Rainer Merkl und Stephan Waack Bioinformatik Interaktiv

Transkript

1

2

3 Rainer Merkl und Stephan Waack Bioinformatik Interaktiv

4 Beachten Sie bitte auch weitere interessante Titel zu diesem Thema Helms, V. Principles of Computational Cell Biology From Protein Complexes to Cellular Networks 2008 ISBN: Ziegler, A., Koenig, I. R., Pahlke, F. A Statistical Approach to Genetic Epidemiology Second, Completely Revised and Enlarged Edition 2009 ISBN: Dehmer, M., Emmert-Streib, F. (Hrsg.) Analysis of Complex Networks From Biology to Linguistics 2009 ISBN: Emmert-Streib, F., Dehmer, M. (Hrsg.) Analysis of Microarray Data A Network-Based Approach 2008 ISBN: Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molekularbiologie der Zelle 2008 ISBN:

5 Rainer Merkl und Stephan Waack Bioinformatik Interaktiv Grundlagen, Algorithmen, Anwendungen 2., erweiterte und neubearbeitete Auflage

6 Autoren PD Dr. Rainer Merkl Institut får Biophysik und Physikalische Biochemie Universitåt Regensburg Universitåtsstraße Regensburg Prof. Dr. Stephan Waack Institut får Informatik Georg-August-Universitåt Goldschmidtstraße GÇttingen 2. erw. u. neubearb. Auflage 2009 Alle BÅcher von Wiley-VCH werden sorgfåltig erarbeitet. Dennoch Åbernehmen Autoren, Herausgeber und Verlag in keinem Fall, einschließlich des vorliegenden Werkes, får die Richtigkeit von Angaben, Hinweisen und Ratschlågen sowie får eventuelle Druckfehler irgendeine Haftung. Bibliografische Information der Deutschen Nationalbibliothek Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet Åber abrufbar. c 2009 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim Alle Rechte, insbesondere die der Ûbersetzung in andere Sprachen, vorbehalten. Kein Teil dieses Buches darf ohne schriftliche Genehmigung des Verlages in irgendeiner Form durch Photokopie, Mikroverfilmung oder irgendein anderes Verfahren reproduziert oder in eine von Maschinen, insbesondere von Datenverarbeitungsmaschinen, verwendbare Sprache Åbertragen oder Åbersetzt werden. Die Wiedergabe von Warenbezeichnungen, Handelsnamen oder sonstigen Kennzeichen in diesem Buch berechtigt nicht zu der Annahme, dass diese von jedermann frei benutzt werden dårfen. Vielmehr kann es sich auch dann um eingetragene Warenzeichen oder sonstige gesetzlich geschåtzte Kennzeichen handeln, wenn sie nicht eigens als solche markiert sind. Satz Hagedorn Kommunikation GmbH, Viernheim Druck Strauss GmbH, MÇrlenbach Bindung Litges & Dopf GmbH, Heppenheim Umschlaggestaltung Adam Design, Weinheim Printed in the Federal Republic of Germany Gedruckt auf såurefreiem Papier ISBN:

7 Inhaltsverzeichnis V Inhaltsverzeichnis Vorwort Website XV XVII 1 Biologische Grundlagen DNA Genetischer Code und Genomkomposition Transkription RNA Proteine Peptidbindung Konformation von Aminosåureseitenketten Ramachandran-Plot Hierarchische Beschreibung von Proteinstrukturen Sekundårstrukturelemente a-helix b-faltblåtter Supersekundårstrukturelemente Protein-Domånen Proteinfamilien Fachbegriffe Zitierte Literatur 25 2 Sequenzen und ihre Funktion Definitionen und Operatoren DNA-Sequenzen Proteinsequenzen Vergleich der Sequenzkomposition Ontologien Semantische Øhnlichkeit von GO-Termen Zitierte Literatur 40 Bioinformatik Interaktiv. 2. Auflage. Rainer Merkl und Stephan Waack Copyright c 2009 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim ISBN:

8 VI Inhaltsverzeichnis 3 Datenbanken DNA-Sequenz-Datenbanken RNA-Sequenz-Datenbanken Proteinsequenz-Datenbanken Proteinstruktur-Datenbanken SMART: Analyse der Domånenarchitektur STRING: Proteine und ihre Interaktionen SCOP: Strukturelle Klassifikation von Proteinen Pfam: Kompilation von Proteinfamilien COG und eggnog: Gruppen orthologer Gene Weitere Datenbanken Zitierte Literatur 54 4 Grundbegriffe der Stochastik Grundbegriffe der beschreibenden Statistik Urnenexperimente und diskrete Verteilungen Die Kolmogoroffschen Axiome Bedingte Wahrscheinlichkeit und Unabhångigkeit Zufallselemente Unabhångigkeit von Zufallselementen Markov-Ketten Erwartungswerte Varianzen Wichtige Wahrscheinlichkeitsverteilungen Diskrete Verteilungen Totalstetige Verteilungen Schåtzer Grundlagen statistischer Tests Eine optimale Entscheidungstheorie: Die Neyman-Pearson-Methode Zitierte Literatur 87 5 Bayessche Entscheidungstheorie und Klassifikatoren Bayessche Entscheidungstheorie Ein Beispiel: Klassifikation der Proteinoberflåche Ûbergang zu bedingten Wahrscheinlichkeiten Erweitern auf m Eigenschaften Marginalisieren Boosting ROC-Kurven Gewichten der Fehlklassifikationen Aufnehmen einer ROC-Kurve Testmethoden får kleine Trainingsmengen Zitierte Literatur 104

9 Inhaltsverzeichnis VII 6 Klassische Cluster- und Klassifikationsverfahren Metriken und Clusteranalyse Das mittlere Fehlerquadrat als GÅtemaß bei Clusteralgorithmen Ein einfaches iteratives Clusterverfahren k-means-clusterverfahren Wahl einer geeigneten Anzahl k von Clustern Statistische Bewertung der Clusteranzahl Hierarchische Clusterverfahren Nåchster-Nachbar-Klassifikation k nåchste Nachbarn Zitierte Literatur Neuronale Netze Architektur von neuronalen Netzen Das Perzeptron Schwellenwertfunktion Ein Beispiel: Modellierung Boolscher Funktionen LÇsbarkeit von Klassifikationsaufgaben Universelle Approximation Lernen in neuronalen Netzen Der Backpropagation-Algorithmus Interpretation des Lernschrittes Codierung der Eingabe Selbstorganisierende Karten Aufbau der Karte Selbstorganisation Zitierte Literatur Genetische Algorithmen Objekte und Funktionen Algorithmus Der Begriff des Schemas Dynamik der Anzahl von Schemata Codierung der Problemstellung Genetisches Programmieren Zitierte Literatur Paarweiser Sequenzvergleich Dotplots Definition Beispiel Implementierung Abschåtzen der Laufzeit Anwendungen Einschrånkungen und Ausblick 162

10 VIII Inhaltsverzeichnis 9.2 Entwicklung eines optimalen Alignmentverfahrens Vom paarweisen zum multiplen Sequenzalignment Dynamisches Programmieren Distanz, Metrik Minkowski-Metrik Eine Metrik får Zeichenketten: Die Hamming-Distanz Levenshtein-Distanz Berechnung der Levenshtein-Distanz Ableiten des Alignments Bestimmen der Øhnlichkeit von Sequenzen Globales Alignment Lokales Sequenzalignment Optimales Bewerten von LÅcken Bewertung mithilfe affiner Kostenfunktion Integration in Algorithmen Namensgebung Zitierte Literatur Sequenz-Motive Signaturen Die PROSITE-Datenbank Die BLOCKS-Datenbank Sequenz-Profile Bestimmen von Scores får Promotor-Sequenzen Sequenz-Logos Konsensus-Sequenzen Sequenzen niedriger Komplexitåt Der SEG-Algorithmus Zitierte Literatur Scoring-Schemata Zur Theorie von Scoring-Matrizen Algorithmen bedingte Anforderung an Scoring-Matrizen Identitåtsmatrizen PAM-Einheit PAM-Matrizen Erweiterte Datenbasis: Die JTT-Matrix BLOSUM-Matrizen Matrix-Entropie Scoring-Schemata und Anwendungen Scoring-Funktionen Zitierte Literatur 210

11 Inhaltsverzeichnis IX 12 FASTA, BLAST, PSI-BLAST FASTA FASTA-Statistik BLAST Statistik von Alignments Statistik globaler Alignments Statistik lokaler Alignments Vergleich der Empfindlichkeit von FASTA und BLAST Verfeinerung der Algorithmen Profil basierter Sequenzvergleich Verwenden von Intermediårsequenzen PSI-BLAST Die Empfindlichkeit von Sequenzvergleichsmethoden Vergleich von Profilen und Konsensus-Sequenzen Zitierte Literatur Multiple Sequenzalignments Berechnen von Scores får multiple Sequenzalignments Iteratives, progressives Bestimmen eines multiplen Alignments ClustalW: Konzepte ClustalW: Algorithmus ClustalW: Multiples Sequenzalignment får Trypsin-Inhibitoren T-Coffee M-Coffee und 3D-Coffee Alternative Ansåtze Verwenden von MSAs zur Charakterisierung von Residuen Entwickeln der Scoring-Funktion SDPpred: Vergleich homologer Proteine mit unterschiedlicher Spezifitåt Alignment von DNA- und RNA-Sequenzen Zitierte Literatur Grundlagen phylogenetischer Analysen Phylogenetische Ansåtze Distanz basierte Verfahren Ultrametrische Matrizen Additive Matrizen Linkage-Algorithmen Der Neighbour-Joining-Algorithmus Parsimony-Methoden Konstruktion eines Parsimony-Baumes Maximum-Likelihood-Ansåtze Ûbergangswahrscheinlichkeiten får DNA-Sequenzen Empirische Modelle der Protein-Evolution Berechnen der Likelihood eines Baumes 278

12 X Inhaltsverzeichnis Quartett-Puzzle Grundannahmen phylogenetischer Algorithmen Phylogenetische Analyse und statistische Bewertung Verwenden von Outgroups Das Bootstrap-Verfahren Weitere phylogenetische Ansåtze und Resultate Zitierte Literatur Hidden-Markov-Modelle Eine Problem orientierte EinfÅhrung Markov-Modelle Ergodische Markovsche Ketten Die Kolmogorov-Chapman-Gleichungen Klassifikation der Zustånde Stationåre Verteilungen Ergodizitåt von Quellen Fazit Niveau und Macht einfacher Tests Exkurs: Grenzwertsåtze Diskrimination von CpG-Inseln Ansåtze zur Lokalisierung von CpG-Inseln Der Begriff des Hidden-Markov-Modells Wichtige Algorithmen får HMMs Der Vorwårtsalgorithmus Der Viterbi-Algorithmus Der RÅckwårtsalgorithmus Die A-posteriori-Wahrscheinlichkeit der Zustånde Das zeitweise unehrliche Casino Das Rekonstruktionsproblem får HMMs Ein Maximum-Likelihood-Schåtzer Der Baum-Welch-Algorithmus zur Parameterschåtzung Zitierte Literatur Profil-HMMs zur Modellierung von Proteinfamilien Profil-HMMs Viterbi-Pfade in Profil-HMMs Eine LÇsung des Anfrageproblems Vorwårts- und RÅckwårtsvariablen Vom MSA zum Profil-HMM Zitierte Literatur Bedingte Markovsche Zufallsfelder Markierungsprobleme und ME-Prinzip Umfang eines Markierungsproblems Merkmale 374

13 Inhaltsverzeichnis XI Maximierung der bedingten Entropie als Induktionsprinzip ML-Parameterbestimmung Der Satz von Hammersley und Clifford IIS-Algorithmus Linien-CRFs Precomputing Inferenz Training: Umsetzung des IIS-Algorithmus Zitierte Literatur Vorhersage der Sekundårstruktur Vorhersage der Proteinsekundårstruktur Erste Ansåtze: Chou-Fasman PHD Profil basierte Vorhersage Vorgehensweise in PHD Die Entwicklung und Validierung der Konformation von PHD Trainieren der neuronalen Netze Validierung mit Leave-one-out-Verfahren Vorhersage der RNA-Sekundårstruktur RNA-Sequenzen und -Strukturen Freie Energie und Strukturen Vorhersage der Sekundårstruktur durch Energieminimierung Strukturen mit Schleifen BerÅcksichtigung von Stacking-Interaktionen Rekursionsgleichungen mit Stacking-Interaktionen STAR: Vorhersage der Sekundårstruktur unter Verwendung eines genetischen Algorithmus Erste Version des Modells Zweite Version: Modellierung der RNA-Faltung Ergebnisse Weitere Verfahren zur Vorhersage von Strukturen mit Pseudoknoten Zitierte Literatur Vergleich von Protein-3D-Strukturen Vergleich zweier Protein-3D-Strukturen Superposition von Protein-3D-Strukturen SAP: Vergleich von 3D-Strukturen mithilfe von VektorbÅndeln Simulated Annealing Superposition mithilfe von DALI Scores får Substrukturen Alignieren von Substrukturen TM-Align Zitierte Literatur 427

14 XII Inhaltsverzeichnis 20 Homologiemodellierung und Vorhersage der Protein-3D-Struktur Verwenden von Threading-Verfahren Eine Profil-Methode: 3D-1D-Profile Bestimmen der Umgebungen Generieren eines 3D-1D-Profils Wissensbasierte Kraftfelder Theoretische Grundlagen Ableiten der Potenziale GenThreader D-PSSM Generieren einer Profil-Bibliothek Erstellen einer 3D-PSSM Prozessieren der Query Strukturvorhersage Beitrag individueller Parameter HHsearch Grundlagen des Alignments von Hidden-Markov-Ketten Paarweises Alignment von HMMs Performanz von HHsearch Strukturvorhersage mit HHsearch ROSETTA/ROBETTA Energieterme De novo Strukturvorhersage mit ROSETTA Alternativen zur Fragmentinsertion Modellieren strukturell variabler Regionen in Homologiemodellen Weitere Ansåtze Zitierte Literatur Analyse integraler Membranproteine Struktur integraler Membranproteine Spezifische Probleme beim Sequenzvergleich Vorhersage der Topologie von Helix-BÅndeln HMMTOP: das Topologiemodell HMMTOP: Architektur des HMMs Vorhersage der Topologie und Struktur von b-fåssern Architektur von TMBpro Ausgabe und Performanz von TMBpro Gegenwårtiger Stand bioinformatischer Methoden Zitierte Literatur EntschlÅsselung von Genomen Shotgun-Sequenzierung Die Anzahl von Contigs beim Shotgun-Ansatz Basecalling Assemblieren von Teilsequenzen 488

15 Inhaltsverzeichnis XIII Phase 1: Bestimmen Åberlappender Pråfix-/Suffix-Regionen Phase 2: Erzeugen von Contigs Phase 3: Generieren der Konsensus-Sequenz Annotation kompletter Genome Metagenomik Spezielle Anforderungen an die Bioinformatik Minimalanforderungen får Metagenom-Annotation Zitierte Literatur Auswertung von Genexpressionsdaten DNA-Chip-Technologie Datenbanken får Genexpressionsdaten Grenzen der Technologie Bioinformatische Analyse von DNA-Chip-Signalen Quantifizierung von Expressionswerten Normalisierung und Datenreduktion Normalisierung Åber Replikate Identifizieren differentiell exprimierter Gene Metriken zum Vergleich von Expressionsdaten Algorithmen får die Analyse kompletter DNA-Chip-Datensåtze Anwendung von Clusterverfahren auf Genexpressionsdaten Validierung und Alternativen Hauptkomponentenanalyse Biclusterverfahren Ein Beispiel får Biclusterverfahren: ISA Der Signatur-Algorithmus Iterative Optimierung Grenzen und Alternativen Genexpressions-Profiling Wårmekarten Der klassische Ansatz Kombination von Datenquellen mithilfe von ClusCor Informationsgewinnung får systembiologische Fragestellungen BÅndelung von Datenbankinformation Statistische Analyse der Termverteilung Verwendbarkeit des Verfahrens Zitierte Literatur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen Biologische Bedeutung des Interaktoms Methoden zum Bestimmen des Interaktoms Anforderungen an Datenbanksysteme Analyse des Genominhaltes Genfusion Phyletische Muster 539

16 XIV Inhaltsverzeichnis Analyse von Genfolgen Performanz Sequenz basierter Methoden Bewertung von Codon-Håufigkeiten Suche nach korrelierten Mutationen Generieren von sortierten MSA-Paaren Identifizieren korrelierter Mutationen Vergleich phylogenetischer Båume Die Mirror-tree-Methode Korrektur des Hintergrundsignals Vorhersage des Interaktoms der Hefe mithilfe eines Bayesschen Klassifikators Zitierte Literatur Zum Schluss Zitierte Literatur 559 Stichwortverzeichis 561

17 Vorwort XV Vorwort Im vergangenen Jahrhundert hat sich in der biologischen Forschung der reduktionistische Ansatz als besonders erfolgreich erwiesen. Damit ist der Versuch gemeint, komplexe Lebensphånomene als vernetztes Zusammenwirken einfacher, in der Sprache der Physik oder Chemie beschriebener Vorgånge zu verstehen. Allerdings ist mittlerweile klar geworden, dass Lebensvorgånge mit solchen top down Ansåtzen, d. h. der Zerlegung komplexer Vorgånge in einfachere, nicht vollståndig zu verstehen sind. Daher gewinnen bottom up Ansåtze zunehmend an Bedeutung. Diese versuchen, das Zusammenspiel der einzelnen Elemente in ihrer Gesamtheit zu modellieren. Die vielen -omik -Ansåtze und die Konzepte der Systembiologie zielen genau in diese Richtung. So sind die Ergebnisse der Genomik und der Transkriptomik mittlerweile zu einer festen GrÇße und zu einer wichtigen Quelle får weiterfåhrende Analyen und Åberraschende Einsichten geworden. Drei Beispiele sollen dies verdeutlichen: Die Sequenzierung des menschlichen Genoms hat gezeigt, dass der Mensch nicht, wie bisher angenommen, bis zu Gene, sondern nur besitzt. Diese Anzahl liegt nicht wesentlich hçher als die des Fadenwurms Caenorhabditis elegans, dessen Genom ca Gene umfasst. Dieses Ergebnis war får viele Wissenschaftler ein Schock, da bis dato genetische Komplexitåt direkt mit der Anzahl von Genen korreliert worden war. Der Befund hat einen Paradigmenwechsel ausgelçst; seither wird die Komplexitåt eines biologischen Systems an der Komplexitåt seiner Interaktionsnetzwerke gemessen. Das ENCODE-Projekt zielt darauf ab, alle funktionellen Elemente des menschlichen Genoms zu identifizieren. In der Pilotphase wurde Åberraschenderweise festgestellt, dass praktisch das komplette menschliche Genom abgelesen und in RNA Åbersetzt wird. Es wird angenommen, dass viele dieser MolekÅle in bisher unbekannter Weise in Regulationsvorgånge eingreifen. Die Sequenzierung des Schnabeltier-Genoms hat unter anderem ergeben, dass diese Art, obwohl sie Eier legt, die Gene får Milchproteine besitzt. Ihre Gift-Proteine und die Schlangengifte stammen von denselben Genfamilien ab, haben sich allerdings unabhångig entwickelt. Aus dem Vergleich molekularer Daten wurde abgeleitet, dass sich der Vorfahre des Schnabeltiers vor ca. 166 Millionen Jahren von der Linie abspaltete, die spåter zu den Såugetieren fåhrte. Wie werden derartige Befunde erhoben? Die får die Datenanalyse notwendigen Werkzeuge liefert die Bioinformatik, ein spezieller Zweig der Computerwissen- Bioinformatik Interaktiv. 2. Auflage. Rainer Merkl und Stephan Waack Copyright c 2009 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim ISBN:

18 XVI Vorwort schaft, der sich seit Mitte des zwanzigsten Jahrhunderts zunåchst kontinuierlich und in den letzten Jahren rasant entwickelte. Zu den ersten, eher bescheidenen Aufgaben, die Biologen an Mathematiker und Informatiker herantrugen, gehçrten die statistische Auswertung der wenigen, damals vorhandenen Sequenzen und deren Speicherung. Heutzutage werden sowohl får das Vorhalten der exponentiell wachsenden Datenmengen als auch får den Betrieb hochkomplexer Programmsuiten leistungsfåhige Server-Farmen bençtigt. Der Aufwand, der auf technischer und theoretischer Seite getrieben werden muss, um den berechtigten AnsprÅchen und Forderungen der Anwender zu genågen, ist enorm, bleibt aber meist hinter einfach zu bedienenden Grafikoberflåchen verborgen. Ebenso unbekannt ist den Nutzern håufig auch der Algorithmus, d. h. die Rechenvorschrift, die mit einem Mausklick angestoßen wird, sowie die Bedeutung der Programmparameter und deren Einfluss auf die Ergebnisse. Dies ist umso erstaunlicher, wenn man den Aufwand bedenkt, der Åblicherweise får die Planung molekularbiologischer Experimente getrieben wird. Es wåre zu erwarten, dass bei der AusfÅhrung bioinformatischer Analysen åhnlich gråndlich vorgegangen wårde. FÅr einen sicheren und souverånen Umgang mit bioinformatischen Tools sind derartige Kenntnisse jedoch unbedingt erforderlich. Nur wer die Eigenschaften und vor allem die Limitationen der Werkzeuge kennt, kann sie optimal einsetzen, ihre Ausgabe korrekt bewerten und die Algorithmen verbessern. Daher ist eine Beschåftigung mit den grundlegenden Methoden und speziellen Konzepten, die sich in der Bioinformatik entwickelt haben, får den Anwender sinnvoll und får diejenigen, die selbst bioinformatische Werkzeuge entwickeln wollen, unbedingte Voraussetzung. Der vorliegende Text will eine Ûbersicht zu den wichtigsten Methoden und LÇsungsansåtzen vermitteln. Einen großen Anteil nehmen Verfahren ein, die sich der Analyse von Sequenzen widmen, da sie die grçßten Datenbestånde ausmachen. Es wurde großer Wert auf eine praxisnahe Darstellung gelegt, in die viele Beispiele und Illustrationen eingestreut sind. Zusåtzlich wird auf einer Webseite Material får Ûbungen angeboten. Auch bei der Zusammenstellung der Ûbungen war es unser Ziel, den kritischen Umgang mit bioinformatischen Tools zu trainieren. Diese zweite Auflage wåre ohne die Mithilfe und die Anregungen vieler unserer Kollegen und Studenten nicht zu realisieren gewesen. Unser besonderer Dank gilt dem Verlag Wiley-VCH und insbesondere den Herren Dr. G. Cicchetti und Dr. A. Sendtko, die uns in allen Belangen stets tatkråftig unterståtzten. Regensburg und GÇttingen, Oktober 2009 Rainer Merkl und Stephan Waack

19 Website Auf einer speziellen Website werden Ûbungen angeboten, die interaktiv unter Verwendung eines Browsers und mithilfe frei verfågbarer Software, sowie unter Benutzung Çffentlich zugånglicher Server bearbeitet werden kçnnen. Verweise auf die wichtigsten Lerneinheiten sind bei den folgenden Kapiteln angegeben. Die Ûbungen haben einerseits das Ziel, das Erfassen der Algorithmen und Modelle weiter zu festigen und erlauben es andrerseits, Werkzeuge in konkreten Anwendungen praktisch zu erproben. Wir bemåhen uns, das Angebot der Dynamik des Internets anzupassen. Das Ûbungsmaterial finden Sie auf

20

21 Grundlagen Biologie und Datenbanken Bioinformatik Interaktiv. 2. Auflage. Rainer Merkl und Stephan Waack Copyright c 2009 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim ISBN:

22 Informationstragende MolekÅle: DNA, RNA, Proteine Sequenzen und ihre Funktion Bioinformatische Datenbanken Die Beschåftigung mit Algorithmen kann faszinieren. Dies gilt insbesondere dann, wenn komplexe und spannende Probleme zu lçsen sind. Zu dieser Kategorie von Aufgaben zåhlen sicherlich auch diejenigen, die an die Bioinformatik herangetragen werden. Håufig måssen aus einer schier nicht zu bewåltigenden DatenfÅlle verrauschte Signale herausgefiltert werden. Nur durch den Einsatz modernster Techniken und unter BerÅcksichtigung von Erkenntnissen aus der Mathematik, der Statistik und natårlich der Informatik ist es mçglich, bioinformatische Algorithmenentwicklung voranzutreiben. Zusåtzlich ist eine gewisse Vertrautheit mit den biologischen Strukturen und dynamischen Prozessen, die im Rechner nachzustellen sind, notwendig und hilfreich. Diese Grundlagen schaffen wir in Teil 1. Im folgenden Kapitel werden wichtige Eigenschaften von DNA, RNA, Aminosåuren und Proteinen erlåutert sowie solche Fakten zu biologischen Objekten und Prozessen eingefåhrt, die får das Verståndnis der im Text dargestellten biologischen Fragestellungen und informatischen LÇsungsansåtze bençtigt werden. Anschließend wird die Datenstruktur Sequenz mit der in der Biologie eingefåhrten Bedeutung vorgestellt. Wir werden uns mit Operationen auf Sequenzen sowie verschiedenen Alphabeten, die zur Codierung von DNA- und Proteinsequenzen definiert wurden, beschåftigen. Sequenzen bilden die Grundlage får viele der hier eingefåhrten Algorithmen; sie werden uns im gesamten Text ståndig begegnen. Die uns interessierenden Sequenzen haben eine biologische Funktion. FÅr deren Beschreibung werden zunehmend Ontologien genutzt. Wir erlåutern die Gen-Ontologie, mit der Genprodukte annotiert werden.muckel Schließlich beschåftigen wir uns mit bioinformatischen Datenbanken. So werden z. B. Sequenzen oder Proteinstrukturen sowie Wissen Åber ihre biologische Funktion, ihre Eigenschaften, ihr Vorkommen etc. in zentralen Datenbanken gesammelt. Diese stellen den Heiligen Gral der Bioinformatik dar. Praktisch bei jeder bioinformatischen Fragestellung wird in irgendeiner Weise auf Datenbanken und das darin deponierte Wissen zuråckgegriffen. Dies kann im Rahmen so unterschiedlicher Aufgaben erfolgen wie der statistischen Auswertung von Sequenzen, dem Vermessen von Reaktionszentren, der Identifizierung von Transkriptionsfaktoren oder der Analyse von Hochdurchsatz-Datensåtzen. Datenbanken bilden auch die Grundlage får das Generieren von Trainingsmengen, die bençtigt werden, um bioinformatische Werkzeuge zu validieren und zu optimieren. Die Qualitåt bioinformatischer Algorithmen, d. h. deren Ausgabe, muss sich messen lassen an den in den Datenbanken deponierten und durch biochemische Experimente abgesicherten Fakten. Zusåtzlich zu Sequenz- und Strukturdatenbanken ist eine FÅlle weiterer Datensammlungen entstanden. Wir werden einige der sogenannten sekundåren Datenbanken, in denen abgeleitetes Wissen aufbereitet wird, vorstellen. Dazu zåhlen Beschreibungen von Stoffwechselvorgången oder hierarchische Schemata zur Klassifikation von Proteinfamilien.

23 1.1 DNA 3 1 Biologische Grundlagen In den folgenden Kapiteln beschåftigen wir uns hauptsåchlich mit Algorithmen auf MakromolekÅlen. FÅr das Verståndnis der Methoden und Modellierungsansåtze bençtigen wir biologische Grundkenntnisse, die wir in diesem Kapitel einfåhren. Zu den wichtigsten molekularbiologischen Objekten gehçren DNA, RNA und Proteine. Dies sind MolekÅle, die jeweils aus kleineren, spezifischen Bausteinen aufgebaut sind. Deren lineare Abfolge kann in Form einer Zeichenkette (Sequenz) angegeben werden. Mit Sequenzen beschåftigen wir uns im folgenden Kapitel 2 genauer. Die DNA ist der wichtigste Datentråger der Molekularbiologie. Hochdurchsatzmethoden sind mittlerweile so verfeinert, dass die Zusammensetzung der DNA mit geringem Aufwand bestimmt werden kann. Proteine haben Funktionen sowohl als Umsetzung der Geninformation als auch bei der Weitergabe der Gene an die nachfolgenden Generationen. Die biologische Bedeutung der RNA hat sich durch Befunde der letzten Jahre stark veråndert. Es ist klar geworden, dass RNA-MolekÅle in erheblichem Ausmaß an Regulationsaufgaben beteiligt sind. In vivo liegen DNA, RNA und Proteine als dreidimensionale Strukturen vor. Neben der Beschreibung dieser Strukturen gehen wir im Folgenden auf solche Eigenschaften oder Prozesse ein, die in bioinformatischen Algorithmen von Bedeutung sind. Einen breiteren Raum nimmt die Darstellung von Proteinarchitekturen ein. Das Kapitel schließt mit einer Definition wichtiger Fachbegriffe. Drei wichtige MakromolekÅle: DNA, RNA, Proteine 1.1 DNA Im bioinformatischen Kontext stehen Sequenzen in der Regel får die Abfolge einer kleinen, definierten Menge von Einzelbausteinen. DNA-Sequenzen sind Modelle får MakromolekÅle der Desoxyribonucleinsåure (abgekårzt DNS oder DNA), die als fådige Struktur Bioinformatik Interaktiv. 2. Auflage. Rainer Merkl und Stephan Waack Copyright c 2009 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim ISBN:

24 4 1 Biologische Grundlagen Nucleotid Reverses Komplement: Sequenz des Gegenstranges vorliegt. Jeder Strang ist eine Folge von vier Einzelbausteinen (Nucleotide), diese bestehen jeweils aus x einem Zucker (in der DNA: Desoxyribose), x einer der Purin- oder Pyrimidinbasen Adenin, Guanin oder Cytosin, Thymin und x einem Phosphatrest. In der Zelle kommt DNA Åblicherweise in doppelstrångiger Form vor. Darin stehen sich Nucleotide paarweise gegenåber, wobei nur zwei Paarungen zugelassen sind (siehe Abb. 1.1 und Abb. 1.2). Aufgrund des chemischen Aufbaus der Nucleotide hat jeder DNA-Strang beliebiger Långe eine eindeutige Orientierung mit jeweils einem freien 3l-OH- und einem 5l-OH-Ende. Sequenzen werden nach Ûbereinkunft stets so geschrieben, dass das 5l-OH Ende links und das 3l-OH-Ende rechts steht. In vivo ist die DNA- Doppelhelix meist zu einem Ring geschlossen, z. B. in Chromosomen oder Plasmiden. Darin sind die beiden komplementåren DNA- Strånge gegenlåufig angeordnet. Die durch den Aufbau vorgegebene Orientierung bedingt die Richtung, in der Gene abgelesen werden. Da Gene auf beiden Strången codiert sein kçnnen, in Datensammlungen jedoch nur die Sequenz eines Stranges abgelegt wird, muss zur Bestimmung der Sequenz des Gegenstranges das reverse Komplement gebildet werden. Abb. 1.1 Raumstruktur der DNA. In der Abbildung ist die Doppelhelix gut zu erkennen. Die basischen Anteile der Nucleotide sind nach innen gerichtet und durch WasserstoffbrÅcken verknåpft. Außen verlaufen die Zucker-Phosphat- Anteile der polymerisierten Nucleotide.

25 1.2 Genetischer Code 5 Abb. 1.2 Basenpaarungen in der DNA. In der als Doppelhelix bekannten DNA-Struktur liegen sich jeweils paarweise die Basen Adenin und Thymin sowie Guanin und Cytosin gegenåber. Zwischen A:T-Paaren kçnnen zwei, zwischen G:C-Paaren drei WasserstoffbrÅcken ausgebildet werden. Je hçher der Anteil von G:C-Paaren, desto mehr Energie muss får das Trennen der beiden Strånge einer DNA- Doppelhelix aufgewendet werden. 1.2 Genetischer Code und Genomkomposition Die Sequenzinformation eines jeden Proteins ist in Form eines Gens in der DNA-Sequenz codiert. Jeweils drei direkt aufeinanderfolgende Nucleotide, die nicht Åberlappend abgelesen werden, codieren får eine Aminosåure. Eine solche Nucleotidgruppe wird Triplett oder Codon genannt. Die Abbildung der 64 Tripletts auf die 20 Aminosåuren heißt genetischer Code, dieser ist in Tabelle 1.1 dargestellt. Dieser Code ist quasi universell, abweichende Codonzuordnungen finden sich z. B. bei Mitochondrien, Mycoplasma und einigen Protozoen (Ûbersicht in [1]). Die Struktur der DNA legt die Lage der einzelnen Gene innerhalb einer DNA-Sequenz nicht fest, daher ergeben sich wegen der zwei mçglichen Ableserichtungen und der drei mçglichen Intervalle pro Leserichtung insgesamt sechs Leseraster. Prinzipiell kann jede Codonsequenz ein Gen codieren, sofern sie zwischen ein im selben Leseraster liegendes Start- und Stoppcodon eingebettet ist. Eine derartige Sequenz wird zur Unterscheidung von Genen (får die eine Funktion nachgewiesen ist) offenes Leseraster (open reading frame, ORF genannt. Basentriplett Codon Leseraster ORF

26 6 1 Biologische Grundlagen Tab. 1.1 Der genetische Code. Die Zahlen geben die Nucleotidposition im Codon an. In einigen speziellen Fållen, wie in mitochondrialen Genomen, kann es Abweichungen von diesem kanonischen Code geben. 2 T C A G 1 T TTT Phe TTC Phe TTA Leu TTG Leu TCT Ser TCC Ser TCA Ser TCG Ser TAT Tyr TAC Tyr TAA Stop TAG Stop TGT Cys TGC Cys TGA Stop TGG Trp T C A G 3 C CTT Leu CTC Leu CTA Leu CTG Leu CCT Pro CCC Pro CCA Pro CCG Pro CAT His CAC His CAA Gln CAG Gln CGT Arg CGC Arg CGA Arg CGG Arg T C A G A ATT Ile ATC Ile ATA Ile ATG Met ACT Thr ACC Thr ACA Thr ACG Thr AAT Asn AAC Asn AAA Lys AAG Lys AGT Ser AGC Ser AGA Arg AGG Arg T C A G G GTT Val GTC Val GTA Val GTG Val GCT Ala GCC Ala GCA Ala GCG Ala GAT Asp GAC Asp GAA Glu GAG Glu GGT Gly GGC Gly GGA Gly GGG Gly T C A G Beispiel Diese Situation wird im folgenden Beispiel klar. Je nach Leseraster resultieren aus derselben DNA-Sequenz unterschiedliche Proteinsequenzen: Leserichtung p...orf... Leserahmen 1..MetValGlyLeuSer*** 2.TyrGlyArgProGluLeu. 3 ValTrpSerAla***Val.. DNA, GTATGGTCGGCCTGAGTTAA (Doppelstrang) CATACCAGCCGGACTCAATT Leserahmen 4..HisAspAlaGlnThrLeu 5.IleThrProArgLeu***. 6 TyrProArgGlySerAsn.. n Leserichtung Im gezeigten Beispiel existiert genau ein ORF (hier im Leserahmen 1), dessen Lage durch ein Startcodon (Met) und ein Stoppcodon (durch *** markiert) definiert ist. In allen anderen Leserastern treten in der gezeigten Sequenz Stoppcodons auf oder es fehlt ein Startcodon. Gene haben allerdings in der Regel eine Långe von mehr als 80 Codonen.

27 1.2 Genetischer Code 7 Der Informationsgehalt I der drei Basenpositionen im Codon ist nicht gleich, es gilt I(Position 2) i I(Position 1) i I(Position 3) [2]. HierfÅr ist der genetische Code verantwortlich: Eine Mutation der dritten Base im Codon veråndert die Aminosåurenkomposition håufig nicht; eine Mutation in der ersten Basenposition fåhrt håufig zum Einbau einer Aminosåure mit åhnlichen Eigenschaften; eine Mutation der mittleren Base verursacht håufig den Einbau einer Aminosåure mit anderen Eigenschaften [1]. Die geringsten Auswirkungen auf die Aminosåurenkomposition der Proteine haben somit Verånderungen der Basenkomposition in Position 3 des Codons, gefolgt von Verånderungen der Basenkomposition an Position 1. Diese Befunde machen deutlich, dass simple statistische Konzepte nicht dazu geeignet sind, codierende Sequenzen adåquat zu modellieren. Der GC-Gehalt ist eine charakteristische GrÇße eines Genoms. In bakteriellen Genomen schwankt der GC-Gehalt zwischen 25 % und 75 %. In G:C-Basenpaaren werden drei WasserstoffbrÅckenbindungen ausgebildet, in A:T-Basenpaaren nur zwei; daher wurde vermutet, dass ein hoher GC-Gehalt des Genoms z. B. får thermophile [3] oder halophile [4] Organismen vorteilhaft wåre. Allerdings ist der GC-Gehalt phylogenetisch und nicht phånotypisch bedingt. Thermophile Organismen leben in Habitaten mit erhçhten Umgebungstemperaturen, halophile kommen in Umgebungen mit erhçhter Salzkonzentration vor. Der spezifische GC-Gehalt einer phylogenetischen Linie scheint durch evolutionåren Druck eingestellt zu werden [5]. Aus dem Vergleich des GC-Gehalts der Genome solcher Bakteriophagen, die ihr eigenes DNA-Replikationssystem, und solcher, die das Replikationssystem des Wirts Escherichia coli verwenden, mit dem GC-Gehalt des Genoms von Escherichia coli wurde geschlossen, dass der GC-Gehalt vom DNA-Replikationssystem moduliert wird [1]. Mutationen im mutt Gen von Escherichia coli induzieren Transversionen von A:T- nach G:C- Basenpaaren [6] und Mutationen im muty Gen Transversionen von G:C- nach A:T-Basenpaaren [7]. Die Genprodukte beider Gene sind an der DNA-Replikation bzw. DNA-Reparatur beteiligt. Codonen kommen nicht mit annåhernd gleicher Håufigkeit in Genen vor. Im Gegenteil, die Codonhåufigkeiten schwanken zwischen den taxonomischen Gruppen betråchtlich. Die Codonpråferenzen der beiden nahe verwandten Bakterien Escherichia coli und Salmonella typhimurium sind sich relativ åhnlich, Codonhåufigkeiten des Bakteriums Bacillus subtilis, das zu beiden eine große phylogenetische Distanz aufweist, sind auffållig anders. Codonen, die får dieselbe Aminosåure codieren, werden synonyme Codonen genannt. Synonyme Codonen treten ebenfalls nicht mit vergleichbarer Håufigkeit auf, einige werden bevorzugt Informationsgehalt der Basenpositionen ist unterschiedlich GC-Gehalt der Genome ist phylogenetisch bedingt Codonhåufigkeiten Synonyme Codonen codieren får dieselbe Aminosåure

28 8 1 Biologische Grundlagen Bevorzugte Codonen eingebaut. Daraus resultierende Unterschiede in der Håufigkeitsverteilung von kurzen Nucleotidketten kçnnen unter Verwendung statistischer Verfahren (Markov-Ketten) ausgenutzt werden, um die Lage von Genen vorherzusagen (z. B. im Programm Glimmer[8]). In Korrelation mit den ungleichmåßigen Codonhåufigkeiten treten Unterschiede in den Spezies spezifischen trna-konzentrationen auf. trna ist an der Translation, d. h. der RNA-instruierten Proteinsynthese, beteiligt. Der genetische Code wird als degeneriert (im Sinne der in der Atomphysik eingefåhrten Bedeutung) bezeichnet, da einige Aminosåuren durch mehrere (synonyme) Codonen codiert werden. Bei manchen Spezies variieren Codonhåufigkeiten zudem stark zwischen einzelnen Genen [9]. In bestimmten Genen tritt Spezies spezifisch eine Teilmenge der Codonen bevorzugt auf (Ûbersichten in [10] und [11]). Diese Verzerrung der Codonhåufigkeiten (codon usage bias) ist positiv korreliert mit der Genexpression [12]. MÇgliche Ursachen får diese Verzerrung der Codonhåufigkeiten sind die unterschiedlichen Konzentrationen der trnas [13, 14], die Aufrechterhaltung der maximalen Elongationsrate, die Kosten får das Korrekturlesen sowie unterschiedliche Translationsraten der Codonen [15]. Diese Verzerrung der Codonhåufigkeiten wird als Strate- Tab. 1.2 Gemittelte Codonhåufigkeiten im Genom von Escherichia coli K-12. Die Summe der Prozentwerte ergibt T C A G 1 T TTT 2.08 TTC 1.78 TTA 1.22 TTG 1.28 TCT 0.89 TCC 0.90 TCA 0.64 TCG 0.86 TAT 1.53 TAC 1.30 TAA 0.19 TAG 0.02 TGT 0.49 TGC 0.65 TGA 0.09 TGG 1.48 T C A G 3 C CTT 1.00 CTC 1.06 CTA 0.35 CTG 5.56 CCT 0.65 CCC 0.47 CCA 0.81 CCG 2.47 CAT 1.23 CAC 1.04 CAA 1.43 CAG 2.93 CGT 2.29 CGC 2.30 CGA 0.32 CGG 0.49 T C A G A ATT 2.91 ATC 2.64 ATA 0.36 ATG 2.80 ACT 0.91 ACC 2.42 ACA 0.59 ACG 1.37 AAT 1.58 AAC 2.28 AAA 3.47 AAG 1.07 AGT 0.76 AGC 1.59 AGA 0.16 AGG 0.11 T C A G G GTT 1.88 GTC 1.49 GTA 1.11 GTG 2.66 GCT 1.57 GCC 2.51 GCA 1.98 GCG 3.49 GAT 3.18 GAC 2.05 GAA 4.12 GAG 1.80 GGT 2.60 GGC 3.07 GGA 0.67 GGG 1.02 T C A G

29 1.3 Transkription 9 gie interpretiert, die Wachstumsraten zu optimieren [10]. Wie wir spåter sehen werden, sind Unterschiede in den Codonhåufigkeiten ein wichtiges Signal, das får bioinformatische Analysen genutzt wird. Bei Prokaryonten weisen Gene, die im Genom benachbart liegen, eine åhnliche codon usage auf. Es wurde gezeigt, dass aus der Øhnlichkeit von Codonhåufigkeiten eine Interaktion der Genprodukte vorhergesagt werden kann [16]. Zudem zeigen diese Befunde die komplexe Komposition codierender DNA-Sequenzen. In Tabelle 1.2 sind die gemittelten Codonhåufigkeiten angegeben, so wie sie im Genom des Bakteriums Escherichia coli K-12 vorkommen. Auffallend selten sind in diesem Genom die Codonen AGA, AGG und CTA. Codon usage von Escherichia coli K Transkription Ganz allgemein wird das Umschreiben eines Textes Transkription genannt. In Analogie hierzu wird die Produktion von mrna als Kopie eines Genabschnittes ebenso bezeichnet. Die får die Transkription notwendigen Enzyme sind die DNA-abhångigen RNA- Polymerasen. Bei der Transkription wird, anstelle von T (Thymin), in die mrna das Nucleotid U (Uracil) eingebaut. Das RNA- MolekÅl, das hierbei entsteht, wird Transkript genannt. Bei der RNA-Synthese måssen zwei Bedingungen eingehalten Bedingungen bei der werden: RNA-Synthese x Die Synthese muss unmittelbar vor einem Gen beginnen. x Es muss der sinntragende (codogene) Strang transkribiert werden. Das Einhalten dieser Bedingungen wird erreicht durch die bevorzugte Bindung von RNA-Polymerase an Erkennungsstellen (Pro- des Transkriptes Promotoren markieren Beginn motoren), die unmittelbar vor Genen liegen. Vergleicht man die Promotoren von Escherichia coli und bildet hieraus einen idealen Promotor, so fållt Folgendes auf: x In einem Bereich, der ca. 10 Basenpaare stromaufwårts des Transkriptionsstarts liegt, findet sich eine Sequenz, die håufig åhnlich zu TATA (-10-Region oder TATA-Box) ist. x In einem Bereich, der ca. 35 Basenpaare stromaufwårts vom Start liegt (-35-Region), befindet sich innerhalb eines AT-reichen Abschnittes eine Sequenz, die håufig åhnlich zu TTGACA ist.

30 10 1 Biologische Grundlagen Abb. 1.3 Konsensus-Sequenz von Escherichia coli Promotoren. Der untere der beiden DNA-Strånge wird transkribiert ab Position +1; nach [17]. DNA-Bindung von Transkriptionsfaktoren regelt RNA-Synthese Operon = Funktionseinheit Abbildung 1.3 zeigt einen idealisierten Promotor; von dessen Zusammensetzung weichen bekannte Promotoren mehr oder weniger stark ab. FÅr die Einleitung der Transkription ist es notwendig, dass Transkriptionsfaktoren an den Promotor oder an zusåtzliche Bindestellen wie Enhancer binden. In vielen Fållen ist das genaue Zusammenwirken dieser Faktoren nicht bekannt. Das Identifizieren von Promotoren mittels bioinformatischer Methoden hilft, mit hçherer Sicherheit Operons vorherzusagen. In prokaryontischen Genomen sind Gene håufig in Funktionseinheiten, den Operons, zusammengefasst. Diese bestehen aus einem Promotor und einer Menge von Genen. Deren Genprodukte sind meist Elemente einer grçßeren Funktionseinheit oder tragen zur selben Stoffwechselleistung bei. So finden sich die Gene, die an der Tryptophan-Biosynthese beteiligt sind, in einem Operon. 1.4 RNA Die Funktion der meisten RNA-MolekÅle ist unbekannt Bei hçheren Eukaryonten kennt man nur får einen kleinen Bruchteil des Genoms die genaue Funktion [18]. Zu den Genomabschnitten mit bekannter Funktion gehçren regulatorische Elemente wie Promotoren sowie die Gene, die får Proteine oder bestimmte RNA-Spezies codieren. FÅr die RNA war bisher eine Funktion als Transfer-RNA, als Komponente von Ribosomen (ribosomale RNA) oder von Spleißosomen gesichert. Der erheblich grçßere Rest des Genoms wurde håufig als Junk-DNA bezeichnet. JÅngste, genomweite Experimente im Rahmen des ENCODE-Projektes haben jedoch gezeigt, dass Tausende, nicht får Proteine codierende Transkripte (ncrnas) existieren, deren Bedeutung unklar ist. Diese Ergebnisse belegen får das Genom des Menschen [19] und der Maus, dass der grçßte Teil transkribiert wird. ncrnas werden in kleine interferierende RNAs, mikro-rnas und lange ncrnas eingeteilt. Letztere haben eine Långe von mehr als 200 Nucleotiden und stellen den grçßten Anteil. FÅr diese RNA-MolekÅle ist eine Beteiligung an der Organisation der Genomarchitektur und der Genexpression plausibel. Kleine RNA-MolekÅle sind an