5 Expression der genetischen Information - März 2009

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1 Page 1 of 21 GRUNDLAGEN DER MOLEKULARBIOLOGIE Prof. Dr. Anne Müller 5 Expression der genetischen Information 5.1 Struktur der RNA 5.2 RNA-Synthese (Transkription) 5.3 RNA-Polymerase 5.4 Promotoren 5.5 Elongation der Transkription 5.6 Termination der Transkription 5.7 Messenger-RNA (mrna) 5.8 Spleissen 5.9 Ribosomale RNA (rrna) 5.10 Transfer-RNA (trna) 5.11 Proteinsynthese (Translation) 5.12 Hemmstoffe der Proteinsynthese 5.13 Genauigkeit des DNA-Metabolismus Die Gene bestimmen die Aminosäurensequenzen der Proteine, die von einer Zelle synthetisiert werden. Die DNA ist jedoch nicht die direkte Matrize für die Proteinsynthese. Diese Aufgabe übernehmen RNA-Moleküle. An der Proteinsynthese sind drei Typen von RNA beteiligt: mrna=messenger RNA (Informationsüberträger von DNA zu Ribosom) trna=transfer RNA (Träger der As, die zusammengehängt werden) rrna=ribosomale RNA (Bestandteil der Ribosomen, den "Proteinsynthesemaschinen") Rel. Häufigkeit Anzahl Nucleotide 5% variabel (je nach dem zu codierenden Protein) 15% ~ 75 80% Prokaryoten: 120 (5S), 1500 (16S), 2900 (23S) Eukaryoten: 120 (5S), 160 (5.8S), 1900 (18S), 4800 (28S) 5.1 Struktur der RNA Die kovalente Struktur der RNA unterscheidet sich von der DNA in zweierlei Hinsicht. Der Zucker in der RNA ist Ribose statt Desoxyribose und anstelle von Thymin kommt die Pyrimidinbase Uracil vor. Die RNA-Moleküle sind einsträngig (mit Ausnahme einiger Viren-RNAs). Durch die Bildung von sog. Haarnadelschleifen gibt es jedoch auch Abschnitte mit Doppelstrangstruktur. Die Basenpaarung ist nicht so genau wie bei der DNA-Doppelhelix. Zum Beispiel kann sich U mit A und G paaren.

2 Page 2 of RNA-Synthese (Transkription) Die Synthese der RNA verläuft gleichfalls nach dem Prinzip der Basenkomplementarität. Die Transkription wird durch DNA-abhängige RNA-Polymerasen katalysiert. Diese Enzyme benötigen folgende Komponenten für die RNA-Synthese: DNA als Matrize. Aktivierte Vorstufen: Es werden alle vier Ribonucleosidtriphosphate (ATP, GTP, UTP und CTP) benötigt. Ein zweiwertiges Metallion: in vivo wird Mg 2+ verwendet. Die Analogien zur DNA-Replikation: Die Syntheserichtung ist 5' --->3'. Das Prinzip des Additionsmechanismus besteht im nucleophilen Angriff der 3'-OH-Gruppe des wachsenden Strangs auf die innerste (α) Phosphatgruppe des neuen Ribonucleosidtriphosphats. Die treibende Kraft der Synthese ist die Hydrolyse des Pyrophosphats (PP i ). Die RNA-Polymerase braucht keinen "Primer". Die DNA-Matrize bleibt bei der Transkription voll erhalten, wohingegen die DNA-Synthese semikonservativ verläuft. Die Initiation des Transkriptionsprozesses erfolgt an einem bestimmten, AT-reichen DNA-Abschnitt, der Promotor genannt wird. Die RNA-Polymerase bindet an den Promotor. Bei der Synthese der RNA wird nur ein DNA-Strang, der Matrizen-Strang, kopiert. Das Ende der Biosynthese wird durch Signalsequenzen auf der RNA bestimmt. Die primären Produkte der Transkription werden noch in mannigfacher Weise verändert. Diese Reifung (processing) der RNA zeigt Unterschiede bei den drei RNA-Arten. Die trna- und die rrna-vorläufer werden nach der Transkription gespalten und modifiziert. In E. coli hingegen wird die mrna unverändert als Matrize zur Proteinsynthese verwendet. Im Unterschied dazu wird in Eukaryoten die mrna an beiden Extremitäten post-transkriptionell modifiziert (5.7) und nicht-kodierende Sequenzen (Introne) werden herausgespleisst (5.8).

3 Page 3 of RNA-Polymerase In E. coli werden alle RNA-Arten durch eine einzige RNA-Polymerase synthetisiert. Das etwa 500 kda grosse Holoenzym hat die Untereinheitenstruktur α 2 ββ'σ, das Core-Enzym α 2 ββ'. Untereinheiten der RNA-Polymerase in E.coli Untereinheit Gen Anzahl Masse (kd) Funktion α rpo A 2 37 Bindet regulatorische Sequenzen β rpo B Bildet Phosphodiesterbindungen β' rpo C Bindet die DNA-Matrize σ 70 rpo D 1 70 Erkennt die -35-Stelle (Startstelle) 5'-NNNNN TTGACA NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN TATAAT NNNNNNN-3' In Eukaryoten sind drei RNA-Polymerasen bekannt. Die RNA-Polymerase I sorgt für die Synthese der ribosomalen RNA, RNA-Polymerase II für die mrna-synthese und Polymerase III ist für die trna-synthese zuständig. Die eukaryotischen RNA-Polymerasen-Holoenzyme bestehen aus mehreren Untereinheiten; einige sind in allen Polymerasen-Arten zu finden, andere sind Pol-I-, Pol-II- oder Pol-III-spezifisch.

4 Page 4 of Promotoren In Prokaryoten wird die Transkription an Promotorstellen initiiert, die aus zwei Sequenzen bestehen: die eine hat ihr Zentrum bei - 10 und die andere bei Das bedeutet, dass die Promotorstellen 10, beziehungsweise 35 Nucleotide vom Startpunkt in 5'-Richtung entfernt liegen, also stromaufwärts. Die Konsensus-Sequenz der -10- Region lautet TATAAT und wird vom RNA-Polymerase-Holoenzym gebunden. Die σ-untereinheit erkennt die - 35-Sequenz. Es sind drei σ-untereinheiten bekannt: σ 70, die an Standard-Promotoren bindet und die -35-Sequenz TTGACA erkennt; σ 54 die an Promotoren der Stickstoffmangel-Gene bindet und die 35-Sequenz GTGGNA erkennt, und σ 32, die an Promotoren der Hitzeschock-Gene bindet und die -35 Sequenz TNNCNCNCTTGAA erkennt. Die Bindung der RNA-Polymerase an einen Promotor führt zu einer lokalen Entwindung der gebundenen DNA, was etwa 17 Basen auf dem Matrizenstrang freilegt und somit den Weg zur Bildung der ersten Phosphodiesterbindung ebnet. RNA-Ketten beginnen gewöhnlich mit pppg oder pppa. Die σ-untereinheit dissoziiert nach der Initiation der neuen Ketten vom Holoenzym und bleibt an der -35-Stelle gebunden. In E. coli sind die Proteine, die für die Tryptophan-Biosynthese oder den Laktose-Metabolismus notwendig sind, zusammen gruppiert und werden von einem einzigen Transkript translatiert. Die Expressionskontrolle dieser Operone wird mit Hilfe von Aktivatoren und Repressoren kontrolliert (siehe Bild). (a ) In Abwesenheit von Laktose wird Transkription des Lac-Operons vom Lac-Repressor (Produkt des Lac I- Gens) reprimiert. (b) Bei der Zugabe von Laktose dissoziiert der Repressor von der DNA, da er vom "Inducer" (1,6-Allolaktose oder Isopropyl-Thiogalaktose, IPTG) gebunden wird und nicht mehr in der Lage ist, an die Operatorstelle zu binden. Die Transkription wird durch die Bindung vom σ 70 -Faktor an die Operatorstelle leicht aktiviert. (c) Bei höherer Laktosekonzentration und fehlender Glukose (Stress) steigt der camp-pegel, was zur Bindung des Catabolit-Aktivatorproteins (CAP) an den Promotor führt, und dabei auch zu starker Aktivierung der Transkription.

5 Page 5 of 21 Für die Initiation der eukaryotischen Transkription werden ebenfalls besondere Erkennungssequenzen und an diese Erkennungssequenzen bindende Proteine (Transkriptionsfaktoren, TF) gebraucht. Der Promotor (Ort der initialen Bindung der RNA-Polymerase) besteht meist aus einer TATA-Box (ca. 30 Basen stromaufwärts von der Initiationsstelle) und aus einer GC-Region, oft mit einer CAAT-Box, Nucleotide stromaufwärts. Regulatorische Regionen (Verstärkerelemente=Enhancer) binden zell-, gewebe- oder entwicklungsspezifische TF, und können stromabwärts oder stromaufwärts von der Promotorstelle liegen. Bild: Die eukaryotischen Transkriptionsfaktoren TFIIA, B, D und E sind für die Initiation der Transkription durch die RNA-Polymerase II (TFIIC) essentiell. Der Zusammenbau dieser allgemeinen Transkriptionsfaktoren erfolgt schrittweise und beginnt mit der Bindung von TBP/TFIID (blau) an die TATA-Box. Nachdem TFIIA, B und D auf der DNA positioniert sind, bindet sich die RNA-Polymerase II (TFIIC, gelb) an den Komplex. Der Pfeil markiert die Stelle des Transkriptionsstarts. Dank Schleifenbildung können Aktivatorproteine (Act), die an weit entfernte Enhancer gebunden sind, mit dem promotor-gebundenen Pre-Initiationskomplex interagieren.

6 Page 6 of 21 Die TF-Untereinheiten des Aktivator-Komplexes müssen häufig selbst aktiviert werden. Dies kann durch posttranslationelle Modifikationen (z.b. Phopshorylierung) geschehen. Einige TF werden durch Liganden-Bindung aktiviert, wie z.b. die Hormon-Rezeptoren.

7 Page 7 of 21 Bilder: Der Glukokortikoidrezeptor (GR) besteht aus Aktivatordomäne (AD), DNA-Bindungsdomäne (DBD) und Ligandenbindungsdomäne (LBD). In Abwesenheit von Hormon ist der GR im Zytoplasma und im Komplex mit einem Inhibitorprotein. Nach Hormonzugabe ändert sich die Struktur der LBD und der Inhibitor wird freigesetzt. Der GR kann jetzt frei in den Kern dislozieren, wo er die Transkription von Genen, welche ein Hormonresponsives Element (HRE, DNA-Sequenz 5 -NAGAACANNNTGTTCTN-3 ) im Enhancer/Promotor besitzen, induziert. 5.5 Elongation der Transkription In Prokaryoten löst sich die Polymerase vom σ-faktor ab. Der σ-faktor bleibt am Promotor gebunden. In Eukaryoten führt die Bildung des Multiproteinkomplexes zur Phosphorylierung der C-terminalen Domäne (CTD) von Polymerase II. Die Polymerase kann sich jetzt vom Promotor absetzen. Die Transkriptionsfaktoren (TFs) bleiben mehrheitlich am Promotor/Enhancer gebunden. Die Kettenverlängerung (Elongation) findet an Transkriptionsblasen statt, die sich mit einer Geschwindigkeit von etwa 50 Nucleotiden pro Sekunde entlang der DNA-Matrize bewegen. Die Fortbewegung in Eukaryoten wird von TFIIH angetrieben, dem Helikase-Komplex, der auch bei der Nucleotid-Excisions-Reparatur beteiligt ist (siehe Kapitel 4.3).

8 Page 8 of 21 Nomenklatur: Der codierende (sense) Strang der DNA und die neusynthetisierte RNA haben die gleiche Sequenz und Orientierung (ausser dass T in DNA durch U in RNA ersetzt wird). Es wird aber der Matrizen- (antisense) Strang transkribiert. 5.6 Termination der Transkription Die neu entstehende RNA-Kette enthält Stoppsignale, um die Transkription zu beenden. Ein prokaryotisches Stoppsignal besteht aus einer RNA-Haarnadelschleife, der mehrere U-Reste folgen. Ein anderes Stoppsignal wird durch das ρ-(rho-) Protein, eine ATPase, erkannt (nur in E. coli). In Eukaryoten sind die Stoppsignale noch nicht vollständig verstanden. Viele Gene, die von Pol II trankribiert sind, besitzen aber Signalsequenzen, z.b. AATAAA, [GT] n, die zur Termination der Transkription führen (siehe 5.7). 5.7 Messenger-RNA Alle Strukturgene werden von RNA-Polymerasen auf die mrna umgeschrieben. In Prokaryoten werden mrna- Moleküle nach der Synthese nur wenig oder gar nicht modifiziert. Viele werden sogar bereits während der Transkription übersetzt. Das primäre Transkriptionsprodukt in Eukaryoten ist die heterogene nucleare RNA (hnrna). Ein Teil dieser hnrna wird anschliessend in reife mrna umgewandelt durch: 1. Anfügen des Cap am 5'-Ende (methylierter Guanosylrest in 5'-->5' Bindung zum ersten Nucleotid) 2. Spaltung am 3'-Ende und Anfügen von Poly-A ( Adenosin-Reste) 3. Spleissen, d.h. die Entfernung von Introns und das Zusammenfügen (Ligieren) der Exons zur reifen mrna. Diese "mature mrna" gelangt dann durch Kernporen ins Cytosol als Matrize für die Proteinsynthese (5.8)

9 Page 9 of Bild: Die Cap-Struktur am 5 -Ende der eukaryotischen Pol II-Transkripte Bild: Transkriptionstermination und Polyadenylierung der Pol II-Transkripte

10 Page 10 of Spleissen Das primäre Transkript in höheren Eukaryoten (hnrna, heterogenous nuclear RNA) enthält Introne (intervening sequences), die aus der mrna entfernt werden müssen. Dieser Prozess heisst Spleissen. Die sogenannten Spleissosomen sind grosse (60 S) Aggregate aus snrnps (small nuclear ribonucleoproteins) und hnrna (mrna Vorläufern). Das U1-snRNP (blau) erkennt die 5'-Spleissstelle (AG/GU), indem es eine Sequenz erkennt, die komplementär zu dieser Spleissstelle ist. Danach bindet das U2-snRNP die Verzweigungsstelle (A) am Intron. Die Assoziation von U1 mit U2 bringt das 5'-Ende mit dem 3'-Ende des Introns zusammen, was U1 in die Lage versetzt, auch mit der 3'-Spleissstelle (AG/G) (Bild oben) eine Basenpaarung einzugehen. Zu diesem Komplex stösst jetzt eine bereits gebildete Anordnung aus U4, U5 und U6. Das katalytische Zentrum des Spleissosoms wird von der U2-snRNA (violett) und der U6-snRNA gebildet, die eine Basenpaarung miteinander eingehen. U2 ist auch mit der Verzweigungsstelle auf dem mrna-vorläufer über eine Basenpaarung verbunden. Bei diesem Prozess wird die Verzweigungsstelle (A) ausgewählt, wodurch die 2'- OH Gruppe des Adenosins für den nucleolytischen Angriff auf die Phosphodiesterbindung der 5'-Spleissstelle frei wird.

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12 Page 12 of Ribosomale RNA (rrna) Das primäre Transkriptionsprodukt ist eine Vorläufer-RNA, die in der posttranskriptionellen Reifung durch spezifische Nucleasen gespalten wird. Dadurch entstehen die verschiedenen in Ribosomen vorkommenden rrna-moleküle. Prokaryoten synthetisieren drei rrnas: 5S, 16S und 23S. In Eukaryoten werden vier rrnas synthetisiert: 5S, 5.8S, 18S und 28S. Die Synthese des eukaryotischen Vorläufers der 5.8S, 18S und 28S rrna findet in den Nucleoli statt und wird von RNA-Pol I katalysiert. 5S rrna wird im Kern von RNA-Polymerase III synthetisiert. Reife rrna kommt ausschliesslich in den Ribosomen vor. Ribosomen sind Nucleoprotein-Komplexe aus etwa 60% rrna und 40% Proteinen und bestehen aus zwei Untereinheiten. Sie sind der Ort der Proteinsynthese. rrnas sind in komplexe dreidimensionale Strukturen gefaltet. In Ribosomen sind die rrna-moleküle wichtiger als die Proteine, da die rrnas die katalytischen Rollen erfüllen.

13 Page 13 of Transfer-RNA (trna) Die trna ist einsträngig und besteht aus etwa 75 Ribonucleotiden, welche teilweise intramolekulare Basenpaarungen eingehen. Wie im Fall der rrna sind die dreidimensionalen Stukturen der trna-moleküle für ihre Funktion in der Proteinsynthese von grosser Bedeutung (siehe unten). L-förmige Raumstruktur Inosin (I) Pseudouridin (ψ) Alle trnas sind spezifisch für ihre As, die am 3'-Ende des Moleküls gebunden werden. Bei der posttranskriptionellen Reifung der trna werden verschiedene Basen modifiziert, dadurch entstehen seltene Nucleotide wie z.b. Inosin, Pseudouridin, Dihydrouridin, 5-Methylcytosin, 7- Methylguanosin usw. 5 Methylcytosin(m 5 C) 7-Methylguanosin(m 7 G) Zudem wird bei der Prozessierung CCA an das 3'-Ende von allen trnas, die diese Endsequenz noch nicht besitzen, angehängt. Am 5'-Ende ist meistens pg.

14 Page 14 of Proteinsynthese (Translation) Proteine können sich nicht durch Umkehrung der Proteolyse aus den freien As bilden, da das Gleichgewicht stark auf Seite der Hydrolyse liegt. Um zu Peptiden zusammengefügt werden zu können, müssen die As zuerst aktiviert werden. Die Bildung von As-Derivaten mit hohem Gruppenübertragungspotential wird als "Aktivierung" der As bezeichnet. Die "aktivierte" As wird auf ein trna-molekül übertragen, welche damit zu Aminoacyl-tRNA wird. Diese "beladene" trna erfüllt zwei Aufgaben: erstens trägt sie die As in energiereicher Bindung; zweitens weist sie eine Nucleotidfolge, das Anticodon, auf, welches mit der mrna eine Basenpaarung eingehen kann und so die Uebersetzung der "Nucleotidsprache" in die "Aminosäurensprache" ermöglicht. Der genetische Code In der mrna kommen vier verschiedene Basen vor, die 20 As determinieren müssen. Demnach bilden vier Buchstaben (A, G, C und U) das Alphabet, aus dem die Codewörter oder "Codone" zusammengesetzt sind. Mit vier Buchstaben können 4 3 = 64 Tripletts gebildet werden. 5'-terminale Base U C A G mittlere Base U C A G 3'-terminale Base Phe Ser Tyr Cys U Phe Ser Tyr Cys C Leu Ser Stop Stop A Leu Ser Stop Trp G Leu Pro His Arg U Leu Pro His Arg C Leu Pro Gln Arg A Leu Pro Gln Arg G Ile Thr Asn Ser U Ile Thr Asn Ser C Ile Thr Lys Arg A Met* Thr Lys Arg G Val Ala Asp Gly U Val Ala Asp Gly C Val Ala Glu Gly A Val Ala Glu Gly G * dient als Startcodon.

15 Page 15 of 21 Es fällt auf, dass der Code, von zwei Ausnahmen abgesehen, nach einem bestimmten Prinzip degeneriert ist: In der 3. Position wird nur zwischen "Pyrimidin" und "Purin" unterschieden; manchmal haben in dieser Position sogar alle vier Basen die gleiche Bedeutung. Beispiel: Die Alanyl-tRNA1 hat an der ersten Anticodon-Stelle ein Inosin (5'-IGC-3'). Da Inosin mit C, U, und A paaren kann, erkennt diese trna die Codone GCU, GCC und GCA. Der Codon GCG wird von Alanyl-tRNA2 erkannt. Der genetische Code ist universell, d.h. er gilt für alle Lebewesen, mit gewissen Ausnahmen bei der DNA von Mitochondrien und bestimmten Einzellern. Für jede der 20 As gibt es in der Regel mehrere spezifische trnas, die z.t. auch verschiedene Anticodone tragen. Da bei der Translation die Aminoacyl-tRNA nur durch das Anticodon erkannt wird, ist es sehr wichtig, dass die trna mit der richtigen Aminosäure beladen wird. Ribosomen Die Ribosomen sind die molekularen Fabriken der Proteinsynthese (siehe Bild in Kapitel 5.9). Sie binden die mrna so, dass die Codone mit den Anticodonen der Aminoacyl-tRNAs präzise paaren können. Sie besitzen Bindungsstellen für das trna-molekül, das mit dem wachsenden Polypeptid gekoppelt ist (P-Stelle), die AminoacyltRNA (A-Stelle) und die trna, die ihr Peptid gerade abgegeben hat (E-Stelle). Sie ermöglichen die Interaktion mit Initiations-, Elongations- und Terminationsfaktoren. Sie katalysieren die Entstehung der Peptid-Bindungen. Sie verschieben sich um drei Nucleotide nach jedem katalytischen Schritt. Das Leseraster (Triplett-Code) wird von der Initiationsstelle definiert.

16 Page 16 of 21 Syntheserichtung der Translation Das Ribosom bewegt sich auf der RNA in der 5' --- > 3-Richtung. Das Protein wächst vom Amino-(N) ---> Carboxy (C)-Terminus. Aus jedem mrna-molekül können drei Proteinsequenzen abgeleitet werden. Die erste beginnt beim 1. Nucleotid, die zweite beim 2. und die dritte beim 3.. Es entstehen dabei drei Leseraster. Der Translationsprozess lässt sich in drei Teilschritte unterteilen: Initiation, Kettenverlängerung und Kettenabbruch. Bild: Durch Leserasterverschiebung können aus einem mrna-molekül 3 unterschiedliche Peptide synthetisiert werden. Initiation In E. coli erfordert die Initiation Formylmethionyl-Initiator-tRNA, die an der P-Stelle der 30S-Untereinheit bindet, zusammen mit GTP und anderen Initiationsfaktoren (IF). Dieser Komplex positioniert sich am AUG-(oder GUG) Initiator-Codon mit Hilfe der 16S rrna, die mit einer purinreichen Sequenz (Shine-Dalgarno) interagiert. Die Bindung der 50S-UE führt zur Hydrolyse von GTP und zur Freisetzung der IF (Bild rechts). In Eukaryoten findet die Proteinsynthese im Cytosol oder im rauhen endoplasmatischen Retikulum statt. Es sind mindestens sechs Initiationsfaktoren (eif) erforderlich. Die meisten davon werden benötigt, um die mrna in der richtigen Orientierung an die kleine Untereinheit (40S) des Ribosoms zu binden. Die Initiator-tRNA ist MethionyltRNA(i). Der Met-tRNA(i)/40S/IF-Komplex bindet am Cap und bewegt sich mit Hilfe von ATP-Hydrolyse in der 5-3 -Richtung, bis das Initiator-Codon (immer ein AUG) identifiziert wird. Die besten Initiator-Codons befinden sich in einer Kozak-Umgebungssequenz (Nucleotid an der -3-Stelle ist ein Purin, und an der +4-Stelle ist Guanosin, z.b. ACCAUGG). Erst dann wird die grosse ribosomale Untereinheit (60S) an den Initiationskomplex gebunden. Die Proteinsynthese beginnt beim Start-Codon. Wichtig: Prokaryotische mrnas können mehrere Startstellen besitzen und damit mehr als ein Proteinmolekül codieren (prokaryotische mrnas sind polycistronisch). Eukaryotische mrnas hingegen sind monocistronisch, da die Translation immer an der Kozak-AUG-Stelle anfängt, die dem 5 -Ende am nächsten liegt.

17 Page 17 of 21 Prokaryotische Initiation Eukaryotische Initiation

18 Page 18 of 21 Eukaryotische Elongation Kettenverlängerung (Elongation) Die Kettenverlängerung erfordert Elongationsfaktoren. In E. coli sind das EF-Tu, EF-Ts und EF-G. Die zweite Aminoacyl-tRNA wird von ET-Tu an die A-Stelle des Ribosoms transportiert. EF-Tu hydrolysiert GTP zu GDP und wird freigesetzt. (EF-Tu.GDP wird von EF-Ts regeneriert durch GDP-GTP Austausch.) EF-Tu bringt die dritte Aminoacyl-tRNA zum Ribosom usw. Die Bildung einer Peptidbindung wird von der 23S rrna (Peptidyl-Transferase) katalysiert. Die Verknüpfung der As durch Peptidbindungen erfordert keine zusätzliche Energie, da die neu ankommenden As schon in aktivierter Form vorliegen. Mit Hilfe von GTP-Hydrolyse bewegt EF-G das Ribosom in 5 ---> 3'-Richtung entlang der mrna, wobei an jedes Codon die entsprechende Aminoacyl-tRNA angelagert wird. Die E- und A-Stellen dürfen nicht gleichzeitig besetzt werden. Wenn die A-Stelle besetzt ist, dissoziiert die freie trna von der E-Stelle.

19 Page 19 of 21 Die eukaryotischen Verlängerungsfaktoren (eef) sind Homologe der prokaryotischen. eef 1α=EF-Tu eef 1βγ =EF-Ts eef 2=EF-G Eukaryotische Termination Kettenabbruch (Termination) - Der Abschluss der Synthese erfolgt dann, wenn auf der mrna ein Stopp-Codon erreicht wird. Die Peptidkette wird hierauf hydrolytisch von der letzten trna abgelöst und das Ribosom dissoziiert in seine Untereinheiten. In Prokaryoten wird die Termination durch Freisetzungsfaktoren (release factors, RF) ermöglicht. RF1 erkennt UAA und UAG; RF2 erkennt UAA und UGA; RF3 ist eine GTPase, die die Bindung von RF1 und RF2 an das Ribosom stimuliert. Eukaryoten besitzen nur zwei Freisetzunsfaktoren, erf1, der alle drei Stopp-Codone erkennt, und erf3, der die Rolle des prokaryotischen RF3 übernimmt. Noch während die Kettenverlängerung an einem Ribosom in vollem Gange ist, können weitere Ribosomen an der RNA mit der Translation beginnen. Demnach bildet sich eine ganze Kette von Ribosomen, welche in 5'-3'-Richtung der mrna entlangfahren. Solche Komplexe nennt man Polysomen.

20 Page 20 of Hemmstoffe der Proteinsynthese Die Unterschiede zwischen den Proteinsynthesemaschinerien der Pro- und Eukaryoten ermöglichen den Einsatz von Inhibitoren der Proteinsynthese von Prokaryoten als Antibiotika: Antibiotikum Streptomycin Tetracyclin Chloramphenicol Cycloheximid Erythromycin Puromycin Wirkung und andere Aminoglykoside hemmen die Initiation und verursachen Fehlablesungen der mrna (bei Prokaryoten) lagert sich an die 30S-Untereinheit an und hemmt die Bindung der Aminoacyl-tRNAs (bei Prokaryoten) hemmt die Peptidyltransferaseaktivität der 50S-Ribosomenuntereinheit (bei Prokaryoten) hemmt die Peptidyltransferaseaktivität der 60S-Ribosomenuntereinheit (bei Eukaryoten) lagert sich an die 50S-Untereinheit an und hemmt die Translokation (bei Prokaryoten) verursacht vorzeitigen Kettenabbruch, weil es als Analogon der Aminoacyl-tRNA wirkt (bei Prokaryoten und Eukaryoten) Inhibitoren der Eukaryoten-Proteinsynthese sind gefährliche Toxine. Das Diphtherietoxin hemmt die Proteinsynthese in Eukaryoten durch Übertragung einer ADP-Riboseeinheit (rot) vom NAD+ auf Diphthamid, einen modifizierten Aminosäurerest des EF2 (Translokase). Diphthamid entsteht durch posttranslationelle Modifikation (blau) eines Histidins. Die dreidimensionale Struktur der 30S-Untereinheit des Ribosoms (rechts) wurde gelöst, auch im Komplex mit verschiedenen Antibiotika. Diese Information ist für das Verständnis der Wirkung dieser Substanzen von höchster Bedeutung. Bild: Röntgenstruktur der 30S-Untereinheit der E. coli Ribosoms

21 Page 21 of Genauigkeit des DNA-Metabolismus DNA-Replikation Polymerase-Fehlerrate Korrekturlesen Fehlpaarungsreparatur Gesamt ~10(e-5) ~10(e-2) ~10(e-3) ~10(e-10) Transkription RNA Polymerase-Fehlerrate Gesamt ~10(e-4) ~10(e-4) Translation Schritt 1: Spezifität der Erkennung von trna durch Aminoacyl-tRNA-Synthetase Schritt 2: Korrekturfähigkeit der Aminoacyl-tRNA-Synthetase Schritt 3: Geschwindigkeit der GTP-Hydrolyse auf ET-Tu Gesamt ~10(e-4) Lernziele Kenntnis über die unterschiedlichen RNA-Arten Unterschiede zwischen RNA- und DNA-Synthese kennen (z.b. in Bezug auf Primer, NTPs/dNTPs usw.) Transkriptionsstadien kennen (Initiation, Elongation, Termination) Was ist ein Promotor? Enhancer? Grundsätzliches Verständnis über den Mechanismus der Transkriptionsinitiation von Genen, welche von der RNA-Pol II transkribiert werden Rolle der Transkriptionsfaktoren in der zell- und gewebespezifischen Genexpression verstehen Aktivierung der Transkriptionsfaktoren kennen (z.b. durch Phosphorylierung) Prozessierung der eukaryotischen RNA verstehen (z.b. Capping, Spleissen, Polyadenylierung) trna-eigenschaften kennen (CCA-Ende, Anticodonschleife) Aktivierung von trna als Träger von Aminosäuren verstehen Grundsätzliches Verständnis über die Stadien der Proteinsynthese (Initiation, Elongation, Termination) Codon-Anticodon-Interaktionen (Wechselwirkung) verstehen (mit Hilfe des genetischen Codes: jede beliebige RNA-Sequenz in die entsprechende Peptidsequenz übersetzen können) Rolle von Inosinresten im Anticodon kennen Prokaryotische versus eukaryotische Proteinsynthese: Unterschied in der Startstelle (Shine- Dalgarno, Kozak) kennen Die wichtigsten Hemmstoffe der Proteinsynthese (Antibiotika) kennen