Genetische Regulation in Eukaryoten

Transkript

1 Genetische Regulation in Eukaryoten Definition: Im strengen Sinne: Regulierung der Transkription eines Genes zu RNAs Im weiteren Sinne: + Regulierung der Expression und Funktion von Genprodukten (RNAs, Proteine)

2 0. Analyse der Genexpression Es kann bestimmt werden: 1. die Menge eines Genprodukts in einem specifischen Zelltyp, in behandelten oder kranken Zellen Real-time PCR cycler 2. gleichzeitige Expression von sehr vielen Genen Microarray scanner

3 Die Bedeutung der genetischen Regulation 1. Emryogenese Erwachsene Komplexität und Vielfalt des Phenotyps

4 Die Bedeutung der genetischen Regulation - Anwendungen Molekuläre Diagnostik DNA oder Protein chips 2. Gentherapie 3. Individuelles Medizin

5 Die Bedeutung der genetischen Regulation - Anerkennung Nobel Preis Physiologie oder Medizin - Entdeckung des lac operons Francois Jacob Jacques Monod Chemie Studieren der eukaryotischen Genexpression Physiologie oder Medizin - Entdeckung der RNA-Interferenz Roger D. Kornberg Andrew Z. Fire Craig C. Mello

6 4.

7 Regulierung von den Genen bis zu Transkription Proteinen 5. mrna Processierung mrna Transport mrna Lokalisation Post-Transkriptional mrna Stabilität Translation Proteindegradation Proteinmodification Post-Translational

8 Über diesen Themen reden wir: 1. Genetische Regulierung 2. Epigenetische Regulierung 3. Epigenetische Vererbung

9 1. Regulierung der Transkription

10 Regulierung der Transkription Chromatinregulierung - Methylation - Acetylation 2. Interaktion zwischen Regulatorelementen cis-elemente: trans-elemente: Promotoren, Enhancers und Silencers RNA-Polymerase, Transkriptionsfaktoren und Co-Faktoren cis-element: lokalisiert auf dem gleichen DNA Strang als das Gen Trans-Element: lokalisiert im Cytoplasma Chromatin: DNA - Protein Komplex im Zellkern

11 Promotoren 11. Terminator Promotor upstream basic Ex1 I1 Ex2 I2 Ex3 pa T Exon Intron Exon Intron Exon polya-signal upstream Promotor Basenpaare basic Promotor Basenpaare Ex1

12 Promotor-Modul Modul Consensussequenzen Transkriptionsfaktoren Basale Promotor-Modul TATA box TATAWAAR TFIID (core Promotor) CAAT box GGCCAATCT NF-1 GC box GGGCGG Sp1 Octamer ATGCAAAT Oct-1 Response Modul CRE WCGTCA CREB Hitzenschock-Modul CTNGAATNTTCTAGA hsp27 Zellspezifisches Modul Hypophysenzelle-Modul ATATTCAT Pit-1 Myoblast-Modul CAACTGAC MyoD Lymphoid-Zelle-Modul GGGACTTTCC NF- B Entwicklungsregulatoren Bicoid-Modul TCCTAATCCC Bicoid Antennapedia-Modul TAATAATAATAATAA Ant N: allerlei Nukleotide W: A oder T Expressionsmuster: bei der Kombination von Modulen bestimmt Consensussequenzen = Motive, Elemente, Module

13 13 Umstrukturierung (remodeling) des Chromatins

14 Die Initiation der Transkription bei Eukaryoten - Transkriptionsfaktoren - Transkriptionskomplex

15 15. Enhancers and Silencers Basenpaare Transkribierte Region P Ex1 I1 Ex2 I2 Ex3 T Is E1 S1 E2 E3 E4 S2 E5 E6 E7 Is Transkriptionsfaktoren binden zu den DNA Regulatorelementen P: Promotor Ex: Exon I: Intron T: Terninator + polya-signal E: Enhancer S: Silencer Is: Insulator general Zelltyp-specifisch

16 Transkriptionsfaktoren 16. DNA Aktivatoren Promotor Gen Enhancer Allgemeine Transkriptionsfaktoren adaptoren RNA-PolymeraseII Transkriptionsinitiationskomplex RNA-Synthese

17 Zellen-spezifische Genexpression 17. Gen 1 S Hautzellen-spezifisches Enhancer P2 Ex1 P1 I1 Ex1 I1 Ex2 I2 Ex3 Gen 2 Ex2 I2 Ex3 I3 Ex4 T T Neuron-spezifisches Enhancer Gen 1 Neuron-spezifisches Enhancer TF Hautzellen-spezifisches Enhancer P2 Ex1 P1 I1 Ex1 I1 Ex2 I2 Ex3 Gen 2 Ex2 I2 Ex3 I3 Ex4 Zellen-spezifische Genexpression: Histon-Muster! 1. Transkriptionsfactor wird exprimiert in der Zelle 2. Erreichbarkeit der Regulatorregion des Genes T T

18 Transkriptionsfaktoren

19 Strukturmotive der Transkriptionsfaktoren

20 Helix-loop-helix DNAbindende und aktivierende Domäne 20. Transzkription aktivator Aktivator Domän DNS-bindende Domän Promoter Gen Stimulation der Zusammenstellung des Komplexes RNA Polimerase Aktivation DNS-bindende Domän Stimulation der Komplexaktivität Bindungsstelle

21 Der Zellkern und Helix-loop-helix die Transkription Kernpore 21. Zytoplasma Kernhülle Kernpore Zellkern Heterochromatin Nucleolus Aktivirung der Transkription bestimmter Gene

22 Posttranskriptionale Regulierung

23 23. mrna-prozessierung 1. Spleiβen 2. Capping 3. Polyadenylation 4. RNA-Editing

24 Der Struktur der Gene Regulatorregion Transkribierte Region Enhancers Terminator upstream basic Ex1 I1 Ex2 I2 Ex3 pa T Promotor Exon Intron Exon Intron Exon polya-signal DNA ATG Transkribierte Region Stop Ex1 Ex2 Ex3 pa Prä-mRNA 5 -UTR - leader ATG Stop 3 -UTR- trailer Cap Ex1 Ex2 Ex3 pa AAAAAA mrna UTR: nicht-translatierte Region (untranslated region) Introns: durchschnittlich 20-mal länger als Exons Codierende Region

25 Schematische Darstellung des Spleiβens Eukaryoten: Exons (kodierende Basensequenzen) und Introns (nichtkodierende Basensequenzen)

26 Der Vorgang des Spleiβens - Consensussequenzen an der Grenzen zwischen Introns und Exons - Spleiβosom: Komplex schneidet RNA, setzt Introns frei, verknüpft Exons (β-thalassemie: β-globin mrna wird nicht richtig gespleiβt) - Selbst-Spleiβen: Ribozym (RNA mit katalytischer Aktivität) (U1) (U2)

27 Spleiβen 27 Die Funktionen der Intronen: 1. Alternatives spleiβen: mehr als ein Protein 2. Enthält Regulatorregionen 3. Genetischer Abfall

28 Prozessierung der mrna Ende: Cap-Gruppe (Schutz gegen Exonucleasen, Bindung der mrna an das Ribosom) 3 -Ende: Poly(A)-Schwanz (Export aus dem Zellkern, Schutz gegen Exonucleasen, Stabilität)

29 RNA Editing 29

30 Alternative Promotornutzung und alternatives Spleiβen DNA RNA Alternatives Spleiβen Alternative Promotornutzung Protein Alternative polya Nutzung DNA Nicht-translatierte Region Translatierte Region Protein

31 31. Transport der mrna mrnas verlassen den Zellkern durch die Kenrpore Zip-Code: Signale auf den mrnas: bestimmen die Lokalisation in der Zelle Motorproteine binden an das Zip-Code Codierende Region ASH1 mrna Zip-code-Sequenz Zip-Code-Struktur

32 Posttranslationale Regulierung

33 Proteindegradation 33. proteasome Ursachen der Degradation: - aberranter Structur - Optimale Existenzdauer - nicht mehr gebraucht - Hunger nach Aminosäuren Lebensdauer: -lang: zb. Steroid-Receptor; -kurz: zb. Proteine der Augenlinse - Aminosäuren an den N-Enden korreliert mit: 1. Rate der ubiquitin-bindung 2. Stabilität - Arg, Lys, Phe, Leu, Trp 1/2 Existenzdauer: 3 min - Cys, Ala, Ser, Thr, Gly, Val, Pro, Met 1/2 Existenzdauer: 20 hrs Ubiquitin (ein Peptid aus 76 Aminosäuren) binden an Proteinen und markeirt sie zur Degradation bei proteolytischen Enzymen der Proteasomen

34 Proteindegradation 34

35 Proteinmodifikationen 35. Precursorpeptide Peptidevarianten 1. Proteolytisches Schneiden - Verschiedene Peptide aus eineem Prekursorpeptid (zb. Neuropeptide) - Entfernen von Inhibitorpeptiden (zb. Verdauundsenzyme) 2. Glycosylation: Transport (Kontrolle über Lokalisation der Proteine) I 3. Phosphorylation: Aktivation - Inaktivation 4. Methylation acethylation: Histon-Regulierung Glycosylation: Anknüpfen einer Glycosyl Gruppe protein inactive kinase phosphatase protein active P N-acetilgluckosamine mannose glucose protein Carbohydrate group

36 Typen der Genexpression

37 Genexpression und Signalwege

38 Die Eigenschaften der Genexpression 38. a.wann? b.wieviel? c.wo?

39 Die Eigenschaften der Genexpression 39 a.wann? Ontogenese, Induktion b. Wieviel? Wieviel RNA, Prpteine? c. Wo? In welcher Zelltyp? d. Wie? Welche alternatives Form? e. In welcher Kombination? Welche Proteine interagieren miteinander?

40 Die Typen der Genexpression 1. Konstitutiv (kontinuirlich) - Haushaltsgene 2. Induziert bei 2a. Nahrung: Glükose in Leberzellen 2b. Stress: Hitzenschock-Proteine, Osmotic (Salz) - Schock 2c. Zellkommunikation: (Mediatoren: Hormone, Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter) 2d. Ontogenetisch reguliert 3. Zelltypspezifisch

41 Genexpression induciert bei Zellkommunikation 41 Eintreten, oder nicht eintreten? Wenn in der Zelle.... Signalmolekül beeinfluβt einen Transkriptionsfactor indirekt

42 42. Aktivation durch Steroid-hormone Signaltransduction Inhibitor (hsp90) Steroid Glucocorticoid Receptor Zellkern DNA GRE Cytoplasma GRE: glucocorticoid response element

43 Aktivation durch Interferon-γ 43. IFN-γ Signaltransduction IFN-γ Receptor P P JAK Kinase Zellkern DNA RE RE: response element IFN: Interferon JAK: Janus activated kinase STAT-1 : transcription factor Cytoplasma

44 Schnelle und langsame Signalwege Signalmolekül 1. Sekundärer Botenstoff Rezeptor G Protein 2. Regulatorproteine inaktiv aktiv inaktiv aktiv Targetproteine inaktiv 6. aktív 6. inaktiv aktiv 7. Veränderter Zellzustand DNA Zellkern RE Neu gebildete Regulatorproteine 9. Veränderter Zellzustand Schnelle Veränderung Langsame Veränderung

45 Informationsbewegung und Rückmeldung Kommunikation mit anderen Zellen 7. Veränderung in Zellfunktion usw. Zellkern Zytoplasma

46 RNA- Interferenz

47 RNAi -- schneiden (Dicing) Dicer ds RNA sirnas (21-23 Basenpaare) RISC Helikase RISC* (aktiviert) Slicer mrna RNAse sirns: small interfering RNS RISC: RNAi-induced silencing complex RISC*: aktivált RISC Slicer: a vágásért felelős RNáz: ribonukleáz Degradiertes mrna

48 RNAi- Amplifikation 48 Dicer dsrna sirnas RNA abhängige RNA-Polymerase mrna repliziertes dsrna viele sirnas sirns: small interfering RNS RISC: RNAi-induced silencing complex RISC*: aktivált RISC Slicer: a vágásért felelős RNáz: ribonukleáz

49 RNA-Interferenz 49. Parallele Wege DICER Ago + andere RISC-Proteine Ago + andere Proteine aktiviertes RISC aktiviertes RITS DNA Mthylierung der Histone und der DNA Degradiertes RNA Hemmung der Transkription

50 RNA-Interferenz. Andrew Z Fire; Craig C Mello mex-3 Gen Caenorhabditis elegans GFP Gen (als Transgen in E. coli) Kontroll Gefärbt Futter: GFP- exprimierende E.coli antisense-rna dsrna Wild Typ RNSi-Deffekt RNAi: Abschaltung von Genen durch dsrnas

51 RNA-Interferenz 51. Andrew Z Fire; Craig C Mello Technologien für selektive Hemmung der Genexprimierung: Früher: - In vitro antisense DNA-Oligonukleotide + antisense RNAs: - In vivo Knock-out Technologie Heute: - Knock-down Technologie mithilfe von RNAi (in vitro + in vivo) Natürliche Funktion: - Antivirales Mechanismus - Regulierung der Genexprimierung

52 Medizinische Bedeutung 52. (1) Gentherapie (2) Antimikrobiales Mittel

53 Epigenetik 1. Zelltyp Bestimmung 2. X-Chromosom Inaktivierung 3. Maternaler Effekt 4. Genetische Prägung (imprinting)

54 Epigenetische Merkmale - Vererbung ohne Gene Epigenetische Vererbung: Informationsübertragung von einer Zelle od. von einem multizellulären Organismus zu den Nachkommen, ohne Veränderung der Nukleotidsequenz der Gene. Epigenetik: Wissenschaftsfeld,dass sich mit epigenetischer Vererbung befasst Chromatin: Komplex von DNA und Proteinen,der im Nukleus gebildet wird

55 Epigenetik Transmission von epigenetischen Informationen: Epigenetische Regulierung: (1) Innerhalb eines Individuums, zwischen Zellen - Zelltypbestimmung (modifiziert: Histon Methylierung, Acetylierung, Phoshorylierung) (modifiziert: DNA Methylierung) - Chromosom Inaktivierung (modifiziert: DNA - Methylierung) Epigenetische Vererbung: (2) Von den Eltern zu den Nachkommen - Genetisches Imprinting (modifiziert: DNA - Methylierung) - Maternaler Effekt (maternal mrnas and proteins are transmitted to offspring)

56 Innerhalb eines Individuums, zwischen Zellen. Epigenetische Regulierung: Transmission von epigenetischen Informationen: 1. Veränderung in Transkription 2. epigenetische Veränderung in Ontogenese 3. Zelltypbestimmung 4. Epigenetisches Program hängt vom Umwelt ab Chemischer Hintergrund: (modifiziert: Histon Methylierung, Acetylierung, Phoshorylierung (modifiziert: DNA Methylierung Chromosom Inaktivierung (modifiziert: DNA - Methylierung) Von den Eltern zu den Nachkommen, zwischen Individen Epigenetische Vererbung: - direkt Effekt: Genetisches Imprinting (modifiziert: DNA - Methylierung) - indirekt Effekt: Maternaler Effekt (mütterliche mrna und Proteine werden den Nachkommen übergetragt)!

57 Epigenetische Regulierung: innerhalb 1 Individuum Zelltypbestimmung Hautzelle Zelltypbestimmung: Ein Zelltyp produziert die gleiche Zell, aber nicht(oder selten) anderer, obwohl ihr DNA Inhalt identisch ist.

58 Epigenetische Regulierung: innerhalb 1 Individuum Zelltypbestimmung Der Histonkod Die Histonkod-Hypothese besagt,dass die chemische Modifikation von Histonen eine Serie von vorprogrammierten Änderungen während der Zelldifferenzierung und Embryogenese ist.

59 Epigenetische Regulierung: innerhalb 1 Individuum Zelltypbestimmung Der Histonkod Differenzierung: Programmierte Veränderung der Histonmuster Differenzierte Hautzelle Eizelle Differenzierte Leberzelle

60 Epigenetische Regulierung: innerhalb 1 Individuum Zelltypbestimmung Embryogenese Hypothetisches Experiment: Insertion des gleichen Zellkerns in unterschiedliche Zytoplasmen zygote

61 Epigenetische Regulierung: innerhalb 1 Individuum Zelltypbestimmung Embryogenese zygote Hypothetisches Experiment: Insertion des gleichen Nukleus in ein jeweils anderes Zytoplasma zygote

62 Epigenetische Regulierung: innerhalb 1 Individuum Zelltypbestimmung DNA Methylierung Die Methylierung der DNA verhindert Genexpression,aber ihre Rolle in der Gewebedifferenzierung ist unklar. Verschiedene Zelltypen haben verschiedene Metilationsmuster Metilom Code?

63 Epigenetische Verärbung: Von den Eltern zu den Nachkommen Maternaler Effekt Der Genotyp der Mutter manifestiert sich in den Nachkommen Function: die Cytoplasma der Eizelle reguliert die ersten Schritte der Embriogenese Pferde- od. Esel-Maultier? Zygote

64 Epigenetische Verärbung: Von den Eltern zu den Nachkommen Genetische Prägung (Imprinting) Methylierung der DNA Der Effekt eines geprägten Gens hängt vom Elternteil ab, von dem es stammt Funktion:?Eltern-Kind-Konflikt Hypothese? Beispiel: IGF2 (insulin-like growth factor): männlich Vorkommen: Säugetiere m. Plazenta, blühende Pflanzen

65 Epigenetische Verärbung: Von den Eltern zu den Nachkommen Genetisches Imprinting In den somatischen Zellen sind bestimmte Gene der väterlichen Chromosomen metiliert (imprintert), andere Gene der mütterlichen Chromosomen sind also imprintiert väterliches Chomosom apai kr. anyai kr. mütterliches Chomosom In den Spermien wird alle Imprintierung gelöscht und nach väterlichen Muster wiederhergestellt In den Eizellen wird alle Imprintierung gelöscht und nach mütterlichen Muster wiederhergestellt

66 Epigenetische Vererbung: Von den Eltern zu den Nachkommen Genetisches Imprinting 15. Chromosom Normal Prader-Willi Syndrom Angelman Syndrom SNRPN UBE3A Deletion (~80%) SNRPN UBE3A SNRPN UBE3A Metilierung Syndrom von Prader-Willi und von Angelman UPD (~20%) Imprinting hiba (~2%) Deletion Wild Typ SNRPN UBE3A Prader- Willi- Syndrom SNRPN UBE3A SNRPN UBE3A Angelman -Syndrom SNRPN UBE3A Lethal Deletion

67 Eltern- Konflikt David Haig Je besser die Mutter das Embryo versorgt, desto weniger werden die anderen Nachkommen versorgt, und desto mehr verliert sie an Fittnes. Die gute Versorgung des Embryos liegt am Interesse des Vaters (der väterlichen Gene), und er kümmert sich um die anderen Nachkommen und die zukünftige Reproduktion der Mutter nicht. Väterlich imprintirte Gene fördern das Wachstum des Embryos, mütterlich imprintierte Gene hemmen das Wachstum des Embryos.

68 Epigenetische Umschaltung Es gibt sehr viele imprintierte Gene (ca. 1300) Imprintierung ist dynamisch, es wird während des Lebens des Individuums verändert Imprintierung spielt eine wichtige Rolle während der Entwicklung und in der Regulierung des Verhaltens Väterlich imprintierte Gene dominieren während der Embryogenese im Gehirn. (Mütterliche Kopien der Gene werden exprimeirt) Später, im Erwachsenenalter, dominieren die väterlichen Gene

69 Dominanz GRB10 Kodiert für ein intrazelluläres Adaptorprotein Interagiert mit Rezeptor-Tyrosin-Kinasen, beeinflusst Signalübertragung Ein imprintiertes Gen (mütterliche und väterliche Kopien des Gens werden unterschiedlich expremiert) Väterliche Kopie: wird im Gehirn expremiert, lindert die Dominanz, Knock-out: dominates Verhalten, kein Ausweichen in Röhr-Test Mütterliche Kopie: wird im Körper expremiert (ausser Gehirn) Funktion: reguliert Metabolismus und Wachstum Weitere imprintierte Gene, die Verhalten beeinflussen: Mest, Peg3 (Pfegeverhalten der Weibchen)

70 Die Umwelt beeinflusst das epigenetische Program Unser Gehirn ist besonders empfindlich für epigenetische Signale

71 Postgenomische Ära Die Entschlüsselung der Nukleotidsequenz der DNA ist erst der Anfang