Biochips Das Labor in der Streichholzschachtel

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1 356 BIOCHEMISCHE METHODEN Biochips Das Labor in der Streichholzschachtel Stefan Lorkowski, Gerhard Lorkowski und Paul Cullen Das Expressionsverhalten von mehreren Tausend Genen kann auf Biochips in der Größe einer Briefmarke simultan analysiert werden. Ziel der Chipentwicklung sind Lab-on-a-chip-Systeme, die kostensparende Routineanalysen in vielen Bereichen der medizinischen Diagnostik mit hohem Probendurchsatz ermöglichen. Die Miniaturisierung molekularbiologischer und biochemischer Methoden bietet zahlreiche Vorteile: Neben einer Reduktion der Herstellungskosten ermöglicht sie einen höheren Grad der Automatisierung und eine größere Flexibilität der Einsatzmöglichkeiten. Wir wollen hier den Stand der Entwicklung auf dem Gebiet der Miniaturisierung im medizinischen Forschungslabor skizzieren und einige Herstellungsverfahren und Anwendungsmöglichkeiten vorstellen. DNA-Chips haben Potenzial für die Genanalyse Das gesamte menschliche Genom umfasst nach heutigen Vorstellungen bis Gene [1], die rund zehn Prozent der insgesamt etwa drei Milliarden Nukleotide Besonders weit fort- geschritten ist die Miniaturisierung im Bereich der DNA-Chiptechnologie. Sie ermöglicht es, DNA-Moleküle in großer Zahl auf feste Oberflächen aufzubringen und zu analysieren. des humanen Erbguts ausmachen. Jedoch ist nur ein Teil aller Gene näher charakterisiert und einem Enzym bzw. Protein funktional zugeordnet. Von den restlichen Nukleinsäuren mit bekannter Sequenz und definiertem Genlokus liegen in öffentlichen Datenbanken nur vereinzelt Expressionsdaten vor, das heißt, dass Gewebe oder Zellen bekannt sind, in denen diese Gene unter bestimmten Bedingungen exprimiert werden. Aus diesen als expressed sequence tags (ESTs) bezeichneten Sequenzen lassen sich zwar Proteinsequenzen vorhersagen, das kodierte Protein ist jedoch nicht identifiziert und seine Funktion weiterhin unbekannt. Mit den herkömmlichen Methoden der klassischen Molekularbiologie und Biochemie ist die Aufklärung des von diesen Genen gesteuerten zellulären Stoffwechsels eine langwierige und aufwändige Arbeit. Dieser Prozess soll daher durch die Entwicklung und Verwendung geeigneter Biochips beschleunigt werden. In den meisten humanen Zellen werden bis Gene gleichzeitig in unterschiedlichen Mengen exprimiert; in den Zellen des Gehirns möglicherweise bis zu Gene [2]. Das Expressionsmuster (die Gesamtheit aller RNAs, engl. expression profile) einer Zelle wird durch ihre physiologische Funktion, ihre Lokalisation und ihren momentanen Aktivierungszustand bestimmt. Da die Zellen eines Organismus sich verändernden Einflüssen unterworfen sind, werden auch diese Expressionsmuster ständig moduliert. Die Kenntnis eines spezifischen Fingerabdrucks der Genexpression einzelner Zellpo- WILEY-VCH Verlag GmbH, Weinheim, /00/ $ /0

2 Biochips pulationen oder eines Gewebes unter bestimmten physiologischen und pathologischen Zuständen kann von großem diagnostischem und therapeutischem Interesse sein. Bislang wurden zur Genexpressionsanalyse 2 Abb. 1. Prinzip der Watson-Crick- Basenpaarung. Durch Wasserstoffbrückenbindungen wird Adenin an Thymidin und Guanin an Cytosin gebunden. Methoden wie die kompetitive RT-PCR, der 5 -Nuklease-Assay und die differential display RT-PCR (DDRT-PCR) eingesetzt, die alle auf der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basieren [3]. Auch andere Verfahren wie Northern-, Dot- bzw. Slot-Blot-Analysen, Ribonuklease-Protektionsassays (RPA), subtraktive und differenzielle Hybridisierungen, Nuklease-S1-Analysen, Nuclear-run-on- Assays und SAGE (serial analysis of gene expression) können für diesen Zweck verwendet werden. Hauptnachteil dieser Methoden ist neben technischen Schwierigkeiten die Tatsache, dass sie ausschließlich die Analyse einiger weniger oder nur einzelner Gene ermöglichen. Verfahren, die die Voraussetzungen für genomweite Expressionsanalysen erfüllen (z. B. DDRT-PCR und SAGE), sind aufwändig und zeitintensiv oder kostspielig in der Geräteanschaffung. Im Unterschied dazu haben DNA-Chips das Potenzial, mit relativ geringem Arbeits- und Zeitaufwand Gene auch in menschlichen Zellen und Geweben hinsichtlich ihres Expressionsverhaltens simultan zu analysieren. Sie können daher zu einer der wichtigsten Neuerungen unserer Zeit werden. Neben der Genexpressionsanalyse werden DNA-Chips eine wichtige Rolle in der molekularen Genetik spielen. Durch ein Verfahren, das als Sequenzierung durch Hybridisierung Abb. 2. Strategien zur Aufarbeitung von mrna-proben für die Expressionsanalyse.

3 358 Biochips 4 3 A bezeichnet wird, können Mutationen und Polymorphismen einzelner Basen (single nucleotide polymorphisms, SNPs) in bekannten Gensequenzen identifiziert werden. Dazu werden kurze DNA-Fragmente an die Oligonukleotide eines Chips hybridisiert. Anhand des resultierenden Hybridisierungsmusters kann die Sequenz des zu untersuchenden Fragments bestimmt werden, sofern die komplementäre Sequenz des Oligonukleotids auf dem Chip bekannt ist. Theoretisch ist mit dem Prinzip der Sequenzierung durch Hybridisierung auch die Sequenzierung unbekannter DNA-Sequenzen möglich. Die Erstellung der Gesamtsequenz einer unbekannten DNA anhand ihres Hybridisierungsmusters ist jedoch aufgrund der großen Datenmenge sehr aufwändig, so dass ein einfaches Sequenzieren mit herkömmlichen Methoden derzeit noch effizienter ist. Dies kann sich jedoch mit den schnell fortschreitenden Entwicklungen der Bioinformatik rasch ändern. Aufbau und Funktionsprinzip eines DNA-Chips Abb. 4. Prinzip der Expressionsanalyse mit zwei Proben auf einem Chip. Die Verwendung von zwei Farbstoffen zur Markierung ermöglicht eine simultane Hybridisierung zweier Proben auf einem Chip. [Abbildung mit freundlicher Genehmigung von Dr. Patrick O. Brown, Universität Stanford] Das Funktionsprinzip eines DNA-Chips ähnelt herkömmlichen Hybridisierungstechniken der Molekularbiologie wie den Northern- oder Southern-Blot-Analysen. Diese Verfahren nutzen die Eigenschaft von Nukleinsäuren, miteinander sequenzspezifisch zu hybridisieren. Unter Hybridisierung wird die nichtkovalente Bindung zweier zueinander komplementärer Nukleinsäurestränge verstanden, die auf der Ausbildung von Wasser- 5 B Abb. 3. Prinzip der Expressionsanalyse mit zwei Chips. Systeme, die mit zwei miteinander zu vergleichenden Chips arbeiten, erinnern an die Twin Towers in New York. Brennende Lichter zeigen Bereiche an, in denen gearbeitet wird (d. h. RNA exprimiert wird). Der Vergleich mit dem zweiten Gebäude zeigt Bereiche mit unterschiedlicher oder gleicher Aktivität. Analog weisen Gene, die im gleichen Maße repräsentiert sind, auf beiden Chips die gleiche Signalintensität auf, Gene, die unterschiedlich exprimiert werden, verschiedene Signalintensitäten. [Abbildungen mit freundlicher Genehmigung von PD Dr. Harald Funke, Institut für Arterioskleroseforschung, Münster] Abb. 5. Expressionsanalyse mit perfect-match/mismatch-system eines Oligonukleotidarrays der Firma Affymetrix. Aus einer RNA werden Bereiche ausgewählt, die in Form von Oligonukleotiden mit 25 Basen auf dem Chip erzeugt werden (perfect-match-sonde). Zusätzlich werden mismatch-oligonukleotide synthetisiert, die sich von den perfectmatch-oligonukleotiden nur durch den Austausch einer einzelnen Base unterscheiden. Ein Vergleich der Signalintensitäten zwischen perfect-match- und mismatch-proben zeigt, ob die Hybridisierung an die perfect-match-sequenz spezifisch ist. Im ersten Feld hat die markierte RNA weder an die perfect-match- noch an die mismatch-oligonukleotide hybridisiert. Da kein Unterschied in der Intensität der Signale sichtbar ist, wird dieses Feld nicht ausgewertet. Feld 3 kann ebenfalls nicht ausgewertet werden, da beide Signale gleich stark sind, die Probe also unspezifisch hybridisiert hat. Alle anderen Felder werden ausgewertet, da hier spezifische Hybridisierungen vorliegen.

4 Biochips stoffbrückenbindungen zwischen den heterozyklischen Basen der Nukleinsäuremoleküle beruht (siehe dazu auch Seite 369). Aufgrund der hohen Spezifität dieser Watson-Crick-Basenpaarung (Abbildung 1) kommt es nur bei einer perfekten Paarung der Basen (Guanin mit Cytosin und Adenin mit Thymin oder Uracil) zu einer ausreichend starken Bindung. Schon eine einzelne Misspaarung kann die Bindungsaffinität stark beeinträchtigen oder völlig unterbinden. Auf einem DNA-Chip werden Nukleinsäuren bekannter Sequenz, die als Sonden bezeichnet werden, auf einem Träger in einem bekannten Muster immobilisiert. Die zu untersuchende Nukleinsäure wird markiert und mit den Nukleinsäuren auf dem Chip hybridisiert. Eine Hybridisierung erfolgt nur zwischen exakt komplementären Nukleinsäuremolekülen, und die Intensität des gemessenen Signals ist zur Menge an hybridisierter Probe proportional. Derartige Mikroarrays werden heute von mehreren Firmen kommerziell angeboten und von vielen Forschungsgruppen selbst hergestellt. Analog zu molekularbiologischen Blotting-Verfahren werden Nukleinsäuren auf Nylonmembranen immobilisiert, die eine hohe Bindungsaffinität für Nukleinsäuren aufweisen. Verwendet werden dafür Plasmide oder PCR-Produkte, die mit einer Dichte von 80 bis 100 Spots/cm 2 auf Membranen mit Ausmaßen einiger Quadratzentimeter aufgetragen werden. Die Detektion der in der Regel radioaktiv markierten Probe erfolgt autoradiographisch auf Röntgenfilmen oder mit Hilfe von Belichtungsplatten, die durch elektromagnetische Strahlung aktivierbar sind. Eine Weiterentwicklung sind Arrays höherer Spotdichten mit mehr als Spots/cm 2. Diese werden allgemein als DNA-Chips bezeichnet. Als Substrat für eine Immobilisierung der Nukleinsäuren dient hierbei häufig Glas, das je nach Anforderung an den Herstellungsprozess chemisch modifiziert wird, aber auch Silizium. Je nach Chiptyp besteht die Nukleinsäurebibliothek auf dem Chip aus kurzen Oligonukleotiden mit bis zu 25 Basen, PCR-Fragmenten mit etwa 500 bis 5000 Basen oder aus Plasmiden, die ein DNA-Fragment geeigneter Größe enthalten. Die Anordnung und Zusammensetzung der Nukleinsäuren auf den Chips müssen dem Verwendungszweck Expressions- oder Sequenzanalyse angepasst werden. Für Expressionsanalysen werden Nukleinsäuren, die repräsentativ für ausgewählte Gene sind, aufgetragen. Als Probe verwendet man Nukleinsäuren, die den Expressionszustand des zu untersuchenden Systems widerspiegeln. Botenribonukleinsäuren (engl. messenger R- NAs) sind für eine direkte Verwendung als Probe ungeeignet, da es keine ausreichend effizienten Detektionssysteme für nicht markierte Nukleinsäuren gibt. Eine Möglichkeit zur Markierung ergibt sich durch die Reverse Transkription der mrna in cdna (complementary DNA; komplementäre DNS). Für Abb. 7. Bildung von Tropfen an piezoelektrischen Düsen. [Microdrop Gesellschaft für Mikrodosiersysteme mbh, Norderstedt] viele Anwendungen ist die so erhältliche Probenmenge jedoch zu gering. Oft ist daher eine Vermehrung (Amplifikation) der cdna obli- 8 6 Abb. 6. Herstellung eines Arrays mit der pin-and-ring array technology. Abb. 8. Die Präzision, mit der piezoelektrische Düsen gesteuert werden können, ist so hoch, dass sich die Tropfen mit Leichtigkeit durch ein Nadelöhr dosieren lassen. [Microdrop Gesellschaft für Mikrodosiersysteme mbh, Norderstedt]

5 360 Biochips 9 a A 9 b B 9 c C 9 d D 9 e E

6 Biochips f F 9 g G Abb. 9. Herstellungstechniken von Nukleinsäurechips, Details im Text. a) Contact tip deposition printing; b) Micro contact printing (µcp); c) Micro fluidics networks (µfn); d) Elektrochemische Fokussierung; e) Photolithographische Herstellung mittels lichtempfindlicher Schutzgruppen und Lochmasken; f) Prinzip der Photolithographie mit Schutzgruppen und Spiegeln; g) Siebdruckverfahren (micro wet printing, µwp).

7 362 Biochips 10 Abb. 10. Oligonukleotidsynthese mit piezoelektrischen Dispensern nach dem Single-jet-Verfahren. gat, die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erfolgen kann, die mit wenigen Synthesezyklen durchgeführt wird. So wird vermieden, dass unterschiedliche Reaktionskinetiken und -verläufe der verschiedenen Nukleinsäuren während der Amplifikation das Verhältnis einzelner Nukleinsäuren zueinander verfälschen. Ein Verfahren, das ohne eine PCR-Amplifikation auskommt, ist die in-vitro-transkription der cdna. Dazu muss während der Reversen Transkription ein Promotor für eine RNA- Polymerase an den cdna-strang angefügt werden, der die Transkription der cdna in crna ermöglicht. Während der Transkription bzw. der PCR-Amplifikation der Nukleinsäuren werden markierte Nukleotide eingebaut, die nach der Hybridisierung eine Detektion der Hybridisierungsereignisse ermöglichen. Abbildung 2 gibt einen Überblick über die Strategien, die zur Probenverarbeitung für Expressionsanalysen möglich sind. Zwei Verfahren zur Bestimmung der Expressionsunterschiede zwischen Proben Beim ersten Verfahren werden zwei identische Chips verwendet, die jeweils mit den markierten Nukleinsäuren zweier Proben hybridisiert werden. Die Signalintensitäten der einzelnen Gene werden mit internen Standards oder statistischen Verfahren normalisiert. Hierfür können Gene verwendet werden, die in Zellen gleichen Typs ein identisches Expressionsniveau aufweisen. Diese Gene werden auch als housekeeping genes bezeichnet, da sie häufig an zentralen Stoffwechselwegen der Zellen beteiligt sind (z. B. die für β-actin, Ribosome und Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase kodierenden Gene). Bei Arrays hoher Dichte kann die Gesamtintensität aller Signale gemittelt und als Basis einer Normalisierung verwendet werden. Unterschiede zwischen den Signalintensitäten deuten auf Expressionsunterschiede hin (Abbildung 3). Bei einem zweiten Verfahren, das mit nur einem Chip für zwei zu untersuchende Proben auskommt, werden zwei verschiedene Markierungen (z. B. die Fluoreszenzfarbstoffe Cy3, 488 nm Anregung und Cy5, 594 nm Anregung) für die beiden Proben verwendet. Die 1:1 gemischten Proben werden dann auf einem Chip hybridisiert. Gene, die im gleichen Maße repräsentiert sind, weisen eine Mischfarbe (z. B. Gelb) auf, während Gene, die unterschiedlich exprimiert werden, die Farbe der entsprechenden Markierung (z. B. Rot oder Grün) zeigen (Abbildung 4). Die beschriebene Vorgehensweise wird oft für Arrays genutzt, die PCR-Produkte oder Plasmide als Nukleinsäurebibliothek verwenden. Der große Vorteil dieser Arrays ist ihre einfache Herstellung. Nachteilig ist jedoch, dass ein solches aus vielen großen Nukleinsäuren bestehendes Gemisch sehr inhomogene Hybridisierungskinetiken aufweist. Daher sind die Hybridisierungsbedingungen (Temperatur, ph, Salzkonzentrationen) für einzelne Moleküle oft nicht optimal, so dass unspezifische oder unvollständige Hybridisierungen auftreten, die die Ergebnisse verfälschen können. Ferner sind die Nukleinsäuren der Bibliothek ungeordnet auf dem Substrat aufgebracht und daher für die Nukleinsäuren der zu hybridisierenden Probe teilweise sterisch unzugänglich. Abhilfe versprechen hier Oligonukleotidarrays, die Nukleinsäuren mit etwa 25 Basen als Sonden auf dem Substrat enthalten. Diese Oligonukleotide können anhand ihrer chemischen Eigenschaften so ausgewählt werden, dass ihre Hybridisierungseigenschaften aufeinander abgestimmt sind. Besonders elegant hat die Firma Affymetrix (San Diego, USA) dieses Verfahren zu einem kommerziellen System umgesetzt. Für Expressionsanalysen werden 20 Oligonukleotide pro RNA ausgewählt und auf dem Chip aufgebracht. Diese Oligonukleotide sind zu 20 verschiedenen Sequenzabschnitten der RNA exakt komplementär und werden daher als perfect-match- Oligonukleotide bezeichnet (Abbildung 5). Da sich die Schmelztemperaturen der Oligonukleotide recht exakt vorhergesagen lassen, können die Oligonukleotide so ausgewählt werden, dass sie ähnliche Hybridisierungseigenschaften haben. Sollten dennoch einige Oligonukleotide nicht oder nur ungenügend hybridisieren, sind ausreichend weitere vorhanden, die für eine Auswertung zur Verfügung stehen. Die Hybridisierungsbedingungen für derart kurze Oligonukleotide können vorab durch Berechnungen und Vorversuche gut aufeinander abgestimmt werden. Dieses System hat den weiteren Vorteil, dass der Anteil an nicht spezifischen Hybridisierungen am Gesamtsignal ermittelt werden kann. Dazu wird für jedes perfect-match-oligonukleotid ein weiteres, sogenanntes mismatch-oligonukleotid auf den Chip aufgebracht. Das mismatch- unterscheidet sich von dem perfect-match-oligonukleotid dadurch, dass in der Mitte des Oligonukleotids eine einzelne Base ausgetauscht ist. Unter idealen Bedingungen findet zwischen der Probe und

8 Biochips 363 dem mismatch-oligonukleotid keine Hybridisierung statt. Signale, die dennoch an Stellen mit mismatch-oligonukleotiden auftreten, müssen daher von unspezifisch hybridisierten Nukleinsäuren stammen. Durch einen Vergleich der Signalintensitäten zwischen der perfect-match- und mismatch-probe kann entschieden werden, ob die Hybridisierung an die perfect-match-sequenz spezifisch ist. Außerdem können für die perfect-match-oligonukleotide korrigierte Intensitäten berechnet und mit den Intensitäten einer weiteren Probe verglichen werden. Da dieser Vergleich anhand aller Oligonukleotidpaare erfolgt, hängt die Entscheidung, ob unterschiedliche Mengen einer RNA in den beiden Proben vorliegen, im Unterschied zu anderen DNA- Chips von der Auswertung aller Signale ab. Eine weitere interessante Anwendung der Oligonukleotidchips ist die Resequenzierung mittels Hybridisierung. Dieses Verfahren ermöglicht die Identifizierung von Mutationen und Polymorphismen einzelner Basen (engl. single nucleotide polymorphisms, SNPs) in bekannten Gensequenzen. Dazu werden den Genabschnitten entsprechende Oligonukleotide auf den Chip aufgetragen. Die Nukleinsäuren einer zu untersuchenden Probe werden amplifiziert und mit den Oligonukleotiden des Chips hybridisiert. Anhand des resultierenden Hybridisierungsmusters kann die Sequenz des zu untersuchenden Fragments bestimmt werden, da die Sequenzen der komplementären Oligonukleotide auf dem Chip bekannt sind. Das Sequenzieren mittels DNA-Chips ist jedoch nicht unproblematisch, da die zu untersuchende mutierte Sequenz hinsichtlich der Hybridisierungsbedingungen nicht optimiert werden kann. Es können daher bei der Hybridisierung der Probe mit den Oligonukleotiden auf dem Chip Fehler auftreten. Daher wurden Resequenzierungschips entwickelt, bei denen jedes Oligonukleotid an jeder Position in der Sequenz variiert wird. So werden in einem rechteckigen Sektor des Chips Oligo- 11 A B C Abb. 11. Aufbau eines elektrischen DNA-Siliziumchips [18]. a) Chip mit 25 Platinelektroden mit einer Kantenlänge von 1 cm. Helle Quadrate in den peripheren Bereichen sind Platinelektroden, über die der Chip an eine Stromquelle angeschlossen wird. Die hellen Linien sind Platinverbindungen zwischen den peripheren und den kleinen Elektroden in der Chipmitte. b) Ausschnitt aus der Mitte des Chips. Dieser 1 1 mm große zentrale Bereich besteht aus vier großen Elektroden in den Ecken mit einem Durchmesser von 160 µm und 25 quadratisch angeordneten Elektroden mit einem Durchmesser von 80 µm. Pt: frei zugängliche Bereiche der Platinelektroden, Si 3 N 4 : Bereiche mit dielektrischem Trisiliziumtetranitrid Si 3 N 4, Si 3 N 4 over Pt: Flächen der Platinelektroden, die mit Si 3 N 4 bedeckt und daher isoliert sind. c) Querschnitt durch einen Elektrodenbereich. Die Lage der Elektrode auf dem Chip wird durch die Linien aus Teil b der Abbildung markiert. Pt: Platinelektrode; Si 3 N 4 : isolierende Si 3 N 4 -Schicht; SiO 2 : inerte Schutzschicht aus Siliziumdioxid auf dem Siliziumträger (Si-substrate); Permeation Layer: mit Streptavidin gekoppelte Agaroseschicht; DNA: biotinylierte Nukleinsäuremoleküle, die an Streptavidin gebunden sind.

9 364 Biochips nukleotide mit allen denkbaren einfachen Basenaustauschen aufgetragen. Diese dienen ähnlich wie die mismatch-proben der Expressionschips als Kontrolle für nicht spezifische Hybridisierungen bzw. zur Detektion heterozygoter Proben. Nachteile dieser Strategie sind die noch relativ hohen Fehlerraten im Vergleich zu klassischen Verfahren und die fehlende Möglichkeit, multiple Mutationen oder komplexe Sequenzabweichungen identifizieren zu können. 12 Prinzipiell ist mit dem Sequenzieren durch Hybridisierung auch die vollständige Sequenzierung unbekannter DNA-Sequenzen möglich. Aufgrund der großen Zahl der dazu nötigen Oligonukleotide ist die Datenanalyse immens aufwändig und kann stark mit Fehlern behaftet sein. Daher sind herkömmliche Methoden bislang effizienter. Allerdings arbeiten Firmen an der Entwicklung von DNA-Chips, die sich zur universellen Sequenzanalyse unbekannter DNA-Proben eignen. 13 Wie kommt die DNA auf den Chip? Zur Herstellung von DNA-Chips stehen prinzipiell zwei Verfahren zur Verfügung, die sich in der Art der Immobilisierung der Nukleinsäuren bzw. in der Art der Oligonukleotidherstellung auf der Substratoberfläche unterscheiden. Im ersten Verfahren werden Nukleinsäuren (PCR-Fragmente, Oligonukleotide etc.) ex situ hergestellt und auf ein Sub- Abb. 12. Querschnitt durch einen XNA-on-Gold-Chip. Auf einem Träger von der Größe eines Mikroskopobjektträgers werden zweimal 96 Proben aufgetragen. Auf das mit Gold beschichtete Glassubstrat werden langkettige Thioalkane aufgebracht (chemical interface). Über ein Biotinmolekül wird eine Streptavidinschicht (biological interface) fest an die Thioalkane gebunden. An dieser Schnittstelle können biotinylierte Proben (Nukleinsäuren, Peptide etc.) immobilisert werden. [Abbildung mit freundlicher Genehmigung der Fa. Interactiva, Ulm] Abb. 13. Lichtempfindliche Schutzgruppen, zur Bedeutung der Substituenten X und R 1,2 siehe Text. In Verbindung 8 ist Z = O, S, N-Alkyl, CH 2, CH 2 -CH 2, CH = CH, und Y ist allgemein ein Alkylrest, ein substituierter Aromat oder eine Elektronendonorgruppe. Von der Firma Affymetrix werden bevorzugt die Verbindungen 1 (mit R 1 = R 2 = H) und 8 als Schutzgruppen eingesetzt.

10 Biochips 365 strat aufgebracht. Bei dem zweiten Verfahren werden Oligonukleotide in situ auf der Oberfläche des Substrats erzeugt. Zu den ersten Methoden gehören das contact tip deposition printing, das micro contact printing (µcp), die micro fluidics networks (µfn) und das electro capture. Photolithographische Verfahren unter Verwendung von lichtempfindlichen Schutzgruppen oder als Photoresisttechnik verwenden ausschließlich in situ auf einem Substrat erzeugte Oligonukleotide. Das piezoelectric printing und das micro wet printing (µwp) sind prinzipiell geeignet, sowohl vorgefertigte Sonden auf einer Oberfläche aufzubringen, als auch Oligonukleotide direkt auf einem Träger zu erzeugen. Contact tip deposition printing Dieses Verfahren wurde 1997 von der Firma Synteni (Fremont, USA) zu einem kommerziell nutzbaren System entwickelt und wird von zahlreichen Forschungsgruppen angewendet. Dabei wird in die Lösung der zu immobilisierenden Nukleinsäure eine Nadel getaucht, an deren Spitze eine definierte Menge der Flüssigkeit verbleibt, die auf der Substratoberfläche deponiert wird (Abbildung 9a). Derzeit übliche Geräte verwenden mehrere Nadeln, die simultan in die Lösung getaucht werden können und erzeugen Spots mit einem Durchmesser von bis zu 70 µm. Meistens verfügen diese Nadeln über eine Kerbe, die, ähnlich der Feder eines Füllfederhalters, als Reservoir für die Lösung dient. Bei einer Variante dieser Technik [4] taucht ein Ring in eine Nukleinsäurelösung (pin-andring array technology), und an der Ringoberfläche bildet sich ähnlich wie bei der Erzeugung von Seifenblasen eine Lamelle. Wird die Flüssigkeitslammelle mit einer Nadel von oben durchstoßen, so kann ein Teil der Flüssigkeit, der an der Nadelspitze verbleibt, auf die Oberfläche des Substrats aufgetragen werden (Abbildung 6). Mit dem contact tip deposition printing lässt sich eine recht hohe Probendichte erreichen. Reproduzierbare minimale Spotgrößen liegen derzeit im Bereich von 50 µm, wobei der Abstand zwischen zwei Spots in etwa der Spotgröße entspricht. Nukleinsäuren werden üblicherweise nicht direkt auf einer Glasoberfläche aufgetragen, vielmehr wird das Glassubstrat zuvor beschichtet. Dafür verwendet man häufig Poly- L-Lysin, das Moleküle über ionische Wechselwirkungen an die Oberfläche bindet. Derart beschichtete Arrays können nur einmal verwendet werden, da beim Entfernen der hybridisierten Proben die immobilisierten Nukleinsäuren auf dem Chip ebenfalls abgelöst werden. Darüber hinaus liegen die Nukleinsäuren ineinander verknäult auf der Oberfläche des Trägers vor. Die Folge ist eine reduzierte Hybridisierungskinetik, da die Sondenmoleküle für die Nukleinsäuren der Proben nicht frei zugänglich sind. Dieses Problem lässt sich Abb. 14. Für das Photoresistverfahren verwendete Verbindungen. XU-218 kann als schützende Polymerschicht unterhalb des Photoresists (SU-8) verwendet werden [14]. Abb. 15. Phosphoramiditverfahren zur Oligonukleotidsynthese (Erläuterung im Text).

11 366 Biochips durch die Verwendung von Linkermolekülen (z. B. Oligoethylenglykolderivate) lösen: Nukleinsäuren, die über ein Linkermolekül an die Trägerschicht gebunden werden, sind besser zugänglich. Manche Hersteller verwenden silylierte Glasträger, um modifizierte Nukleinsäuren kovalent mit einer Schiffschen-Base-Reaktion an die Substratoberfläche zu binden und damit eine Wiederverwendung der Arrays zu ermöglichen. 16 Micro contact printing (µcp) In Analogie zum contact tip deposition printing wird beim micro contact printing (µcp) ein Stempel aus Polydimethylsiloxan (PDMS) zur Übertragung der Nukleinsäuren auf eine Trägeroberfläche verwendet (Abbildung 9b). Solche Stempel können bereits heute reproduzierbar mit definierten Strukturen von weniger als 50 nm erzeugt werden und eröffnen neue Perspektiven in der Miniaturisierung [6]. Die bisher erzielten Ergebnisse bei der Anwendung des µcp zur Übertragung von Substanzen auf Trägeroberflächen sind jedoch ernüchternd. So wurde bislang kein auf dem µcp basierendes Verfahren zur Herstellung von DNA-Chips mit einer für umfangreiche Analysen ausreichenden Probendichte vorgestellt. Micro fluidics networks (µfn) Die aus dem µcp abgeleiteten micro fluidics networks (µfns) sind eine interessante Alternative zur Herstellung von Mikroarrays. Auf einer Substratoberfläche (Glas, Gold, Poly- Abb. 16. Funktionsprinzip des kompetitiven Suspensionshybridisierungssarrays. Zunächst wird ein Oligonukleotid an eine individuelle Partikelpopulation gebunden, die dann mit fluoreszenzmarkierten Reporter-Oligonukletiden hybridisiert wird. Die Bindung zwischen den beiden Molekülen kann im Durchflusszytometer als durchschnittliche Fluoreszenz gemessen werden. In einem zweiten Ansatz wird das Reporter-Oligonukleotid zunächst mit einem Kompetitor inkubiert. Die Reporter-Moleküle werden an den Kompetitor gebunden und stehen daher nicht mehr für eine Hybridisierung an die Oligonukleotide der Mikropartikel zur Verfügung. Es resultiert eine Abnahme der mittleren Fluoreszenz, die für eine Quantifizierung der Nukleinsäuren in der Probe herangezogen werden kann (Abbildung nach [18]). Mittlerweile bieten zahlreiche Firmen Geräte für die Herstellung von Chips nach diesem Verfah- ren an. Die Arbeitsgruppe von Pat Brown an der Universität Stanford hat sogar Anleitungen für den Eigenbau eines derartigen Geräts im Internet publiziert [5]. styrol oder Silizium/Siliziumdioxid) werden Kapillaren erzeugt, indem ein mit kleinen Kanälen versehener PDMS-Stempel auf die Oberfläche aufgesetzt wird (Abbildung 9c). Die Kanäle werden mit einer Lösung der aufzutragenden Substanz gefüllt. Die Lösung wird durch Kapillarkräfte in das Innere des Stempels gezogen und benetzt die Substratoberfläche. Die Immobilisierung der Substanzen erfolgt an vorpräparierten Stellen. Für die Immobilisierung von Antikörpern kann die Oberfläche des Trägers mit Hydroxylsuccinimidylestern aktiviert werden, um eine chemische Kopplung der Aminogruppen der Proteine zu ermöglichen [7]. Schwierigkeiten können jedoch durch das Verstopfen der Kapillaren und eine limitierte Zahl an verwendbaren Lösungsmittel auftreten. Die µfns werden erfolgreich zur Immobilisierung von Immunglobulinen eingesetzt [8]. Piezoelektrische Drucktechniken Piezoelectric printing Ähnlich wie ein Tintenstrahldrucker Tinte auf ein Blatt Papier sprüht, können mit einem piezoelektrischen Dispenser kleine Flüssigkeitsmengen auf einer Oberfläche aufgetragen werden (Prinzip ähnlich Abbildung 9a, aber Reservoir ist durch Düse ersetzt). Diese Dispenser, deren weniger als 100 µm große Pipettierspitzen aus Silizium und Glas gefertigt werden, können Volumina von weniger als einem Nanoliter ( pl) in sehr kurzen Zeitintervallen (Tropfenfrequenz bis 2 khz) mit einem Volumenfehler von weniger als einem Prozent abgeben. Abbildung 7 zeigt eine Aufnahme der Tropfenbildung an solchen Spitzen. Mit kommerziell erhältlichen piezoelektrischen Systemen können Arrays mit Spotdurchmessern von etwa 200 µm in einem Abstand von bis zu 300 µm und einer Spotdichte von mehr als 1400 Spots/cm 2 erhalten werden. Piezoelektrische Dispensersysteme müssen mit hoher Präzision im Bereich weniger Mikrometer gesteuert und bewegt werden. Abbildung 8 demonstriert am Beispiel eines Nadelöhrs die Genauigkeit, mit der dies möglich ist. Grundsätzlich sind bei Dispensersystemen Kontaminationen möglich. Diese können durch ein Verdampfen der kleinen Probenvolumina und durch Spritzer beim Aufschlag des Tropfens auf der Trägeroberfläche entstehen. Man versucht, die Reproduzierbarkeit der Systeme durch den Einsatz von Trägeroberflächen mit unterschiedlicher Benetzbarkeit zu erhöhen. Der Vorteil des piezoelektrischen Druckverfahrens ist, dass ein Kontakt der Düse mit der Trägeroberfläche vermieden werden kann. Mit anderen Systemen werden durch den Kontakt zwischen Spitzen und Substrat häufig Erschütterungen hervorgerufen, die ein ungenaues Auftragen der Proben und eine Beschädigung sowohl des Substrats als auch der Nadel bewirken können. Prinzipiell können mit piezoelektrischen Dispensern nicht nur ex situ erzeugte Proben aufgetragen, sondern auch Oligonukleotide in situ auf einem Substrat synthetisiert werden (Abbildung 10) [8].

12 Biochips 367 Die verwendeten Druckköpfe sind hochspezialisiert, so dass die Verwendung verschiedener Lösungen und Reagenzien mit unterschiedlichsten physikalischen Eigenschaften nur bedingt möglich ist. Zur Lösung dieses Problems existieren derzeit zwei Strategien, die beide ein modifiziertes Phosphoramiditverfahren zur Synthese der Oligonukleotide verwenden (vgl. auch Siebdruckverfahren, Abbildung 15). Die erste Methode das single-jet-system verwendet einen einzelnen Dispenser, um ein Reagenz auf das Substrat aufzubringen, das eine Entschützung der 5 - Hydroxylfunktion der Nukleotidderivate an bestimmten Stellen auf dem Substrat bewirkt. Die Kopplung eines Nukleotids an die entschützte Hydroxylgruppe und die anschließende Oxidation des Phosphors erfolgt durch Benetzen der gesamten Substratoberfläche mit den entsprechenden Reagenzien. Die zweite Methode verwendet fünf verschiedene Dispenser (multiple-jet-system), von denen jeweils eine Düse eins der vier zur Oligonukleotidsynthese benötigten Phosphoramidite enthält. Der fünfte Dispenser wird zum Auftragen des Detritylierungsreagenzes verwendet. Elektrochemische Fokussierung electro capture Ein gänzlich anderes Verfahren wurde von der Firma Nanogen (San Diego, USA) entwickelt (Abbildung 9d) [9]. Die Basis dieser active programmable electronic device technology bildet ein Siliziumchip mit einer Fläche von 1cm 2, der mit 25, 64 oder 100 Platinelektroden bestückt ist. Zur Herstellung wird auf einem Siliziumträger eine Schicht Siliziumdioxid erzeugt. Diese wird zunächst mit Aluminium und dann mit einem Photoresist bedeckt. Mit Hilfe einer Maske wird der Resist an den Stellen, an denen später die Platinelektroden liegen sollen, entwickelt und anschließend entfernt. Auf den freigelegten Bereichen wird eine 20 nm dicke Grundierung aus Chrom aufgebracht, darüber die 500 nm dicke Elektrodenschicht aus Platin. Nun werden Resist und Aluminium entfernt, anschließend eine 2 µm dicke dielektrische Schicht aus Trisiliziumtetranitrid (Si 3 N 4 ) aufgetragen, die wiederum mit einem Photoresist bedeckt wird. Genau über den Platinelektroden wird dieser Resist sowie die Si 3 N 4 - Schicht entfernt, so dass die Elektroden von oben frei zugänglich und an den Seiten durch Si 3 N 4 isoliert sind. Nach dem Entfernen des gesamten Resists wird der Chip mit Agarose beschichtet, die zuvor mit Streptavidin derivatisiert wurde (Abbildung 11) und die die Immobilisierung biotinylierter Moleküle auf der Oberfläche ermöglicht. Für Nukleinsäureanalysen wird der Chip zum Aufbringen der Sonden mit einer Lösung aus biotinylierten Oligonukleotiden bedeckt. Durch sukzessives Anlegen eines positiven Potenzials an einzelne Elektroden können die negativ geladenen, biotinylierten Oligonukleotide gezielt an mit Streptavidin präparierte Stellen transportiert werden. Durch die hohe Bindungsaffinität der Streptavidin/Biotinwechselwirkungen (K D =10-15 M) werden die Oligonukleotide an diesen Stellen gezielt immobilisiert. Zur Zeit befinden sich für genetische Analysen Chips mit bis zu 400 Elektroden in der Entwicklung, während für Expressionsanalysen Arrays mit 1000 bis Elektroden vorgesehen sind. XNA on Gold Die Firma Interactiva Biotechnologie (Ulm) hat einen Biochip entwickelt, der zur Immobilisierung aller gängigen mit Biotin markierten Biomoleküle geeignet ist (XNA on Gold, Abbildung 12). An einer auf einem Glasobjektträger aufgedampften Goldschicht von der Dicke eines zehntausendstel Millimeters wird eine Schicht aus sich selbst ausrichtenden, langkettigen Thioalkanen kovalent gebunden. An die Thioalkane wird Biotin gebunden und mit Streptavidin abgesättigt. Über freie Bindungsstellen können mit Biotin markierte Moleküle (Nukleinsäuren, Saccharide, Peptide, Lipide etc.) am Streptavidin immobilisiert werden. Zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen wird die Oberfläche des Chips vor der Immobilisierung der Sonden mit einer hydrophoben Teflonschicht bedeckt, die mit einem Raster aus 50 µm tiefen und 1,5 mm durchmessenden Vertiefungen versehen ist. In diesen Vertiefungen werden die Proben aufgebracht. Wegen der umgebenden hydrophoben Fläche sammeln sich wässrige Lösungen der Biomoleküle besonders gut in den vertieften Arealen. Auf einer Fläche von mm können derzeit zweimal 96 Proben immobilisiert werden. In der Entwicklungsphase sind jedoch bereits Arrays mit zweimal 384 Proben. Die Detektion kann mittels Chemilumineszenz, Fluoreszenz oder Autoradiographie erfolgen. Ein großer Vorteil der ex situ-erzeugung der Nukleinsäuren ist, dass über einen zusätzlichen Trennungsschritt die Proben vorher gereinigt werden können. In der Praxis sind solche Reinigungsverfahren jedoch aufwändig und für Massenproduktionen mit Arrays hoher Probendichte ungeeignet. Technisch aufwändig sind auch Verfahren, die Oligonukleotide durch in-situ-kombinatorische Synthese direkt auf der Chipoberfläche erzeugen wie photolithographische Techniken und das micro wet printing. Photolithographische Schutzgruppenentfernung mit Lochmasken Das von der Firma Affymetrix (Kalifornien, USA) angewandte und zur Serienreife entwickelte photolithographische Verfahren [10] beinhaltet eine in-situ-kombinatorische Festphasensynthese der Oligonukleotide auf einem Substrat und basiert auf Techniken, die ursprünglich in der Halbleiterherstellung entwickelt wurden. Als Trägeroberfläche für die zu synthetisierenden Oligonukleotide wird Glas verwendet, dessen Oberfläche mit einer photolabilen Schutzgruppe beschichtet wird (Abbildung 9e). Mit einer Lochmaske werden definierte Areale der Oberfläche belichtet und durch das Abspalten lichtsensitiver Schutzgruppen für Reaktionen aktiviert. Die aktivierten Bereiche werden mit einem ausgewählten Nukleosid inkubiert, das mit frei vorliegenden Hydroxylgruppen der Oberfläche reagiert. Wiederholt man die Prozedur, können weitere Areale aktiviert und mit anderen Nukleotiden inkubiert werden. Jedes eingesetzte Nukleosid ist mit einer zuvor eingeführten lichtsensitiven Schutzgruppe an der 3 -Position der Riboseeinheit versehen. Daher kann durch wiederholtes Auflegen verschiedener Masken, anschließender Aktivierung mit Licht und Inkubation mit geschützten Nukleotiden ein dichter Rasen definierter Oligonukleotide auf der Oberfläche synthetisiert werden. In 32 Synthesezyklen können mit diesem Verfahren durch geschickte Auswahl der 32 Lochmasken mehr als verschiedene Oligonukleotide mit einer Kettenlänge von acht Bausteinen hergestellt werden. Die photolabilen Schutzgruppen haben die allgemeine Formel Ar C(R 1 )(R 2 ) O C(O)-X (Abbildung 13) [11]. Ar ist hier ein Arylrest, eine heteroaromatische Gruppe oder ein vinylähnliches Derivat dieser Reste. R 1 und R 2 sind unabhängig voneinander ein Wasserstoffrest, optional substituierte Alkyl-, Alkenyl-,

13 368 Biochips Alkynyl-, Arylreste oder Heteroaromaten bzw. vinylähnliche Derivate. X steht für eine abzuspaltende Gruppe, die mit dem Ar C(R 1 )(R 2 ) O C(O)-Rest über ein Heteroatom verknüpft ist oder eine feste Oberfläche. Der große Nachteil dieser Technik sind die hohen Kosten für die Lochmasken und die schlechte Ausbeute von 95 Prozent pro Zyzlus, welche die Größe und Qualität der Oligonukleotide nachhaltig beeinflusst. Nur etwa 28 Prozent der 25mere werden in der gewünschten Weise synthetisiert. Photolithographische Schutzgruppenentfernung mit Mikrospiegeln Ein kürzlich vorgestelltes photolithographisches Verfahren kommt ohne die teuren Chrom/Glas-Lochmasken aus [12], die bei herkömmlichen photolithographischen Verfahren eingesetzt werden. Mit einer der Projektionsfernsehtechnik (Texas Instruments, Texas) entliehenen Methode erzeugten die Forscher eine virtuelle Lochmaske mit bis zu digital über einen Computer ansteuerbaren Mikrospiegeln mit einer Kantenlänge von 16 µm. Diese Spiegel sorgen dafür, dass je nach ihrer Winkelstellung definierte Stellen auf einem Array punktgenau mit UV- Licht belichtet werden können. An den belichteten Stellen werden photoaktivierbare Schutzgruppen abgespalten, die anschließend mit zugegebenen Nukleotiden zu einer wachsenden Nukleotidkette umgesetzt werden können. Mit diesem neuen Verfahren konnten bereits Zehntausende von 16 µm großen, DNA-haltigen Areale (features) mit einem Abstand von 1 µm auf einer Fläche von mm realisiert werden, in denen theoretisch verschiedene Oligonukleotide synthetisiert werden können. Mit den von Texas Instruments neu entwickelten und als high-definition television mirror arrays bezeichneten Spiegelsystemen könnten schon bald Arrays mit zwei Millionen Arealen entwickelt werden (Abbildung 9f). Photoresist wet masking Wegen der recht niedrigen Ausbeuten bei der Festphasensynthesechemie mit lichtempfindlichen Schutzgruppen wurde ein Verfahren entwickelt, das auf der Nutzung einer Photoresisttechnik beruht [13]. Diese Technik soll neben der Verwendung der Reagenzien herkömmlicher DNA-Festphasensynthesen eine Auflösung im Bereich der Grenzen der optischen Photolithographie (< 1 µm) ermöglichen. Bei dem als single layer resist process bezeichneten Verfahren wird die mit N,N-Bis(hydroxyethyl)aminopropyltriethoxysilan beschichtete Substratoberfläche zunächst mit einem Phosphoramiditderivat (4,4 -Dime- thoxytritylhexaethylenglykol-(2-cyanoethyl- N,N-diisopropyl)phophoramidit) chemisch geschützt und anschließend komplett mit einer in der Halbleiter- und Mikrosystemtechnik üblichen Photoresistschicht (Abbildung 14, Verbindung SU-8) bedeckt. Nach dem Belichten mit UV-Licht durch eine Lochmaske kann der Resist ausschließlich an den belichteten Stellen entwickelt und entfernt werden. Es resultiert ein Muster von Öffnungen mit bis zu 1 µm Kantenlänge, durch die das Entschützungsreagenz an die Oberfläche gelangen und die Phosphoramiditschutzgruppen entfernen kann. Anschließend können vorgefertigte Oligonukleotide, die mit weiteren Schutzgruppen vor einer Weiterreaktion geschützt sind, mit den freien Hydroxylgruppen auf dem Chip reagieren. Durch erneutes Belichten, Entwickeln und Entfernen des Resists werden neue Bereiche auf der Chipoberfläche freigelegt, die für eine weitere Reaktion zur Verfügung stehen. Die Verwendung eines Photoresists erhöht den Kontrast zwischen den freigelegten und geschützten Bereichen, so dass die beim herkömmlichen photolithographischen Verfahren durch Streulicht auftretenden Randeffekte, die eine geringere Effizienz der Oligonukleotidsynthese in diesen Bereichen bewirken, reduziert werden. Dieses Photoresistverfahren liefert jedoch nur mäßige Gesamtsyntheseausbeuten. Dies rührt zum Teil daher, dass das Entschützungsreagenz mit den im Resist eingebetteten Phosphoramidit reagieren kann. Zusätzlich beeinträchtigen das Entwickeln und Entfernen des Resists nachfolgende Reaktionen, da Nebenreaktionen mit den unter dem Resist liegenden Substanzen auftreten können. Durch die Verwendung einer inerten Polymerschicht (Verbindung XU-218) zwischen der Substratoberfläche und dem Resist können die unerwünschten Wirkungen auf die im Polymer eingebetteten Oligonukleotide reduziert werden. Diese Schicht beeinträchtigt zwar die optische Auflösung, dennoch können Gesamtausbeuten von etwa 90 Prozent erreicht werden. Durch Verwendung eines LCD-Projektors (LCD = liquid crystal display) zum Entfernen der lichtempfindlichen Resistschicht kann auf den Einsatz photolithographisch herzustellender Masken verzichtet werden [14]. Siebdruckverfahren micro wet printing Das Siedruckverfahren [15] (micro wet printing; µwp) ist in Abbildung 9g veranschaulicht. Es basiert auf einer wet-masking-technik. Für die Herstellung der Chips wird eine Druckkassette mit einem Siliziumrahmen verwendet, die die Positionierung einer mit Öffnungen versehenen Maske auf der Chipoberfläche ermöglicht. Zusammen mit dem Rahmen bildet ein aufgelegtes Glas ein Kanalsystem, das die einzelnen Zugänge zur Maske in der Druckkassette miteinander verbindet. Positionsmarker auf der Kassette und dazu komplementäre Markierungen auf der Chipoberfläche ermöglichen das korrekte Ausrichten beider zueinander. Nach dem Ausrichten sind nur die Areale der Substratoberfläche für Reagenzien zugänglich, die sich unterhalb der Öffnungen in der Maske befinden. Nachdem Reagenzien und anschließend Waschlösungen durch die Kanäle auf die Oberfläche geleitet wurden, wird die Maske entfernt und eine neue für einen weiteren Synthesezyklus positioniert. Durch alternierende Zugabe der Nukleosidderivate und den Einsatz von Masken mit variierenden Mustern der Öffnungen können kurze Oligonukleotide an definierte Positionen auf das Substrat aufgebracht werden. Mit dieser Technik können auch ex situ erzeugte Nukleinsäuren und andere Substanzen (Proteine, Antikörper etc.) immobilisiert werden. Das Syntheseverfahren, das zur Erzeugung der Oligonukleotide beim µwp-verfahren und bei den dispenservermittelten in situ- Synthesen verwendet wird, ist in Abbildung 16 dargestellt. Das dort gezeigte Phosphoramiditverfahren ist eine weiterentwickelte Festphasentechnik [16], die eine automatisierte schnelle Oligonukleotidsynthese ermöglicht und heute von einer Vielzahl von Firmen verwendet wird. Für die Synthese wird eine Dimethoxytritylschutzgruppe (DMTr) am 5 -Ende der zu verlängernden Nukleotide mit Säure abgespalten (Detritylierung). Das geschützte Nukleotid ist über eine Linkergruppe am 3 -Ende an eine Trägeroberfläche geknüpft. Das durch die Abspaltung des DMTr-Restes entstehende freie 5 -Ende des Nukleotids reagiert in Gegenwart von Tetrazol mit einem 3 -Phosphoramiditderivat eines zweiten Nukleosids mit über 99 Prozent Ausbeute. Verbliebene nicht umgesetzte 5 - Enden können durch Acetylierung vor einer unerwünschten Weiterreaktion geschützt werden. Die Phosphittriestergruppe, die aus der Kopplungsreaktion resultiert, wird durch

14 Biochips 369 Exkurs: Hybridisierung Als Hybridisierung bezeichnet man die nichtkovalente Bindung zweier zueinander komplementärer, einzelsträngiger Nukleinsäuren unter Ausbildung einer Nukleinsäurehybridduplex, die auf der Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den heterozyklischen Basen der Nukleinsäuremoleküle beruht (vgl. Abbildung 1 im Text). Diese Watson-Crick-Basenpaarung ist so spezifisch, dass schon einzelne Basenmisspaarungen die Bindungsaffinität beeinträchtigen oder sogar vollständig unterbinden können. Aus diesem Grund kann die Hybridisierung zur Identifizierung und Isolierung von Nukleinsäuren und zur Bestimmung des Ausmaßes der Homologie zwischen Nukleinsäuren verwendet werden. Um eine Hybridisierung zu ermöglichen, müssen Nukleinsäuren zunächst durch Erwärmen über den Schmelzpunkt T m hinaus denaturiert werden. Das Erwärmen zerstört die Wasserstoffbrückenbindungen sowohl zwischen den beiden Nukleinsäuresträngen als auch intramolekular ausgebildete Basenpaarungen. Die Hybridisierung erfolgt im Anschluss an die Denaturierung. Für die Bildung von DNA/DNA-Hybriden mit Längen zwischen 50 bis 5000 Bp wird die Hybridisierung etwa 25 C und für DNA/RNA-Hybride etwa 15 C unterhalb der Schmelztemperatur durchgeführt, da hier die Reassoziationsrate und Spezifität am günstigsten ist. Oligonukleotide mit weniger als 50 Bp werden im allgemeinen 5 C unterhalb der Schmelztemperatur hybridisiert. Die Schmelztemperatur der Nukleinsäuren wird entscheidend durch die Basenzusammensetzung und den Salzgehalt der Lösungen beeinflusst. Wegen der niedrigeren Zahl an Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Adenin und Thymin ist die Stabilität der Bindung zwischen diesen beiden Basen deutlich niedriger als zwischen Guanin und Cytosin. Durch Hinzufügen eines zusätzlichen Adenin/Thymin-Basenpaars erhöht sich die Schmelztemperatur eines kurzen Nukleinsäuredoppelstranges um etwa 2 C, durch Hinzufügen eines Guanin/Cytosin- Basenpaars jedoch um ca. 4 C. Die Assoziation von zwei Nukleinsäuresträngen folgt einer Kinetik zweiter Ordnung, und die Gleichgewichtsreaktion lässt sich mit der nachfolgenden Gleichung beschreiben: k1 A + Bs A k2 wobei AB dem Hybrid der beiden Einzelstränge A und B entspricht. Selbst für kurze Nukleinsäurestränge liegt das Gleichgewicht dieser Reaktion unterhalb der Schmelztemperatur weit auf der rechten Seite. Wenn a und b die Ausgangskonzentrationen der beiden Stränge A und B sind und x die Konzentration von AB zur Zeit t, dann ist die Geschwindigkeit der Assoziation gegeben durch: dx/dt =k 1 (a x) (b x) k 2 x. Da k 2 viel kleiner als k 1 ist, folgt näherungsweise: dx/dt =k 1 (a x) (b x). Obwohl häufig einer der Hybridisierungspartner in relativ niedriger Konzentration vorliegt (d. h. a >> b), gibt es Umstände, unter denen A und B in gleicher Konzentration vorhanden sind (z. B. bei der Reassoziation geschmolzener DNA). Die obige Gleichung vereinfacht sich für einen solchen Fall wie folgt: dx/dt =k 1 (a x) 2. Die Integration dieser Gleichung ergibt: x/a = a k 1 t/(1 + k 1 a t) [31]. Diese Gleichung stellt die mathematische Grundlage der C 0 t-methode dar und wird gewöhnlich ausgedrückt in C/C 0 = 1/(1 + k 1 C 0 t). In dieser Gleichung ist C die Konzentration der restlichen denaturierten DNA zum Zeitpunkt t und C 0 ist die Anfangskonzentration der denaturierten DNA. Die graphische Darstellung der Hybridisierung bzw. Assoziation erfolgt durch das Auftragen von C/C 0 gegen C 0 t (Abbildung in diesem Kasten). C 0 t ist damit ein Maß für den Reassoziationsgrad einzelsträngiger DNA, die durch Hitzedenaturierung von Duplex-DNA hergestellt wurde. Die zwei Parameter, die sich auf die Reassoziation auswirken, sind damit die anfängliche Konzentration C 0 der einzelsträngigen DNA und die Zeit t [31]. Ein geeigneter Weg, die Reassoziationsgeschwindigkeiten verschiedener Nukleinsäuren miteinander zu vergleichen, ist der C 0 t 1/2 -Wert, der dem C 0 t-wert entspricht, bei dem die Hälfte der DNA reassoziiert ist. Je niedriger der C 0 t 1/2 ist, desto größer ist die Geschwindigkeit, mit der die komplementären Stränge der DNA miteinander reassoziieren. Es ist unwahrscheinlich, dass alle Basen während der Bildung eines Doppelstranges gleichzeitig assoziieren. Vermutlich bildet sich zunächst ein transienter Komplex aus, an dem nur einige wenige Basenpaare beteiligt sind. Die Ausbildung des Doppelstranges erfolgt von diesem Punkt ausgehend in beide Richtung wie ein Reißverschluss, in dem sich eine Basenpaarung nach der anderen ausbildet. Zu jedem Zeitpunkt kann dieser Prozess sich in zwei Richtungen fortsetzen Basenpaarung oder Separation der Basen. Sind die Basen zueinander komplementär und für die Ausbildung der Wasserstoffbrückenbindung frei verfügbar, so ist die Bildung der Basenpaare bevorzugt. Falls die Basen nicht zueinander komplementär oder aufgrund von Sekundärstrukturen im Molekül nicht zugänglich sind, kann dies zu einer Auflösung des bis dahin ausgebildeten Doppelstranges führen [32 34]. Einen entscheidenden Einfluss hat die Temperatur auf die Hybridisierung. Hohe Hybridisierungstemperaturen erhöhen die Spezifität der Doppelstrangbildung, da eine verstärkte Wärmebewegung der Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen entgegen wirkt. Bei Temperaturen nahe am Schmelzpunkt des Doppelstranges bleiben nur perfekt gepaarte Moleküle miteinander verbunden, während Basenmisspaarungen zu einer Destabilisierung des Doppelstranges und zur Separation der beiden Nukleinsäurestränge führen. Niedrige Temperaturen begünstigen die Bildung unspezifisch gepaarter Doppelstränge. Die Spezifität der Hybridisierung wird auch durch den Zusatz von Salzen nachhaltig beeinflusst. Allgemein gilt als Faustregel, dass die Stringenz der Assoziation zum Doppelstrang zunimmt, je niedriger die Salzkonzentration der Hybridisierungslösung ist [32].

15 370 Biochips Methoden für Expressionsanalysen Differential Display RT-PCR (DDRT-PCR) Die Methode ermöglicht Expressionsanalysen mehrerer Zellpopulationen ohne Kenntnis einer Gensequenz mittels Multiplex-PCR [19]. Die Analyse unterrepräsentierter Transkripte wird durch eine Amplifikation ermöglicht. Differenzielle Hybridisierung (differential cdna library screening) Für diese Art Expressionsanalyse wird RNA von zu vergleichenden Zellpopulationen isoliert, mit einer Reversen Transkriptase in cdna umgeschrieben und radioaktiv markiert [20]. Bakterien bzw. Phagen einer cdna-genbank werden mit den markierten cdnas hybridisiert. Unterschiede in den Signalintensitäten weisen auf Expressionunterschiede hin. Expressed sequence tags (ESTs) Spezifische Sequenzsegmente von exprimierten Nukleinsäuren. Sie repräsentieren einen Teil der gesamten exprimierten RNA und werden durch die Sequenzierung von cdna-fragmenten (z. B. aus einer RT-PCR) oder cdna-bibliotheken gewonnen. Kompetitive RT-PCR Verfahren, bei dem der PCR ein Standard bekannter Konzentration zugesetzt wird [21]. Dieser wird mit denselben Primern wie die Zielsequenz amplifiziert, so dass es zu einer Konkurrenzreaktion beider Fragmente kommt. Für eine Quantifikation wird die zu bestimmende Probe in mehrere Aliquots aufgeteilt, in jedes wird eine zunehmende Menge Kompetitor gegeben. Nach der Amplifikation werden die beiden PCR-Produkte, die leicht in der Größe variieren, elektrophoretisch getrennt. Über die Signalintensitäten des Kompetitors und der Probe kann die Ausgangsmenge der Probe abgelesen werden. Northern- bzw. Dot-/Slot-Blot-Analysen Der Northern-Blot ist ein weitverbreitetes Verfahren zur Expressionsanalyse [22]. Zuerst erfolgt eine Größenseparation der zu untersuchenden RNA- Proben durch eine denaturierende Gelelektrophorese. Die aufgetrennte RNA wird mittels eines Kapillar-Blots auf eine Membran transferiert. Durch Hybridisierung der Membran mit einer markierten Nukleinsäure (Sonde), die komplementär zur zu analysierenden RNA in den Proben ist, kann diese RNA-Spezies auf der Membran lokalisiert und anhand der Signalintensität relativ zu anderen Proben quantifiziert werden. Bei Dot- oder Slot-Blot-Analysen wird die RNA mit Hilfe eines Rasters auf der Membran ohne Größenauftrennung aufgetragen und mit markierten Nukleinsäuresonden hybridisiert [23]. Die Quantifizierung einer RNA-Spezies erfolgt analog zum Northern-Blot. Diese Verfahren können auch genutzt werden, um definierte DNA-Fragmente oder Plasmide auf Membranen aufzutragen und diese mit zu untersuchenden, markierten cdnas zu hybridisieren. Nuclear-Run-on-Assay Sensitive Methode, um die Promotoraktivität eines Gens in vivo zu messen [24]. Dafür werden isolierte, aktive Zellkerne mit Ribonukleotiden inkubiert, von denen das Uracil radioaktiv markiert ist. Es werden daher nur RNA-Moleküle elongiert und markiert, die zum Zeitpunkt des Zellaufschlusses bereits initiiert waren. Nach der Isolierung der RNA kann die zu untersuchende RNA-Spezies mit Blot-Verfahren relativ zu anderen Proben quantifiziert werden. Nuklease S1-Analyse Verfahren zur Expressionsanalyse, das die Hybridisierung markierter einzelsträngiger DNA-Sonden nutzt, die komplementär zur zu untersuchenden RNA sind [25]. Der Reaktionsansatz wird mit der einzelstrangspezifischen Ribo- und Desoxyribonuklease S1 versetzt. Es verbleiben ausschließlich homolog gepaarte Doppelstranghybride, die elektrophoretisch getrennt und autoradiographisch quantifiziert werden. Polymerase-Kettenreaktion, PCR Die PCR ist ein Verfahren zur Amplifikaion beliebiger DNA-Abschnitte mit Hilfe von DNA-Polymerasen [26]. Voraussetzung für den Duplikationsprozess ist einzelsträngige DNA, die einen kurzen, doppelsträngigen Abschnitt mit einem freien 3 - OH-Ende enthält, das durch die DNA-Polymerase verlängert werden kann. Diese kurzen Doppelstränge können durch Zugabe kurzer Oligonukleotide (Primer) künstlich geschaffen werden. Nach der Hybridisierung des Primers an die komplementäre einzelsträngige DNA (Annealing) kann der Primer von der DNA-Polymerase verlängert werden (Elongation), wobei der DNA-Einzelstrang als Matrize für die Neusynthese dient. Der Neusynthetisierte DNA-Doppelstrang wird durch eine Temperaturerhöhung in Einzelstränge gespalten (Denaturierung). Neue Primer binden beim Abkühlen, und der Syntheseprozess wiederholt sich. Werden einem Reaktionsansatz zwei Primer zugesetzt, einer der am sense-strang und einer der am komplementären antisense-strang bindet, so wird mit jedem Zyklus von Denaturierung und Neusynthese das zwischen den Primern befindliche Segment verdoppelt. Ribonuklease-Protektionsassay (RPA) Diese Methode zur Expressionsanalyse basiert auf der Hybridisierung isolierter zellulärer RNA mit einer zur gesuchten RNA komplementären, markierten Nukleinsäuresonde [27]. Diese antisense-rna- Sonden werden in vitro synthetisiert. Die aus der Hybridisierung hervorgehenden RNA-RNA-Hybride werden mit einem Gemisch der RNasen A und T1 inkubiert. Beide RNasen hydrolysieren spezifisch alle einzelsträngigen RNA-Bereiche. Ausschließlich perfekt gepaarte Hybride aus Sondenund zellulären RNA-Molekülen bleiben als doppelsträngige Nukleinsäurefragmente intakt. Die Fragmente werden elektrophoretisch aufgetrennt und autoradiographisch detektiert. Das Autoradiogramm kann zur relativen Quantifizierung der gesuchten RNA-Spezies verwendet werden. RT-PCR RNA muss für eine Amplifikation zunächst in DNA umgeschrieben werden, da sie nicht direkt als Matrize von DNA-Polymerasen genutzt werden kann. Die Transkription der RNA in komplementäre DNA (cdna) mit Reversen Transriptasen (RTasen bzw. RNA-abhängige DNA-Polymerasen) wird als Reverse Transkription (RT) und die Gesamtreaktion aus RT und Amplifikation der cdna wird als RT-PCR bezeichnet. SAGE (serial analysis of gene expression, serielle Genexpressionsanalyse) Technisch sehr aufwändiges Verfahren, das eine schnelle und detailierte Analyse tausender Transkripte ermöglicht und direkt Informationen über die Häufigkeit von Transkripten liefert [28]. Diese Methode basiert auf zwei Prinzipien. 1.) Kurze Oligonukleotidsequenzen von neun bis zehn Basen enthalten ausreichend Informationen, um ein Transkript eindeutig zu identifizieren, sofern das Oligonukleotid an einer definierten Position innerhalb des Transkripts lokalisiert ist. 2.) Die Verkettung kurzer einzelner Nukleotidabschnitte (tags) ermöglicht eine effiziente, automatisierbare Sequenzierung multipler tags. Anhand der Häufigkeit einer gefundenen tag-sequenz kann ermittelt werden, wie häufig das Oligonukleotid (und sein entsprechendes Transkript) in der Probe vorhanden ist. Subtraktive Hybridisierung Weiterentwicklung der differenziellen Hybridisierung, die auch zum Nachweis schwach exprimierter Transkripte geeignet ist [29]. Von einer zu untersuchenden Zellpopulation wird anhand der isolierten RNA cdna oder crna synthetisiert. Diese wird mit einem Überschuss an Poly(A + )-RNA oder sense-crna einer zweiten Zellpopulation hybridisiert. Theoretisch verbleiben nach der Hybridisierung nur solche Nukleinsäuren der ersten Zellpopulation als einzelsträngige Moleküle, für die keine korrespondierenden Transkripte in der zweiten Zellpopulation existieren. Diese einzelsträngigen Nukleinsäuren werden säulenchromatografisch aufgreinigt und durch Klonierung nachfolgend identifiziert. UV-Crosslinking Durch ein Crosslinking mit UV-Licht (meist bei 254 nm) können Nukleinsäuren kovalent an Nylonmembranen immobilisiert werden. Dadurch werden die Hybridisierungssignale intensiviert, da weniger Nukleinsäuren während der nachfolgenden Arbeitsschritte von der Membran gewaschen werden. 5 -Nuklease-Assay (Real-time-PCR) Der Assay ermöglicht es, den Reaktionsverlauf einer PCR online quantitativ zu erfassen [29].

16 Biochips 371 Oxidation mit Iod zum Phosphotriester überführt. Die Reaktion wird sukzessiv mit den entsprechenden DMTr-Nukleosiden fortgesetzt, bis das gewünschte Oligonukleotid vorliegt. Die Kantenlänge der Spots liegt mit 2 µm extrem niedrig und ermöglicht sehr hohe Probendichten. Suspensionsarrays Eine Sonderstellung unter den derzeit vorhandenen Systemen nehmen die Suspensionsarrays ein [17], die von der Firma Luminex (Texas, USA) entwickelt wurden. Dieses Verfahren verwendet eine Suspension mit Mikropartikeln mit Durchmessern von bis zu 5,5 µm, die aus Polystyrol und Methacrylat bestehen und in verschiedenen Intensitäten mit Fluoreszenzfarbstoffen (Orange, 585 nm, und Rot, > 650 nm) markiert sind. Durch die Verwendung von Mikropartikeln unterschiedlicher Größen und Farben entstehen diskrete Partikelpopulationen, die in Durchflusszytometern identifiziert werden können. Die mögliche Anzahl Populationen ist von den verfügbaren Farbstoffen und Techniken zur Markierung der Beads sowie von der Zahl unterscheidbarer Farben im Durchflusszytometer abhängig. Momentan sind mit zwei Farben 64 verschiedene Partikel herstellbar. Durch eine weitere Farbe kann die Zahl der verfügbaren Populationen auf über 500 erhöht werden. An die Carboxylgruppen des Methacrylats der markierten Partikel können Oligonukleotide oder Antikörper kovalent über Aminogruppen gebunden werden. Ferner können die Mikropartikel mit Streptavidin gekoppelt werden. Die Bindung der Substanzen erfolgt über eine Biotinmarkierung. Für Expressionsanalysen von Nukleinsäuren werden Oligonukleotide (für Immunoassays Antikörper) derart gekoppelt, dass jeder Partikelpopulation ein spezifisches Oligonukleotid (bzw. ein definierter Antikörper) zugeordnet werden kann. Die Oberfläche eines Partikels bietet ausreichend Platz für eine kovalente Bindung von etwa Molekülen. Aufgrund der geringen Größe und Dichte verbleiben diese Partikel mehrere Stunden in Suspension. Die Analyse von Nukleinsäuren ist mit diesem Verfahren auf zwei Arten möglich, die beide auf der Hybridisierung von Nukleinsäuren einer Probe in einer Beadsuspension basieren. Beim direkten Hybridisierungsassay erfolgt die Hybridisierung, wie bei den herkömmlichen DNA-Arrays, zwischen einem markierten Amplikon einer Probe und den Oligonukleotiden der Partikel. Der kompetitive Hybridisierungsassay besteht aus zwei getrennten Maßansätzen. Zunächst werden die Beads mit einem fluoreszenzmarkierten Reporter-Oligonukleotid hybridisiert. Diese Bindung wird im Durchflusszytometer als durchschnittliche Fluoreszenz detektiert. In einem zweiten Ansatz wird das Reporter- Oligonukleotid zunächst mit einem Kompetitor (der mit der Nukleinsäure in der Probe identisch ist) inkubiert. Dabei werden Reportermoleküle an den Kompetitor gebunden, die dann nicht mehr zur Hybridisierung an die Mikrobeads zur Verfügung stehen. Es resultiert eine Abnahme der mittleren Fluoreszenz, die nur von der vorhandenen Kompetitormenge abhängig ist. Die Messung der Fluoreszenzintensität und die anschließende Auswertung erfolgt in Durchflusszytometern mit mehreren Fluoreszenzkanälen. Daraus resultiert eine hohe Flexibilität in der Anwendbarkeit der Suspensionsarrays: Mit nur einem Messgerät sind neben Expressions- und Mutationsanalysen auch nahezu alle gängigen Immunoassays möglich, da neben den Oligonukleotiden auch Antigene, Antikörper, Rezeptoren, Peptide und Enzymsubstrate an die Partikel gebunden werden können. Ausblick Die Entwicklung von Herstellungsverfahren für DNA-Chips ist ein Schwerpunkt der derzeitigen Forschung. Nötig sind verbesserte Technologien, die eine kostenoptimierte Herstellung ermöglichen, da die Verwendung von Arrays mit hohen Probendichten high-density arrays derzeit für viele Anwender einen unüberwindbaren Kostenfaktor darstellen. Optimierte Herstellungsverfahren sollten zu einer besseren Reproduzierbarkeit und zu höheren Syntheseausbeuten führen. Alternativ müssen Verfahren entwickelt werden, die eine Wiederverwendung der teuren DNA- Chips ermöglichen. Neben den zahlreichen Herstellungsverfahren für DNA-Chips sind verschiedene Detektionstechniken und mathematische Analysemethoden für die Nukleinsäureanalytik mit DNA-Chips entwickelt worden. Das Ziel der Entwicklung sind Systeme, die ein komplettes diagnostisches Verfahren mit Aufarbeitung, Verarbeitung und Messung von Proben auf einem Chip ermöglichen: Lab on a chip. Summary Many techniques in molecular biology and biochemistry can now be effectively miniaturised. For example, it is now possible to simultaneously analyze the expression of several thousand genes using a biochip with the size of a postage stamp. However, the uses of biochips extend far beyond the DNA sequencing and analysis of gene expression, and include a wide range of biochemical and immunological techniques in addition to novel means of sample preparation and distribution. The ultimate aim of chip development is the production of integrated lab on a chip systems. Such systems will soon make their presence felt in many areas of routine laboratory medicine where they will save costs and increase sample throughput. Literatur [1] F. Feldmann, Chem. unserer Zeit 2000, 34, [2] J. G. Sutcliffe, Annu. Rev. Neurosci. 1988, 11, [3] R. K. Saiki, S. Scharf, F. Faloona, K. B. Mullis, G. T. Horn, H. A. Erlich und N. Arnheim, Science 1985, 230, [4] S. D. Rose, J. Ass. Lab. Autom. 1998, 3, [5] mguide/index.html. [6] A. Kumar und G. M. Whitesides, Appl. Phys. Lett. 1993, 63, [7] E. Delamarche, A. Bernard, H. Schmid, B. Michel und H. Biebuyck. Science 1997, 276, [8] A. P. Blanchard, Genetic Engineering, Principles and Methods, Vol. 20, Plenum Press, New York, 1998, S ; T. P. Theriault, S. C. Winder und R. C. Gamble, Application of ink-jet printing technology to the manufacture of molecular arrays, DNA Microarrays, A Practical Approach, (Hrsg.: M. Schena), Oxford University Press, Oxford, 1999, S [9] R. G. Sosnowski, E. Tu, W. F. Butler, J. P. O Connell und M. J. Heller, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94,

17 372 Biochips [10] R. J. Lipshutz, S. P. Fodor, T. R. Gingeras und D. J. Lockhart, Nat. Genet. 1999, 21 (Supplement 1), [11] N. Q. Nam, G. H. McGall und R. P. Rava, Int. Pat. WO [12] A. P. Blanchard und S. H. Friend, Nat. Biotech. 1999, 17, 953. [13] S. Singh-Gassom, R. D. Green, Y. Yue, C. Nelson, F. Blattner, M. R. Sussman, und F. Cerrina, ibid. 1999, 17, [14] G. McGall, J. Labadie, P. Brock, G. Wallraff, T. Nguyen und W. Hinsberg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, [15] H. R. Garner, MicroArray robotics and instrumentation systems, Proceedings of lab chips and microarrays for Biotechnical Applications, CHI [16] E. Ermantraut, T. Schulz, J. Tuchscheerer, S. Wölfel, H.-P. Saluz, E. Thallner und J. M. Köhler, Building Highly Diverse Arrayed Substance Libraries by Micro Offset Printing, Proceedings of Micro Total Analysis Systems 98, (Hrsg.: D. J. Harrison und A. van den Berg), Kluwer Scientific Publishing, Dordrecht, [17] D. Voet und J. G. Voet. Biochemistry. 2 engl. Auflage, John Wiley & Sons, Inc. New York, 1995, S [18] K. J. Lackner, J. Kilwinski, T. Langmann, C. Aslanidis und G. Schmitz, Med. Gen. 1999, 11, [19] P. Liang, und A. B. Pardee, Science 1992, 257, [20] E. Messe, Differentielle Genaktivität, Bioanalytik (Hrsg. F. Lottspeich und H. Zorbas), Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1998, S [21] G. Gilliland, S. Perrin, K. Blanchard und H. F. Bunn, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87, [22] J. C. Alwine, D. J. Kemp und G. R. Stark, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977, 74, [23] T. Brown und K. Mackey, Analysis of RNA by northern and slot blot hybridization, Current Protocols in Molecular Biology (Hrsg.: F. A. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith und K. Struhl), John Wiley & Sons, New York, 1997, S [24] R. Voit, Analyse von Promotorstärke und aktiver RNA-Synthese, Bioanalytik (Hrsg.: F. Lottspeich und H. Zorbas), Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1998, S [25] A. J. Berk und P. A. Sharp, Cell 1977, 12, [26] R. K. Saiki, D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis und H. A. Erlich, Science 1988, 239, [27] R. Voit, Analyse von Promotorstärke und aktiver RNA-Synthese, Bioanalytik (Hrsg.: F. Lottspeich und H. Zorbas), Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1998, S [28] V. E. Velculescu, L. Zhang, B. Vogelstein und K. W. Kinzler, Science 1995, 270, [29] P. M. Holland, R. D. Abramson, R. Watson und D. H. Gelfand, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88, Korrespondenzadresse: Stefan Lorkowski, Institut für Arterioskleroseforschung an der Universität Münster, Domagkstraße 3, D Münster; Fax: 0251/ ; lorkost@uni-muenster.de. Stefan Lorkowski studierte Chemie und Biochemie an der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster. Derzeit promoviert er bei Paul Cullen am Institut für Arterioskleroseforschung an der Universität Münster im Fach Biochemie unter der Betreuung von Erwin Arno Galinski. Gerhard Lorkowski studierte Biologie mit dem Schwerpunkt Mikrobiologie an der Westfälischen Wilhelms-Universtät Münster. Nach seiner Postdoktorandenzeit von 1984 bis 1987 am Physiologisch-Chemischen Institut der Universität Münster, wechselte er in die Pharmazeutische Industrie. Dort war er als Leiter der Klinischen Forschung der Wyeth-Gruppe verantwortlich für die klinische Weiterentwicklung von Forschungsubstanzen in Deutschland. Aktuell beschäftigt er sich bei der MUCOS Pharma GmbH in München mit den immunmodulatorischen Eigenschaften einer systemischen Therapie mit proteolytischen Enzymen. Paul Cullen studierte Humanmedizin in Dublin. Die Promotion erfolgte 1988 im Fach Medizin an der Medizinischen Hochschule Hannover promovierte er zum Doctor of Medicine an der National University of Ireland, Dublin. Von 1990 bis 1992 studierte er Biochemie und Molekularbiologie am King s College in London habilitierte er an der Wilhelms-Universität Münster bei Gerd Assmann. Schwerpunkt seiner gegenwärtigen Forschung ist die Aufklärung der Rolle der Makrophagen während der Atherogenese. Er ist Mitgründer der Firma Ogham GmbH zur Entwicklung von DNA-Chips für die medizinische Diagnostik.