RNA-Regulationsmechanismen: RNA Interferenz

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1 RNA-Regulationsmechanismen: RNA Interferenz Vorlesung System-Biophysik 19. Dez Literatur Martens: BIOspektrum 4/02 8. Jahrgang M. Kuhlmann: Biol. Unserer Zeit Nr.3 (2004), S. 142.

2 Genregulation durch Transkriptionsfaktoren (Jacob&Monod)

3 RNA Interferenz (Fire&Mello) RNA Moleküle können interferieren, d.h. insbesondere kann doppelsträngige RNA den Abbau von RNA und damit die posttranskriptionelle Stillegung (Silencing) eines Gens bewirken.

4 Nobelpreis für Physiologie oder Medizin 2006 Andrew Z. Fire and Craig C. Mello for their discovery of "RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA"

5 Auch RNA kann komplementäre Strukturen bilden Doppelstrang } (dsrna)

6 The simplest of all viral life cycles. The hypothetical virus shown consists of a small double-stranded DNA molecule that codes for only a single viral capsid protein. No known virus is this simple.

7 The life cycle of the Semliki forest virus. The virus parasitizes the host cell for most of its biosyntheses.

8 Beispiele für virale Genome RNAtobacco mosaic virus parvovirus SV40 DNAT4 bacteriophage fx174 bacteriophages

9 The life cycle of a retrovirus. The enzyme reverse transcriptase first makes a DNA copy of the viral RNA molecule and then a second DNA strand, generating a double-stranded DNA copy of the RNA genome. The integration of this DNA double helix into the host chromosome, catalyzed by the viral integrase, is required for the synthesis of new viral RNA molecules by the host-cell RNA polymerase.

10 Die offenen Fragen im klassischen Modell der Genregulation (bis 1998) 1. Das Problem mit der Petunie - cosuppression 2. Antisense DNA

11 Die blaue Farbe der Petunie wird durch das Enzym Chalkonsynthase erzeugt Läßt sich die blaue Farbe durch Zugabe von zusätzlichen Chalkonsynthase-Genen verstärken?

12 Überraschung: Die Zugabe eines zusätzlichen Gens für Chalkon- Synthase führt zur Unterdrückung der Farbe - Ein Phänomen das man Cosuppression nennt.

13 Die Antisense Strategie Durch Zugabe kleiner Antisense DNA Stücke werden spezifische mrna Moleküle für die Translation gesperrt

14 Das Experiment von Fire und Mello RNA carrying the code for a muscle protein is injected into the worm C. elegans. Single-stranded RNA has no effect. But when double-stranded RNA is injected, the worm starts twitching in a similar way to worms carrying a defective gene for the muscle protein.

15 RNA silencing 1. DICER: analog einer RNase III 2. sirna (small interfering RNA)

16 3. RISC: RNAi-induzierter silencing complex (mit unbekannter Untereinheit : SLICER)

17 Standardmodell für RNAi: RISC: RNAi-induzierter silencing complex (mit unbekannter Untereinheit : SLICER) doppelsträngige RNA wird von Dicer (ein Homolog der dsrnaspezifischen RNase III) in sirnas zerlegt, sirnas werden von RISC gebunden und entwunden, der Antisense-Strang spezifiziert RISC (RNA Induced Silencing complex mit ssrnase-aktivität) zur Degradation der Ziel-mRNA.

18 Alternativer RNAi Mechanismus Entwundene sirnas dienen der RNA abhängigen RNA-Polymerase RdRP als Primer, sodass mit der mrna als Matrize ein neuer Doppelstrang gebildet wird. Weil dieser Doppelstrang wieder als Substrat für Dicer dienen kann, ist die mrna Degradation durch RISC theoretisch nicht erforderlich.

19 Verbindung zwischen Antisense RNA und RNAi

20 Natürliche Funktionen des Gene Silencings

21 Zelluläre Funktionen von RNAi Abbau aberranter RNAs und RNA-Bruchstücke Post-transkriptionale Genregulation durch endogene Antisense-RNAs Abwehr von Retroviren (z.b. Aids, TMV etc.)

22 Retro-Virus indiziertes Gene Silencing

23 Gene knock down genomic DNA mrna Die sirna werden in isolierte Zellen eingebracht (transfiziert) und die mrna des Zielgens wird abgebaut. Die resultierende Verringerung der Genprodukte (knock down) ermöglicht es, Hinweise auf die physiologische Bedeutung des betreffenden Genes zu erhalten. RISC proteins sirna Elbashir S, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T (2001). "Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells". Nature 411 (6836):

24 Beispiel : sirna zur Bekämpfung von HIV Ansatzpunkte für sirna bei HIV: Angriff auf virale RNA: Hier kann gleich die RNA nach dem Eindringen in die Zelle angegriffen werden, noch bevor die Reverse Transkriptase die virale RNA in cdna umwandeln kann.

25 sirna Therapieansatz gegen Krebs Einsatzmöglichkeiten von sirna bei Krebserkrankungen ist z.b. die Unterdrückung des mutierten p53-proteins. Wildtyp-p53 funktioniert als Tumorsuppressor, indemes die Zelle dazu zwingt, in Apoptose oder einen Zellzyklus-arrest überzugehen. Eine sporadisch entstandene Mutation in einem Allel des p53-gen wirkt dominant und kann so den Eintritt in die Apoptose oder den Zellzyklusarrest verhindern. sirna-vermittelte Inhibition des mutierten p53-allels könnte daher die Krebsentstehung verhindern.

26 Zusammenfassung RNAi... * Kann Verdau von mrna triggern * Benötigt Dicer, RISC und RdRP * Ist in der Lage spezifische mrna (damit Gene) auszuschalten * Ist Teil eines alten molekularen Immunsystems zur RNA Kontrolle * Ist auf zwei Arten für die Gentechnik von hoher Bedeutung a) Therapeutisch b) Research Bereich

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