Fortbildungsveranstaltung der Bayerischen Apothekerkammer Weiße und rote Biotechnologie: Möglichkeiten für die Zukunft
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- Hansi Sommer
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1 Fortbildungsveranstaltung der Bayerischen Apothekerkammer Weiße und rote Biotechnologie: Möglichkeiten für die Zukunft Prof. Theo Dingermann Institut für Pharmazeutische Biologie Goethe-Universität Frankfurt/Main
2 Die Revolution in den Biowissenschaften Biomoleküle - Organismus Organismus - ein Biomolekül Molekularbiologie
3
4 Paul Berg Walter Gilbert Frederick Sanger 1980 Mitbegründer einer neuen revolutionären Technologie, heute bekannt als Gentechnologie Erste Rekombination von DNAs (P. Berg) Chang, S.H. Cohen & H.W. Boyer (1973) "Es könnte möglich sein, in E. coli Gene einzuführen, die metabolische oder synthetische Funktionen wie etwa die Photosynthese oder die Herstellung von Antibiotika festlegen und eigentlich anderen biologischen Klassen angeboren sind" (Boyer, 1973) Sequenzierung von DNA W. Gilbert & F. Sanger (1977)
5 Verschiedene Sparten der Biotechnologie Die grüne Gentechnik: Die Anwendung gentechnischer Verfahren in der Pflanzenzüchtung, die Nutzung gentechnisch veränderter Pflanzen in der Landwirtschaft und im Lebensmittelsektor. Die rote Gentechnik: Die Anwendung der Gentechnik in der Medizin zur Entwicklung von Arzneimitteln und diagnostischer und therapeutischer Verfahren. Die graue oder weiße Gentechnik: Die Nutzung gentechnisch veränderter Mikroorganismen zur Herstellung von Enzymen oder Feinchemikalien für industrielle Zwecke, in der Mikrobiologie und der Umweltschutztechnik.
6 Die weiße Biotechnologie
7 Die weiße Biotechnologie Biotechnische Optimierung von Produktionsleistungen Beispiel: Penicillin-Produktion durch Penicillium notatum 100 U/ml 250 U/ml 500 U/ml 900 U/ml 1500 U/ml NRRL-1951 NRRL-1951-B25 X-1612 Wis Q-176 BL-3-DIO spontane Mutation Mutagenese Röntgenstrahlung Mutagenese UV-Licht Mutagenese UV-Licht chemische Mutagenese verschiedene Mutagenesen U/ml heutige Produktionstämme
8 Die weiße Biotechnologie Industrielle Biotechnologie gezielte Optimierung von Produktionsleistungen durch Veränderung der DNA durch gezielte Selektion und/oder ungerichtete Mutagenese durch Chemikalien durch ultraviolette Strahlung durch ionisierende Strahlung Nachteile: zeitaufwändig teuer nur Profilierung bestehender genetischer Fähigkeiten Ausweg: gezielte gentechnische Veränderung
9 Die weiße Biotechnologie Gentechnische Optimierung von Produktionsleistungen "Molekulare" Biotechnologie gezielte Optimierung von Produktionsleistungen durch Veränderung der DNA (gezieltes Ausschalten vorhandener Gene) oder Einführung neuer Gene in einen Produktionsstamm mit gentechnischen Methoden Vorteile: schneller als konventionelle Selektionsmethoden Möglichkeit des Zufügens vorher nicht vorhandener Fähigkeiten funktioniert über Artgrenzen hinweg
10 DNA-Isolierung Schneiden und Wieder- verbinden mit Enzymen: Restriktionsendonukleasen Ligasen u.a.
11 Gezielte Gen-Inaktivierung +/+ Ansteuern des Zielgens: homologe Rekombination Gene replacement Selektionsmarker: neo R Homologe Rekombination +/m Knock-out-Zelle (heterozygot)
12 Target"- Organismus Quell"- Organismus Genetische Informations- einheit = universell verständlich in allen biologischen Organismen
13 Target"- Organismus Quell"- Organismus Genetische Informations- einheit = universell verständlich in allen biologischen Organismen Kontrolleinheiten = extrem spezifisch
14 Vitamin-C-Synthese
15 Vitamin-C-Synthese
16 Vitamin-C-Synthese
17 Weiße Biotechnologie
18 Potential der weißen Biotechnologie Reduzierung der Gesamtabfallmenge um 30 % der Menge gefährlicher Abfälle um 75 % der Luftemissionen von flüchtige organische Verbindungen (VOC) um ca. 36 % von Treibhausgasen um ca. 25 % des Ozonbildungspotentials um bis zu 58 % des Versauerungspotentials (SO 2 -Aquivalente) um 50 % des Gesamtenergieverbrauchs um 34 % McKinsey schätzt das gesamte Reduktionspotential für CO 2 - Emissionen durch den Einsatz biotechnischer Verfahren auf weltweit 65 bis 180 Mio. t/a (Riese 2004).
19 Einsatz technischer Enzyme Marksegment Waschmittel Käsereifung und Aroma Mehl und Backwaren Lederbehandlung Glukose-Isomerisierung Früchteverwertung und Wein Stärke-Abbau Brauerei (nicht in D) Silage und Tierfutter Papier und Textil Anteil am Gesamteinsatz (%)
20 Biotechnisch hergestellte Bulg-Produkte Chemikalie Weltjahresproduktion in Tonnen L-Glutaminsäure Zitronensäure L-Lysin Milchsäure Glukonsäure Vitamin C
21 Die rote Biotechnologie
22 Produktion rekombinanter Proteine in Bakterien
23 Produktion rekombinanter Proteine in Bakterien Die Stärken von Escherichia coli nicht pathogen Genom komplett bekannt umfangreiche Erfahrung der Genetik nimmt leicht DNA auf schnelles Wachstum einfache Handhabung kostengünstige Medien zum Teil extrem hohe Proteinausbeuten
24 Produktion rekombinanter Proteine in Bakterien Die Schwächen von Escherichia coli keine Prozessierung von RNA keine posttranslationalen Modifikationen Proteine oft nicht in der korrekten Tertiärstruktur Proteine oft denaturiert ("Inclusion bodies") Freisetzung von Endotoxinen (Pyrogenen)
25 Produktion rekombinanter Proteine in Bakterien Problem: Herstellung von Glykoproteinen Proteine, die Glykosylierungen oder andere posttranslationale Modifikationen für ihre Funktionalität benötigen, können nicht in Bakterien hergestellt werden!
26 Produktion rekombinanter Proteine in Hefe Saccharomyces cerevisiae
27 Produktion rekombinanter Proteine in Hefe Die Stärken von Saccharomyces cerevisiae echter Eukaryont schnelles Wachstum umfangreiche Erfahrung mit Hefe-Genetik Genom vollständig bekannt Zellen und deren Produkte sind nicht pathogen Zellen produzieren keine Pyrogene meist korrekte Faltung der exprimierten Proteine zum Teil hohe Proteinausbeuten Sekretion in das Kulturmedium einige posttranslationale Modifikationen sind machbar biologisch sicher (genetically recognized as safe, GRAS) einfache Handhabung kostengünstige Medien
28 Produktion rekombinanter Proteine in Hefe Die Schwächen von Saccharomyces cerevisiae kaum Prozessierung von RNA Glykosylierungen sind stark verschieden von Säugerzellen (Man 6-9 GlcNAc 2 ; Hypermannosylierung: Man x GlcNAc 2 ) Antibiotika-Selektion nur bedingt einsetzbar Selektion über Auxotrophie-Marker
29 Produktion rekombinanter Proteine in Hefe N-Glykosylierungen sind stark verschieden von Säugerzellen High Mannose-Typ (>100 Mannose-Einheiten)* terminale Mannose α1,3 (α1,2 in Säugerzellen) stark antigen erhöhte Clearance * Produktionsstämme mit inaktivierter α1,3-mannosyltransferase Wenn tierische Proteine N-Glykosylierungen für ihre Funktionalität brauchen, können sie in Hefe in der Regel nicht oder nur eingeschränkt hergestellt werden.
30 Produktion rekombinanter Proteine in Insektenzellen
31 Produktion rekombinanter Proteine in Insektenzellen Nutzung eines biologischen Vektors: Baculovirus DNA-Virus infiziert nur Invertebraten, vor allem Insektenzellen (sehr hoher biologischer Sicherheitsstandard) dsdna-genom bp, zirkulär intrazelluläre Akkumulation von Virus-Paketen, die in eine Polyhedrin- Matrix eingeschlossen (okkludiert) sind Polyhedrin-Synthese beginnt h nach Infektion und dauert 4-5 Tage an
32 Produktion rekombinanter Proteine in Insektenzellen Baculovirus infiziert über 40 Insektenarten und Zelllinien typische Produktionszelllinien für Herstellung rekombinanter Proteine: Sf9, Sf21 (abgeleitet von Spodoptera fugiperda) auch
33 Produktion rekombinanter Proteine in Säugerzellen
34 Produktion rekombinanter Proteine in Säugerzellen Häufig verwendete Zelllinien Zelllinie Herkunft Eigenschaften CHO Chinese Hamster Hamster dhfr Ovary Zellen Genamplifikation für hohe Expressionsleistung notwendig BHK Baby Hamster Hamster keine Genamplifikation für Kidney Zellen hohe Expressionsleistung notwendig C127 Maus 293 Mensch Konstitutive Expression des Adenovirus E1A-Gens sehr hohe Expressionsraten
35 Produktion rekombinanter Proteine in Säugerzellen Die Stärken von Säugerzellkulturen sehr nahe am "humanen System" korrekte Faltung auch komplexer Proteine Sekretion in das Kulturmedium (fast) authentische posttranslationale Modifikationen "authentische" Glykosylierung gibt es nur in humanen Zelllinien!
36 Produktion rekombinanter Proteine in Säugerzellen Glykosylierungsmuster sind stark abhängig von den Kulturbedingungen: Wachstumsraten beeinflussen Anheftung terminaler Sialinsäure- und Galactosereste sowie die globale Nutzung von Glykosylierungsstellen (Makroheterogenität) Serumzugabe in das Medium kann die Komplexität der Glykosylierungen beeinflussen Verfügbarkeit von Glukose beinflusst Glykosylierungsraten Energiestatus der Zelle (ATP, O 2 ) beinflusst Glykosylierungsraten Fermentationsbedingungen Fed-Batch vs. kontinuierliche Kultur Akkumulation von Ammonium in Fed-Batch-Kulturen Akkumulation von Glykosidase (z.b. Sialinase)
37 Produktion rekombinanter Proteine in Säugerzellen Die Schwächen von Säugerzellkulturen teure Medien langsames Wachstum hohe Investitionskosten für Fermentation hohe Produktionskosten* hohe Lagerungskosten für Master-Zelllinien "Upscaling" ist schwierig möglicherweise anfällig für humane Pathogene (vor allem Viren) relativ geringe Proteinmengen produzierbar
38 Produktion rekombinanter Proteine in Tieren
39 "Pharming": Herstellung von Arzneistoffen in Tieren Fremdgene werden unter Kontrolle des β-lactoglobulin-promotors in Milchdrüsenzellen exprimiert Die Milchdrüse: idealer Bioreaktor zur Produktion rekombinanter Proteine Zelldichte 1000-fach höher als in Säugerzellkulturen Milchdrüsenzellen führen authentische posttranslationale Modifikationen durch (insbesondere Glykosylierungen) 2-10 Gramm pro Liter rekombinantes Protein sind möglich (nur 0,2-1 g/l in Zellkulturen) lebenslange, kontinuierliche Produktion während der Laktationsphase der Tiere
40 "Pharming": Herstellung von Arzneistoffen in Tieren Schaf und Ziege kurze Trächtigkeit und Zeit bis zur Geschlechtsreife geringe Größe der Tiere verursacht relativ geringe Haltungskosten relativ hohe Milchleistung 2,5 Liter Milch/Tag, 305 Tage im Jahr > 800 Liter pro Laktationsperiode, 1-8 kg reines rprotein/jahr "standardisierte" Zuchttiere: BELE (Breed Early, Lactate Early): bereits nach 3-6 Monaten geschlechtsreif, ganzjährig aktiv kleiner als normale Ziegen produzieren ca. 1 Liter Milch pro Tag
41 Tissue-Engineering Xenotransplantation
42 Trends in der pharmazeutischen Relevanz der Biotechnologie Gentechnologie: Basis einer ganz neuen Gruppe von Arzneimitteln Gentechnologie: Basis eines Paradigmenwechsels in der Diagnostik Gentechnologie: Basis für die Entdeckung neuer Funktionen alter Wirkstoffe
43 Interaktionswirkstoffe Chemie Substitutionswirkstoffe Gentechnologie
44 Rekombinante Proteine Target"- Organismus Quell"- Organismus = ectopisch exprimierte (humane) Proteine
45 Herstellung rekombinanter Target"- Organismus Protein Quell"- Organismus Kontrollregionen Informationseinheit "genetic engineering" Transgener Organismus (GVO) Extraktion und Reinigung
46 Indikationen Anämie Angiogenese-Inhibition/ Makuladegeneration (AMD) Antithrombotika Asthma Atemwegsinfektionen Bakterielle/virale Infektionen Chronische Entzündungen Diabetes Fertilitätsstörung Gerinnungsstörungen Impfprophylaxe Infarkt/Schlaganfall Knochenbrüche Krebs Lysosomale Speicherkrankheiten Multiple Sklerose Osteoporose Paroxysmale nächtlich Hämoglobinurie Psoriasis Rheuma Schleimhautentzündungen Sepsis Stoffwechselstörungen Transplantation Wachstumsstörungen Wundheilung
47 Entwicklung biotechnologischer Wirkstoffe 1. Generation 2. Generation 3. Generation
48 Paradigmenwechsel in der Diagnostik ca. 6 Milliarden Buchstaben ca Gene
49 Die Revolution in den Biowissenschaften Informatik Molekularbiologie
50 Der Mensch?
51 Die Menschen!
52 Die Menschen! Diese Eigenschaften ergeben sich aus Buchstabenvariationen. Sie sind ererbt und sind somit in allen Zellen abgespeichert. und es sind erstaunlich wenig: Ca. 1 : Buchstaben Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)
53 Hauptprobleme der Medikamententherapie Fehlende Wirksamkeit Kardiovaskuläre Medikamente: ACE-Inhibitoren % Beta-Blocker % Statine (HMG-CoAR-I) % Antidepressiva SSRI % Trizyklische Antidepressiva %
54 Hauptprobleme der Medikamententherapie Nebenwirkungen (ADR, adverse drug reactions) Stationäre Krankenhauspatienten: USA (Lazarou et al. 1998) % 6,7 % (2,2 Mio) schwere Nebenwirkungen 0,3 % ( ) tödliche Nebenwirkungen Vierthäufigste Todesursache (nach KHK, Krebs, Schlaganfall) Deutschland: Todesfälle jährlich
55 Arzneimittel werden metabolisiert Arzneimittel Metabolit wirksam unwirksam wirksam unwirksam wirksam wirksam
56 Arzneimittel werden metabolisiert 12 Zahl Individuen MR 10
57 Arzneimittel werden metabolisiert
58 Klinisch relevante Substrate für CYP2D6 Antiarrhythmika Antidepressiva Beta-Blocker Amiodaron Imipramin Propranolol Encainid Desipramin Timolol Flecainid Amitriptylin Bufuralol Mexilitin Nortriptylin Metoprolol N-Propylamalin Clomipramin Carvedilol Spartein Paroxetin Propafenon Neuroleptika Perphenazin Thioridazin Haloperidol Risperidon Andere Codein Debrisoquin Amphetamine (Ecstasy!) Indoramin Phenformin
59 Klinisch relevante Substrate für CYP2C19 Antiepileptika Diazepam Phenytoin Phenobarbiton Protonenpumpenhemmer Lansoprazol Omeprazol Pantoprazol Andere Amitriptylin Clomipramin Cyclophosphamid Progesteron Nelfinavir
60 Problem-Wirkstoff Tamoxifen
61 Problem-Wirkstoff Tamoxifen
62 Problem-Wirkstoff Tamoxifen
63 Der Expressions Fingerprint als biotechnologische Revolution
64
65 Der genetische Fingerprint als biotechnologische Revolution
66 Der genetische Fingerprint als biotechnologische Revolution gesund krank krank gesund Signaturen der Genexpression
67 Der genetische Fingerprint als biotechnologische Revolution therapieresistent therapierbar
68 Stratifizierte Medizin
69 Stratifizierte Medizin Exakte Beschreibung biologischer Mechanismen Multiple Behandlungs- Optionen Stratifizierte Medizin Klinische Biomarker
70 zur optimalen Therapie für jeden individuellen Patienten Optimale Behandlung
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