14 Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Information

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1 14 Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Information Die genetische Information (Erbgut) eines Lebewesens ist in seinem Genom gespeichert, das aus DA besteht. Die einzelnen codierenden Einheiten werden Gene genannt. Die meisten Gene sind Baupläne für Proteine. Jede Zelle enthält das ganze Erbgut. Vor der Zellteilung muss die DA verdoppelt werden (Replikation). Die Genexpression ist die Umsetzung eines Gens in das kodierte Protein, sie ist gut reguliert. Die DA muss zunächst im Zellkern in mra umgeschrieben werden (Transkription). An den Ribosomen im Zytosol findet dann die Proteinbiosynthese (Translation) statt, die Übersetzung der mra in die Aminosäuresequenz Zusammenfassung des Proteins. Proteine werden während und nach der Translation prozessiert und an ihre Wirkorte innerhalb und außerhalb der Zelle gebracht. Ihr Abbau erfolgt durch Proteasen. Durch verschiedene äußere und innere Einflüsse (hemikalien, Strahlung, Viren, spontan) ist die DA einem Mutationsrisiko ausgesetzt, weshalb sie Reparaturmechanismen benötigt. Erfolgen diese nur unzureichend, können Krankheiten (Erbkrankheiten, Tumorerkrankungen) die Folge sein. Das Wissen um die Mechanismen des Genoms lässt sich in der Biotechnologie u. a. für die Synthese von Proteinen und Analyse von Erbgut nutzen ukleotide Zum Aufbau, zur Struktur sowie zur Bedeutung der ukleotide als Einzelmoleküle und als Bestandteil der uklein säuren Kap. 7. Merke Zur Wiederholung ukleoside und ukleotide: Base + Zucker = ukleosid (z. B. Adenosin, Desoxyadenosin) Base + Zucker + (1 3 Moleküle) Phosphat = ukleotid (ukleosidphosphat) Base + Zucker + 1 Phosphat = ukleosidmonophosphat (z. B. MP und dmp) Base + Zucker + 2 Phosphate = ukleosiddiphosphat (z. B. GDP und dgdp) Base + Zucker + 3 Phosphate = ukleosidtriphosphat (z. B. UTP und TTP) Purin- und Pyrimidinbasen: Purinbasen (bizyklisch): Adenin, Guanin Pyrimidinbasen (monozyklisch): Thymin, ytosin Tab listet alle Basen, ukleoside und ukleotide zur Verdeutlichung auf Synthese Für die Synthese der Purin- und Pyrimidinnukleotide wird doppelt aktivierte Ribose, 5-Phosphoribosyl-1-pyrophosphat (PRPP), benötigt. Während das bizyklische Ringsystem der Purinbasen direkt auf ein Molekül PRPP aufgebaut wird, wird der Pyrimidinmonozyklus erst synthetisiert und dann auf PRPP übertragen. Synthese und Aktivierung der Ribose Ribose entsteht im oxidativen und im nichtoxidativen Zweig des Pentosephosphatwegs ( Kap ) in ihrer einfach aktivierten Form (Ribose-5-phosphat). Für die ukleotidsynthese muss der Zucker zusätzlich am 1-Atom aktiviert werden, wo das Purinringsystem aufgebaut bzw. der fertige Pyrimidinring angebaut werden soll. Diese Aktivierung führt das Enzym Ribose-5-phosphat-Pyrophosphokinase durch, indem es Pyrophosphat (PP i ) von ATP überträgt: Ribose-5-P + ATP Tab Basen, ukleoside und ukleotide. Base ukleosid ukleotid Adenin ytosin Guanin Uracil Thymin Adenosin (RA) Desoxyadenosin (DA) ytidin (RA) Desoxycytidin (DA) Guanosin (RA) Desoxyguanosin (DA) Uridin (RA) Thymidin* (DA) Ribose-5-phosphat- Pyrophosphokinase PRPP + AMP Es entsteht die doppelt aktivierte Ribose, das 5-Phosphoribosyl-1-pyrophosphat (PRPP). Das Enzym Ribose-5-phosphat- Pyrophosphokinase unterliegt einer Feedback-emmung: Das vorläufige Endprodukt der Purinnukleotidsynthese, Inosinmonophosphat (IMP), sowie die Endprodukte AMP und GMP (in geringerer Ausprägung auch ADP und GDP) verringern seine Aktivität. Synthese der Purinnukleotide Synthese von Inosinmonophosphat (IMP) IMP ist das Zwischenprodukt der Purinsynthese und wird in mehreren Schritten synthetisiert (Abb. 14.1): Das Enzym Glutamin-Phosphoribosyl-Amidotransferase katalysiert die Substitution der Pyrophosphat-Gruppe an Adenosinmonophosphat (AMP, Adenylat), -diphosphat (ADP), -triphosphat (ATP) Desoxyadenosinmonophosphat (damp, Desoxyadenylat), -diphosphat (dadp), -triphosphat (datp) ytidinmonophosphat (MP, ytidylat), -diphosphat (DP), -triphosphat (TP) Desoxycytidinmonophosphat (dmp, Desoxycytidylat), -diphosphat (ddp), -triphosphat (dtp) Guanosinmonophosphat (GMP, Guanylat), -diphosphat (GDP), -triphosphat (TP) Desoxyguanosinmonophosphat (dgmp, Desoxyguanylat), -diphosphat (dgdp), -triphosphat (dgtp) Uridinmonophosphat (UMP, Uridylat), -diphosphat (UDP), -triphosphat (UTP) Thymidinmonophosphat (TMP, Thymidylat)*, -diphosphat (TDP)*, -triphosphat (TTP)* * Es ist üblich, nicht von Desoxythymidin, sondern lediglich von Thymidin zu sprechen, da praktisch nur eine Desoxy-Form existiert. 1

2 14 Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Information 2 P Gln P 3 + Glu P P ATP + Gly 1 2 P Ribose P PRPP Ribose 2 5-Aminoimidazol- Ribonukleotid 5 ADP + P i ATP PP i P Ribose 5-Phosphoribosyl-1-amin 2 Formyl-Glycinamidin- Ribonukleotid ADP + P i Gln + 2 ADP + P i 3 + Glu 4 ATP TF P Glycinamid- Ribonukleotid 3 TF Ribose 2 Formyl-Glycinamid- Ribonukleotid (ATP +) 6 (ADP + P ) i P Ribose P Ribose 2 arboxyaminoimidazol- Ribonukleotid ATP + Asp 7 ADP + P i P Ribose 2 2 P Ribose Inosinmonophosphat (IMP, Inosinat) 2 TF 9 8 P Ribose P Ribose Abb Synthese der Purinnukleotide bis zum IMP (bei Säugetieren TF entfällt offenbar der ATP- Verbrauch bei Schritt 6). [3] 2

3 14.1 ukleotide 1 des PRPP durch eine Aminogruppe. Es entsteht 5-Phosphoribosyl-1-amin (1). Donor der Aminogruppe ist die AS Glutamin: Diese wird am katalytischen Zentrum des Enzyms zu Glutamat und Ammoniak ( 3 ) hydrolysiert, 3 trifft durch einen Tunnel im Enzym auf PRPP. Die gleichzeitige Abspaltung des Pyrophosphats von PRPP liefert die Energie für diese Schrittmacherreaktion (ommitted step) der Purinbiosynthese. Das Enzym ist, einem ommitted step gemäß, wirksam reguliert: Durch PRPP wird es aktiviert, durch ATP, ADP, AMP sowie GTP, GDP, GMP und IMP gehemmt (Feedback-emmung). Im nächsten Schritt kommt die Aminosäure Glycin ins Spiel. Ihre arboxylgruppe wird zunächst phosphoryliert. So aktiviert, kann sie mit der Aminogruppe des 5-Phosphoribosyl-1-amins reagieren. Es entsteht die Verbindung Glycinamid-Ribonukleotid (2). An der freien Aminogruppe des Glycin-Anteils wird nun ein -Atom durch einen Formylrest ersetzt. Donor der Formylgruppe ist 10 -Formyl-Tetrahydrofolsäure ( 10 - Formyl-TF oder -F 4 ). Es entsteht das Formyl-Glycinamid-Ribonukleotid (3). un wird das -Atom, das an der inneren Amidbindung des Moleküls beteiligt ist, unter ATP-Verbrauch aktiviert. Durch Übertragung einer Aminogruppe auf dieses -Atom, die wie im ersten Schritt von Glutamin stammt, entsteht ein Amidin. Das entstandene Zwischenprodukt heißt Formyl-Glycinamidin-Ribonukleotid (4). Das Formyl-Glycinamidin-Ribonukleotid zyklisiert zum 5-Aminoimidazol-Ribonukleotid (5). Dabei wird 2 freigesetzt und ein Molekül ATP verbraucht. Der entstandene 5-Zyklus (Imidazolring) wird von aktiviertem ydrogencarbonat (phosphoryliertes 3, bei Säugern wohl keine Phosphorylierung nötig) carboxyliert, zunächst an der Aminogruppe, dann durch intramolekulare Umlagerung am 5-Atom (6). Dann wird der arboxylatrest des Imidazolrings unter ATP-Verbrauch aktiviert, um mit der Aminosäure Aspartat unter Ausbildung einer Peptidbindung zu kondensieren. Vom Aspartat bleibt nur eine Aminogruppe 10 -Formyl-TF Glutamin Glycin 3 R Glutamin Aspartat 10 -Formyl-TF Abb erkunft der Atome der Purinbase ypoxanthin (Base des IMP). [3] zurück, der Rest wird als Fumarat (ein Zwischenprodukt des itratzyklus) abgespalten (7). 10 -Formyl-TF liefert das letzte fehlende -Atom (8). un kann der zweite Ring unter 2 -Abspaltung geschlossen werden. Das Ergebnis ist Inosinmonophosphat (IMP), das ukleotid mit der Base ypoxanthin (9). Merke Die Synthese der Purinnukleotide beginnt mit PRPP, auf das der Bizyklus aufgebaut wird. Zwischenprodukt ist Inosinmonophosphat (IMP). Es entsteht unter Beteiligung von einem PRPP, zwei Glutaminen, einem Glycin, zwei 10 -Formyl-TF und einem Aspartat. Insgesamt werden bei Säugern vier ATP (die Pyrophosphat-Abspaltung von PRPP nicht mitgerechnet) und zwei energiereiche 10 -Formyl-TF verbraucht. Abb zeigt zusammenfassend die erkunft der Atome der Purinbase ypoxanthin. Synthese von AMP und GMP aus IMP (Abb. 14.3) AMP wird praktisch in einem Schritt aus IMP gebildet. Dabei wird der arbonylsauerstoff am 6-Atom durch eine Aminogruppe ersetzt. Diese liefert die AS Asparaginsäure (Aspartat) unter Abspaltung von Fumarat. Katalysiert wird die Reaktion von der Adenylsuccinat-Synthetase; die Energie stammt aus der ydrolyse von GTP. 2 2 P 2 IMP GTP + Asp AD+ + 2 GDP + P i AD + + P Ribose Adenylsuccinat P Ribose Xanthinmonophosphat (XMP, Xanthylat) P Fumarat Gln Glu 3 ATP Ribose Adenosinmonophosphat (AMP, Adenylat) AMP + PP i P Ribose 2 Guanosinmonophosphat (GMP, Guanylat) Abb Bildung von AMP und GMP aus IMP. [3] 3

4 14 Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Information Die GMP-Synthese ist etwas aufwändiger. Zunächst oxidiert die IMP-Dehydrogenase IMP zu Xanthosinmonophosphat (XMP). Ein 2 -Molekül liefert dabei den Sauerstoff, der am 2-Atom angreift, Wasserstoffakzeptor ist AD +. Die entstehende Ketogruppe ist nicht von Dauer: Der Sauerstoff wird durch Übertragung einer AMP-Gruppe aktiviert (ATP- Verbrauch!) und dann durch eine 2 -Gruppe (aus Glutamin) ersetzt. Das verantwortliche Enzym GMP-Synthetase wird durch GMP gehemmt (Produkthemmung). Da die Adenylsuccinat-Synthetase GTP und die GMP-Synthetase ATP benötigt, sind die Synthesen beider ukleotide aneinandergekoppelt. Synthese der Pyrimidinnukleotide Synthese von Uridinmonophosphat (UMP) UMP ist das vorläufige Endprodukt der Pyrimidinnukleotidsynthese und wird in mehreren enzymkatalysierten Schritten synthetisiert (Abb. 14.4): ydrogencarbonat ( 3 ) wird phosphoryliert und dadurch aktiviert. Das entstandene arboxyphosphat reagiert mit Ammoniak ( 3 ) zur arbaminsäure. Durch deren Phosphorylierung entsteht arbamoylphosphat. Die komplette Reaktion wird von der arbamoylphosphat-synthetase II des Zytosols katalysiert (1 a c). 3 stammt in der Regel aus der ydrolyse von Glutamin. Im nächsten Schritt verbindet die Aspartat-Transcarbamoylase arbamoylphosphat mit Aspartat zu arbamoylaspartat (2). Dabei wird ein Molekül Phosphat frei. Das arbamoylphosphat zyklisiert, katalysiert durch die Dihydroorotase, zu dem Sechsring Dihydroorotat (3). Die rotat-dehydrogenase oxidiert dieses Molekül zu rotat, wobei sie das osubstrat AD + zu AD+ + reduziert (4). un erst tritt PRPP hinzu: rotat reagiert mit PRPP unter Abspaltung von Pyrophosphat zu rotidin(-5 -)monophosphat (MP, rotidylat). Diese Reaktion wird von der Pyrimidin-Phosphoribosyltransferase katalysiert (5). Die rotidylat-decarboxylase (MP-Decarboxylase) decarboxyliert MP zu Uridin(-5 -)monophosphat (UMP, Uridylat). Mit UMP ist bereits das erste ukleotid der RA fertiggestellt, es enthält die Base Uracil (6). Merke Die Synthese der Pyrimidinnukleotide beginnt mit dem Aufbau des Monozyklus, ausgehend von arbamoylphosphat. Der fertige Zyklus wird dann auf PRPP übertragen. arbamoylphosphat ist Zwischenprodukt bei der arnstoffsynthese im Lebermitochondrium, es entsteht hier aus 4 + und 3 (sowie 2 ATP). Die Reaktion wird durch die arbamoylphosphat-synthetase I katalysiert (Aktivator: -Acetylglutamat). bei der Pyrimidinsynthese im Zytoplasma, es entsteht hier aus der Aminogruppe am δ--atom von Glutamin und 3 (sowie 2 ATP). Die Reaktion wird durch die arbamoylphosphat-synthetase II katalysiert (Aktivator: PRPP, Inhibitor: UTP). ATP 1a ADP 3 P i ATP ADP 2 2 P 1b 2 1c P 2 ydrogencarbonat arboxyphosphat arbaminsäure arbamoylphosphat Aspartat 2 P i 4 AD rotat AD + + Dihydroorotat 2 arbamoylaspartat PRPP 5 PP i P 2 6 P 2 rotidinmonophosphat (MP, rotidylat) Uridinmonophosphat (UMP, Uridylat) Abb Pyrimidinnukleotid-Synthese bis zum UMP. 4

5 14.1 ukleotide Synthese von TP und TMP (Abb. 14.5) Für die Synthese von TP wird UMP zunächst durch zweimalige Phosphorylierung in UTP umgewandelt. un katalysiert die TP-Synthetase den Austausch des Keto-Sauerstoffs am 4-Atom des Pyrimidinrings gegen eine Aminogruppe. Für die Synthese von TMP wird UMP zunächst zu UDP phosphoryliert. Anschließend wird UDP zu dudp reduziert (s. u., Reduktion von ukleotiden zu Desoxynukleotiden). Durch Abspaltung eines Phosphatmoleküls entsteht dump. Die Thymidylat-Synthase methyliert den Pyrimidinring des dump, wodurch TMP gebildet wird. Donor der Methylgruppe ist ( )Methylen-Tetrahydrofolat (TF). ach der Reaktion liegt es oxidiert als Dihydrofolat (DF) vor und wird mit ilfe von AD+ + wieder rege neriert. Aus TF lässt sich mit der Aminosäure Serin als Methylgruppendonor wieder Methylen-TF gewinnen (Abb. 14.5). Merke Alle Ribonukleotide außer TP liegen nach ihrer Synthese stets zunächst als ukleosidmonophosphate vor. TP entsteht aus UTP. Alle Desoxyribonukleotide außer TMP liegen nach ihrer Synthese stets zunächst als ukleosiddiphosphate vor. TMP entsteht aus dump. Klinik Ein Antimetabolit ähnelt in seiner Struktur dem physiologischen Substrat eines Enzyms. Er wird wie das echte Substrat gebunden, kann dann aber nicht bzw. nicht korrekt verstoffwechselt werden. Dadurch hemmt er das Enzym kompetitiv. Sulfonamide sind Antimetaboliten der bakteriellen Folsäuresynthese. Sie hemmen ein dabei beteiligtes bakterielles Enzym, weil sie einer Zwischenstufe (p-aminobenzoesäure) ähneln. Menschliche Zellen, die selbst keine Folsäure herstellen, sind nicht betroffen. Purin- und Pyrimidinanaloga sowie Folsäureantagonisten sind emmstoffe der ukleotidsynthese, die als Antimetaboliten wirken. Sie werden als Zytostatika eingesetzt, d. h., sie hemmen die Zellteilung, insbesondere bei teilungsaktiven Zellen wie Tumorzellen ( Kap. 14.5): Das Purinanalogon Mercaptopurin ist ein Basenanalogon. Es hemmt verschiedene Enzyme der Purinbiosynthese kompetitiv (z. B. die Inosinmonophosphat- Dehydrogenase) und unterdrückt somit die DA- und RA-Synthese. Außerdem wird es in Form von Mercaptopurinnukleotiden in die DA eingebaut, was zu fehlerhafter Replikation führt. Bei den Pyrimidinanaloga wirkt 5-Fluorouracil (5-FU) als Basenanalogon; es hemmt die Thymidylat-Synthase (TMP-Synthese blockiert). ytosinarabinosid (ytarabin) hingegen wirkt als ukleosidanalogon: Es enthält die Base ytosin und statt Ribose den epimeren Zucker Arabinose (unterschiedliche Stellung der -Gruppe am 2-Atom). Als ukleotid wird es in die DA eingebaut und stört so deren weitere Replikation. Folsäureantagonisten hemmen die Dihydrofolat-Reduktase, so dass DF nicht in TF umgewandelt werden kann. Da TF ein ofaktor der Purin- und Pyrimi dinnukleotidsynthese ist, kommt diese zum Erliegen. Die wichtigsten Folsäureantagonisten sind Methotrexat und Aminopterin. Phosphorylierung der Ribonukleosidmonound -diphosphate Ribonukleosidmonophosphate werden zu -di- und -triphosphaten durch einmalige bzw. zweimalige Phosphorylierung: Katalysierendes Enzym zum Diphosphat ist eine ukleosidmonophosphat-kinase (MP-Kinase). osubstrat ist ATP: MP + ATP DP + ADP. Entsprechend katalysiert zum Triphosphat eine ukleo siddiphosphat-kinase (DP-Kinase). osubstrat ist meist ATP: DP + ATP TP + ADP. Eine besonders wichtige MP-Kinase ist die Adenylatkinase (AMP-Kinase). Sie katalysiert die Reaktion AMP + ATP 2 ADP. ur aus ADP kann in Atmungskette und Glykolyse ATP regeneriert werden. Gln Glu 2 2ATP UTP 2 ADP ATP ADP + P i P P P 2 TP P 2 ADP + + UMP ADP +P i ADP + ATP dump 5, 10-Methylen-Tetrahydrofolat Dihydrofolat P 2 TMP 3 Abb Synthese von TP und TMP aus UMP. [3] 5

6 14 Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Information P P 2 Base P P 2 Ribonukleotid-Reduktase Thioredoxin FAD 2 Reduktion von Ribonukleotiden zu Desoxyribonukleotiden Desoxyribonukleotide entstehen aus Ribonukleotiden, katalysiert durch das Enzym Ribonukleotid-Reduktase. Substrat des Enzyms sind ausschließlich Ribonukleosiddiphosphate (Abb. 14.6). MPs müssen also zunächst phosphoryliert werden. Die Reduktion verläuft folgendermaßen: Im aktiven Zentrum enthält die Ribonukleotid-Reduktase zwei ysteinylreste, also S-Gruppen. Diese binden die 2 --Gruppe der Ribose und reduzieren das 2 --Atom durch einen Mechanismus, bei dem insgesamt zwei e und zwei + übertragen werden. Der Sauerstoff des 2 --Atoms wird in Form von 2 abgespalten. Von den ysteinylresten des Enzyms verbleiben, nachdem sie jeweils ein Wasserstoffatom (je ein Proton und ein Elektron) abgegeben haben, zwei Schwe felradikale. Diese verbinden sich zu einer Disulfidbrücke (S-S-Bindung). Für eine weitere Katalyse muss das Enzym in seine reduzierte Form überführt, also regeneriert werden. Dies gewährleistet Thioredoxin, ein Protein, das eine noch stabilere S-S-Brücke als das Enzym ausbildet und dessen Disulfidbrücke deshalb reduzieren kann. xidiertes Thioredoxin wird über die xidation von FAD 2 zu FAD in seine reduzierte Form zurückverwandelt. Zuletzt wird aus FAD durch die xidation von ADP+ + zu ADP + wieder FAD 2. ADP+ + stammt vor allem aus dem Glucoseabbau im Pentosephosphatweg. Unter dem Strich ist also zu bilanzieren: DP + ADP+ + Ribonukleotid- Reduktase Ribonukleotid-Reduktase S S S S S S Thioredoxin ddp + ADP Durch anschließende Phosphorylierung der ddps entstehen dtps, die Substrate der DA-Synthese. S FAD ADP + ADP + + v. a. Pentosephosphatweg S Base + Abb Mechanismus der Ribonukleotid-Reduktase und beteiligte ilfsreaktionen. Reduzierte ( einsatzfähige ) Reduktionsmittel sind grün dargestellt, oxidierte ( verbrauchte ) rot. [3] Funktion Funktion der Ribonukleotide Eine Reihe von Enzymklassen (Tab. 14.2) verwendet TPs, um Energie zu gewinnen, zu regulatorischen Zwecken oder als Bausteine. Energielieferanten TPs enthalten energiereiche Bindungen ( Kap. 10.4). Transferasen verwenden ATP und andere TPs, um Moleküle für anabole Stoffwechselwege zu aktivieren. ft erfolgt die Aktivierung über Phosphorylierung durch Kinasen (Phosphoryl-Gruppen übertragende Transferasen): Um ein Molekül zu aktivieren, wird an die entsprechende Bindung ein Phosphat (oder Pyrophosphat), das von einem TP stammt, angehängt. In manchen Fällen erfolgt an der zu aktivierenden Stelle auch die Verknüpfung mit ukleosiden oder ukleotiden: PAPS (Phosphoryladenosyl-Phosphosulfat) ist das aktivierte Sulfat, UDP-Glucose (Uridindiphosphat-Glucose) ist die aktivierte Form der Glucose. Derart aktiviert, kann Glucose z. B. in Glykogen eingebaut werden. DP-holin (ytidinphosphat-holin): In dieser aktivierten Form kann holinphosphat (nicht holin) unter MP-Abspaltung auf Akzeptoren übertragen werden. Mit Diacylglycerol (DAG) als Akzeptor entsteht Phosphatidylcholin (Lecithin). SAM (S-Adenosyl-Methionin) entsteht aus der Aminosäure Methionin und dient der Übertragung von Methylgruppen, z. B. auf oradrenalin unter Bildung von Adrenalin. Ligasen knüpfen unter TP-Verbrauch thermodynamisch ungünstige Bindungen. ydrolasen, die TPs hydrolysieren und dabei Konformationsänderungen erfahren, ermöglichen in der Zelle eine Vielzahl unterschiedlicher Prozesse. Beispiele dafür sind aktiver Membrantransport (z. B. durch die Pumpe a + -K + - ATPase), intrazelluläre Transportaktivitäten (z. B. Kinesin- ATPase) oder Bewegungsvorgänge (z. B. Myosin-ATPase). Signalmoleküle und Regulatoren Zyklisches AMP (camp) bzw. GMP (cgmp) sind Second messenger ( Kap ). Der Status regulatorischer G-Proteine ( an/aus ) wird über GTP und dessen ydolyse reguliert. Tab TP-verbrauchende und nicht-tp-verbrauchende Enzymklassen. Enzymklasse katalysierte Reaktion TP-Verbrauch xidoreduktasen Redox-Reaktionen nein Transferasen Gruppentransfer manche, z. B. Kinasen ydrolasen ydrolysen manche, z. B. a + -K + -ATPase Lyasen Spaltung oder Bildung von Bindungen nein ohne Energieverbrauch Isomerasen Isomerisierungen nein Ligasen Spaltung oder Bildung von Bindungen unter Energieverbrauch ja 6

7 14.1 ukleotide Viele Kinasen verwenden ATP als osubstrat, um Enzyme durch Übertragung eines Phosphatrests zu regulieren (Interkonversion, Kap. 11.4). Ganz allgemein ist die Aktivität der TP-verbrauchenden Enzyme an das Angebot an TPs (und somit den Energieinhalt der Zelle) gekoppelt. Bausteine für die RA ( Kap ) Bausteine für oenzyme Dinukleotid-oenzyme wie AD (ikotinamidadenindinukleotid), ADP (AD-Phosphat) und FAD (Flavinadenindinukleotid) entstehen auf der Basis von ATP. Auch oenzym A und obalamin enthalten einen AMP-Anteil. Funktion der Desoxyribonukleotide Sie sind Bausteine für die DA ( Kap ). In ihrer Abfolge ist die Erbinformation gespeichert Abbau und Wiederverwertung Die ukleotidsynthese ist aufwendig und energieintensiv, insbesondere die Synthese der bizyklischen Purinbasen. Deshalb werden ukleotide häufig nicht komplett, sondern lediglich zu ukleosiden oder Basen abgebaut, die bei Bedarf der Synthese neuer ukleotide dienen (Wiederverwertung, Salvage pathway). Abbau der ukleotide zu Basen Der Abbau aller ukleotide beginnt auf der Stufe der ukleosidmonophosphate. Adenosinmonophosphate werden in der Regel zunächst in IMP umgewandelt: AMP wird in den meisten Geweben durch die AMP-Desaminase desaminiert, wodurch IMP entsteht ( Abb. 14.7), das die Base ypoxanthin enthält. damp muss zunächst dephosphoryliert werden, um dann von der Adenosin-Desaminase (ADA) zu Desoxyinosin desaminiert zu werden. Die übrigen ukleosidmonophosphate werden direkt abgebaut. Um sie so weit abzubauen, dass die Basen isoliert vorliegen, sind zwei Schritte (und zwei Enzyme) nötig: Die ukleotidase katalysiert die ydrolyse des Monophosphats: 2 ukleosidmonophosphat (z. B. GMP) + 2 ukleosid (z. B. Guanosin) + P i Die Spaltung der Bindung zwischen Zucker und Base erfolgt hydrolytisch (ukleosidase): ukleosid (z. B. ytidin) + 2 (Desoxy-)Ribose + Base (z. B. ytosin) phosphorolytisch (ukleosid-phosphorylase): ukleosid (z. B. Desoxyguanosin) + P i (Desoxy-)Ribose-1-P + Base (z. B. Guanin) Abbau der Basen Abbau der Purinbasen (Abb. 14.7) Guanin und ypoxanthin (aus dem AMP-Abbau) werden zunächst in die Purinbase Xanthin umgewandelt. Dies geschieht bei Guanin durch Desaminierung (katalysiert von der Guanase), bei ypoxanthin durch xidation (katalysiert von der Xanthin-xidase). Dieselbe Xanthin-xidase oxidiert dann Xanthin zu arnsäure. ierbei wird molekularer Sauerstoff ( 2 ) gespalten und ein Atom auf Xanthin übertragen. Das zweite Sauerstoffatom wird auf 2 übertragen, so dass 2 2 entsteht. 2 2 wird von Peroxidasen abgebaut. Die Xanthin-xidase ist ein molybdän- und eisenhaltiges Flavoprotein der Leber und gehört zur Enzymgruppe der Monooxygenasen. Beim Menschen und bei anderen Primaten endet der Abbau der Purinbasen mit der arnsäure (bzw. deren Salz = Urat), die mit dem Urin ausgeschieden wird. Die meisten Säugetiere setzen den Abbau bis zu Allantoin, andere Tiere bis zum arnstoff fort. Abbau der Pyrimidinbasen ytosin wird zum Zwecke seines Abbaus zunächst zu Uracil desaminiert. Uracil und Thymin werden unter Verwendung von ADP+ + reduziert. Es entstehen Dihydrouracil und Dihydrothymin. Beide Moleküle sind noch Ringsysteme. Die Ringe werden dann hydrolytisch gespalten (zwischen 3 und 4). Im nächsten Schritt werden 3 und 2 abgespalten. Dabei entsteht beim Uracil-Abbau β-alanin, das zu Acetat, 2 und 3 abgebaut wird Ribose P Ribose P AMP IMP ypoxanthin Xanthin Guanin Urat + arnsäure Abb Purinabbau bei Mensch und anderen Primaten. [3] 7

8 14 Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Information beim Thymin-Abbau β-aminoisobutyrat. Dieses wird zu Propionat, 2 und 3 abgebaut oder durch Transaminierung und xidation in Methylmalonyl-oA umgewandelt. Methylmalonyl-oA kann über Umwandlung in Succinyl-oA in den itratzyklus einfließen. Wiederverwertung von Basen und ukleosiden Basen-Recycling Bis zu 90 % der freien Purinbasen werden wiederverwendet und nicht abgebaut: Die Adenin-Phosphoribosyl-Transferase überträgt Adenin auf PRPP unter Pyrophosphat-Abspaltung: Adenin + PRPP AMP + PP i (freies Adenin stammt aus ebenwegen des Abbaus von Adenosinphosphaten.) Die ypoxanthin-guanin-phosphoribosyltransferase (GPRT) katalysiert die Bildung von IMP und GMP aus PRPP und den entsprechenden Basen. Guanin + PRPP GMP + PP i ypoxanthin + PRPP IMP + PP i Bei den weniger komplexen Pyrimidinen ist die Bedeutung des Basen-Recyclings geringer. Es existiert jedoch auch eine Pyrimidin-Phosphoribosyltransferase. ukleosid-recycling Adenosin-Kinase, Guanosin-Kinase und Uridin-ytidin-Kinase phosphorylieren die entsprechenden ukleoside, so dass ukleosidmonophosphate entstehen Pathobiochemie yperurikämie und Gicht Beim Menschen (und bei anderen Primaten) endet der Purinnukleotid-Abbau mit der arnsäure, die im Blut nur in begrenztem Maße löslich ist. Bei ererbter oder erworbener Minderung der arnsäureausscheidung oder Steigerung der Purinnukleotidsynthese sowie durch purinreiche Ernährung (z. B. Innereien) steigt der arnsäurespiegel im Blut an (yperurikämie, bei Männern > 8 mg arnsäure/dl Plasma, bei Frauen > 6 mg/dl). Ist das Löslichkeitsvermögen von arnsäure erschöpft, so fallen in verschiedenen Geweben Urate (Salze der arnsäure) aus. Die auftretenden Beschwerden sind die Symptome der Gicht: Arthritis urica: atriumuratkristalle in den Gelenken führen zu Entzündungsreaktionen. Gichtnephropathie: Uratkristalle lagern sich in den ierentubuli ab, mit der Folge einer progredienten iereninsuffizienz (Uratniere). Von primärer yperurikämie spricht man, wenn ein vererbter Stoffwechseldefekt für den Anstieg des arnsäurespiegels verantwortlich ist, z. B.: polygen vererbte Verminderung der tubulären arnsäuresekretion (ca. 75 % aller Fälle), Fehlen von Salvage-Enzymen (z. B. GPRT, s. u. Lesch- yhan-syndrom ), yperaktivität der Xanthin-xidase. Diverse Krankheiten und Umstände haben eine sekundäre yperurikämie zur Folge: Bei iereninsuffizienz, Keto- und Lactatazidose ist die arnsäureausscheidung vermindert. Bei Psoriasis, Zytostatika- und Strahlentherapie sterben Zellen ab, so dass vermehrt Purine anfallen. Bei Erkrankungen des hämatopoetischen Systems wie Leu k- ämien oder Polycythaemia rubra vera ist die Purinnukleotidsynthese gesteigert. Die Therapie der yperurikämie besteht in Reduktion der Purin-Zufuhr: insbesondere Verzicht auf Innereien; auch Fleisch, Fisch, Meeresfrüchte, ülsenfrüchte und Spargel sind purinreich (Milch hingegen ist purinarm). Auch hilfreich sind Gewichtsreduktion (aber Vorsicht: zu drastische Einschränkung der Kalorienzufuhr führt zur vermehrter Bildung von Ketonkörpern, die die tubuläre arnsäuresekretion hemmen. So kann Reduktionsdiät einen Gichtanfall auslösen!), Alkoholverzicht (auch Alkohol behindert die tubuläre arnsäuresekretion!) und vermehrte Flüssigkeitszufuhr. der Gabe von Medikamenten: Urikostatika (z. B. Allopurinol) hemmen die Xanthin- xidase, d. h., die Bildung von arnsäure wird unterdrückt und die Vorstufen Xanthin und ypoxanthin werden renal eliminert. Urikosurika (z. B. Probenecid) steigern die arnsäureausscheidung, indem sie die tubuläre Rückresorption hemmen. Lesch-yhan-Syndrom ier besteht ein X-chromosomal-rezessiv vererbter Defekt der ypoxanthin-guanin-phosphoribosyltransferase (GPRT), der die Wiederverwertung der Purinbasen stört. Durch vermehrten Basenabbau ist die arnsäureproduktion erhöht, was zu primärer yperurikämie führt. Zusätzlich wird die De-novo-Synthese der Purinnukleotide stimuliert, was die Folgen des Defekts weiter verschlimmert: bereits im Säuglings- und Kindesalter ierensteine und Gicht, autoaggressives Verhalten, Spastik und geistige Behinderung (die Ursachen dieser Symptome sind unbekannt) Adenosin-Desaminase-Mangel und SID Bei Patienten mit Adenosin-Desaminase(ADA)-Mangel kann Desoxyadenosin nicht in Desoxyinosin umgewandelt werden. Stattdessen wird angereichertes Desoxyadenosin enzymatisch in bei höheren Konzentrationen toxisches datp verwandelt. Besonders betroffen sind Lymphozyten, die im gesunden rganismus eine sehr hohe ADA-Aktivität aufweisen. Die toxische Wirkung besteht vermutlich vor allem darin, dass datp die Ribonukleotid-Reduktase und damit die DA-Synthese in B- und T-Zellen hemmt. Dies führt zu einem schweren Immundefekt: Etwa 50 % der Patienten mit Severe combined immunodeficiency syndrome (SID) weisen einen Adenosin- Desaminase-Mangel auf ukleinsäuren Desoxyribonukleinsäure (DS; oder DA = desoxyribonucleic acid) und Ribonukleinsäure (RS; oder RA = ribonucleic acid) kommen im Zellkern (ukleus) gehäuft vor und sind aufgrund ihres Phosphorsäureanteils Säuren. Daher der ame ukleinsäuren. In der DA ist die Erbinformation der Lebewesen kodiert. Verschiedene RA-Spezies (v. a. mra und tra) garantieren den Fluss der genetischen Information vom DA-ode hin zur Aminosäuresequenz der Proteine. eben den Prote- 8

9 14.2 ukleinsäuren inen (Polypeptiden) sind die ukleinsäuren (Polynukleotide) die zentralen Moleküle der. Die genetische Information ist in der DA gespeichert. Vor jeder Zellteilung wird die DA verdoppelt (Replikation) und bei der Zellteilung an die Tochterzellen weitergegeben. Der Großteil dieser Information sind Baupläne für Proteine. Um diese Pläne aus dem Zellkern zu den Ribosomen (den rten der Proteinbiosynthese) im Zytosol zu bringen, wird der betreffende DA-Abschnitt in sog. Messenger-RA (mra) umgeschrieben (Transkription). Diese dient bei der Aneinanderreihung der Aminosäuren zum Protein (Translation) als Vorlage Grundbegriffe Gen Ein Gen ist allgemein formuliert eine kodierende Einheit auf dem DA-Strang. Der Genbegriff wurde mit zunehmender wissenschaftlicher Erkenntnis schwerer zu fassen, so ist die Ein-Gen-ein-Protein-ypothese überholt, weil sowohl verschiedene Gene am Aufbau eines einzigen Proteins beteiligt sein können als auch ein Gen verschiedene Eiweiße (u. a. durch alternatives Spleißen, Kap ) hervorbringen kann. Und schließlich sind auch DA-Abschnitte, die für strukturelle RA (z. B. die in Ribosomen enthaltene RA) kodieren, Gene. Auf DA-Ebene gibt es bestimmte Sequenzen, die ein Gen ausmachen. Ein typisches eukaryontisches (ein Protein codierendes) Gen besitzt (Abb. 14.8): eine Promotorsequenz: Diese Kontrollsequenz enthält die Ansatzstelle für die RA-Polymerase (das Transkriptionsenzym) und ihre ofaktoren, die Transkriptionsfaktoren. ein Start-odon ( Kap ): die ersten drei Basen, die translatiert werden. Diesen gehen jedoch Basen voraus, die transkribiert, aber nicht translatiert werden: die sog. 5 -untranslated region = 5 -UTR. ein Stopp-odon ( Kap ): die drei Basen nach dem letzten translatierten odon. Dem Stopp-odon folgen weitere Basen, die transkribiert, aber nicht translatiert werden: die sog. 3 -untranslated region = 3 -UTR. einen pen reading frame (RF, offenes Leseraster): Dies sind alle Basen zwischen Start- und Stopp-odon. eine Terminatorregion. Man unterscheidet bei Eukaryonten außerdem: Exons: die translatierten, kodierenden Basensequenzen innerhalb eines Gens zuzüglich 5 - und 3 -UTR, Introns: die nichttranslatierten, nichtkodierenden Basensequenzen zwischen den Exons. Sie werden zwar transkribiert, dann aber aus der primären RA herausgeschnitten (Spleißen = Splicing). In reifer mra sind sie nicht mehr enthalten. Durch sog. alternatives Spleißen können zwei oder mehr verschiedene Polypeptide aus einem Gen hervorgehen. Merke Exons = Sequenzen im Gen, die in der reifen mra enthalten sind. Introns = Sequenzen zwischen den Exons, die aus der unreifen RA herausgespleißt werden. Eukaryontischen Genen sind Enhancer-Sequenzen und Silencer-Sequenzen assoziiert. Diese können in 5 -Richtung (upstream) oder in 3 -Richtung (downstream), aber auch innerhalb des Gens liegen. Enhancer (aktivierend) und Silencer (hemmend) beeinflussen die Aktivität eines Gens und werden ihrerseits von Liganden reguliert ( Kap ). Prokaryonten besitzen keine Introns, dafür liegen bei ihnen oft mehrere Strukturgene zwischen Start- und Stopp-odon (polycistronische Gene). Genom Das Genom ist die Gesamtheit aller in einer Zelle vorliegenden genetischen Information, also der Gesamt-DA-Gehalt einer Zelle. Der Begriff schließt sowohl das auptgenom im Zellkern als auch das ebengenom in den Mitochondrien ein (Mitochondrien besitzen eigene DA). Im Prinzip enthält jede kernhaltige Körperzelle das ganze Genom; Unterschiede bestehen lediglich hinsichtlich der Aktivität der einzelnen Gene. Die DA im Zellkern liegt in Form von 46 hromosomen bzw. 23 hromosomenpaaren (diploide Körperzelle) vor: Je zwei hromosomen (ein väterliches und ein mütterliches als Ergebnis der geschlechtlichen Rekombination) sind homolog, d. h., sie besitzen die gleichen Gene (Ausnahme: X- und Y- hromosom). Die Basensequenzen homologer Gene weichen nur geringfügig voneinander ab. Genorte (sog. Loci), die auf den homologen hromosomen unterschiedlich ausgeprägt sein können, werden Allele genannt. Voraussetzung für hromosomenmutationen (-aberrationen) ist ein hromosomenbruch, z. B.: Duplikation: Ein hromosomenabschnitt liegt auf einem hromosom in zweifacher Ausführung vor, z. B. aufgrund von ungleichem rossing-over bei der Meiose. Auf dem homologen hromosom fehlt der Abschnitt. Deletion: Der abgebrochene hromosomenabschnitt fehlt (er wurde zerstört). Translokation: Der abgebrochene Abschnitt eines hromosoms ist in ein nichthomologes hromosom integriert. Inversion: Der abgebrochene hromosomenabschnitt wurde wieder in das betroffene hromosom integriert, liegt aber verkehrt herum vor. Abb Eukaryontisches Gen. 9

10 14 Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Information Das menschliche Genom umfasst ca. 3,2 Milliarden Basenpaare und ca Gene, aus denen durch alternatives Spleißen vermutlich über verschiedene Proteine hervorgehen können. ur ca. 30 % seiner Basensequenzen werden in primäre RA transkribiert. Wiederum nur 5 % der primären mra werden translatiert, nur ca. 1,5 % der Basensequenzen des menschlichen Genoms (ca. 45 Mio. Basen) sind also kodierend. Der nichtkodierende Rest von ca. 98,5 % lässt sich weiter unterteilen in Introns (ca. 25 % des Genoms): nichtkodierende Basensequenzen innerhalb der Gene, nichtkodierende Basensequenzen zwischen den Genen (ca. 70 % des Genoms). Sie werden auch als onsense-sequenzen bezeichnet und lassen sich einteilen in nichtrepetitiv (ca. 20 % des Genoms): Die Sequenz kommt im Genom nur einmal vor. repetitiv (ca. 50 % des Genoms): Die Sequenz kommt im Genom mehrmals vor. Man unterscheidet weiter zwischen hoch- (bis zu mehrere Millionen Mal vorkommenden) und niedrigrepetitiven, zwischen kurzen und langen repetitiven sowie zwischen verstreut und aneinandergereiht (sog. Tandem-repeats, z. B. Gene für die rra) vorliegenden repetitiven Sequenzen. ochrepetitive, kurze Tandem-repeats befinden sich z. B. im Bereich des hromosomenzentrums und der hromosomenenden und erfüllen hier wichtige strukturelle Aufgaben. Repetitive Sequenzen spielen eine wichtige Rolle bei genetischen Untersuchungen ( Kap ). Veränderungen repetitiver Sequenzen können Krankheiten hervorrufen. Merke Das menschliche Genom umfasst: 46 hromosomen (23 hromosomenpaare), ca Gene, ca. 3,2 Milliarden Basenpaare, kodierende (ca. 1,5 %) und nichtkodierende (ca. 98,5 %) Basensequenzen, repetitive und nichtrepetitive Basensequenzen. Der Fluss der genetischen Information Das zentrale Dogma der Molekularbiologie (F. rick) lässt sich wie folgt darstellen: DA Transkription (RA-Polymerase) mra Translation (Ribosom) Protein. Bei allen Eukaryonten liegt der Bauplan für die Proteine (das auptgenom) im Zellkern vor. Die Ribosomen als rt der Proteinbiosynthese befinden sich jedoch im Zytoplasma. Als Boten fungieren hier die sog. Messenger-RAs (mras). Auch die zellkernlosen Prokaryonten verwenden den Zwischenschritt über mras. Die erstellung der einzelsträngigen mras auf der Grundlage eines DA-Strangs als Matrize gewährleistet das Enzym RA-Polymerase, der Vorgang heißt Transkription ( Kap ). Auf Basis der ins Zytoplasma transportierten mra erfolgt an den Ribosomen die Proteinbiosynthese: die als Translation ( Kap ) bezeichnete Übersetzung der mra in die Aminosäuresequenz des kodierten Proteins nach den Regeln des genetischen odes. Am Rande sei bemekt, dass das oben dargestellte Dogma u. a. durch die Entdeckung des retroviralen Enzyms reverse Transkriptase, das RA in DA umschreibt, eine Erweiterung erfahren hat. Der genetische ode Die Information für die Aminosäuresequenz von Polypeptiden ist in der Basensequenz der DA verschlüsselt. Die vier DA-Buchstaben A, T,, G müssen deshalb die 20 protei nogenen Aminosäuren abbilden können. Zwei Basen können nur 4 2, also 16 Buchstaben kodieren. Demnach sind drei Basen für eine eindeutige Kodierung der 20 Aminosäuren nötig, und tatsächlich ist der genetische ode ein Triplett-ode. Die kodierenden Einheiten sind also Basentripletts. Drei Basen könnten 4 3, also 64 Aminosäuren kodieren. Substrate des Ribosoms sind aber nur 20 verschiedene Aminosäuren. Trotzdem kommen alle 64 möglichen Tripletts im Genom vor (Tab. 14.3): Viele Aminosäuren werden von mehreren Tripletts (Synonymen) codiert, die sich meistens nur im dritten Buchstaben unterscheiden. Jedoch wird z. B. Arginin von den sechs odons GG, G, GA, GT sowie AGA und AGG kodiert, für Tryptophan (TGG) und Methionin (ATG) existiert jeweils nur ein Triplett (die Anzahl der im ode vorhandenen Synonyme korreliert nicht mit der Einbaufrequenz der Aminosäure). Wegen der Synonyme enthält der genetische ode nicht das Maximum an Information (64 Aminosäuren); er ist degeneriert und nur in Richtung DA Polypeptid eindeutig. DA-Basen unterliegen u. a. durch äußere Einflüsse (z. B. Strahlung) einer gewissen Mutationswahrscheinlichkeit. Wird dabei eine Base durch eine andere ersetzt, spricht man von einer Substitution oder Punktmutation ( Kap ). Dank der Degeneration des genetischen odes ist eine Substitution der letzten Base eines Tripletts mit relativ hoher Wahrscheinlichkeit ohne Bedeutung. Diese Tatsache wirkt sich also auf die Eigenschaften des kodierten Polypeptids konservativ aus. Auch eine Substitution der ersten Base ist oft nicht schwerwiegend, da der harakter der Aminosäure (hydrophob, hydro- oder Tab Der genetische ode. Position 1 im odon* T Position 2 im odon* T A G Position 3 im odon* T: Phe : Phe A: Leu G: Leu Position 1 im odon* T: Ser : Ser A: Ser G: Ser T: Tyr : Tyr A: Stopp G: Stopp T: ys : ys A: Stopp G: Trp Position 2 im odon* T A G Position 3 im odon* T: Leu : Leu A: Leu G: Leu Position 1 im odon* T: Pro : Pro A: Pro G: Pro T: is : is A: Gln G: Gln T: Arg : Arg A: Arg G: Arg A Position 2 im odon* T A G Position 3 im odon* T: Ile : Ile A: Ile G: Met (Start) Position 1 im odon* T: Thr : Thr A: Thr G: Thr T: Asn : Asn A: Lys G: Lys T: Ser : Ser A: Arg G: Arg G Position 2 im odon* T A G Position 3 im odon* T: Val : Val A: Val G: Val * Ableserichtung: 5 3 T: Ala : Ala A: Ala G: Ala T: Asp : Asp A: Glu G: Glu T: Gly : Gly A: Gly G: Gly 10

11 14.2 ukleinsäuren amphiphil) mit hoher Wahrscheinlichkeit dennoch erhalten bleibt. Bei Ausfall einer Base allerdings verschiebt sich das gesamte Leseraster, der genetische ode ist kommafrei. Zwar unterscheiden sich die Lebewesen in der Vorliebe für bestimmte Synonyme, der genetische ode gilt jedoch für alle Lebewesen, d. h., er ist universell. Kleine Abweichungen gibt es nur bei Mikroorganismen und Mitochondrien. Merke Der genetische ode ist ein Triplett-ode ohne Komma. degeneriert: Zu den meisten Aminosäuren gibt es mehrere odons. eindeutig: Zu jedem odon gibt es nur eine Aminosäure. konservativ: Die kodierte Information ist relativ gut gegen Basenaustausch geschützt. universell: Alle irdischen Lebewesen benutzen ihn. Die drei Stopp-odons TGA, TAA und TAG (bzw. in RA- Sprache UGA, UAA und UAG) stehen nicht für eine Aminosäure, sondern für das Ende der Translation. Gelangt das Ribosom an diese Stelle, dissoziiert es von der mra ab. Dagegen gibt es bei Eukaryonten nur ein Start-odon als Ansatzstelle des Ribosoms, nämlich ATG (RA: AUG). Es kodiert gleichzeitig auch für die AS Methionin. Ein echtes Start-odon wird dem Ribosom deshalb zusätzlich durch vor AUG liegende ukleotide angekündigt. Jedes am Ribosom entstehende Polypeptid beginnt tatsächlich mit Methionin. Dem gereiften Protein fehlt diese Startaminosäure jedoch häufig. Die hromosomen der Eukaryonten verfügen über viele Replika und ris (ca pro hromosom): ur durch gleichzeitige Replikation an vielen Stellen können die hromosomen rasch genug repliziert werden. Das Bakterium E. coli kann sein Genom in ca. 40 Minuten replizieren, die menschliche Zelle benötigt mehrere Stunden. Der Verdopplungs-Mechanismus basiert darauf, dass nach Auftrennung des DA-Strangs die Basen jedes Einzelstrangs komplementäre dtps binden können, die sich unter Pyrophosphat-Abspaltung zu einem Tochterstrang verbinden lassen. Jeder neue DA-Doppelstrang besteht demnach aus einem Eltern- und einem neu synthetisierten Tochterstrang; die DA-Replikation ist semikonservativ. Um den Vorgang exakt und schnell zu ermöglichen, ist eine Vielzahl von Molekülen beteiligt. Bei Prokaryonten vollzieht sich die Replikation von einem ri aus uni- oder bidirektional. Es bildet sich eine bzw. zwei sog. Replikationsgabel(n). Bei Eukaryonten findet die Replikation von einem ri aus stets bidirektional statt, DA-replizierende Enzyme wandern in beide Richtungen über das Replikon (Abb. 14.9). Es gibt zwei Replikationsgabeln und eine wachsende Öffnung (Replikationsblase). Ablauf Die Replikation vollzieht sich in drei Schritten: Initiation (Vorbereitung und Start), Elongation (Kettenverlängerung), Termination (Stopp). Merke Die Begriffe Stopp- (keine passende Aminosäure) und Start-odon (Ansatzstelle des Ribosoms) beziehen sich nur auf die Translation. Die Transkription eines Gens erfolgt vor dem Start-odon und geht über das Stopp-odon hinaus. Klinik Statistisch die gefährlichste Punktmutation ist ein Ersatz der zweiten Base des Tripletts durch eine andere Base, da hierdurch z. B. eine hydrophobe Aminosäure durch eine hydrophile ersetzt werden kann. Dies kann die Struktur und alle davon abhängenden Eigenschaften des Proteins verändern. Ein bekanntes Beispiel für diesen Sachverhalt ist die Sichelzellanämie: Durch Umwandlung des Tripletts GAG in GTG wird die polare Aminosäure Glutamat durch die unpolare Aminosäure Valin ersetzt. Das Ergebnis ist ein verändertes ämoglobin, das den Erythrozyten Sichelzellform verleiht. Die starren Sichelzellen können bei omozygoten Gefäße verschließen und z. B. zu rganinfarkten führen Die Replikation der DA Vor jeder Zellteilung muss die DA verdoppelt (= repliziert) werden, damit jede Zelle das komplette Erbgut besitzt. Der eukaryontische Replikationsmechanismus ist dem prokaryontischen ähnlich, jedoch ist er komplexer (auf wichtige Unterschiede soll in diesem Kapitel hingewiesen werden). Einen DA-Abschnitt, der als Einheit repliziert wird, bezeichnet man als Replikon. Ein Bakterium besitzt nur ein Replikon: Seine gesamte DA wird in einem Stück repliziert, das ringförmige Bakteriengenom besitzt nur einen Startpunkt der Replikation (rigin of replication, kurz ri genannt). Initiation Spezifische DA-bindende Proteine leiten auf ein Signal hin an einem ri die Replikation ein. Bei Eukaryonten bilden sog. Lizenzfaktoren und weitere Moleküle den Präreplikationskomplex aus. Das Enzym elikase entwindet ATP-abhängig den DA- Doppelstrang: Zunächst am ri, dann schiebt es die Replikationsgabel ATP-abhängig weiter. Entstehende Einzelstrangbereiche werden über Single strand binding proteins (SSBPs) an unkontrollierter Basenpaarung gehindert. Die Entwindung des Doppelstrangs führt in benachbarten DA-Abschnitten zu übermäßiger Verdrillung und Spannung im Molekül. Um diese zu lösen, führt die Topoisomerase II (Abb. 14.9) ATP-abhängig eine sog. negative Superspiralisierung (engl.: negative supercoil) in die DA ein. Dazu durchtrennt sie beide DA-Stränge. Die Topoisomerase I sorgt hinterher über einen Einzelstrangbruch für die Entspannung dieser Spiralisierung (ein thermodynamisch begünstigter Vorgang, der kein ATP benötigt). Topoisomerasen können Phosphodiesterbindungen innerhalb eines DA-Strangs spalten und wieder knüpfen, durch das Zusammenspiel der beiden entgegengesetzt wirkenden Topoisomerasen wird eine optimale Anpassung der DA-Spiralisierung erreicht. Merke Topoisomerase II: Doppelstrangbruch Topoisomerase I: Einzelstrangbruch Die Aufgabe der DA-Polymerasen ist es, DA-Tochterstränge komplementär zu den elterlichen Einzelstängen mit dtps als Bausteinen zu synthetisieren. Pro- und Eukaryonten besitzen mehrere verschiedene DA-Polymerasen. Alle fügen an eine freie 3 --Gruppe eines wachsenden Poly- 11

12 14 Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Information Bewegungsrichtung der Replikationsgabel RI Bewegungsrichtung der Replikationsgabel Topoisomerase II Replikationsgabel Abb Replikationsblase mit Topoisomerase II. Rot: elikase, blau: Single strand binding proteins (SSBPs), grün: Replikationsrichtung. [3] nukleotids die 5 -Phosphat-Gruppe eines dtp unter Pyrophosphatabspaltung an. Die meisten dieser Enzyme können nur dann ein ukleotid anfügen, wenn sie die Richtigkeit der vorhergehenden Basenpaarung überprüft haben (Proofreading). Deshalb können sie keine DA-Kette von null starten, sondern benötigen eine kurze, korrekt gepaarte ukleinsäuresequenz mit einer freien 3 --Gruppe am 3 -Ende. Dieser sog. Primer wird von einer DA-abhängigen RA-Polymerase namens Primase (bei Eukaryonten Untereinheit der Starter-DA-Polymerase α, s. u.) hergestellt. Sie synthetisiert am ri eine kurze komplementäre RA-Sequenz an den Elternstrang. Elongation An die 3 --Gruppe des RA-Primers knüpft die DA- Polymerase das erste Desoxyribonukleotid und eröffnet die Elongation (5 3 -DA-Polymerase-Funktion). Bei Prokaryonten wird der Tochterstrang von der DA- Polymerase III an den Primer synthetisiert. Bei Eukaryonten wird das Anfangsstück (die ersten ca. 20 ukleotide an den Primer) noch von der DA-Polymerase α synthetisiert, der Rest von der schnelleren DA-Polymerase δ. DA-Polymerase δ (und wohl auch α durch Wechselwirkung mit einem anderen Protein) besitzt eine Proofreading-Funktion: Sie überprüft die Korrektheit der vorhergehenden Base. Eine 3 5 -Exonuklease-Untereinheit schneidet eine unkorrekte Base heraus, die sofort durch eine korrekte ersetzt wird. Bei Prokaryonten besitzen DA-Polymerasen I (s. u.) und III Proofreading- und 3 5 -Exonuklease-Funktion. Während der Elongation ist ein DA-Polymerase-Dimer (ein Komplex aus zwei Polymerasen, Abb ) aktiv. An jedem Elternstrang findet sich ein katalytisches Zentrum. Man kann sich diesen Replikations-Enzymkomplex als einen Reißverschluss vorstellen, der einen Eingang für die doppelsträngige Eltern-DA und je einen Ausgang für die beiden jeweils zur älfte neu entstandenen DA-Doppelstränge hat. Dabei ist die Synthese des einen Tochterstrangs ungleich schwerer als die des anderen: Replikation am Leit(= Führungs)strang Ein Elternstrang verläuft in 3 5 -Richtung. Der gegenläufige Tochterstrang entsteht in 5 3 -Richtung, passend zur Syntheserichtung der DA-Polymerase, die die 5 -Phosphat- Gruppe eines dtp an die freie 3 --Gruppe eines Strangs knüpft (Abb ). Der in 3 5 -Richtung verlaufende sog. Leit- oder Führungsstrang (engl.: leading strand) lässt sich ohne Proleme kontinuierlich replizieren. Replikation am Folge(= Verzögerungs)strang Der zweite Elternstrang verläuft in 5 3 -Richtung. Der Tochterstrang müsste in 3 5 -Richtung entstehen, wozu die Abb Die Wachstumsrichtung der DA (schematisch). [3] 12

13 14.2 ukleinsäuren Bewegungsrichtung der Replikationsgabel 5 3 Leitstrang RI 5 3 Folgestrang 5 3 Replikationsgabel Leitstrang Folgestrang Bewegungsrichtung der Replikationsgabel DA-Polymerase jedoch nicht in der Lage ist. Um das Problem zu umgehen, werden bei der Replikation am sog. Folgeoder Verzögerungsstrang (engl.: lagging strand) multiple Primer eingesetzt: Die Primase (bei Eukaryonten eine Untereinheit der DA-Polymerase α) synthetisiert in kurzen Abständen RA-Primer, an deren freie 3 --Gruppe die DA- Polymerase III (Prokaryonten) bzw. die DA-Polymerase α (Eukaryonten) ukleotide hängt. Eukaryonten wechseln wie am Leitstrang nach ca. 20 dtps zur DA-Polymerase δ. In einem Modell erreicht die Replikationsmaschinerie über eine Schleifenbildung, dass beide Tochterstränge lokal in die gleiche Richtung synthetisiert werden können (Abb ). An den Primer hängt die Polymerase (III bzw. α) bis zu mehrere tausend ukleotide. Das prokaryontische Enzym stoppt, noch bevor es auf den Primer des vorangegangenen Fragments stößt. Es entlässt die DA, um sich einem neuen Primer zuzuwenden, und die DA-Polymerase I schließt die verbliebene Lücke. Bei Eukaryonten bleibt ein Fragment vermutlich mit dem DA-Polymerase δ-dimer verbunden, bis die Polymerase auf den Primer des zuvor synthetisierten Fragments trifft, der dort immer noch vorhanden ist. Diesen Primer entfernt die DA-Polymerase δ bzw. I mit einer 5 3 -Exonuklease-Aktivität. Dieselben Enzyme füllen (DA-Polymerase-Funktion) die entstandene Lücke mit dtps, und eine DA-Ligase (siehe Termination) verknüpft die DA- Abschnitte. Der ganze Vorgang wiederholt sich: Der nächste Abschnitt des Elternstrangs bildet eine Schleife im Enzym, und die Primase synthetisiert einen Primer für das nächste Fragment. Der Folgestrang wird also diskontinuierlich (in 5 3 -Richtung) synthetisiert (Abb ). Die Fragmente des Folgestrangs, die noch nicht mit dem bereits fertigen Teil der Tochterstrang-DA verbunden sind, heißen nach ihrem Entdecker kazaki-fragmente. Merke Die prokaryontischen DA-Polymerasen I und III sowie die eukaryontische DA-Polymerase δ (indirekt wohl auch α) besitzen eine Proofreading-Funktion, die die Korrektheit der zuletzt eingefügten Base überprüft. Eine 3 5 -Exonuklease-Untereinheit schneidet eine als unkorrekt erkannte Base wieder heraus, die sofort durch eine korrekte ersetzt wird. Dies gilt für Leit- und Folgestrang. Termination Die Replikationsgabel der Prokaryonten erreicht schließlich wieder den ri (Ringstruktur der DA!) und begegnet auf dem Leitstrang dort dessen Primer. Eukaryontische Replikationsgabeln treffen auf dem Leitstrang auf den Primer des achbarreplikons. Eine 5 3 -Exonuklease schneidet den Primer ab (die Primer des Folgestrangs wurden kontinuierlich abgeschnitten). Die entstehende Lücke wird in Richtung gefüllt. Eine DA-Ligase schließt bei Prokaryonten den DA-Ring und verknüpft bei Eukaryonten die einzelnen Replika. Das DA-Ende, das mit dem Primer verknüpft war, trägt am 5 --Atom keine Phosphatgruppe mehr, so dass keine Phosphodiesterbindung geknüpft werden kann. Dieses Problem löst die Ligase, indem sie ATP spaltet und AMP auf die 5 --Gruppe überträgt. Anschließend ligiert sie die beiden DA-Enden. Zusammenfassung Tab zeigt alle an der Replikation beteiligten pro- und eukaryontischen Enzyme und Proteine in chronologischer Reihenfolge. Abb Die Synthese des Leit- und des Folge-Tochterstrangs (Prokaryonten). Rot: elikase, blau: Single strand binding proteins (SSBPs), gelb: Primer, grün: Wachstumsrichtung des Tochterstrangs. [3] Abb DA-Polymerase- Dimer (gelb) mit Schleife am Folgestrang. Der Folgestrang ist blau, der Leitstrang rot, die Wachstumsrichtung der Tochterstränge grün dargestellt. [3] Telomere und Telomerase ach Entfernung des Primers am absoluten 5 -Ende beider Tochterstränge kann dieses Stück nicht gefüllt werden. Beiden Strängen fehlen also am 5 -Ende einige ukleotide (in vitro ca ) pro Replikationszyklus. Dennoch gehen keine wichtige Information verloren, da die hromosomenenden mit Telomeren, nichtkodierenden hochrepetitiven TTAGGG- Sequenzen, ausgestattet sind. Sind die Telomere somatischer Zellen nach ca. 50 Zellteilungen aufgebraucht, verliert die Zelle ihre Teilungsfähigkeit (zelluläre Seneszenz). Dies ist für somatische Zellen offenbar gewollt (evtl. Verhinderung von Krebsentstehung), u. a. in Keimbahnzellen jedoch nicht. ier kommt mit der Telomerase ein besonderes Enzym ins Spiel, das mit einer internen RA-Sequenz als Matrize Telomere wieder verlängern kann. Aktive Telomerase ist in embryonalen Zellen, Keimgeweben, manchen Stammzellen und oft in Tumorzellen nachzuweisen. Von der Erforschung der Telomerase erhofft man sich u. a. Ansätze zur Krebstherapie. emmstoffe der DA-Replikation Die wichtigsten emmstoffe der DA-Replikation sind in Tab aufgelistet. 13

14 14 Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Information Tab Die an der Replikation beteiligten pro- und eukaryontischen Enzyme/Proteine. prokaryontisches Enzym/Protein eukaryontisches Enzym/ Protein Funktion elikase elikase ATP-abhängig: Aufwinden der DA am ri und Schieben der Replikationsgabel über das Replikon SSBP SSBP Stabilisierung der Einzelstrangbereiche der Replikationsgabel bzw. -blase durch Verhinderung unkontrollierter Basenpaarung Topoisomerase II (Gyrase) Topoisomerase II Lösen der von der elikase verursachten DA-Spannung im noch nicht aufgewundenen Bereich durch Einführen einer negativen Superspiralisierung (ATP-Bedarf) Topoisomerase I Topoisomerase I Aufheben der negativen Superspiralisierung (kein ATP-Bedarf) Primase (DA-abhängige RA-Polymerase) DA-Polymerase I DA-Polymerase III Primase (DA-abhängige RA-Polymerase, Untereinheit der DA-Polymerase α) DA-Polymerase α Synthese der RA-Primer am Anfang des Replikons (Leitstrang) und am Anfang jedes kazaki-fragments (Folgestrang) 5 3 -Exonuklease: entfernt den Primer am Anfang des Replikons und am Anfang der kazaki-fragmente 5 3 -DA-Polymerase: füllt die Lücken zwischen den kazaki-fragmenten und die durch Abschneiden der Primer entstandenen Lücken 3 5 -Exonuklease: Proofreading-Funktion 5 3 -DA-Polymerase: verlängert RA-Primer an Leit- und Folgestrang komplementär zum parentalen Strang 3 5 -Exonuklease: Proofreading-Funktion besitzt Primase-Untereinheit 5 3 -DA-Polymerase: knüpft die ersten ca. 20 dtps an den Primer DA-Polymerase δ 5 3 -DA-Polymerase: führt die von der DA-Polymerase α begonnene DA- Synthese fort bis zu einem Primer (Leit- und Folgestrang) 5 3 -Exonuklease: entfernt den Primer am Anfang der kazaki-fragmente 3 5 -Exonuklease: Proofreading-Funktion DA-Ligase DA-Ligase Verbindung der freien DA-Enden von kazaki-fragmenten bzw. am ri Tab emmstoffe der DA-Replikation. Substanz Wirkungsmechanismus Einsatz ipro floxacin emmung der bakteriellen Topoisomerase (Gyrase) Mitomycin Quervernetzung von DA-Strängen, dadurch ist ihre Entwindung unmöglich Quervernetzung von DA-Strängen, dadurch ist ihre Entwindung unmöglich Einbau in die DA. Bei der Initiation der Replikation kann die Topoisomerase die Phosphodiesterbindung an ytosinarabinosid zwar spalten, aber nicht wieder knüpfen Antibiotikum Zytostatikum yclophosphamid ytosinarabinosid Zytostatikum Zytostatikum Mutationen und ihre Reparatur Die Fähigkeit der DA zur Mutation ist Stärke und Schwäche zugleich. hne Mutationen hätte eine Evolution hin zu höheren Lebewesen nicht stattfinden können. Auf der anderen Seite lösen Mutationen viele Erkrankungen wie z. B. Krebs aus. Mutationsformen Man unterscheidet Mutationen, die das Erscheinungsbild eines hromosoms verändern (hromosomenmutationen), und solche, die sich auf ein Gen beschränken (Genmutatio nen). hromosomenmutationen ( Kap ) Genmutationen Von Bedeutung sind Mutationen in kodierenden Regionen, die beim Menschen ca. 1,5 % der DA ausmachen, aber auch innerhalb der nichttranslatierten regulatorischen Bereiche. Substitution Bei der Substitution (Punktmutation), der häufigsten Mutationsart, wird eine Base durch eine andere ersetzt, also ein odon verändert. Dies bleibt ohne Folgen, wenn dank der Degeneration des genetischen odes die kodierte Aminosäure dieselbe bleibt (Silent-Mutation). Ändert sich die Aminosäure (Missense-Mutation), kommt es einerseits auf ihre Bedeutung im Protein und andererseits darauf an, ob die veränderte AS ähnliche oder entgegengesetzte Eigenschaften hat (Sichelzellanämie, Kap ). Die Bildung eines Stopp-odons (onsense-mutation) wiegt am schwersten. Man unterscheidet zwei Arten der Substitution: Transition ist der Austausch einer Purin- gegen eine andere Purinbase (A, G) oder einer Pyrimidin- gegen eine andere Pyrimidinbase (, T). Transversion ist der Austausch einer Purin- (A, G) durch eine Pyrimidinbase (T, ). Insertion und Deletion Bei der Insertion (= Addition) werden eine oder mehrere Basen in die Gensequenz eingefügt, bei der Deletion entfernt. Beides ist gefährlicher als die Substitution: Beträgt die Zahl der hinzugefügten oder entfernten Basen nicht drei oder ein Vielfaches von drei, kommt es zu einer Verschiebung des Leserasters (Rasterschubmutationen = Frameshifts). Mutationsursachen Mutationen können durch externe Faktoren (chemischer oder physikalischer Art, Mikroorganismen), sog. Mutagene, bedingt sein, aber auch ohne äußere Auswirkung auftreten. Zu den chemischen Mutagenen gehören Basenanaloga: 5-Bromuracil und 2-Aminopurin werden 14

15 14.2 ukleinsäuren z. B. anstelle von Thymin bzw. Adenin in die DA eingebaut. 5-Bromuracil paart beim nächsten Replikationszyklus mit größerer Wahrscheinlichkeit mit Guanin statt mit Adenin, 2-Aminopurin mit ytosin statt mit Thymin. Es kommt also zu AT G-Transitionen. desaminierende Reagenzien: Salpetrige Säure ( 2 ) bewirkt z. B. Transitionen, indem sie mit Basen reagiert, die Aminogruppen enthalten. 2 desaminiert u. a. ytosin oxidativ zu Uracil, das mit Adenin statt mit Guanin paart. alkylierende Reagenzien: Sie führen zusätzliche Alkylgruppen in die Basen ein. Ethylmethansulfonat (EMS) erzeugt z. B. Transitionen, indem es eine Ethylgruppe an das 7- Atom des Guanins hängt, das dann mit Thymin statt mit ytosin paart. Zu den Alkylanzien zählen auch bestimmte Pestizide und Kampfgase wie Lost (Senfgas), das außerdem eine DA-Quervernetzung bewirkt (bifunktionel les Alkylans). hydroxylierende Reagenzien: ydroxylamin wandelt z. B. die Aminogruppe von ytosin in eine ydroxylaminogruppe um. interkalierende Substanzen: Dies sind oligozyklische aromatische Verbindungen wie Ethidiumbromid, Actinomycin oder Benzpyren (aus Zigarettenrauch). Sie schieben sich zwischen benachbarten Basenpaaren in die DA ein (Interkalation). Das beeinträchtigt die Replikation und führt zu Insertionen oder Deletionen (mögliche Rasterverschiebung). bestimmte anorganische Substanzen wie Arsen, hrom, ickel und Asbest (Asbest gilt als nicht gentoxisches Kanzerogen, d. h., es wirkt indirekt, indem es u. a. über Entzündung zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies führt). sonstige Substanzen, z. B. itrosamine (lösen alkylierende Prozesse aus), Aflatoxine (Pilzgifte, können durch kovalente Bindung an die DA deren Replikation stören) oder Substanzen, die zur Bildung freier Radikale führen. Physikalische Mutagene sind UV-Strahlung: Sie kann über kovalente Verknüpfung zweier benachbarter Thyminbasen ein Thymindimer hervorrufen. Dieses macht eine fehlerfreie Replikation unmöglich. Durch körpereigene Enzyme wird die Reaktion rückgängig gemacht (s. u.). ionisierende ( radioaktive ) α-, β-, γ-strahlung: Sie kann alle Arten von Mutationen bis hin zu hromosomenmutationen hervorrufen. ft wirkt sie nicht unmittelbar auf die DA ein, sondern generiert in Zellen Radikale, die mit der DA reagieren. Biologische Mutagene sind v. a. Tumorviren ( Kap ) und springende genetische Elemente (Transposons). Spontane Mutationen treten auf bei Tautomerisierungen: Bei diesen Isomerisierungen werden nur Protonen und/oder Doppelbindungen verschoben. Basen können spontan von der normalen Ketoform (= Laktamform) zur Enolform (= Laktimform) tautomerisieren. Anomale Basenpaarungen wie z. B. A Enol- führen bei der Replikation zu Mutationen im Tochterstrang. thermischer Depurinierung: Dies ist die spontane Spaltung der -glykosidischen Bindung zwischen Purinbase und Desoxyribose. Sie tritt ca mal pro Zelle und Tag auf (kann aber in der Regel repariert werden, s. u., Reparaturmaßnahmen). Problemen während der Zellteilung: Sie können zu hromosomenmutationen ( Kap ) in Körper- oder Keimzellen führen. Einbau falscher ukleotide durch die DA-Polymerase bei der DA-Replikation: Trotz der Überprüfung der Korrektheit der zuletzt eingefügten Base durch das Enzym (und des erausschneidens und Ersetzens derselben bei Fehlern) nicht gänzlich ausgeschlossen. Basen-Alkylierung und -Desaminierung: Diese Reaktionen erfolgen auch spontan, erstere z. B. mehrere hundert Mal pro Zelle und Tag. Reparaturmaßnahmen (s. u.) können dies in der Regel ausgleichen. Merke Mutationen werden durch exogene chemische, physikalische oder biologische Faktoren verursacht oder entstehen spontan. Vor allem Mutationen in Genen, die die Zellproliferation kontrollieren, können krebserregend sein. Mutagene sind deshalb potentielle Kanzerogene. Reparaturmechanismen Angesichts der Mutationsrisiken, denen die DA ausgesetzt ist, sind wirksame Reparaturmaßnahmen lebensnotwendig. Menschen mit Defekten an Genen, die Reparaturenzyme kodieren, haben ein erhöhtes Krebsrisiko. Es existieren verschiedene Reparaturmechanismen, von denen einige vorgestellt werden sollen. Direkte Reparatur: Das Enzym DA-Photolyase, das einige Lebewesen (nicht aber der Mensch!) besitzen, beseitigt direkt UV-bedingte Thymindimere, indem es sie photochemisch spaltet. Photochemisch bedeutet, dass das Enzym seine Energie durch Absorption eines Photons gewinnt, es wird also sinnvollerweise bei hoher Lichtintensität aktiviert. Andere Enzyme der direkten DA-Reparatur besitzt auch der Mensch, z. B. ein Enzym, das direkt die Alkylierung von Guanin rückgängig macht. Basenexzisionsreparatur: Ein Reparatur-Enzymkomplex erkennt eine veränderte Base und schneidet sie heraus, ein Desoxyribosephosphat- Rumpf bleibt. Eine 5 3 -Endonuklease öffnet den DA-Einzelstrang vor dem Rumpf, eine 5 3 -Exonuklease schneidet ihn heraus. Daraufhin fügt eine DA-Polymerase das korrekte ukleotid ein. Eine Ligase schließt den Strang. Beispiel: Ausschneiden von Uracil aus der DA. ukleotidexzisionsreparatur: Kurze DA-Sequenzen (24 bis 32 ukleotide) mit inkorrekten Basen können herausgeschnitten und anhand der Basen des komplementären Strangs korrekt ersetzt werden. Postreplikationsreparatur: Bei der Replikation wird eine fehlerhafte Stelle umgangen, die Reparatur erfolgt hinterher auf der Grundlage des homologen hromosoms. Reparatur von Doppelstrangbrüchen: Zwei Reparatursysteme sind untersucht. Das eine basiert auf Informationen von homologen hromosomen, das andere verbindet freie DA-Enden, so wie sie sind (EJ = non-homologous end joining). Merke Angesichts des Mutationsrisikos der DA kann ein rganismus nur mit DA-Reparaturmechanismen überleben. Man unterscheidet direkte Reparatur, Basenexzisions- und ukleotidexzisionsreparatur sowie weitere Mechanismen wie Postreplikationsreparatur und die Reparatur von Doppelstrangbrüchen. 15

16 14 Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Information Klinik Xeroderma pigmentosum ist ein Syndrom, das durch Defekte der DA-Reparaturmechanismen ausgelöst wird. Es wird autosomal-rezessiv vererbt. Die über zehn bekannten Gendefekte umfassen vor allem Gene für die Enzyme der Exzisionsreparatur (Erkennung, Repair-Endonuklease, Repair-Exonuklease, Repair-Polymerase). Insbesondere UV-Schäden der DA können nicht repariert werden. Betroffene neigen bereits nach kurzer Sonnenlichtexposition zu Sonnenbrand, autentzündungen, -trockenheit und yperpigmentierung (bräunliche Flecken). Warzenartige Gebilde treten gehäuft auf. Durch die Gefahr von auttumoren ab frühester Kindheit ist die Lebenserwartung eingeschränkt. Komplette Vermeidung von Sonnenlicht (jedoch nicht von Mondlicht Mondscheinkinder ) sowie regelmäßige Krebsvorsorgeuntersuchungen sind unabdingbar. Ataxia teleangiectatica (Louis-Bar-Syndrom) wird ebenfalls autosomal-rezessiv vererbt. Ursächlich ist ein Defekt des ATM-Gens (Ataxia-teleangiectatica-Mutations-Gen), das für die ATM-Proteinkinase kodiert. Dieses Enzym wird bei (strahleninduzierten) DA-Doppelstrangbrüchen aktiviert und phosphoryliert daraufhin u. a. DA-Reparaturenzyme. Die ATM-Mutation führt zu erhöhter Strahlenempfindlichkeit und Krebsgefahr. Weitere Symptome sind u. a. Erweiterung der Kapillaren (Tel[e]angiektasie) und damit einhergehende Schädigung der aut sowie des Gehirns (Ataxie). inzu kommt ein Mangel an IgG und IgA Transkription: von DA zu RA Bei der Transkription wird zu einer DA-Basensequenz eine komplementäre RA-Basensequenz erstellt. RA wird vom Multienzymkomplex RA-Polymerase aus den Ribonukleosidtriphosphaten ATP, TP, GTP und UTP synthetisiert. Die RA-Polymerase benutzt den sog. kodogenen ( )-DA- Strang als Matrize. Er wird daher auch als Matrizenstrang bezeichnet. Das Ergebnis der Synthese, die primäre RA (das primäre Transkript), weist also dieselbe Basensequenz auf wie der kodierende (+)-DA-Strang (mit U statt T). Die primäre RA wird während und nach der Transkription noch zur reifen RA modifiziert. RA-Typen Bei der Transkription entstehen verschiedene RA-Typen. Die wichtigsten sind: Messenger-RA (mra) und ihr Vorläufer, die eterogeneous nuclear RA (hnra = prä-mra). Die reifen proteinkodierenden mras verlassen bei Eukaryonten den Zellkern und werden im Zytosol am Ribosom in die kodierte Aminosäuresequenz übersetzt (translatiert, Kap ). Bei den zellkernlosen Prokaryonten dagegen sind Translation und Transkription räumlich und zeitlich eng verbunden: Bereits an teilweise fertiger mra beginnen Ribosomen mit der Translation. mra macht nur ca. 5 % der zellulären RA aus. Da mra aber eine relativ kurze altbarkeit besitzt, dient die Transkription dennoch zu einem großen Teil der mra-synthese. Transfer-RA (tra): bei der Translation Bindeglied zwischen Aminosäuren und RA-Sequenz ( Kap ), ribosomale RA (rra): ist Bestandteil der Ribosomen, Small nuclear RA (snra): beteiligt an Spleißvorgängen ( Kap ). Die verschiedenen RA-Typen werden bei Prokaryonten von einer DA-abhängigen RA-Polymerase synthetisiert. Bei Eukaryonten gibt es drei Formen davon, die unterschiedliche RA-Typen synthetisieren: RA-Polymerase I synthetisiert rra (8S, 5,8S und 28S). Das Enzym ist im ukleolus lokalisiert und resistent gegen α-amanitin, das Gift des Knollenblätterpilzes. RA-Polymerase II synthetisiert mra (und snra), ist im ukleus lokalisiert und wird durch geringe Dosen α- Amanitin stark gehemmt. RA-Polymerase III synthetisiert tra (sowie snra und 5S-rRA), ist im ukleus lokalisiert und weniger empfindlich gegen α-amanitin als die RA-Polymerase II. Merke Eukaryonten besitzen für jeden der drei aupttypen der RA eine eigene RA-Polymerase: I für rra, II für mra, III für tra. Die RA-Polymerase-Varianten sind unterschiedlich empfindlich gegenüber dem Knollenblätterpilz-Gift α-amanitin (I nicht empfindlich, II sehr empfindlich, III bedingt empfindlich). Klinik Das Gift des Knollenblätterpilzes (Amanita spec.), α-amanitin, ist eines der gefährlichsten natürlichen Gifte. Die tödliche Dosis beträgt beim Erwachsenen etwa 0,1 mg/ kg Körpermasse. Die Giftwirkung beruht auf der emmung der RA-Polymerasen II und III, was die Transkription von DA zu mra und tra verhindert. Vergiftete Zellen sterben nach einer gewissen Zeit ab, insbesondere Leberzellen. Die Vergiftungserscheinungen beginnen nach 8 24 Stunden mit Durchfällen und Erbrechen. ach ca. 3 Tagen treten schwere Leberschäden (und evtl. weitere rganschäden, z. B. der iere) auf. Todesursache ist meist fulminantes Leberversagen. Ablauf Die Transkription erfolgt bei Eukaryonten und Prokaryonten in drei Schritten, die denen der Replikation ( Kap ) entsprechen. Jedoch benötigen RA-Polymerasen keinen Primer. Initiation Für den Beginn der Transkription ist im Gegensatz zur DA- Replikation nur ein spezifischer DA-Abschnitt von Inte r- esse. Damit die RA-Polymerase diesen finden kann, existieren vor dem eigentlichen Gen DA-Regionen, an die die Polymerase bindet. Bei Prokaryonten bindet die RA-Polymerase direkt, bei Eukaryonten binden zunächst DA-bindende Regulatorproteine, die sog. Transkriptionsfaktoren, dann die RA-Polymerase. Die Andockstellen liegen in der sog. Promotor-Sequenz vor dem Gen (Promotoren, s. a., Regulation ). Initiation bei Prokaryonten Die prokaryontische RA-Polymerase ist ein Multimer α 2 ββ σ. Die σ-untereinheit dirigiert das Enzym zum Promotor. hne diese bindet die RA-Polymerase gleichermaßen an jede DA-Sequenz, mit ihr sinkt die Affinität für beliebige DA-Sequenzen, und das Enzym gleitet so lange an der DA entlang, bis es auf eine Andockstelle im Promotor trifft. Die σ-untereinheit dissoziiert nun ab, das ore-enzym α 2 ββ startet die Transkription. 16

17 14.2 ukleinsäuren Initiation bei Eukaryonten Bei den Eukaryonten verwendet jede der drei RA-Polymerasen spezifische Promotoren mit spezifischen Andockstellen. Für die RA-Polymerase II, die prä-mra synthetisiert, ist die wichtigste Andockstelle die sog. TATA-Box (s. u., Regulation ). Die eukaryontischen RA-Polymerasen können jedoch erst nach dem Binden der sog. Transkriptionsfaktoren (TFs) und nicht direkt an die Andockstellen im Promotor binden. TFs sind DA-bindende Proteine mit speziellen DA-bindenden Strukturen, z. B.: Zinkfinger: kleine Proteindomänen, die über - oder S- haltige Aminosäuren Komplexe mit Zink-Kationen bilden. Die entstehenden Proteinschleifen mit den positiv gelade nen Zn 2+ -Ionen greifen wie Finger in die negativ geladene DA. Leucin-Zipper (engl.: zipper = Reißverschluss): Basische, also positiv geladene Aminosäuren in dieser Proteindo mäne binden an die negativ geladene DA, leucinreiche Bereiche dienen der Dimerisierung oder Bindung weiterer Enzyme A A A A A D TATAAA D TATAAA D TATAAA D TATAAA D TATAAA D TATAAA J B B B B F F RA-Polymerase II E F RA-Polymerase II DA-Matrize Abb Die Ini tiation der Transkrip tion. D: TFIID-Komplex, A: TFIIA, B: TFIIB, F: TFIIF = ATP-abhängige elikase, E: TFIIE, : TFII, J: TFIIJ. [3] elix-loop-elix-strukturen: Ihre Loop-Domäne ähnelt der DA-bindenden Domäne der Leucin-Zipper. Jede RA-Polymerase hat ihre eigenen Transkriptionsfaktoren. So gehört zur RA-Polymerase II der Transkriptionsfaktor II (TFII), ein Sammelbegriff für alle Transkriptionsfaktoren dieser Polymerase, die im Bereich der TATA-Box binden und das Enzym hierhin dirigieren. Die Reihenfolge der Initiation (Abb ): Der TFIID-Komplex bindet mit seiner Untereinheit TBP (TATA-Box-Bindeprotein) an die TATA-Box des Promotors. TBP und DA bilden einen Komplex mit einer asymmetrischen Struktur. Aufgrund der Asymmetrie kann die Transkription nur in eine Richtung die 5 3 -Richtung des kodierenden (+)-Strangs verlaufen. Erst gebundenes TBP stellt die Bindungsstellen zur Verfügung für: TFIIA, dann TFIIB. Schließlich bindet mit TFIIF eine ATPabhängige elikase, die den DA-Doppelstrang für die RA-Polymerase II öffnet. Die Sequenz TATA(AA) erleichtert den Trennvorgang, da A-T nur über zwei Wasserstoffbrücken (statt dreier bei G-) bindet. Erst wenn diese Transkriptionsfaktoren gebunden sind, bindet die RA-Polymerase II an diesen Komplex, wird jedoch noch nicht aktiv. Vervollständigt und aktiviert wird der basale Transkriptionsapparat durch weitere TFII-Komponenten (TFIIE, TFII und TFIIJ). un liegt eine lokale Entspiralisierung der DA im Bereich von 17 Basenpaaren (= 2 vollständigen DA-Windungen) vor. Diese Struktur mit der gebundenen RA-Polymerase heißt Transkriptionsblase (Abb ). Die nun einsatzbereite RA-Polymerase wird an ihrer carboxyterminalen Domäne (TD-tail mit zahlreichen Serinund Threoninresten) phosphoryliert und dadurch aktiviert. Die zur Phosphorylierung nötige Kinasefunktion besitzt vermutlich der Transkriptionsfaktor TFII. Phosphoryliert entledigt sich das Enzym der nun nicht mehr benötigten Transkriptionsfaktoren und wandert vom Promotor zum Transkriptionsstartpunkt ( 1 ). Bei RA-Polymerase I und III weicht der Ablauf der Initiation nur geringfügig von dem der RA-Polymerase II ab. Merke Die Bindung eukaryontische RA-Polymerasen wird durch Transkriptionsfaktoren vermittelt. Elongation Die Transkriptionsblase läuft über das Gen, wobei eine elikase die eintretende DA-Doppelhelix fortwährend entwindet. Wie bei der Replikation gleichen Topoisomerasen den entstehenden Druck im Molekül aus. Beim Austritt aus der Abb Transkriptionsblase. [3] 17

18 14 Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Information Blase verdrillen sich die DA-Doppelstränge wieder. In ihrem Inneren liegt fortwährend ein DA-RA-ybrid-Doppelstrang aus acht Basenpaarungen vor ( Abb ). Die RA-Polymerase synthetisiert RA (analog zu den DA-Polymerasen) in 5 3 -Richtung; Bausteine sind ATP, TP, GTP und UTP. Als Erstes ist das 5 -Ende der RA fertiggestellt und tritt aus dem Enzym aus (woraufhin bei Prokaryonten die Translation beginnen kann). Im Unterschied zu DA-Polymerasen benötigen RA- Polymerasen keinen Primer und besitzen keine Proofreading- Funktion. Ihr Produkt ist um den Faktor fehlerhafter. Eine fehlerhafte RA spielt in der Fülle der korrekten RAs jedoch keine Rolle, Fehler in der RA werden auch nicht weitervererbt. Die Transkription ist langsamer (die RA wächst pro Sekunde um ca. 50 ukleotide) als die Replikation (ca. 800 ukleotide pro Sekunde). Termination Eukaryonten und Prokaryonten besitzen unterschiedliche Terminationsstrategien. Termination bei Prokaryonten Termination durch Stammschleife (engl.: stem loop = eine Schleife mit Stamm; Syn.: engl.: hairpin = aarnadel): Das Terminationssignal ist hier eine G-reiche Palindromsequenz, d. h. (+)- und ( )-Strang weisen, jeweils in Richtung abgelesen, dieselbe Basensequenz auf. Bei Betrachtung der entstehenden RA fällt auf: Auf die erste älfte des Palindroms, z. B. GG, folgt in der zweiten älfte die komplementäre Sequenz in umgekehrter Reihenfolge, z. B. GGGG. Die Basen des Palindroms bilden deshalb mit sich selbst eine Stammschleife (Abb ). Diese ist aufgrund der G- bzw. G-Paarungen (je drei Wasserstoffbrückenbindungen!) recht stabil. Instabil sind hin gegen die Paarungen zwischen den oft auf das Palindrom folgenden poly(u)-sequenzen auf RA- und poly(a)-sequenzen auf DA-Seite. Die Stammschleife führt offenbar zum Stocken der Transkription, was der schwach gebundenen poly(u)-ra die hance zum Ablösen von der DA und zum Verlassen des Enzyms gibt. Rho-abhängige Termination: Das Rho-(ρ-)Protein zieht unter ATP-Spaltung an der RA, die die RA-Polymerase verlässt, und gleitet an ihr hinauf. ytosinreiche RA- Bereiche beschleunigen es, so dass es die RA-Polymerase einholt und damit die Transkription beendet. Attenuation: eine Form der Genregulation, die bei der Genexpression von Prokaryonten vorkommt, wo Trans kription und Translation nicht räumlich getrennt sind. Ribosomen nehmen dabei Einfluss auf die Sekundärstruktur der mra. ohe Konzentrationen der Aminosäure Tryptophan bewirken z. B. ein schnelleres Fortschreiten des Ribosoms auf gerade entstehenden mras, die Proteine der Tryptophansynthese kodieren. Dadurch bildet sich eine mra-struktur aus, die die weitere Translation unterbindet. Termination bei Eukaryonten Über die Termination der eukaryontischen Transkription ist vergleichsweise wenig bekannt. Reife eukaryontische RA besitzt an ihrem 3 -Ende die Polyadenylierungssequenz, die dem posttranskriptionellen Anfügen des poly(a)-schwanzes ( Abb. 14.8) dient. Die DA-Grundlage dieser Sequenz gilt evtl. auch als Terminierungssignal, auch wenn die RA-Polymerase II oft noch (ca. 300 ukleotide) über diese Sequenz hinaus transkribiert. Regulation Die Kontrollelemente der Transkriptionsregulation (= Regulation der Genexpression, Kap ) lassen sich einteilen in cis-elemente: DA-Sequenzen, die der Regulation dienen, z. B. Promotoren, trans-elemente: DA-bindende Moleküle, die der Regulation dienen, z. B. der prokaryontische σ-faktor oder die eukaryontischen Transkriptionsfaktoren. emmstoffe der Transkription sind in Tab zu sehen. Merke is-elemente sind regulatorische DA-Sequenzen (z. B. Promotoren). Trans-Elemente sind regulatorische DA-Bindemoleküle (z. B. Transkriptionsfaktoren). Regulation bei Eukaryonten Vor allem hinsichtlich ihrer Regulation ist die Transkription bei Eukaryonten komplexer als bei Prokaryonten. Es wirken eine Vielzahl verschiedener cis- und trans-elemente: cis-elemente: Promotoren enthalten die Bindungsstellen für die eukaryontischen Transkriptionsfaktoren (trans-elemente) und die RA-Polymerase. Einige wichtige Sequenzmotive findet man in vielen Promotoren (Abb ). Sie sind benannt nach ihrer onsensussequenz, d. h. ihrem Mittelwert, von dem sie oft nur wenig abweichen. Für die RA-Polymerase II ist die wichtigste Bindungsstelle die sog. TATA-Box zwischen ukleotidpositionen 30 und 100 (also upstream). Verbreitet ist auch eine AAT-Box im Bereich 40 bis 150. Konstitutive Gene, die immer benötigt werde, besitzen oft eine sog. G-Box. Zum Promotor fasst man die Boxen, dazwischenliegende Bereiche und eventuelle weitere Sequenzen zusammen. RA-Polymerase I und III binden an Promotoren mit eigenen spezifischen Bindungsstellen. DA-Matrize 75 GGAATT AAT-Box (manchmal vorhanden) 25 TATAAA TATA-Box (ogness-box) +1 Beginn der Transkription Abb Stammschleife als prokaryontisches Terminationssignal. [3] Abb Eukaryontischer Promotor. [3] 18

19 14.2 ukleinsäuren DA-Matrize TTGAA TATAAT 35-Region Abb Prokaryontischer Promotor. [3] Enhancer sind DA-Sequenzen, die die Transkription stimulieren, indem sie die Bindung von trans-elementen an den Promotor unterstützen und Gene für den Transkriptionsapparat zugänglich machen ( Kap und ). Sie sind unabhängig von ihrer Ausrichtung oder Lokalisation auf dem (+)- oder ( )-Strang wirksam und können mehrere tausend bp vor (upstream) oder hinter dem Gen (downstream) angesiedelt sein. Das inhibierende Gegenstück heißt Silencer. trans-elemente, z. B.: Enhancer-bindende Proteine G-Box- und AAT-Box-assoziierte Transkriptionsfaktoren Transkriptionsfaktor II (TFII, spezifisch für RA-Polymerase II): s. o., Ablauf Regulation bei Prokaryonten cis-elemente: Ein optimaler prokaryontischer Promotor weist in der 35-Region die Sequenz TTGAA und in der 10-Region die Sequenz TATAAT (= Pribnow-Box, Abb ) auf. Außerdem sind die beiden Regionen idealerweise 17 ukleotide voneinander entfernt. Je mehr ein Promotor von diesen Bedingungen abweicht, desto schlechter ist er. Einem selten benötigten Gen ist ein schwacher Promotor vorangestellt. weitere Regulationssequenzen auf der DA (peratoren, Kap ) trans-elemente, z. B.: σ-untereinheiten der RA-Polymerase: Es existieren verschiedene σ-untereinheiten für verschiedene Umweltfaktoren. Bei stark erhöhter Umgebungstemperatur wird eine andere σ-untereinheit exprimiert als bei normaler Temperatur. Diese bindet an Promotoren, die speziellen itzeschockgenen vorangestellt sind. Transkriptionsfaktoren: Auch Prokaryonten besitzen spezifische Regulatorproteine, die an bestimmte DA- Sequenzen binden und mit der RA-Polymerase wechselwirken. Ihre Bedeutung ist bei Prokaryonten jedoch geringer als bei Eukaryonten. emmstoffe der Transkription Tab emmstoffe der Transkription. Pribnow- Box Substanz Wirkungsmechanismus Einsatz iprofloxacin Rifampicin Actinomycin D Mitomycin (yclophosphamid) emmung der bakteriellen Topoisomerase (Gyrase) emmung der prokaryontischen RA-Polymerase Quervernetzung von DA- Strängen (Komplexbildung mit Guanin), dadurch ist ihre E ntwindung unmöglich Quervernetzung von DA- Strängen, dadurch ist ihre Entwindung unmöglich Beginn der Transkription Antibiotikum Antibiotikum (bei Tuberkulose) Zytostatikum Zytostatikum Reifung und Transport der RA o- und posttranskriptionelle RA-Prozessierung RA-Prozessierung, die Reifung von primärer (prä-ra) zur fertigen RA, findet co- und posttranskriptionell statt. Primäre rra- und tra-transkripte werden bei Eukaryonten und Prokaryonten in ähnlicher Weise prozessiert. PrämRAs (= hnras) werden nur bei Eukaryonten wesentlich prozessiert. ur eukaryontische Gene besitzen Introns, die aus der prä-mra herausgeschnitten werden müssen (Spleißen). Darüber hinaus versehen Eukaryonten ihre primären Transkripte mit speziellen Kappen am 5 - und Schwänzen am 3 -Ende. Die Prozessierungsschritte finden bei Eukaryonten im Zellkern statt. Prozessierung der primären rra-transkripte Bei Eukaryonten sind ribosomale RA kodierende Gene in speziellen hromosomenbereichen lokalisiert, die mit dem ukleolus in Verbindung stehen. Die Gene liegen als hochrepetitive Tandem-repeats ( Kap ) vor. Eukaryonten und Prokaryonten schneiden beide mit ilfe von ukleasen aus einer einzigen großen prä-rra die verschiedenen rra- Untereinheiten (Eukaryonten: 18S, 28S und 5,8S; Prokaryonten: 16S, 5S und 23S) heraus. Die eukaryontische 5S-rRA wird nicht im ukleolus transkribiert. Prozessierung der primären tra-transkripte tra-vorläufer werden auf vielfache Weise prozessiert (Beispiel Eukaryonten): Eine 5 -Leader-Sequenz wird entfernt. Ein Intron wird herausgespleißt (Mechanismus s. u.). Das UU-Dinukleotid am 3 -Ende wird durch A ersetzt. Mehrere Basen werden modifiziert (methyliert, desaminiert, reduziert), wobei seltene Basen wie Pseudouridin entstehen. Prozessierung der primären mra-transkripte otranskriptionelles Anhängen einer 5'-Kappe (mra- apping): och während der RA-Synthese wird das erste ukleotid der prä-mra, das am 5'-Ende als Diphosphat vorliegt, mit GMP verbunden. Dabei entsteht eine ungewöhnliche 5'-5'-Triphosphatbrücke (Abb ). Anschließend wird die Base des GMP zu 7-Methyl-Guanin methyliert. Auch die Ribose-Einheiten der beiden folgenden ukleotide können an ihren 2 --Gruppen methyliert werden (Abb ). Diese Kappe (ap) schützt die mra vor dem Abbau durch ukleasen und vor Dephosphorylierung durch Phosphatasen. Außerdem erhöht sie die Translationsrate an den Ribosomen. Posttranskriptionelle Polyadenylierung (poly[a]-schwanz, Abb ): Eine Endonuklease erkennt am 3 -Ende der prä-mra die Polyadenylierungssequenz (AAUAAA) und entfernt dahinterliegende ukleotide. Eine poly(a)-polymerase fügt an das verkürzte 3 -Ende den poly(a)-schwanz an, ihr Substrat ist ATP. Die ganze Bedeutung dieses Vorgangs ist noch nicht bekannt. Eine mra mit poly(a)- Schwanz wird vermehrt translatiert, ihre albwertszeit ist länger und sie ist für die Zelle z. B. von viraler Fremd-RA unterscheidbar. Spleißen (engl.: splicing, Abb ): Dabei werden Introns aus der prä-mra entfernt und Exons zur fertigen mra verbunden. Durch alternatives Spleißen der prä-mra können aus einem Gen unterschiedliche Proteine entstehen 19

20 14 Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Information Abb Anhängen eines poly(a)-schwanzes an eine eukaryontische prä-mra. [3] Abb Struktur der 5 -Kappe einer prokaryontischen mra. [3] (z. B. in den B-Zellen membranständige und freie Antikörper). Das korrekte Spleißen gewährleisten konservierte intronanzeigende Sequenzen der prä-mra, die von der katalytisch aktiven Small nuclear RA (snra) über ybridisierung erkannt werden. Die snra ist Bestandteil der snrps (Small nuclear ribonucleoprotein particles), die auch Proteinanteile besitzen. Verschiedene snrps sowie spezifische Proteine (Spleißfaktoren) und die prä-mra lagern sich zu den sog. Spleißosomen zusammen. Das eigentliche Spleißen besteht in zwei Umesterungen ( Abb ): Eine 2 --Gruppe eines ukleotids im Inneren des Introns (engl.: branch point = Verzweigungsstelle) bildet mit der 5 -Phosphat-Gruppe des ukleotids am Intronanfang (5 -Spleißstelle) eine Phosphodiesterbrücke aus. Dadurch entsteht eine intermediäre Struktur ( Lassostruktur ). Die 3 --Gruppe von Exon 1 wird mit der 5 -Phosphat-Gruppe von Exon 2 verknüpft. Das Ergebnis ist das intronfreie Spleißprodukt und ein lassoartiges Intron mit einer internen Verzweigungsstelle. Abb Spleißen einer eukaryontischen prä-mra (Y = Purin, R = Pyrimidin, = beliebiges ukleotid). [3] 20