Protokoll Praktikum für Humanbiologie Studenten

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1 Protokoll Praktikum für Humanbiologie Studenten Teil A: Charakterisierung der Auswirkungen von γ Interferon auf die Protein und mrna Mengen in humanen A549 Lungenepithelzellen. Studentenaufgaben Tag 1 (Montag): Behandlung der Zellen mit γ Interferon: Vorgegeben: Six Well Plates mit kultivierten humanen A549 Zellen. Medium aus Wells absaugen. Behandlung der Zellen: 3 Wells mit Medium OHNE γ Interferon beschicken (Kontrollen): 12 ml MEM Medium + FCS 4 ml/well zugeben. 3 Wells mit Medium MIT γ Interferon (500 Units/ml) beschicken (induzierte Proben). γ Interferon: Units/ml = 100 U/µL 500 U/ml = 5 µl γ Interferon/ml. 12 ml MEM Medium + 60 µl γ Interferon 4 ml/well zugeben. Inkubation für 24 h. Studentenaufgaben Tag 2 (Dienstag): Zellernte: Medium aus Wells absaugen. Wells mit PBS (Phosphate buffered Saline) waschen. Zugabe von 1 ml TRIzol Reagenz/Well. Lyse der Zellen durch mehrmaliges auf und abpipettieren. Proben in Eppendorfgefäße überführen. Einfrieren der Proben in flüssigem Stickstoff (ln 2 ). RNA Präparation: Phasentrennung: Proben auftauen, anschließend 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Zugabe von 200 µl Chloroform/ ml TRIzol Reagenz. 15 Sekunden kräftig von Hand schütteln. 3 min bei RT inkubieren. Zentrifugation: Tischzentrifuge, g, 15 min, 4 C. Wässrige obere Phase abnehmen (enthält RNA), in neues Eppendorfgefäß überführen.

2 RNA Präzipitation: Zugabe von 500 µl Isopropanol. RNA Präzipitation ( Fällung ) bei 20 C über Nacht (ÜN). Studentenaufgaben Tag 3 (Mittwoch): Abschluss RNA Präparation: Abschluss RNA Präzipitation: Zentrifugation: Tischzentrifuge, g, 10 min, 4 C. Waschen des RNA Präzipitates ( Pellets ) zur Entfernung überschüssiger Salze: Isopropanol Überstand abnehmen und verwerfen. Zugabe von 1 ml 75% Ethanol. Eppendorfgefäß mehrmals invertieren ( Pellet waschen ). Zentrifugation: Tischzentrifuge, 7500 g, 5 min, 4 C. Ethanol Überstand entfernen (Pellet so trocken wie möglich). Pellet trocknen (an offener Brenner Flamme). Lösen des RNA Präzipitates: Zugabe von ca. 50 µl RNase freiem Wasser (Volumen abhängig von Pellet Größe). Eppendorfgefäße für 3 h auf Eis. Eppendorfgefäße für 30 min zu RT, anschließend wieder auf Eis. Qualitätskontrolle der RNA Präparationen: Spektralphotometrische Bestimmung von Konzentration und Reinheit der RNA Präparationen (1.5 µl) mittels des NanoDrop 8000 (Messung der A 260, A 280 und A 230 ). Analyse der Qualität der RNA Präparationen (100 ng) mittels des Agilent Bioanalyzer. Studentenaufgaben Tag 4 (Donnerstag): cdna Synthese (Je 2 Ansätze pro Gruppe: 1x Kontrolle, 1x γ Interferon induzierte Probe): Erforderliche Komponenten: High Capacity cdna Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Erstellung des cdna Mastermix: Ansatz: 10x RT Buffer: 2.0 µl 25x dntps: 0.8 µl 10x RT Random Primers: 2.0 µl Reverse Transcriptase: 1.0 µl H 2 O: 4.2 µl 10.0 µl

3 Erstellung der Reaktionsansätze: Je Ansatz: cdna Mastermix: 10 µl RNA (2 µg): XX µl H 2 O: ad 20 µl Inkubation: 25 C 10 min 37 C 120 min 85 C 5 min RT (Reverse Transcription) Real Time PCR: Je 14 Ansätze (3 technische Replikate je Probe) pro Gruppe: 3x Kontrolle mit Assay, 3x γ Interferoninduzierte Probe mit Assay, 3x Kontrolle mit Assay, 3x γ Interferon induzierte Probe mit Assay 2x NTC = No Template Control (ohne cdna) mit Assay bzw. Assay. Erforderliche Komponenten: TaqMan Pre developed Assay Reagents (Human 20x) (Applied Biosystems). Gene Expression Mastermix (Applied Biosystems). Assay 20x (Applied Biosystems). Erstellung der Reaktionsansätze: Je Ansatz: Gene Expression Mastermix (2x): 10 µl Assay (20x) bzw. Assay (20x): 1 µl cdna (1:2 verdünnt 50 ng/µl): 2 bzw. 0 µl H 2 O: 7 bzw. 9 µl 20 µl Platten Beschickungsschema für vier Gruppen A, B, C und D: A B C D NTC_A NTC_A NTC_B NTC_B NTC_C NTC_C NTC_D NTC_D

4 Farbcodierung der einzelnen Studenten Gruppen A, B, C, D; Rot = Assays, Grün = Assays. Gerät: 7900 HT Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems). Inkubation: 95 C 10 min 95 C 15 sec 60 C 01 min 40 x Software: SDS Software (Applied Biosystems) zur relativen Quantifizierung ( Ct Methode).

5 Studentenaufgaben Tag 5 (Freitag): Datenexport: Software: RQ Manager (Applied Biosystems)

6 Auswertung: Software: DataAssist Software(Applied Biosystems) Diskussion der Ergebnisse

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