wasserbindungsvermögen kann allgemein definiert werden als die Fähigkeit des Fleisches, das eigene oder unter Umständen zugesetztes Wasser ganz oder teilweise festzuhalten (Honikel 1987). Das Wasser ist in der Muskulatur auf unterschiedliche Weise verteilt, und zwischen den Verteilungsräumen bzw. verschiedenen Bindungszuständen gibt es fließende Übergänge. Man unterscheidet 1. das Wasser des extrazellulären Raumes, das je nach Fortschreiten der postmortalen Prozesse 10 15% des Volumens einnimmt (Hamm 1963, Honikel 1987). 2. das Wasser des sarkoplasmatischen Raumes. Es ist frei beweglich und wird nur durch Zellmembranen am Austritt aus

50 40 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM der Zelle gehindert. Das Sarkoplasma entält etwa 20% des Gesamtwassers der Muskulatur, während 70% in den Fibrillen enthalten sind (Hamm 1963,1972). Die Sarkoplasmaproteine spielen demnach für die Wasserbindung keine Rolle, sondern das Wasser wird im Gefüge der myofibrillären Proteine gebunden (Hamm 1963). Hier unterscheidet man nach proteingebundenem beziehungsweise echtem Hydratationswasser. Das proteingebundene Wasser ist unmittelbar an die polaren Gruppen der Muskelproteine gebunden. Diese Bindung ist so fest, daß das Wasser selbst beim Gefrieren auf -50 o C nicht auskristallisiert. immobilisiertem Wasser, das noch in filamentgebundenes und fibrillengebundenes Wasser unterteilt wird. Es befindet sich im Gegensatz zum proteingebundenen Wasser in den Zwischenräumen der Eiweißmoleküle, an die es durch elektrostatische Kräfte und Querverbindungen gebunden ist (Wasserdipol an polare Gruppen der Peptidketten). Diese Bindung ist nicht so fest wie die des Hydratationswassers, man bezeichnet das fibrillengebundene Wasser daher als immobilisiert. Unmittelbar p.m. beginnen die Veränderungen des Wasserbindungsvermögens, die Menge des zwischen den Fibrillen immobilisierten Wassers nimmt ab, durch Zellmembranbrüche kann Wasser aus den Zellen austreten, das dann in den sich vergrößernden extrazellulären Raum übertritt. In dessen kapillären Räumen breitet es sich aus, bevor es langsam an der Fleischoberfläche erscheint und verdunstet oder abtropft. Fleisch hat unmittelbar nach dem Schlachten ein sehr hohes Wasserbindungsvermögen, es sinkt parallel zum ph Wert Abfall und der Entwicklung des Rigor mortis ab, um nach Stunden ein Minimum zu erreichen. Danach steigt das Wasserbindungsvermögen wieder an. Als Gründe für die Veränderung der Was-

51 2.6. FLÜSSIGKEITSHAUSHALT UND IONENVERTEILUNG 41 serbindung werden das Absinken des ph Wertes, die Sarkomerenverkürzung, die Entwicklung des Rigor mortis, ein Einfluß des ATP Wertes und die Löslichkeitsverringerung der myofibrillären Proteine diskutiert Einfluß des ph-wertes auf das WBV Durch sein Absinken p.m. nähert sich der ph Wert allmählich dem isolelektrischen Punkt (I.P.) des Fleisches (ph 5,0 5,4), an dem sich die Muskelproteine nach außen neutral verhalten. Die Zahl freier ionisierter Gruppen an den Proteinen, an die sich die polaren Wassermoleküle anlagern können, nimmt also ab (Nettoladungseffekt). Darauf haben natürlich auch die im Sarkoplasma enthaltenen Salze Einfluß (Hamm 1972, Offer et al. 1988). Der ph Wert hat auch auf die räumliche Anordnung der Myofibrillen Einfluß. Am I.P. ist die Zahl der elektrostatisch positiv und negativ geladenen Gruppen gleich groß, so daß benachbarte Proteinzellen durch die größtmögliche Zahl von elektrovalenten Salzbindungen zu einem engen Netz zusammengezogen werden. Deshalb muß ein größerer Teil des immobilisierten Wassers verhältnismäßig locker außerhalb des Polypeptidnetzes gespeichert werden, als es bei einem höheren ph Wert der Fall wäre (Stereoeffekt) (Hamm 1972). Bedingt durch diese Effekte zeigen intakte Muskelstücke eine lineare Abhängigkeit des Wasserbindungsvermögens vom End ph Wert (Bouton et al. 1971, Kim et al. 1985, Offer und Knight 1988) Einfluß von Sarkomerenverkürzung, ATP Wert und Rigor mortis auf das WBV Nach dem Schlachten kommt es zu einer mehr oder weniger starken Verkürzung der Muskelfasern und damit des gesamten Muskels, die man als Verkürzung der

52 42 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM Sarkomeren messen kann. Wenn dann der ph-wert auf unter 5,9 und der ATP Gehalt auf weniger als 1 µmol abgesunken ist, tritt (bei Rinderbräten) der Rigor mortis ein (Hamm et al. 1980). Es wurde diskutiert, daß das Eintreten des Rigor mortis wegen der festen Querverbindungen zwischen Aktin und Myosin und der dadurch bedingten dichteren Packung der Filamente zur Verschlechterung des Wasserbindungsvermögens beitrage (Offer et al. 1988). Dagegen spricht, daß, wie Honikel et al. (1986) und Hamm et al. (1980) feststellten, der Drip p.m. zwar linear zu der Sarkomerenverkürzung zunimmt, beim Eintritt des Rigor mortis konnten Hamm et al. (1980) dann aber keinen zusätzlichen Einfluß dieses Ereignisses auf die weitere Abnahme des Wasserbindungsvermögens feststellen. Demzufolge hat auch der abnehmende ATP Wert, der sich indirekt über das Auslösen des Rigor mortis auswirkt, keinen Einfluß auf das Wasserbindungsvermögen. Dies läßt sich damit erklären, daß es bei absinkendem ph-wert aus elektrostatischen Gründen zu einer Annäherung der Eiweißfilamente kommt (s.o.). Diese liegen dann bei Eintritt des Rigor mortis bereits so dicht zusammen, daß der Rigor mortis nur noch eine geringe weitere Verdichtung bewirken kann, die für die weitere Abnahme des Wasserbindungsvermögens unwesentlich ist Einfluß der Proteinlöslichkeit Wismer Pedersen (1966) stellte fest, daß bei Schweinefleisch die herabgesetzte Wasserbindungsfähigkeit mit einer bedeutenden Herabsetzung der Löslichkeit der Muskelproteine gekoppelt ist. Da gleichzeitig eine einge Wechselwirkung mit dem sinkenden ph Wert beobachtet wurde, begründete er das verringerte Wasserbindungsvermögen mit der Denaturierung der fibrillären Proteine.

53 2.6. FLÜSSIGKEITSHAUSHALT UND IONENVERTEILUNG 43 Nach Hamm und Grabowska (1979) nimmt innerhalb der ersten 24 Stunden nach dem Schlachten die Extrahierbarkeit des myofibrillären Eiweißes stark ab. Dies sei vor allem durch die Verknüpfung von Aktin und Myosin bei der Ausbildung des Rigor mortis bedingt, wodurch Myosin nicht in Lösung gehen kann. Das Wasserbindungsvermögen nahm parallel dazu ab Die Entstehung des Tropfsaftes Wie oben beschrieben, kommt es im Verlauf der Fleischreifung zu Veränderungen des Wasserbindungsvermögens, die schließlich zum Abtropfen bzw. Verdunsten von Gewebsflüssigkeit aus dem Fleisch, dem Tropfsaftes oder Drip, führen. Den Tropfsaftverlust definert Hamm (1985) folgendermaßen: Saftaustritt aus nicht erhitztem Fleisch oder Fleischprodukten (ohne Tausaft) ohne Anwendung einer äußeren Kraft Die Zusammensetzung des Tropfsaftes Der Tropfsaft ist eine konzentrierte Lösung intrazellulärer Muskelproteine, darunter die Enzyme der Glykolyse und Myoglobin, das dem Drip seine rötliche Farbe gibt (Offer et al. 1989, Offer und Cousins 1992), aber auch Strukturproteine wie das Myosin wurden gefunden (Honikel und Kim 1985). Die Protein Konzentration des Drips liegt bei ungefähr mg/ml und nimmt mit zunehmendem Volumen des Drips ab. Der Tropfsaft enthält etwa 124mMol/l Na +, 21mMol/l K + und 3mMol/l Cl. Verglichen mit den Ionen-Konzentrationen der intrazellulären Flüssigkeit und des Plasmas lassen diese Zahlen den Schluß zu, daß der Tropfsaft sich zu ungefähr 10 Teilen aus intrazellulärer Flüssigkeit und zu einem Teil aus extrazellulärer Flüssigkeit zusammensetzt (Offer und Knight 1988).

54 44 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM Die Bildung des Tropfsaftes Die Bildung des Drips geht mit einer Umverteilung der Flüssigkeitsräume im Fleisch und einer Vergrößerung des extrazellulären Raumes einher. Im lebenden Muskel ist das Wasser in den Myofibrillen, wie bereits erwähnt, in dem Geflecht zwischen dicken und dünnen Filamenten gebunden. Änderungen in Gehalt und Verteilung dieses Wassers müssen daher ihren Ursprung in Veränderungen dieser Zwischenräume und in strukturellen Veränderungen auf der Ebene der Sarkomere oder Myofilamente haben (Offer et al. 1989, Honikel et al. 1986). Die erste wichtige Veränderung ist das schon beschriebene Absinken des ph Wertes während der Fleischreifung, wodurch das Wasserbindungsvermögen der Myofibrillen sinkt. Als Nächstes kommt es mit dem Einsetzen des Rigor mortis durch die festen Aktin-Myosin-Verbindungen zu einem weiteren Zusammenziehen und Verfestigen des Filamentgeflechtes, wodurch Wasser nach außen gedrängt wird (Offer et al. 1988). Nach Untersuchungen von Hamm (1980) hat dieses Einsetzen des Rigor allerdings bestenfalls noch einen unterstützenden Effekt auf die weitere Abnahme des Wasserbindungsvermögens (s.o.). Honikel et al. (1986) stellten darüberhinaus aber einen engen Zusammenhang zwischen Sarkomerenverkürzung und Tropsaftverlust fest. Das Abnehmen der Sarkomerenlänge war mit dem steigenden Drip eng korreliert. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß während der Entwicklung des Rigor der Durchmesser der Muskelfasern abnimmt und der extrazelluläre Raum zunimmt (Honikel et al. 1986, Hefron u. Hegarty 1974). Daher muss sich Wasser aus dem intrazellulären in den extrazellulären Raum bewegen. Im weiteren Verlauf der Fleischreifung kommen dann sicher Zellmembranbrüche hinzu, durch die Flüssigkeit aus den Zellen austreten kann. Honikel und Kim (1985) nahmen dies als eine Hauptursache für das schlechte Safthaltevermögen von PSE Fleisch an, da der Tropfsaft Myosin ent-

55 2.6. FLÜSSIGKEITSHAUSHALT UND IONENVERTEILUNG 45 hielt, das aufgrund seiner Molekülgröße bei intakten Membranen nicht aus der Zelle auszutreten vermag. Es bilden sich dann Kapillaren und Spalten im muskulären Bindegewebe, erst im Perimysium, dann mit Einsetzen des Rigor auch im Endomysium um die Fibrillenbündel herum (Offer und Cousins 1982), in denen sich die austretende Flüssigkeit sammelt, und so entstehen zwei verschiedene Kompartimente mit extrazellulärer Flüssigkeit. Dies ist ein langsamer Prozeß, unmittelbar nach dem Rigor zeigen auch Muskeln mit starker Sarkomerenverkürzung keine, oder nur wenig Drip Entwicklung. Der Effekt der Sarkomerenverkürzung auf den Drip wird erst während der Lagerung post rigor sichtbar. Offensichtlich hängt die Zunahme der Drip Produktion nicht von der Verschiebung von Flüssigkeit vom intrazellulären in den extrazellulären Raum ab, sondern ist eine Funktion der langsamen Wanderung des extrazellulären Wassers durch die extrazellulären Kanäle (Honikel 1986). Durch diese kapillaren Spalten bewegt sich der Drip aufgrund von hydrostatischem Druck und Schwerkraft an die Fleischoberfläche und verdunstet oder tropft ab (Offer et al. 1988, Hamm 1987). Offer et al. konnten die Existenz von longitudinalen Kanälen durch die Muskulatur nachweisen. Der Drip bewegt sich durch diese in Muskelfaserrichtung und tropft an der Schnittfläche des Fleisches ab Die Vergrößerung des extrazellulären Raumes Während des geschilderten Vorganges der Drip Formation vergrößert sich der extrazelluläre Raum stetig. Über das Ausmaß dieser Vergrößerung finden sich in der Literatur unterschiedliche Angaben:

56 46 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM Nach Honikel (1987) macht das extrazelluläre Wasser im lebenden Muskel weniger als 10% des Gesamtwassers aus, kann aber im Fleisch auf über 15% ansteigen. Penny (1977) verglich den Tropfsaftverlust und die Vergrößerung des extrazellulären Raumes von Schweinefleisch bei unterschiedlichen Lagerungstemperaturen: bei 10 o C betrug der extrazelluläre Raum 2 5 % des Muskelvolumens und es wurden 1 2 % Drip gewonnen. Bei 37 o C waren es 10 14% und der extrazelluläre Raum vergrößerte sich auf 16 25%. Fialik (1983) verglich die Größe des extrazellulären Raumes bei normalem und bei PSE Schweinefleisch und fand in histologischen Schnitten signifikant größere extrazelluläre Räume beim PSE Fleisch. Dies erscheint bei Kenntnis der Mechanismen der Drip-Formation und der Tatsache, daß das Wasserbindungsvermögen von PSE Fleisch stark herabgesetzt ist, auch plausibel. Bendall und Swatland (1988) stellten eine Abhängigkeit der Menge des gebildeten Drips und der Größe des extrazellulären Raumes vom ph Wert bei Schweinefleisch fest. Die Größe des extrazellulären Raumes nahm mit sinkendem ph zu, er betrug bei ph 7,0 2% und bei ph 6,4 6%. Guignot et al. (1991) fanden bei Kalbfleisch, daß die Größenzunahme des extrazellulären Raumes mit der Geschwindigkeit des Absinkens des ph Wertes korreliert ist, aber nicht vom ph-endpunkt des Fleisches beeinflußt wird.

57 2.6. FLÜSSIGKEITSHAUSHALT UND IONENVERTEILUNG WBV von erhitztem Fleisch und Kochverlust Da Fleisch zum Verzehr meist erhitzt wird, ist sein Wasserbindungsvermögen beim Erhitzen von großem praktischem Interesse, sowohl, was die Einflüsse des Wasserbindungsvermögens auf die Zartheit betrifft, als auch den Gewichtsverlust (Honikel 1987). Beim Erhitzen des Fleisches kommt es zu typischen Veränderungen in Farbe und Aroma, zu einer Schrumpfung und Verfestigung des Gewebes und damit zum Austreten von Kochsaft. Der damit verbundene Gewichtsverlust wird als Kochverlust bezeichnet (Seuss und Honikel 1987). Dies geschieht, weil bei der Erhitzung Muskelproteine denaturieren, gelöste Eiweiße werden unlöslich, die Strukturproteine gehen aus ihrer geordneten in eine zufällige Knäulstruktur über, es kommt auch zu einer Schrumpfung von Bindegewebsproteinen wie dem Kollagen (Honikel 1981, 1986). All dies führt aus den schon in Kapitel geschilderten Gründen zu einer Verringerung des Wasserbindungsvermögens. Die Ergebnisse der Bestimmung des Kochverlustes sind jedoch stark von der Bestimmungsmethode abhängig, von der Erhitzungsgeschwindigkeit, der Endtemperatur, dem ph Wert des Fleisches und der Größe des Fleischstückes (Honikel 1987). Der Kochverlust ist bei langsam erhitzem Fleisch höher als bei sehr schnell erhitztem Fleisch und nimmt mit steigender Endtemperatur der Erhitzung zu (Pospiech und Honikel 1991, Honikel 1999). PSE Schweinefleisch hatte bei niedrigeren Temperaturen ein etwas schlechteres Wasserbindungsvermögen als normales Schweinefleisch, bei hohen Temperaturen war dann kaum ein Unterschied festzustellen. Dies hatte auch schon die Untersuchung von Seuss und Honikel (1987) ergeben. Bouton et al. (1971) stellten fest, daß der Kochverlust von Lammfleisch in Relation zum End ph Wert sowohl des rohen als auch des gekochten Fleisches mit steigendem ph Wert abnahm. Fleisch mit höherem

58 48 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM End ph Wert hat also ein besseres Wasserbindungsvermögen, wie es ja auch vom DFD Fleisch auch bekannt ist. Insgesamt ist die Bestimmung des Kochverlustes ein wertvolles Hilfsmittel zur Beurteilung des Wasserbindungsvermögens gekochten Fleisches, die Ergebnisse müssen aber immer im Zusammenhang mit Bestimmungsmethode und Beschaffenheit des Untersuchungsmaterials gesehen werden (Honikel 1987).

59 2.7. ZARTHEIT Zartheit Die Zartheit ist ein wichtiges Qualitätsmerkmal des Fleisches, dem auch für die Vermarktung entscheidende Bedeutung zukommt. Sie entwickelt sich nach der Schlachtung während der Fleischreifung und wird durch verschiedene innere und äußere Faktoren beeinflußt. Rindfleisch hat mit Einsetzen des Rigor mortis die geringste Zartheit, die Zartheit erreicht dann über eine Reifungsdauer je nach Lagerungsbedingungen von 14 bis 21 Tagen ein Optimum. (Currie u. Wolfe 1980, Katsaras et al. 1984, Honikel, 1992). Die äußeren Einflußfaktoren sind Geschlecht, Alter, Ausmästungsgrad und Fütterung des Schlachttieres. Außerdem hat noch die Behandlung des Schlachtkörpers beim Zerlegen, Lagern und Transport einen Einfluß auf die Zartheit. (Asghar und Pearson 1980, Lee und Schön 1985, Sielaff und Thiemig, 1990, Honikel und Potthast 1991). Die inneren Faktoren, die für die Zartheit bestimmend sind, wurden in den vorangegangenen Kapiteln über die biochemischen und strukturellen Veränderungen während der Fleischreifung bereits beschrieben: es sind Anteil und Beschaffenheit des Bindegewebes im Fleisch, die Struktur der Muskelfasern und die daran auftretenden Alterationen (Shimokomaki et al. 1972, Davey 1983 und Bailey 1988), sowie die beschriebenen enzymatischen Aktivitäten bei der Fleischreifung (vgl. Kap. 2.4) (Dransfield 1992, Koohmaraie 1994, Halloran et al. 1997), die zu einer fortschreitenden Fragmentierung der Myofibrillen führen. Diese Myofibrilläre Fragmentation und die Sarkomerenlänge sind wichtige innere Zartheitsfaktoren (Møller et al. 1973, Lee und Schön 1986, Offer et al. 1989).

60 50 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM 2.8 Methoden zur Messung der Zartheit Das Problem bei der Messung des Fleisch Qualitätsmerkmals Zartheit ist, daß es sich um eine komplex zusammengesetzte sensorisch erfaßbare Eigenschaft handelt, die wie folgt beschrieben wird: Zartes Fleisch ist beim Kauen angenehm weich, mürbe oder locker, man hat das Gefühl, daß das Fleisch einem auf der Zunge zergeht oder zerfälllt (Lee 1984). Die Erfassung einer solchen Eigenschaft ist natürlich am besten mit einer sensorischen Untersuchung möglich, die zwar einerseits mit einer gewissen Unsicherheit durch die Subjektivität der testenden Personen behaftet ist, andererseits erfassen chemische oder physikalische Meßverfahren immer nur einzelne Elemente des Phänomens Zartheit Sensorische Erfassung der Zartheit Obwohl eine sensorische Analyse primär auf subjektiven Sinneseindrücken beruht, wird dabei heute ein hoher Grad an objektiver, d.h. allgemeingültiger Aussage angestrebt. Dies ist bei gut ausgebildeten Testpersonen und einem festgelegten Prüfschema wie bei den DLG Qualitätsprüfungen für Fleischerzeugnisse heutzutage möglich (Hoffmann 1986). Gegenüber den sensorischen Erfassungsmethoden, die zwar die Zartheit umfassender beschreiben, haben die chemischen und physikalischen Meßmethoden den Vorteil der besseren Reproduzierbarkeit, leichteren Standardisierung und Zeitersparnis Mechanische Meßmethoden Um die Zartheit zu messen, wurden in der Vergangenheit zahlreiche mechanische Methoden entwickelt, die meist auf einem der folgenden Prinzipien basieren: sche-

61 2.8. METHODEN ZUR MESSUNG DER ZARTHEIT 51 ren, durchschneiden, penetrieren, zerkleinern oder komprimieren (Asghar und Pearson, 1980). Wenn man von der oben zitierten Definition der Zartheit ausgeht, die den sensorischen Eindruck zarten Fleisches beim Kauen beschreibt, erscheint es folgerichtig, als physikalisches Gegenstück für diese sensorische Wahrnehmung eine Zartheits-Meßmethode anzuwenden, die die Funktion der Zähne nachahmt. Aus diesem Grund hat sich der Warner-Bratzler-Scherapparat als am häufigsten genutzte Vorrichtung der Zartheitsmessung durchgesetzt (Hecht 1986, Honikel 1999). Bei diesem Gerät wird eine geometrisch genau definierte Probe zwischen ein keilförmig zulaufendes stumpfes Scherblatt gelegt und durchtrennt. Das Scherblatt wird dabei zuerst in das Fleisch gedrückt, das an dieser Stelle zuerst komprimiert und dann durchgeschert wird. Die dazu benötigte Kraft wird als Scherkraft [N] bezeichnet. Bei diesen Meßverfahren wird meist die maximal benötigte Kraft (maximale Scherkraft, Peak Shear Force) in kpa oder N angegeben. Die maximale Scherkraft ist neben der Reifungsdauer des Fleisches von der Temperatur, bis zu der das Fleisch vor der Messung erhitzt wurde, abhängig. Sielaff und Thiemig (1990) fanden eine stetige Erhöhung der Scherkraft bei Temperaturen bis o C, dann einen rapiden Abfall und dann einen erneuten Anstieg auf ein Maximum bei o C. Mit Scherkaftmessung ist es möglich, in einem frühen Stadium der Fleischreifung recht sichere Voraussagen über die Zartheit des Fleisches am Ende der Reifungszeit zu machen (Augustini und Spindler 2000, Freudenreich und Augustini 2001). Asghar und Pearson (1980) betonen jedoch, daß die Ergebnisse von Scherkraftmessungen und die abgeleiteten Korrelationen zu anderen Zartheitsparametern immer auch im Zusammenhang mit den verwendeten statistischen Methoden und der Probenzahl gesehen werden müssen. Da der Muskel in seiner

62 52 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM Textur nicht homogen aufgebaut sei, sei es wichtig, ausreichend viele Proben von verschiedenen Stellen zu vermessen. Weitere Angaben zu Scherkraftmessungen an Rindfleisch finden sich in den Arbeiten von Bouton et al. (1975), Lee und Schön (1986), Crouse et al. (1991), Boakye und Mittal (1993), Geesink et al.(1995), Wu et al. (1995), Watanabe et al. (1996) sowie Nishimura et al. (1998) Analytische Methoden Ein anderer Ansatz zur Bestimmung der Zartheit ist der analytische. Da man davon ausgeht, daß die Veränderungen an den Myofibrillen während der Fleischreifung eine wichtige Grundlage für die Zunahme der Zartheit sind, benutzt man analytische Methoden, die diese Veränderungen untersuchen. Dazu werden häufig die Myofibrilläre Fragmentation und die Messung der Sarkomerenlänge gewählt. Der Vorteil dieser analytischen Methoden besteht darin, daß sie am rohen Muskel durchgeführt werden können und nicht wie die Scherkraft-Messung erst nach Erhitzung. Sie reflektieren strukturelle Veränderungen am reifenden Muskel, die von der Denaturierung der Fleischproteine beim Erhitzen unbeeinflußt sind Myofibrilläre Fragmentation Verschiedene Autoren haben in der Vergangenheit festgestellt, daß mit zunehmender Reifung p.m. die Myofibrillen eine erhöhte Tendenz haben, bei Zerkleinerung des Fleisches in kleine Fragmente zu zerbrechen. Dies beruht vor allem auf einer Schwächung der Strukturen im Bereich der Z-Scheiben. (Davey und Gilbert 1969, Gann und Merkel 1978, Katsaras et al. 1984). Da festgestellt wurde, daß diese Fragmentierung im Verlauf der Reifungszeit zunimmt, wurde an Ver-

63 2.8. METHODEN ZUR MESSUNG DER ZARTHEIT 53 fahren gearbeitet, sie als Myofibrillärer Fragmentations-Index (MFI) objektiv zu bestimmen. Außerdem wurde untersucht, wie der MFI mit parallel gemessenen Warner-Bratzler-Scherkraftwerten korreliert ist. Die Fragmentation der Myofibrillen kann entweder direkt lichtmikroskopisch bestimmt werden oder durch eine photometrische Trübungsmessung, bei der der MFI ermittelt wird. Photometrische Trübungsmessungen führten Møller et al. (1973), Olson et al. (1976), Olson und Parrish (1977), Parrish (1978), Cole und Davis (1981) und Kühne (1990) durch, wobei Olson et al. parallel auch lichtmikroskopische Untersuchungen durchführten. Bei der Trübungsmessungs Methode werden Fleischproben einer standardisierten Zerkleinerung und Aufarbeitung der entstandenen Suspension unterzogen. An dieser Suspension werden dann Absorptionsmessungen durchgeführt. Da der Grad der Trübung mit dem Gehalt an kleinen Myofibrillen Bruchstücken korreliert, können Rückschlüsse auf den in der Muskulatur vorliegenden Grad der Fragmentation gezogen werden. Das Ergebnis der Absorptionsmessung wird als MFI angegeben. Die genannten Autoren fanden je nach untersuchtem Muskel, Lagerungstemperatur und -zeit, unterschiedlich enge Korrelation zwischen dem Fragmentations- Index und der Zartheit von Rindermuskeln, gemessen als Warner-Bratzler-Scherkraftwerte (zwischen r= 0,65 und r= 0,97, Olson und Parrish (1977), Parrish (1978) ). Eine lichtmikroskopische Untersuchung führten Katsaras et al. (1984) durch. Sie mikroskopierten homogenisierte Rindermuskulatur und bestimmten an je 100 Myofibrillen den Anteil an fragmentierten Myofibrillen, die nur aus 1 5 Sarkomeren bestanden. Sie stellten fest, daß die Bruchbereitschaft der Myofibrillen vom 1. bis zum 20. Reifungstag ständig zunahm, wobei die stärkste Steigerung in den ersten sechs Tagen zu verzeichnen war.

64 54 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM Sarkomerenlängen Eine weitere analytische Methode zur Zartheitsbestimmung ist die Messung der Sarkomerenlängen. Der Zusammenhang zwischen Sarkomerenlängen und Zartheit wurde schon seit längerer Zeit von verschiedenen Autoren beobachtet und untersucht. Nach der anfänglichen Kontraktion der Sarkomeren während des Rigor Mortis kommt es während der Reifungszeit wieder zu einer Zunahme der Sarkomerenlängen, dabei wurde gleichzeitig eine Zunahme der Zartheit beobachtet (Locker 1960, Gotthardt et al. 1966, Marsh und Leet 1966, Katsaras et al. 1984). Die ultrastrukturellen Veränderungen, die während der Reifungsphase an den Myofibrillen auftreten, wurden in dieser Arbeit schon an anderer Stelle beschrieben (vgl. Kap. 2.5). Diese Veränderungen, die schließlich auch die myofibrilläre Fragmentation verursachen, werden für die Längenzunahme der Sarkomeren und die Zunahme der Zartheit verantwortlich gemacht. Es sind hier vor allem die Desintegration der Z Scheiben und die Lösung der Aktin Filamente aus ihren Verankerungen an der Z Scheibe zu nennen. Die Dissoziation des Actomyosin- Komplexes soll nur von untergeordneter Bedeutung sein (Gotthardt et al. 1966, Davey und Dickson 1970, Katsaras et al. 1984). Die Sarkomerenlänge wird meist lichtmikrokopisch ermittelt, entweder an Fleischproben, die ähnlich wie zur MFI-Bestimmung homogenisiert wurden (Locker et al. 1959, Katsaras et al. 1984), oder an histologischen Schnitten (Gotthardt et al. 1966) oder aber an einzelnen herauspräparierten Muskelfasern (Davey und Dickson 1970, Kühne 1990). Darüber, ob eine Homogenisierung der Probe Einfluß auf die Sarkomerenlänge hat, gibt es in der Literatur unterschiedliche Aussagen (Voyle 1971, Pospiech und Honikel 1987). Swartz et al. (1993) untersuchten Rindermuskulatur mit Hilfe von Fluoreszenz- Mikroskopie, um mit fluoreszierenden Konjugaten von Myosin Subfragment 1,

65 2.9. FLEISCHFARBE 55 Alpha Actinin und Actin die Bindungsstellen in den Myofibrillen bei unterschiedlichen Sarkomerenlängen zu verdeutlichen. Voyle (1971) beschreibt als Alternative zur Lichtmikroskopie die Methode der Laser-Diffraktionsmessung. Dabei wird die Sarkomerenlänge mit Hilfe der Ablenkung eines monochromatischen He-Ne-Lasers (632,8 nm) durch das Streifengitter der Muskulatur gemessen. Pospiech und Honikel (1987) verglichen die lichtmikroskopische und die Lasermethode hinsichtlich ihrer Genauigkeit und fanden generell gute Übereinstimmung. Sie stellten fest, daß Diskrepanzen in den Ergebnissen auf der Verwendung unterschiedlicher Pufferlösungen bei der Aufbereitung der Proben beruhen und auf verschiedenen Berechnungsmethoden und gaben Hinweise, wie diese Mängel zu beheben seien. Zu Diskrepanzen kam es vor allem dann, wenn die Muskulatur stark verkürzt war. Sie empfahlen, die Laser-Messung als schnelles Screening Verfahren einzusetzen und die Ergebnisse lichtmikroskopisch zu überprüfen. Sie ließen allerdings die Frage offen, welcher der beiden Meßwerte der richtige ist und der wahren Sarkomerenlänge entspricht. 2.9 Fleischfarbe Da die Fleischfarbe für den Verbraucher ein wesentliches Kriterium bei der Kaufentscheidung ist, ist sie ein wichtiges Qualitätsmerkmal des Fleisches. Sie wird von verschiedenen Variablen wie Tierart, Alter, Fütterung, Temperatur, Verpackung und Verlauf der Glykolyse p.m. beeinflußt (Hamm 1975, Potthast 1986, Feldhusen et al. 1987). Diese Faktoren nehmen Einfluß auf Gehalt und Zustand des Muskelfarbstoffes Myoglobin. Dieser bestimmt in erster Linie neben strukturellen Eigenschaften von Muskelproteinen, die für die Reflexion des Lichts an der Oberfläche verantwortlich sind, den Farbeindruck. Weniger bedeutende Muskelfarbstoffe sind die Cytochrome und das Hämoglobin. Die Menge des im Muskel

66 56 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM vorhandenen Hämoglobins hängt vom Ausblutungsgrad des Tieres ab. Im allgemeinen wird die Fleischfarbe zu 95% vom Myoglobin und zu 5% vom Hämoglobin bestimmt (Potthast 1986). Myoglobin und Hämoglobin gehören zur Gruppe der Chromoproteide und sind in ihrem Aufbau eng verwandt. Das Myoglobin besteht aus einem Eiweißmolekül, dem Globin, und einer farbgebenden, prosthetischen Gruppe, dem Häm, und hat ein Molekulargewicht von Das Häm hat sowohl im Hämo- als auch im Myoglobin dieselbe chemische Zusammensetzung. Es besteht aus vier Pyrrolkernen (stickstoffhaltige Ringsysteme), die über Methinketten miteinander verknüpft sind. In der Mitte befindet sich ein zentrales, zweiwertiges Eisen-Ion, von dessen Koordinationsstellen nur vier durch den Pyrrolring besetzt sind. Die fünfte wird von einem Histidin-Rest des Globin- Moleküls eingenommen, wodurch die Verbindung zum Proteinteil des Moleküls hergestellt wird. An die letzte freie Bindungsstelle können gasförmige Stoffe wie O 2, NO oder CO angelagert werden. Das Myoglobin dient zur Speicherung und zum Transport des aus dem Blut aufgenommenen lebensnotwendigen Sauerstoffs zu den Mitochondrien der Muskelzelle. Die Farbe des Fleisches wird vom Oxidationszustand des Fe 2+ -Moleküls und vom Liganden an der sechsten Koordinationsstelle bestimmt. Die purpurrote Farbe von frisch aufgeschnittener Muskulatur kommt durch reduziertes Myoglobin mit Fe 2+ und unbesetzter sechster Koordinationsstelle zustande. Tritt dann unter dem Einfluß von Luftsauerstoff ein O 2 -Molekül an diese Stelle, entsteht das kirschrote Oxymyoglobin. Wird jedoch das Fe 2+ -Ion im reduzierten Myoglobin zu Fe 3+ oxidiert, entsteht grau-braunes Metmyoglobin. An der sechsten Koordinationsstelle sitzt dann ein H 2 O-Molekül (Hoffmann 1981, Fox 1987, Karlson 1988). Aufgrund der oben geschilderten Oxidationsvorgänge unterliegt die Farbe frischen Fleisches schnellen Veränderungen. Diese sind u.a. abhängig vom Sauerstoff- Partialdruck, dem ph-wert und der Temperatur. So tritt bei frischem Fleisch

67 2.9. FLEISCHFARBE 57 nach längerer Sauerstoffexposition eine Veränderung der Farbe von kirschrot nach graubraun durch Metmyoglobin-Bildung ein. Dies kann durch Reifung unter Vakuum verhindert werden, dabei werden auch nach längerer Reifungsdauer keine negativen Farbveränderungen festgestellt. Wird so gelagertes Fleisch dann an der Luft dem Sauerstoff ausgesetzt, nimmt es sehr schnell Sauerstoff auf und erhält so die gewünschte kirschrote Farbe des Oxymyoglobins. Mit der Dauer der Reifung können sogar die L*a*b*-Werte am frischen Anschnitt steigen. Die Ursache soll sein, daß die sauerstoffverbrauchenden Enzyme der tieferen Schichten mit fortschreitender Reifung inaktiviert werden. Dadurch kann dann, wenn das Fleischstück angeschnitten wird, mehr Oxymyoglobin gebildet werden (Augustini und Fischer 1998) Methoden zur Messung der Fleischfarbe Um festzustellen, zu welchem Anteil die Komponenten des Gesamtfarbkomplexes Myoglobin (Oxymyoglobin, Metmyoglobin und reduziertes Myoglobin) in einer Fleischprobe vorhanden sind, gibt es die Möglichkeit, die prozentualen Anteile reflexions-spektralphotometrisch zu ermitteln (Stewart et al. 1965, Snyder und Armstrong 1967, Feldhusen 1992). Diese Labormethode, die auch in der vorliegenden Arbeit verwendet wurde, ist aber sicher nicht für den routinemäßigen Einsatz am Schlachthof geeignet. Einfacher anzuwenden und von praktisch größerer Bedeutung sind Methoden, bei denen die Farbe, die Farbhelligkeit und, durch wiederholte Messungen, die Farbstabilität der Fleischoberfläche gemessen werden. Die objektive Bestimmung der Fleischfarbe kann spektralphotometrisch erfolgen (Klettner und Stiebing 1980). Die Spektralwertkurve, die sich nach Beleuchtung der Probe mit definier-

68 58 KAPITEL 2. WISSENSCHAFTLICHES SCHRIFTTUM tem Licht durch Reflexion ergibt, dient zur Berechnung der Normspektralwerte X, Y und Z nach DIN Die Messung der Farbhelligkeit wird seit langem als Kriterium zur Diagnose von PSE Fleisch beim Schwein eingesetzt, Geräte hierzu sind neben dem neueren Opto-Star Helligkeitsmeßgerät das breite Verwendung findende Göttinger Fotometer (Göfo). Dabei mißt eine Photozelle das vom Meßobjekt reflektierende Licht und überträgt es auf Skalenwerte von 1 (sehr hell) bis 100 (dunkel) (Feldhusen et al. 1987, Höreth und Dobrowolski 1994). Über die Messung der Fleischhelligkeit hinaus besteht die Möglichkeit, eine dem Farbempfinden des menschlichen Auges entsprechende Farbbeschreibung nach dem L*a*b*-System der CIE (Commission Internationale l Eclairage) vorzunehmen. Dabei werden aus den Normspektralwerten die Farbmeßzahlen L (Helligkeit), a (Rot- bzw. Grünwert) und b (Gelb- bzw. Blauwert) berechnet (DIN 6174). Ein L-Wert von 0 bedeutet schwarz, ein L Wert von 100 weiß, dazwischen liegen die Grautöne. Die a und b Werte, die den Farbton bestimmen, kommen hinzu. Ein positiver a-wert bedeutet einen überwiegenden Rotanteil, ein positiver b Wert bedeutet einen überwiegenden Gelbanteil (Feldhusen et al. 1987, Klettner 1989, Feldhusen 1992).

69 Kapitel 3 Eigene Untersuchungen 3.1 Material Die Untersuchungen wurden an Muskelproben aus dem M. longissimus dorsi von Rindern sowie am Blutserum der gleichen Tiere durchgeführt. Die Proben wurden von 16 bei der amtlichen Schlachttier und Fleischuntersuchung als tauglich beurteilten Mastbullen der Rasse Deutsche Rotbunte gewonnen. Die Mastbullen gehörten den Fleischigkeitsklassen U, R und O sowie den Fettgewebsklassen 2 und 3 an und hatten ein Zweihälftengewicht zwischen 335 und 450 kg. Ursprünglich standen für die Untersuchungen 19 Mastbullen zur Verfügung, die mit Tier 1 19 durchnumeriert wurden. Die Versuchsergebnisse von dreien der Tiere (Tier 4, 6 und 7) konnten nicht ausgewertet werden, beziehungsweise die Proben mußten verworfen werden. Bei Tier 4 wurde durch ein zu schnelles Herunterfahren der Kühlkammer ein Cold Shortening verursacht, bei den Tieren 6 und 7 kam es durch einen Fehler beim Einschweißen der Proben zu bakterieller Kontamination und Verderben der Proben. Im Rahmen der Hauptversuche wurden die Tiere 3 19 verwendet (exclusive Tiere 4,6 und 7, s.o.). Tier 1 und 2 wurden für 59

70 60 KAPITEL 3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN Vorversuche verwendet, von diesen Tieren wurden jedoch die Meßergebnisse von Leitfähigkeits und ph Wert-Messungen in die Auswertung mit einbezogen. Die Zahl der für die Untersuchungen verwendeten Proben ist daher unterschiedlich und wird bei den einzelnen Untersuchungen jeweils angegeben. 3.2 Versuchsplan Die Untersuchungen wurden von Juni bis Dezember 1994 im Zentrum für Lebensmittelwissenschaften, Zentrumsabteilung für Lebensmittelkunde, Fleischhygiene und -technologie sowie im Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt. Die Untersuchungen an den Muskelproben erfolgten 45 Minuten p.m. und dann am 2., 8., 14., 19.,23. und 27. Tag p.m. 3.3 Versuchsdurchführung Probengewinnung Das Untersuchungsmaterial wurde auf dem Schlachthof der Fleischversorgung Hannover GmbH im Rahmen der täglichen Schlachtungen gewonnen. Während des Blutentzuges wurde von den Tieren eine Blutprobe für die spätere Serumgewinnung genommen. Die Entnahme der Muskelproben erfolgte 45 Minuten p.m., direkt nach dem Wiegen, aus dem noch nicht gekühlten Tierkörper. Dabei wurde aus dem M. longissimus dorsi einer Tierkörperhälfte zwischen dem 7. und 12. Brustwirbel ein etwa 3000g schwerer Abschnitt herauspräpariert. Die Proben wurden dann zur Aufarbeitung ins Institut für Lebensmittelkunde transportiert.

71 3.3. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG Probenbearbeitung Muskelproben Im Institut wurde der aus dem M. longissimus dorsi entnommene Muskelstrang in sieben Teilstücke von jeweils g Gewicht zerlegt. Diese wurden durch Einschweißen in Kunststofffolienbeutel (KALLE Vacu-Beutel, 150 mm 300 mm, Fa. KALLE Folien, Wiesbaden) vakuumverpackt. Die Muskelproben wurden dann flach auf Edelstahltabletts gelegt und in einem Klimaprüfschrank (Klimaprüfschrank 1000 AB/20 J-S, Fa. Weiss Technik, Gießen) zunächst 24 Stunden lang bei +12 o C gelagert, um einer Kälteverkürzung vorzubeugen. Über den weiteren Versuchszeitraum betrug die Temperatur dann +2 o C Serum Bei der Schlachtung der Tiere wurden während des Blutentzuges Blutproben für die Serumgewinnung entnommen. Sie wurden gleich bei der Entnahme in die später verwendeten sterilen Zentrifugengläser (Glas Zentrifugengläser Duran Schott, 90 ml Fassungsvermögen) gefüllt und abgedeckt bei Zimmertemperatur gelagert. Nach dem möglichst erschütterungsfreien Transport ins Institut wurden die Gläser noch ein bis zwei Stunden stehengelassen, bis sich ein fester Blutkuchen gebildet hatte. Die Blutprobe wurde dann bei 5500 U/min (RZB = 4250 * g) 25 Minuten zentrifugiert (Heräus Christ Minifuge 2). Das entstandene Serum wurde in neue sterile Zentrifugengläser überpipettiert und abermals zentrifugiert, dieser Vorgang wurde bei Bedarf noch ein bis zweimal wiederholt. Das gewonnene Serum wurde dann in einen Erlenmeyerkolben überführt und gemeinsam mit den Muskelproben kühl gelagert.

72 62 KAPITEL 3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN Untersuchungsmethoden Chemikalien Die bei den Untersuchungen verwendeten Chemikalien stammten sämtlich, sofern nicht anders angegeben, von der Fa. Merck, Darmstadt. Die Chemikalien entsprachen dem Reinheitsgrad pro analysis (p.a.) Messungen der elektrischen Leitfähigkeit Die elektrische Leitfähigkeit von Muskulatur, Serum, Überstand und Tropfsaft wurde mit dem Conduktometer Digi LF 191 (Fa. WTW, Weilheim) mit daran angeschlossener Einstichelektrode LST/F für Muskulatur gemessen. Das Gerät verfügt über eine separate Einstichsonde für die Temperaturmessung und eine automatische Temperaturkompensation für den gemessenen Leitfähigkeitswert. Das Conduktometer wurde wöchentlich kalibriert. Bei der Messung an der Muskulatur wurde die Elektrode fünfmal quer zur Muskelfaserrichtung eingestochen, aus den Meßergebnissen wurde jeweils der Mittelwert gebildet. Leitfähigkeit der Muskulatur Die Leitfähigkeit der Muskulatur wurde zu den oben genannten 7 Meßzeitpunkten an Proben von 16 Tieren untersucht (Tier Nr. 1 3, 5, 8 19), es ergab sich also eine Gesamtzahl von 112 untersuchten Muskelproben. Bei der Messung an der Muskulatur wurde die Elektrode fünfmal quer zur Muskelfaserrichtung eingestochen, aus den 5 Meßergebnissen wurde jeweils der Mittelwert gebildet. Leitfähigkeit des Serums Die Leitfähigkeit wurde an Proben des bei der Schlachtung gewonnenen Serums von allen 19 Tieren gemessen. Die erste Messung fand am 2. Tag p.m.

73 3.3. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG 63 nach der Serumgewinnung statt. Danach wurde das Serum im Kühlschrank gelagert und es wurden zu Kontrollzwecken parallel zur Untersuchung der Muskelproben jeweils zu den übrigen Untersuchungszeitpunkten weitere LF- Messungen an diesen gelagerten Serumproben durchgeführt. Vor der LF-Messung wurde die Elektrode gründlich mit Alkohol desinfiziert, um eine bakterielle Kontamination des Serums zu vermeiden. Die LF-Messung wurde mit der gleichen Elektrode durchgeführt, die auch zur Leitfähigkeitsmessung an der Muskulatur benutzt wurde (Conduktometer Digi LF 191 mit Einstichelektrode LST/F, Fa. WTW, Weilheim). Um Meßungenauigkeiten durch Bewegungen der Elektrode zu vermeiden, wurde die Elektrode an einem Stativ fixiert und die Serumprobe im Erlenmeyerkolben so daruntergestellt, daß die Leitfähigkeit der Probe bei fünf verschiedenen Eintauchtiefen gemessen werden konnte. Aus den Meßergebnissen wurde jeweils der Mittelwert gebildet. Leitfähigkeit des Muskel-Homogenat-Überstandes Prinzip Ziel dieser Methode war es, die Leitfähigkeit eines Mediums zu messen, das die Summe der in extra- und intrazellulärer Flüssigkeit des Muskels enthaltenen freien Ionen enthält, um diese mit der elektrischen Leitfähigkeit des intakten Muskels zu vergleichen. Darüberhinaus sollte dieses Medium auf seinen Gehalt an den mengenmäßig am häufigsten in extra- und intrazellulärer Flüssigkeit enthaltenen Elektrolyten, nämlich Kalium-, Natrium- und Chlorid-Ionen analysiert werden, um diese Elektrolytkonzentrationen mit denen der extra- und intrazellulären Kompartimente des Muskels vergleichen zu können. Um ein solches Medium zu erhalten, mußte unter Zerstörung des natürlichen

74 64 KAPITEL 3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN Zellverbandes ein Gemisch aus extra- und intrazellulärer Flüssigkeit hergestellt werden. Probenaufbereitung Um ein solches Gemisch zu erhalten, wurde aus Muskelproben ein Homogenat hergestellt und die enthaltene Flüssigkeit abzentrifugiert. Dazu wurde 10 g sorgfältig von Fett und Bindegewebe befreite Rindermuskulatur zunächst auf Erbsengröße zerschnitten und dann mit einer Moulinette (Fa. Moulinex) vorzerkleinert. Der zerkleinerten Muskulatur wurden dann in einem weitlumigen Zentrifugenglas 15 ml Aqua dest. zugesetzt, dann wurde sie mit einem Ultra Turrax (Fa. Jahnke und Kunkel GmbH, Staufen) 30 Sekunden lang auf Stufe 5,5 homogenisiert. Vom Stab des Ultra-Turrax wurde daran hängengebliebenes Bindegewebe entfernt und zum übrigen Homogenat gegeben. Dann wurde der Stab mit 5 ml Aqua dest. abgespült, so daß dem Gemisch nun insgesamt 20 ml Aqua dest. zugesetzt worden waren. Diese Proben wurden dann bei 5000 U/min (RZB = 1500 * g) 10 min lang zentrifugiert (Hereaeus Christ Cryofuge 20-3) und von dem entstandenen Überstand das auf der Oberfläche schwimmende Fett vorsichtig entfernt. Der Überstand wurde dann in ein weiteres Zentrifugenglas dekantiert, in dem dann die Leitfähigkeits- und ph-wert-messungen stattfanden. Zahl untersuchter Proben Die Leitfähigkeit des Homogenat-Überstandes wurde an Proben von 13 Tieren gemessen. Da in Vorversuchen geklärt werden konnte, daß die LF des Überstandes recht konstant blieb, wurde nur an 3 Untersuchungszeitpunkten gemessen, nämlich

75 3.3. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG 65 am 2., 19. und 27. Tag p.m.. Es wurden also insgesamt 39 Proben untersucht. Messung Die LF-Messung wurde ebenfalls mit dem Conduktometer Digi LF 191 und der Einstichelektrode LST/F durchgeführt. Um Meßungenauigkeiten durch Bewegungen der Elektrode zu vermeiden, wurde auch das Zentrifugenglas mit der Probe am Stativ fixiert und die Elektrode dann so angeschraubt, daß die Leitfähigkeit der Probe bei fünf verschiedenen Eintauchtiefen gemessen werden konnte. Aus den Meßergebnissen wurde jeweils der Mittelwert gebildet. Die gemessenen Werte wurden dann noch rechnerisch korrigiert, um die Verdünnung durch das bei der Probenaufbereitung zugesetzte Aqua dest. wieder herauszurechnen. Bei der oben noch beschriebenen Analyse der Elektrolyte wurde bei der Untersuchung des Überstandes der Verdünnungsfaktor auf die gleiche Weise kompensiert. Prüfung des Einflusses von Proteinen auf die LF des Überstandes Prinzip Dieser Versuch sollte klären, wieweit die elektrische Leitfähigkeit nicht nur von den freien beweglichen Ionen in der Lösung beeinflußt wird, sondern auch von Makromolekülen wie Proteinen. Dazu wurde erstens der wie bereits beschrieben hergestellte Überstand von den darin enthaltenen Eiweißen befreit, die LF dieses enteiweißten Überstandes wurde mit der vorher gemessenen Leitfähigkeit des Überstandes verglichen. Zweitens wurde die LF einer Lösung gemessen, die kleinere Moleküle, nämlich Aminosäuren in unterschiedlichen Konzentrationen, enthielt.

76 66 KAPITEL 3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN Probenzahl Die Zahl der für diesen Versuch aufbereiteten und untersuchten Proben entspricht der oben für die Untersuchung des Homogenat-Überstandes angegebenen. Probenaufbereitung Um den Überstand so weitgehend wie möglich von Eiweißen zu befreien, wurde er nach der ersten LF-Messung im Wasserbad zwei Minuten lang bis zum Sieden erhitzt. Das ausgefallene denaturierte Eiweiß wurde danach 10 min lang bei 6000 U/min abzentrifugiert. Der klare enteiweißte Überstand, den man dann erhielt, wurde in ein weiteres Zentrifugenglas dekantiert, in dem dann die LF-Messung in der beschriebenen Weise stattfand. Weiterhin wurde eine 0,01molare KCl-Lösung mit bekannter Leitfähigkeit (LF = 5,24 ms/cm), wie sie auch zur Kalibrierung des LF Geräts verwendet wurde, mit steigenden Konzentrationen (0,1 1,0%) eines Eiweißhydrolysats aus tierischem Eiweiß, das bis zu freien Aminosäuren aufgeschlossen worden war, versetzt. Die Leitfähigkeit dieser Lösungen wurde dann in der beschriebenen Weise gemessen. Leitfähigkeitserhöhung nach mechanischer Belastung Dieser Versuch wurde im Anschluß an die anderen Hauptversuche mit zusätzlich genommenen Muskelproben durchgeführt. Es sollte hierbei untersucht werden, wie die elektrische Leitfähigkeit des Fleisches, über die Reifungsdauer von 27 Tagen betrachtet, nach definierter mechanischer Belastung ansteigt. Material und Probenaufbereitung Die Untersuchungen wurden an Muskelproben aus dem M. longissimus

77 3.3. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG 67 dorsi von Rindern durchgeführt. Die Proben wurden von 8 bei der amtlichen Schlachttier- und Fleischuntersuchung als tauglich beurteilten Mastbullen der Rasse Deutsche Rotbunte gewonnen. Die Mastbullen gehörten den Fleischigkeitsklassen E und U an und der Fettgewebsklasse 3 an. Bei der Probenentnahme wurde ein ca. 1,5 kg schweres Stück des M. longissimus dorsi direkt nach der Schlachtung entnommen und in 7 Scheiben geschnitten, die analog zu den anderen Versuchen direkt nach der Schlachtung und dann am 2., 8., 14., 19., 23. und 27. Tag p.m. untersucht werden sollten. Es wurden also insgesamt 48 Muskelproben untersucht. Die Stücke wurden in Folienbeutel eingeschweißt und wie die anderen Proben zunächst 24 Stunden lang bei + 12 o C gelagert, über den weiteren Versuchszeitraum betrug die Temperatur dann + 2 o C. Versuchsdurchführung Um eine definierte mechanische Belastung zu erzeugen, wurden die Muskelproben in die rotierende Trommel eines Tumblers gelegt, der sich mit 25 U/min drehte. Um Verschmutzungen des Gerätes zu vermeiden, wurden die Proben locker in einen Plastikbeutel gepackt. Die auf dem Boden der Trommel liegenden Muskelstücke wurden durch die Drehbewegung des Gerätes fast bis um 180 o nach oben befördert, um dann über eine Strecke von ca. 50 cm wieder auf den Boden des Gerätes zu fallen, dieser Vorgang wiederholte sich entsprechend der Rotation der Trommel 25mal pro Minute. Die Leitfähigkeit der Muskulatur wurde vor dem Tumbeln unmittelbar nach der Entnahme aus dem Folienbeutel gemessen, dann wurde die LF nach 30 sec, 1 min und 2 min Tumbeln gemessen. Der Ablauf war also: Messung der LF, dann

78 68 KAPITEL 3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN 30 sec Tumbeln, erneute Messung, nochmals 30 sec Tumbeln, erneute Messung, nochmals 1 min tumbeln, letzte LF-Messung Analyse der Elektrolyte Um eine Beziehung zwischen der Leitfähigkeit der untersuchten Flüssigkeiten und ihrem Gehalt an freien beweglichen Ionen herstellen zu können, wurden Serum, Überstand und Tropfsaft auf ihren Gehalt an den mengenmäßig am häufigsten vertretenen Ionen, nämlich Na +, K + und Cl untersucht. Die hierfür jeweils genommenen Proben von Serum, Überstand und Tropfsaft entsprechen zahlenmäßig den Angaben für die anderen an diesen Flüssigkeiten vorgenommenen Untersuchungen. Die Na + und K + -Analyse erfolgte flammenfotometrisch (FLM 3, Fa. Radiometer, Willich). Der Meßbereich für das jeweilige Element wurde mit Standardlösungen, die jeweils den stark unterschiedlichen Na K Verhältnissen von Serum, Tropfsaft und Überstand angepaßt waren, geeicht. Der Chloridgehalt wurde coulometrisch bestimmt (CMT 10 - Chloridtitrator, Fa. Radiometer, Willich), die Nachweisgrenze dieser Methode liegt bei 0,1 mmol/l ph-wert Der ph Wert der Muskelproben und des Serums wurde mit dem elektrischen ph-meter (ph 530, Fa. WTW, Weilheim) in Kombination mit einer ph Einstichelektrode (406-M6 KN2, Fa. INGOLD Meßtechnik, Steinbach/Ts.) und angeschlossenem Temperaturfühler für die Temperaturkompensation gemessen. Die Messungen wurden parallel zu den LF-Messungen an der Muskulatur ebenfalls an Proben von 16 Tieren zu allen 7 Untersuchungszeitpunkten durchgeführt, sodaß sich eine Gesamtzahl von 112 untersuchten Proben ergibt. Es fanden dabei an jeder Probe fünf ph Wert Messungen an der Oberfläche statt, aus denen der

79 3.3. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG 69 Mittelwert gebildet wurde, im Serum wurde einmal durch Eintauchen gemessen. Die Zahl der untersuchten Serumproben entspricht ebenfalls der der Serumproben, an denen die Leitfähigkeit gemessen wurde Tropfsaftverlust Der Tropfsaftverlust wurde an Proben von 14 Tieren (Tier Nr. 3, 5, 8 19) an den 6 Untersuchungszeitpunkten vom Tag p.m. bestimmt, es wurden also 84 Proben gewonnen. Für die Bestimmung des Tropfsaftverlustes wurde die Muskelprobe direkt nach dem Einschweißen in den Folienbeutel gewogen und das vorher festgestellte Gewicht des Beutels von diesem Wert subtrahiert. Am jeweiligen Untersuchungstag wurde die Muskelprobe dann aus dem Folienbeutel, in dem der entstandene Tropfsaft zurückblieb, genommen, vorsichtig trockengetupft, sofort gewogen und der Tropfsaftverlust in Prozent des Anfangsgewichtes berechnet. Der im Beutel gewonnene Tropfsaft wurde dann zur Aufbewahrung für die weiteren Untersuchungen in Kunststofffläschchen überführt Extrazellulärer Raum Prinzip Um die Größenveränderungen des extrazellulären Raumes post mortem verfolgen zu können, wurden zu den jeweiligen Untersuchungszeitpunkten histologische Gefrierschnitte der Muskulatur angefertigt. Diese Schnitte wurden gefärbt und dann mit Hilfe eines Photomikroskops fotografiert, von den Negativen wurden Papierbilder abgezogen. Diese Farbfotografien wurden dann zur Erfassung der Größe des extrazellulären Raumes mit einem

80 70 KAPITEL 3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN Farb-Scanner in einen Personal Computer eingespeichert, auf dem sie dann mit Hilfe zum Teil selbstgeschriebener Programme ausgewertet wurden. Es wurden insgesamt 123 Farbfotos ausgewertet, die von histologischen Schnitten von Muskelproben von 8 Tieren (Tier Nr ) zu den 6 Untersuchungszeitpunkten vom Tag p.m. stammen. Durchführung Histologie Bei der Anfertigung der histologischen Schnitte wurde nach einer leicht modifizierten Methode nach Penny (1977) vorgegangen. Dazu wurden aus der Muskulatur schonend ca mm 3 große Proben längs zur Faserrichtung herauspräpariert und in flüssigem Stickstoff tiefgefroren. Um die Aufbewahrung im Stickstoff zu erleichtern und um sie beschriften zu können, wurden die Proben auf schmalen Holzspateln festgebunden. Nachdem die Muskelproben vollständig durchgefroren waren, wurden sie aus dem Stickstoff genommen und, um ein Antauen zu verhindern, möglichst schnell in einen Kryostaten (Kryostat 1720, Leitz Wetzlar) verbracht, in dem bei 20 o C histologische Schnitte von 8 µm hergestellt wurden. Diese Schnitte wurden einer H.E. Färbung unterzogen und nach dem Trocknen mit Hilfe von Histokitt und Deckgläschen eingedeckt. Die gefärbten Schnitte wurden dann mit einem Photomikroskop (Olympus BH-2 Mikroskop, Fa. Olympus Optical Co., Hamburg) lichtmikroskopisch untersucht und bei 25, 40 und 156facher Fotovergrößerung fotografiert. Das Mikroskop war mit einem Kameraaufsatz mit automatischem Photomikroskopier-System versehen (automatische Kamera PM C-35 AD-4, Olympus Automatic Photomicrographic System PM-10ADS). Von den Negativen (Farbfilm von Kodak, Kodacolor Gold 100 mit 100

81 3.3. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG 71 Asa) wurden für die weitere Verarbeitung Papierbilder im Format 13 x 18 cm abgezogen. Auswertung der Bilder auf dem PC Die Farbfotos der histologischen Muskelschnitte wurden zunächst mit einem Farbscanner (Mikrotek Farbscanner) und der Software Adobe Photoshop Ltd. Edition D1-2.5 (Fa. Adobe, Unterschleißheim ) in einen PC eingespeichert. Dies geschah mit einer Auflösung von 100 dpi und 24 Bits/Pixel. Das bedeutet, daß das Farbbild in 100 Punkte pro Zoll zerlegt und von jedem dieser Pixel der Farbwert bestimmt wurde, dieser Farbwert wurde in seine Rot, Grün und Blauanteile aufgeteilt und diese Farbwerte, für jede Farbe ein Byte pro Pixel, wurden gespeichert. Diese Daten wurden auf einem 486er PC unter dem Betriebssystem Linux mit Hilfe zum Teil selbstgeschriebener, zum Teil fertiger Programme ausgewertet und der auf den Fotos abgebildete extrazelluläre Raum berechnet. Die beschriebene Aufspaltung der Bilder in ihre Farbanteile ermöglichte es dann, nicht nur das gesamte aus Rot, Grün und Blau Anteilen bestehende Bild auf dem Computer-Monitor darzustellen, sondern auch, jeden Farbanteil einzeln abzubilden. Bei einer Abbildung des Grün-Anteils erkennt man dann das Bild des Muskelschnittes, zusammengesetzt aus vielen Grüntönen von hell bis dunkelgrün, ein solches Bild zeigt Abb Wenn man diese Darstellungsweise für jeden der Farbanteile wählt, wird deutlich: Der Rotanteil ist im ECR fast genau so groß wie im ICR. Der Blauanteil zeigt deutliche Unterschiede zwischen ICR und ECR.

82 72 KAPITEL 3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN Der Grünanteil zeigt deutlichere Unterschiede als der Blauanteil. Dies ließ den Grünanteil für die möglichst genaue Festlegung der Zellgrenzen im Bild am geeignetsten erscheinen. Dies wird in Abb. 3.1 illustriert. An den Zellrändern geht die Grün-Intensität nun, wie erwähnt, von dunkelgrün (IZR) nach hellgrün (EZR) über, ohne daß sich die Zellgrenzen innerhalb dieses Überganges exakt festlegen ließen. Da es aber für die Berechnung des EZR erforderlich ist, die Zellgrenzen möglichst genau zu bestimmen, wurde für jedes Bild einzeln der Mittelwert der Helligkeitswerte der in diesem Übergangsbereich befindlichen Pixel bestimmt. Danach wurde der Grün Helligkeits Wert jedes einzelnen Pixels des gesamten Bildes ausgezählt und jedes Pixel, dessen Helligkeitswert größer als dieser Mittelwert war, dem ECR zugerechnet und alle dunkleren Pixel dementsprechend dem ICR. Die beschriebene Methode wurde an Bilddateien bekannten Inhalts validiert. Dazu wurden Bilder mit pseudozufällig errechneten Bildpunkten erzeugt, parallel dazu wurden die Farbwerte der Pixel in eine Textdatei geschrieben. Das Auswertungsprogramm musste anschließend aus der Bilddatei die Zahlenwerte der Textdatei reproduzieren können.

83 3.3. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG Zartheitsparameter 1. Myofibrillärer Fragmentationsindex Der Myofibrilläre Fragmentationsindex (MFI) wurde als photometrische Trübungsmessung mit einer modifizierten Methode nach Møller et al. (1973), Olson et al. (1976) und Kühne (1990) ermittelt. Es wurden Muskelproben von 13 Tieren (Tier Nr. 5 und 8 19) an den 6 Untersuchungszeitpunkten Tag p.m. untersucht, die Zahl untersuchter Proben betrug also insgesamt 78. Die Proben wurden folgendermaßen verarbeitet: Einwaage von 2 g fett und bindegewebsfreier, auf Erbsengröße zerkleinerter Rindermuskulatur in ein Zentrifugenglas. Auffüllen mit 20 ml Puffer, Zusammensetzung nach Møller et al. (1973) und Olson (1976): 100 mm KCl 20 mm K 2 HPO 4 1 mm EDTA auf ph = 7,0 eingestellt. 30 Sekunden mit einem Ultra Turrax auf Stufe 5,5 zerkleinern. Zentrifugieren bei 3000 U/min (RZB = 1000 * g), 15 Minuten lang (Zentrifuge von Heraeus Christ, Cryofuge 20-3). Überstand dekantieren, mit 10 ml Puffer auffüllen und den Bodensatz mit Hilfe eines kleinen Spatels vollständig resuspendieren. Filtern durch ein metallenes Sieb mit ca. 0,5 mm Maschenweite in ein weiteres Zentrifugenglas, Ausspülen des ersten Zentrifugenglases und des Siebes mit 10 ml Puffer.

84 74 KAPITEL 3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN Dieser Vorgang (Sedimentation, Dekantieren des Überstandes, Resuspension und Filtration) wird noch dreimal wiederholt. Nach dem letzten Zentrifugieren wird nur noch einmal resuspendiert (die Filtration findet nicht mehr statt). An dieser Suspension wird die Biuret Eiweiß Bestimmung durchgeführt. 0,85 ml der Eiweiß Suspension und 0,15 ml einer 3molaren Trichloressigsäure in ein Zentrifugenglas pipettieren. Zentrifugation bei 6000 U/min, 10 min lang. Überstand verwerfen, den Niederschlag in 5 ml Biuret Lösung lösen. Nach 30 min und vollständigem Lösen des Niederschlags mit Aqua dest. auf 10 ml auffüllen. Die Extinktion dieser Lösung wird im Photometer (Spectralphotometer Hitachi ) bei 546 nm gemessen (Leerwert: 5 ml Biuret-Lösung + 5 ml Aqua dest.). Der Proteingehalt der Lösung wird nach folgender Formel berechnet: Extinktion 17 0, 85 = mg Protein/ml Einstellen des Proteingehaltes der Suspension auf 0,4 mg/ml durch Verdünnen mit Puffer. Photometrische Extinktionsmessung (Trübungsmessung) bei 540nm gegen den Puffer als Leerwert. Der gemessene Extinktionswert dient als Maß für den MFI. 2. Sarkomerenlänge Die Sarkomerenlängen wurden lichtmikroskopisch mit Hilfe eines modifizier-

85 3.3. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG 75 ten Verfahrens nach Kim (1984) und Kühne (1990) gemessen. Es wurden an 6 Untersuchungszeitpunkten Proben von 12 Tieren (Tier Nr. 3, 5, 8 17) untersucht, sodaß sich eine Gesamtzahl von n = 72 untersuchten Proben ergibt. Dazu wurden aus der Probe drei Muskelstücke von etwa 2 cm Länge und 3 4 mm Durchmesser herauspräpariert und zur Fixation in eine Tüpfelschale gegeben. Die Fixationslösung setzte sich zusammen aus Phosphatpuffer 0,2 M mit ph = 7,0 (KH 2 PO 4 und Na 2 HPO 4 im Verhältnis 60:40) 2%iger Glutardialdehyd-Lösung Saccharose 0,2 M Die Fixationslösung wurde auf einen ph von 7,0 eingestellt. Nach 45-minütiger Fixationsdauer wurden die Proben entweder sofort untersucht oder zur Aufbewahrung in kleine Kunststofffläschchen verbracht und bei 20 o C eingefroren. In Vorversuchen war vorher sichergestellt worden, daß das Tiefkühlen der fixierten Proben das Untersuchungsergebnis nicht beeinträchtigt, dazu waren einige Proben sofort nach dem Fixieren untersucht und dann tiefgefroren worden. Einige Tage später wurden diese tiefgekühlten Proben dann nochmals untersucht, wobei die gleichen Ergebnisse ermittelt wurden. Für die Untersuchung wurden dann aus den frisch fixierten bzw. aufgetauten Proben schonend mehrere Muskelfasern herauspräpariert, auf einen Objektträger gebracht und mit einem Tropfen Aqua dest. sowie einem Deckgläschen bedeckt. Die Deckgläschen wurden seitlich mit einem Streifen Tesafilm fixiert. Die mikroskopische Untersuchung erfolgte mit einem

86 76 KAPITEL 3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN Lichtmikroskop (Fa. Leitz, Wetzlar) mit 100 Objektiv. Zur Messung wurde ein Schrauben Mikrometerokular der Fa. Leitz mit 12,5facher Vergrößerung verwendet (Vergrößerung insgesamt 1250fach). Zur Bestimmung der Sarkomerenlängen wurden zwölf Messungen jeweils an einer Gruppe von zehn Sarkomeren an verschiedenen Fasern vorgenommen und der arithmetische Mittelwert gebildet. 3. Kochsaftverlust Für die Bestimmung des Kochsaftverlustes und die anschließende Messung der Scherkraft wurden von den Muskelproben weitgehend fett und bindegewebsfreie gleichförmige Stücke von ca. 200 g Gewicht abgetrennt. Dies geschah an den 6 Untersuchungszeitpunkten vom Tag p.m. an Muskelproben von 13 Tieren (Tiere Nr. 5 und 8 19). Diese Proben wurden exakt gewogen und in luftdichte, hitzebeständige, eng anliegende Polyäthylenbeutel vakuumverpackt und in einem Wasserbad (Schüttelwasserbad Typ 3047, Fa. Köttermann, Hänigsen) zwei Stunden lang bei 80 o C erhitzt. Dieses Erhitzungsverfahren hatte sich als am geeignetsten erwiesen, um die mit 200 g recht großen Muskelproben schonend auf eine Kerntemperatur von ca. 70 o C gleichmäßig durchzuerhitzen; bei dieser Temperatur sind dann nach Seuss und Honikel (1987) weit über 90 % der Proteine in der Muskulatur denaturiert. Danach kühlten die Beutel im Kühlschrank ab. Die Auswaage fand dann nach Abgießen des entstandenen Kochsaftes, Abtupfen des Fleisches mit einem Handtuch und einer ca. 15 minütigen Trockenphase bei Zimmertemperatur statt. 4. Scherkraft Für die Scherkraftmessung wurden die für dieselben, für die Kochverlust-

87 3.3. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG 77 Bestimmung bereits erhitzten Proben verwendet; die Probenanzahl ist entsprechend. Nach der Bestimmung des Kochsaftverlustes und dem Abtrocknen bei Zimmertemperatur wurden mit einer Metallstanze längs zur Faserrichtung des Fleisches etwa 4 5cm lange Zylinder mit einem Durchmesser von 12 mm aus den Proben ausgestochen. An diesen Proben wurde eine Textur-Profil-Analyse mithilfe des Texture Analyzers TA-XT2 (Fa. Stable Micro Systems, Haslemere, Surrey, England) durchgeführt. Der Texture Analyzer war zu diesem Zweck mit einem Aufsatz in Form eines metallenen Scherblattes mit einer dreieckigen Aussparung versehen worden. Die wie oben beschrieben aufbereiteten Proben (zylinderförmig) wurden längs unter diese Aussparung des Scherblattes gelegt, soddaß sie quer zur Faserrichtung geschert und teils auch durchtrennt wurden. Die Deformationsgeschwindigkeit betrug 2 mm/sec. Die Auswertung der gemessenen Daten erfolgte auf einem angeschlossenen PC mit der zum Texture Analyzer gehörigen Software XT.RA Dimension. Die Deformation der Proben wurde dabei in einem Kraft [N] / Weg [%] Diagramm dargestellt. Der Meßwert der Kraft in Newton an der ersten Spitze dieser Kurve ( Peak 1 ) dokumentiert dabei die Bruchfestigkeit des Untersuchungsguts und wurde als Maß für die Scherkraft herangezogen Farbe Bestimmung der prozentualen Myoglobinanteile Prinzip Bei diesem Versuch sollte festgestellt werden, wie sich das Verhältnis von reduziertem Myoglobin zu Oxymyoglobin während der Fleischrei-

88 78 KAPITEL 3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN fung bei den eingeschweißten Proben ändert und wie sich der Oxymyoglobin Anteil bei den Proben nach Zutritt von Luftsauerstoff ändert. Dazu wurde die prozentuale Verteilung der Komponenten des Gesamtfarbkomplexes Myoglobin (Oxymyoglobin, Metmyoglobin und reduziertes Myoglobin) reflexions-spektralphotometrisch nach der Methode von Stewart et al. (1965) mit einer Ergänzung von Snyder und Armstrong (1967) ermittelt. Dieses Verfahren, bei dem der sogenannte K/S-Wert bestimmt wird, hat den Vorteil, daß die Pigmentzusammensetzung der Muskeloberfläche erfaßt wird, ohne die Muskelstruktur durch destruierende Maßnahmen zu verändern. Unter K/S- Wert versteht man den Quotienten aus Absorptions- und Streuungs- Koeffizienten pro Einheit Gewebedicke. Es werden an der Oberfläche der Fleischprobe Reflexionswerte bei drei verschiedenen Wellenlängen gemessen. Snyder und Armstrong (1967) empfahlen die Messung bei 572 nm, 525 nm und 474 nm, weil es sich bei diesen Wellenlängen um sogenannte Isobestic Points handelt. Dies sind Wellenlängen, an denen die Absorptionsindices der Pigmentanteile gleich sind. Fehler durch Unebenheiten oder Inhomogenitäten der Probenoberfläche werden so minimiert. Zahl der Proben Die Messungen wurden an den 6 Untersuchungszeitpunkten vom Tag p.m. an Muskelproben von 13 (Tiere Nr. 5 und 8 19) Tieren durchgeführt, sodaß sich eine Gesamtzahl von n = 78 Proben ergibt. Durchführung Es wurde ein Teil der Muskelprobe verwendet, die auch für die anderen Versuche (Messung von LF, MFI, Scherkraft usw.) benutzt wurde. Un-

89 3.3. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG 79 mittelbar nach der Entnahme der Fleischprobe aus dem Folienbeutel wurden an der Oberfläche zwei runde Proben mit einem Durchmesser von 20 mm und einer Dicke von 0,7 mm ausgestanzt. Die eine Probe wurde für die spätere Vergleichsmessung auf einem Tablett zur Seite gelegt, wo ihre Oberfläche dem Luftsauerstoff ausgesetzt war. Bei der anderen Probe wurde sofort die Reflexion der Muskeloberfläche gegenüber einem Weißstandard mit dem Spektralphotometer (Hitachi , Fa. Hitachi, Hannover) bei 474 nm, 525 nm und 572 nm gemessen, unter Verwendung eines speziell für die Messung diffuser Reflexionen konzipierten Aufsatzes (Ulbrichtsche Kugel). Nach 60 min Wartezeit wurde mit der beiseite gelegten Probe ebenso verfahren. Die den gemessenen Reflexionswerten entsprechenden K/S-Werte (Koeffizient aus Absorptions- (K) und Streuungswert (S) ) wurden nach einer Tabelle von Judd (1952) bestimmt. Anhand von Eichgeraden, die in Versuchen von Feldhusen (1992) und Warnatz (1993) erstellt worden waren, wurde aus dem Quotienten K/S 474 : K/S 525 der Myoglobin- Anteil und aus dem Quotienten K/S 572 : K/S 525 der Metmyoglobin- Anteil in % errechnet. Der Oxymyoglobin-Anteil errechnete sich dann durch Subtraktion der anderen beiden Komponenten von 100%. Oberflächenfarbe Die Farbe der Muskeloberflächen wurde mit dem Minolta Chroma-Meter CR 100 (Fa. Minolta, Ahrensburg) nach dem L*a*b-System mit der CIE Normlichtart D 65 gemessen (DIN 6174). Der Meßkopf des Gerätes hatte eine runde Meßfläche mit einem Durchmesser von 1,1 cm. Die Messungen wurden an den 6 Untersuchungszeitpunkten vom Tag p.m. an Muskelproben von 13 (Tiere Nr. 5 und 8 19) Tieren durch-

90 80 KAPITEL 3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN geführt, sodaß sich eine Gesamtzahl von n = 78 Proben ergibt. An jeder Probe wurden drei Messungen durchgeführt, aus denen der arithmetische Mittelwert gebildet wurde. 3.4 Statistische Auswertung Für die Auswertung des zeitabhängigen Verlaufs der Meßgrößen elektrische Leitfähigkeit, Elektrolytkonzentrationen, Tropfsaftverlust, ph-wert, MFI, Sarkomerenlänge, Kochsaftverlust, Scherkraft, L*a*b*-Wert und Oxymyoglobin-Anteil in der Muskulatur wurden die jeweiligen arithmetischen Mittelwerte (je nach Meßgröße Proben je Meßzeitpunkt, vgl. Kap. 4) und die Standardabweichungen berechtnet. In den entsprechenden Abbildungen (vgl. Kap. 4) sind die Mittelwerte gegen die Zeit (Tage p.m.) aufgetragen, die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Um Zusammenhänge zwischen den einzelnen Meßgrößen zu aufzuzeigen, wurden ausgesuchte Kombinationen, bei denen dies sinnvoll erschien, gegeneinander aufgetragen (vgl. Tab. 4.1 und zum Beispiel 4.23) und lineare Regressionsanalysen durchgeführt (vgl. Harms 1992). Der Korrelationskoeffizient r ist eine dimensionslose Größe zwischen -1 und +1. Ein Korrelationskoeffizient nahe ±1 gibt an, daß die Regressionsgerade den Zusammenhang der beiden Meßgrößen gut beschreibt. Ein betragsmäßig kleiner Wert r deutet darauf hin, daß die verwendete Regressionsgerade den Zusammenhang wenig oder nicht widerspiegelt. Es wurde allerdings deutlich, daß die lineare Regression nicht in allen Fällen nicht die optimale Wahl ist, den Zusammenhang zweier Größen zu beschreiben (vgl. Abb. 4.25); jedoch mangelte es in diesem Fall an einem Modell, das einen geeigneteren Kurvenverlauf vorgab. Die Geradengleichung der Regressionsgeraden sowie der Korrelationskoeffizient sind bei den einzelnen Abbildungen angegeben.

91 3.4. STATISTISCHE AUSWERTUNG 81 Die Auswertung erfolgte auf einem Personal Computer unter dem Betriebssystem Linux mit den Programmen bc (GNU Software) und xmgrace (Software aus dem Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel).

92 82 KAPITEL 3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN Abbildung 3.1: Das Bild des histologischen Schnittes wird in seinen Rot, Gru n und Blauanteil zerlegt und es wird gleichzeitig aus den drei Farben ein Schwarzweißbild gemischt. Entlang der schwarzen Linie durch alle vier Bilder wird die Intensita t der jeweiligen Farbe ermittelt und in der unteren Grafik gegen die Koordinate aufgetragen. Der Gru nanteil zeigt die deutlichsten Unterschiede zwischen ICR und ECR.

93 Kapitel 4 Ergebnisse Für die Untersuchungen standen ursprünglich Muskelproben von 19 Mastbullen zur Verfügung (vgl. Kap. 3), die mit Tier 1 19 durchnumeriert wurden. Die Versuchsergebnisse von dreien der Tiere (Tier 4, 6 und 7) konnten nicht ausgewertet werden beziehungsweise die Proben mußten verworfen werden. Bei Tier 4 wurde durch ein zu schnelles Herunterfahren der Kühlkammer ein Cold Shortening verursacht, bei den Tieren 6 und 7 kam es durch einen Fehler beim Einschweißen der Proben zu bakterieller Kontamination und Verderben der Proben. Aus organisatorischen Gründen konnte auch nicht jede Untersuchung an jeder Probe durchgeführt werden, da zum Teil einzelne Muskelproben durch Luftziehen der Plastikbeutel verdorben waren. Die genaue Anzahl der untersuchten Proben ist daher bei den einzelnen Untersuchungen vermerkt. 4.1 Ergebnisse der Leitfähigkeitsmessungen Die in der Rindermuskulatur gemessenen LF Werte stiegen von 2,6 ms/cm unmittelbar nach der Schlachtung im Laufe der Fleischreifung auf 12,2 ms/cm am 27. Tag p.m. an. Es wurden Proben von 16 Tieren untersucht, die Standardab- 83

94 84 KAPITEL 4. ERGEBNISSE weichung lag dabei zunächst nur bei 0,2 0,5 ms/cm, stieg dann aber bis auf 2,8 ms/cm (siehe Abb. 4.1). Leitfähigkeit in der Muskulatur [ms/cm] Tage p.m. Abbildung 4.1: Verlauf des LF-Wertes in der Muskulatur während der Lagerung (Die Stichprobenzahl an jedem einzelnen Meßzeitpunkt betrug n=16, x). (Anmerkung: In Abweichung zum Tagungsbericht der 36. Tagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene in Garmisch Partenkrichen 1995 wird hier eine Standardabweichung von 1,03 ms/cm angegeben; es lag ein Fehler bei der Berechnung der im Tagungsbericht angegebenen Werte vor, der hier korrigiert wurde.)

95 4.1. ERGEBNISSE DER LEITFÄHIGKEITSMESSUNGEN 85 Dies ist auf eine höhere Empfindlichkeit der Muskulatur gegenüber mechanischen Einflüssen zurückzuführen. Diesen Zusammenhang zeigt Abbildung Leitfähigkeit [ms/cm] vor Tumblen 30 sec. 60 sec. 120 sec Tage p.m. Abbildung 4.2: Anstieg der LF-Werte in der Muskulatur nach unterschiedlich langer mechanischer Belastung durch Tumbeln (x, n= 8 an jedem einzelnen Meßzeitpunkt). Hier wurde die Leitfähigkeit nach unterschiedlich langer mechanischer Belastung der Muskulatur gemessen. Dies führt zu einem Anstieg des LF Wertes, und zwar umso stärker, je länger das Fleisch getumbelt wurde bzw. je länger es zum Zeitpunkt der mechanischen Belastung bereits gereift war. So liegt der End LF Wert (27. Tag p.m.) des Fleisches, das vor der Messung 120 Sekunden getumbelt wurde, mit 17,1 ms/cm um 70,8 % höher als der derselben Probe in unbelastetem Zustand (LF = 12,96 ms/cm).

96 86 KAPITEL 4. ERGEBNISSE Abbildung 4.3 stellt die Leitfähigkeit der Muskulatur den im Serum, dem Überstand des Homogenates und den im enteiweißten Überstand gemessenen Werten gegenüber. Während die LF in der Muskulatur über die Reifungszeit wie beschrieben ansteigt, bleiben die LF-Werte dieser Flüssigkeiten über die Meßzeitpunkte im wesentlichen konstant und liegen auch sehr viel höher. 50 Leitfähigkeit [ms/cm] Muskulatur Serum Überstand Überstand (enteiweißt) Tage p.m. Abbildung 4.3: Vergleich der Leitfähigkeiten in Muskulatur, Serum und Überstand über die Lagerungszeit (x, n = 16).

97 4.2. FLÜSSIGKEITS- UND ELEKTROLYT-HAUSHALT Flüssigkeits- und Elektrolyt-Haushalt Hierbei ging es um Untersuchungen zu den Flüssigkeits und Elektrolyt Verschiebungen zwischen den Kompartimenten der Muskulatur. Um eine Basis für Modell Berechnungen zu bekommen, mit denen nachvollzogen werden sollte, wie sich die Volumenverhältnisse zwischen intra- und extrazellulärem Raum sowie dem p.m. produzierten Drip verschieben und wie sich die Mengenverhältnisse der darin enthaltenen Ionen verändern, wurden die folgenden Untersuchungen durchgeführt Tropfsaft-Verluste Die Tropfsaftverluste (der sog. Drip) der in Plastikbeutel eingeschweißten Muskelproben betrugen am 2. Tag p.m. 0,8 Gew.%, um dann bis zum 27. Tag p.m. bis auf 1,7 Gew.% anzusteigen. Mit zunehmender Fleischreifung wurde dabei die Schwankungsbreite und damit die Streuung der Werte größer (vgl. Abb. 4.4).

98 88 KAPITEL 4. ERGEBNISSE 2.5 Tropfsaftverlust [Gew.-%] Tage p.m. Abbildung 4.4: Tropfsaftverluste in % über die Lagerungszeit (Zu jedem Meßzeitpunkt wurden jeweils n = 14 Proben untersucht, x).

99 4.2. FLÜSSIGKEITS- UND ELEKTROLYT-HAUSHALT Vergrößerung des extrazellulären Raumes Mit Hilfe histologischer Schnitte war nachweisbar, daß sich parallel zum vermehrt austretenden Tropfsaft der extrazelluläre Raum in der Muskulatur vergrößerte. Am 2. Tag p.m. wurde ein ECR von 2 % gemessen, der sich dann bis zum 27. Tag p.m. bis auf über 20 % vergrößerte (siehe Abb. 4.5). Abb. 4.6 und Abb. 4.7 zeigen Fotografien histologischer Schnitte, die die Muskulatur am Tag der Schlachtung und am 27. Tag p.m.zeigen und die Volumenzunahme des ECR demonstrieren. Extrazellulärer Raum [%] Tage p.m. Abbildung 4.5: Vergrößerung des extrazellulären Raumes in der Muskulatur während der Lagerung. Es wurden insgesamt 123 Fotos von histologischen Schnitten ausgewertet, die, über die Meßzeitpunkte verteilt, von 8 Tieren stammten und zu jedem Meßzeitpunkt der arithmetische Mittelwert gebildet (x).

100 90 KAPITEL 4. ERGEBNISSE Abbildung 4.6: Histologischer Schnitt durch die Muskulatur am Tage der Schlachtung. Abbildung 4.7: Histologischer Schnitt durch die Muskulatur 27 Tage p.m.

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