DISS. ETH Nr THE DEVELOPMENT OF A CISGENIC SCAB RESISTANT APPLE CV. GALA. A dissertation submitted to

Transkript

1 DISS. ETH Nr THE DEVELOPMENT OF A CISGENIC SCAB RESISTANT APPLE CV. GALA A dissertation submitted to ETH Zürich For the degree of Doctor of Sciences presented by THALÏA VANBLAERE Master in Biotechnology, University of Ghent, Belgium Born January 17 th 1983 Citizen of Belgium accepted on the recommendation of Prof. Dr. Cesare Gessler, examiner Prof. Dr. Bruce McDonald, co-examiner Dr. Ir. Henk Schouten, co-examiner 2011

2 Abstract ABSTRACT Breeding technology in apple is a very time-inefficient process and is not able to improve an already existing cultivar, since apple breeding always leads to the establishment of a new cultivar. Genetic engineering is an important complement to the breeding technology through its ability to add single genes into an already established apple cultivar without impairing quality and productivity traits. Gene insertion is mediated by Agrobacterium which transfers its T-DNA, carrying the gene of interest, into the plant genome. The concept of cisgenesis was established about five years ago and refers to the genetic modification of plants solely utilizing genes from crossable donor plants. These genes must be used in its sense orientation and have to be under control of its own regulatory sequences. In this thesis it was attempted to genetically modify the apple cultivar Gala to carry the apple resistance gene, HcrVf2, using different strategies. In a first approach, the cisgene HcrVf2 and several genes of foreign origin were initially inserted into Gala resulting in transgenic plants. After activation of an inducible sitespecific recombination system, the foreign genes were removed and led to the development of cisgenic Gala lines. Ten transgenic lines were initially generated, whereas only two lines showed absence of vector backbone integration. Three cisgenic lines, resulting from the recombination step, were then investigated for copy number, site of integration into genome, expression level and scab resistance. Copy number, integration site and recombination process could be unequivocally determined for two of the three putative cisgenic lines, i.e. C and C The third line, C , showed indications toward genomic rearrangements that have taken place during the recombination step, resulting in chromosomal deletions and gene silencing. For this line no direct conclusions could be drawn. Cisgenic lines C and C showed an HcrVf2 expression at a lower level than the classically bred cultivar carrying HcrVf2, Florina. This can be explained by the weak expression of the HcrVf2 gene, which could be due to the length of the promoter, terminator and/or the integration site. Cisgenic line C was considered as the best transformed line since it contained the lowest amount of foreign DNA, however the expression level and resistance level was lower than cisgenic line C7.1.49, which in turn showed more foreign DNA integration into the plant genome of Gala. I

3 Abstract A second approach was tested through a method called co-transfer. Two T-DNAs, one containing HcrVf2 and the other containing the selectable marker genes were inserted into the plant cells of Gala through Agrobacterium-mediated transformation. After transformation a short transient selection period was applied and transformed plants cells were selected on selection media. Upon selection pressure removal, the T-DNAs could integrate into the genome independently from one another, leading to different genotypes of which one was the integration of only HcrVf2 into the genome. 32 putative cisgenic shoots resulted from analysis of seven independent transformations which generated more than 500 putative transformed shoots. These lines could not be further evaluated to determine if they were true cisgenic Gala plant lines, because of a failure of the growth chambers which resulted in the loss of all putative cisgenic lines. These are the first reports of the generation of cisgenic apple cv. Gala carrying the scab resistance gene HcrVf2. It has been shown that the development of cisgenic crops is feasible. The weak resistance to apple scab could be raised through the use of longer promoters and terminators. Aiming at durable resistance, these strategies may be combined with different resistance cisgenes which are currently under development. A next step in gene technology would be a technology which replaces non-functional alleles with functional ones, the so called targeted gene/allele replacement technology. Keywords: Venturia inaequalis, HcrVf2, genetic engineering. II

4 Zusammenfassung ZUSAMMENFASSUNG Züchtung des Apfel ist ein sehr aufwendiger und zeit-intensiver Prozess und ist nicht in der Lage, eine bereits vorhandene Sorte zu verbessern, da dabei, gegeben durch die hohe Heterozygothie und Selbst-Infertilität, immer eine neue Sorte entsteht mit eigenen spezifischen Eigenschaften. Die Gentechnik ist eine wichtige Ergänzung zur Züchtungstechnologie. Sie ermöglicht es, einzelne Gene in eine bereits bestehende Apfelsorte einzubauen, ohne Qualität und Produktivität zu beeinträchtigen. Geninsertion wird durch Agrobacterium vermittelt, dessen T-DNA das entsprechende Gen enthält und es in das pflanzliche Genom transferiert. Das Konzept der Cisgenesis wurde vor rund fünf Jahren entwickelt und bezieht sich auf die genetische Veränderung von Pflanzen unter ausschliesslicher Verwendung von Genen aus kreuzbaren Spenderpflanzen. Diese Gene müssen in ihrer natürlichen Orientierung und unter der Kontrolle der eigenen regulatorischen Sequenzen verwendet werden. In dieser Arbeit wurde mit zwei unterschiedlichen Strategien versucht das Apfel-Resistenzgen HcrVf2 ursprünglich vom Wildapfel Malus floribunda 821 in die Apfelsorte Gala, einzubauen In einem ersten Ansatz wurden das cisgen HcrVf2 und mehrere Gene fremder Herkunft zunächst in Gala eingesetzt und somit ergaben sich transgene Pflanzen. Nach der Aktivierung eines induzierbaren ortsspezifischen Rekombinationssystems wurden die fremden Gene entfernt und dies führte somit zur cisgenen Gala -Linien. Zehn transgene Linien wurden zunächst erzeugt, von denen nur zwei keine Integration des Vektor backbone zeigten. Drei cisgene Linien entstanden aus dem Rekombinationsschritt wurden dann für die Kopien-Anzahl, Stelle der Integration im Genom, Rekombinationsprozess und Schorfresistenz untersucht. Die Anzahl Kopien, der Integrationsort und Auswirkung der Rekombination konnten eindeutig für zwei der drei mutmasslichen cisgenen Linien, i.e. C und C bestimmt werden. Die dritte Linie, C zeigte Anzeichen genomischer Reorganisationen, die während des Rekombinationsschrittes stattgefunden und zu chromosomalen Deletionen (Zerstörungen) und Gen-Silencing geführt haben. Für diese Linie konnten keine direkten Rückschlüsse gezogen werden. Die cisgenen Linien C und C zeigten eine HcrVf2-Expression auf niedrigerem Niveau als die klassisch gezüchtete HcrVf2 Sorte Florina. Dies kann durch die schwache Expression des Gens HcrVf2 erklärt werden, welche auf die Länge der Promotor, Terminator und/oder den Integrationsort im Genom zurückgeführt werden kann. Die cisgene Linie C wurde als III

5 Zusammenfassung beste transformierte Linie betrachtet, da sie die geringste Menge von Fremd-DNA enthält, jedoch ihre Expression und Resistenz war niedriger als bei der cisgenen Linie C7.1.49, welche wiederum mehr Fremd-DNA Integration in das pflanzliche Genom von Gala zeigte. Der zweite Ansatz basierte auf einer Methode namens Co-transfer. Zwei T-DNAs, von denen eine HcrVf2 und die andere das Selektions-Gen trug, wurden durch Agrobacterium- in die Zellen der Sorte Gala eingeschleust. Nach der Transformation und einem kurzen Transient- Zeitraum wurden transformierte Pflanzen-Zellen auf Selektionsmedium ausgewählt. Nach Entfernung des Selektionsdrucks konnten sich die T-DNAs unabhängig voneinander in das Genom integrieren oder nicht. Dies führte zu unterschiedlichen Genotypen, von denen Einer die Integration von nur HcrVf2 in das Genom war. 32 mutmasslich cisgene Sprosse resultierten aus der Analyse der sieben unabhängigen Transformationen, die mehr als 500 mutmasslich transformierte Sprosse erzeugte. Ein technischer Fehler in den Klimakabinen führte zum Verlust aller vermeintlichen cisgenen Linien. Es konnte deshalb nicht bewertet werden, ob es sich um wahre cisgene Gala Linien handelt. Dies sind die ersten Berichte über die Erzeugung von cisgenen Äpfeln cv. Gala die das Schorf-Resistenzgen HcrVf2 enthalten. Es hat sich somit gezeigt, dass die Entwicklung cisgener crops möglich ist. Die schwache Resistenz gegen Apfelschorf könnte durch den Einsatz längerer Promotoren und Terminatoren erhöht werden. Diese Strategien können im Hinblick auf dauerhafte Beständigkeit mit unterschiedlichen Resistenz-Cisgenen kombiniert werden, die derzeit in Entwicklung sind. Ein nächster Schritt in der Gentechnik wäre eine Technologie, die nicht-funktionale Allele durch funktional ersetzt, die sogenannte gezielte Gen/Allel-Ersatz -Technologie. IV