Xenogene DNA-Impfstoffe auf Basis der Tyrosinhydroxylase gegen das Neuroblastom Nicole Huebener, Alexander Stermann, Stefan Fest, Bianca Baykan,

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1 Xenogene DNA-Impfstoffe auf Basis der Tyrosinhydroxylase gegen das Neuroblastom Nicole Huebener, Alexander Stermann, Stefan Fest, Bianca Baykan, Holger Lode Rationale: Die Idee, eine zelluläre, lang anhaltende Immunantwort im Körper zu induzieren, vermittelt durch zytotoxische CD8+T-Zellen, die sich gegen den Tumor richten, scheint zur Therapie des Neuroblastoms besonders attraktiv. Die Tyrosinhydroxylase (TH), das Schrittmacherenzym der Katecholaminbiosynthese, ist in der Mehrzahl der Neuroblastome stark überexprimiert und wird aufgrund dessen auch als Diagnose-Marker verwendet (, ). Die Überwindung der Selbsttoleranz des Immunsystems wurde durch den Einsatz sog. DNA- Minigen-Vakzine, die für Peptide aus der murinen TH-Sequenz kodieren, bereits in vivo gezeigt (Huebener et al., Mol Cancer Ther 8, in print). Nun soll untersucht werden, ob sich antitumorale Effekte auch nach xenogener Immunisierung zeigen und sogar verstärken lassen aufgrund der induzierten Kreuzreaktivität (, ). Hierzu werden die gesamte kodierende Sequenz der humanen TH (hth), sowie von ihr abgeleitete Minigene in vivo als Impfstoffe eingesetzt. Als Adjuvants soll single chain (sc) IL- dienen, welches vom gleichen Plasmid exprimiert wird wie die vom Tumorantigen stammende DNA. Der eukaryotische Expressionsvektor pbud CE. (Fa. Invitrogen), der zwei unabhängige Expressionskassetten aufweist, soll dazu verwendet werden. Zwei weitere DNA-Vakzine wurden auf Basis des eukaryotischen Expressionsplasmids pcmv-fub konstruiert; das Vektordesign vermittelt die Bildung eines Ubiquitin (Ub)-Minigen- Fusionspeptids, in dem die C-terminale AS des Ub zu Ala76 mutiert ist (5). Dies soll einen proteasomalen Abbau des eingefügten Antigens, die Voraussetzung für die Präsentation von AG-Peptiden in MHC-Klasse-I, induzieren (6, 8). Die im Ubiquitinvektor enthaltenen DNA-Sequenzen sind ) die cdna der hth () und ) ein Minigen, welches für drei hochantigene MHC-Klasse-I-Epitope kodiert (). Die Applikation der DNA-Vakzine erfolgt unter Nutzung attenuierter Bakterien des Stammes Salmonella typhimurium SL77. Das von uns verwendete syngene, immunkompetente A/J- Mausmodell ist bestens geeignet, den Einfluß von DNA-Vakzinierung sowohl auf das subkutane Primärtumorwachstum als auch auf die nach operativer Entfernung des Tumors eintretende spontane Metastasierung in sekundäre Organe zu untersuchen (7).

2 Ergebnisse: In einem ersten Experiment wurden die drei hergestellten Vakzine vergleichend eingesetzt. Es ergab sich, daß alle drei Vakzine in gleicher Weise den Primärtumor hemmten, was sich deutlich am verlangsamten Tumorwachstum erkennen läßt (Abb. ). Auch der Effekt auf die Metastasierung der Leber fiel bei allen Vakzinen ähnlich aus und war im Vergleich zur Leervektor-geimpften Kontrollgruppe statistisch signifikant unterschiedlich (Abb. und ). tumor size [mm ] 5 -scil liver weight [g] 5,5,5,5,5,5 Abb. und : Gezeigt sind die Hemmung des Tumorwachstums, links, und der Effekt auf die Lebermetastasierung nach Impfung mit, und dem scil-exprimierenden -Vakzin. Statistische Signifikanz ist mit einem dargestellt (p<.5). number of tumor nodes on liver surface grade of liver metastasis 5, 5, 5,,,,,,,,,,, 5,,,, (p<.5),,, 5, 6,,,, (p<.5) hth-scil,,,,,,,,,, Abb. : Gezeigt ist die Auswertung der Lebermetastasierung nach Impfung mit, und dem scil-exprimierenden -Vakzin. Hierbei wird dem prozentualen Anteil einer Metastasierung der Leberoberfläche ein bestimmter Metastasierungsgrad (-) zugeordnet: % =, <% =, -5% =, >5% =.

3 Nach diesem Versuch konnte festgestellt werden, daß das xenogene TH-Vakzin auch ohne zusätzliches Adjuvants in Form von IL eine effektive Antitumorantwort in den behandelten Mäusen induzierte. Um diese Antitumorantwort näher zu charakterisieren, wurden in einem weiteren in vivo-versuch die CD8-T-Zellen vor, während und nach der Impfung mit dem -Vakzin depletiert. Daraufhin blieb der Effekt auf das Tumorwachstum und auf die Lebermetastasierung in diesen Mäusen aus (Abb. und 5). tumor size [mm ] 5 hth+anti-cd8 6 8 hth+ anticd8 Metastatic scores,,,,,,,,,,,,,,, tumorfree mice Abb. und 5: ) Gezeigt ist die Hemmung des Tumorwachstums durch das -Vakzin ( ) bzw. das Ausbleiben dieser Hemmung, wenn CD8-T-Zellen in den geimpften Mäusen depletiert wurden ( ). 5) Auch die Lebermetastasierung wird in CD8-depletierten, -geimpften Mäusen nicht verhindert. Statistische Signifikanz ist mit einem dargestellt (p<.5). Einen weiteren deutlichen Hinweis auf die Beteiligung von spezifischen zytotoxischen T- Zellen an der Antitumorantwort gab die Untersuchung von Zellkulturüberständen von aus geimpften Mäusen isolierten T-Zellen, die mit inaktivierten target-zellen (NXS- Neuroblastomzellen) über mehrere Tage inkubiert wurden. Die T-Zellen aus der - Gruppe sowie der -Gruppe produzierten signifikant höher das Th-Zytokin IFN-γ, welches von aktiven zytotoxischen T-Zellen gebildet wird (Abb. 6).

4 6 IFN-gamma [pg/ml] Abb. 6: Gezeigt ist die Konzentration an IFN-γ in Zellkulturüberständen von T-Zellen aus geimpften und Kontrollmäusen, die sechs Tage lang mit inaktivierten NXS-Zellen inkubiert wurden. Statistische Signifikanz ist mit einem dargestellt (p<.5). Um die Vermutung, daß zytotoxische T-Zellen den Hauptanteil an der durch die xenogenen Vakzine induzierten Immunantwort ausmachen, weiter zu untermauern, werden derzeit Zytotoxizitätsassays mit aus Milzen isolierten T-Zellen durchgeführt. Ferner soll Tumormaterial aus geimpften und ungeimpften Mäusen auf eine Infiltration durch CD8 + T- Zellen hin untersucht werden. Auch die therapeutische Effizienz der beiden xenogenen TH-Vakzine soll in einem Langzeitexperiment untersucht werden.

5 Reference List Miyajima,Y., Kato,K., Numata,S., Kudo,K. and Horibe,K. Detection of neuroblastoma cells in bone marrow and peripheral blood at diagnosis by the reverse transcriptasepolymerase chain reaction for tyrosine hydroxylase mrna, Cancer, 75: , 995. Pession,A., Libri,V., Sartini,R., Conforti,R., Magrini,E., Bernardi,L., Fronza,R., Olivotto,E., Prete,A., Tonelli,R. and Paolucci,G. Real-time RT-PCR of tyrosine hydroxylase to detect bone marrow involvement in advanced neuroblastoma, Oncol.Rep., : 57-6,. Loftus,D.J., Castelli,C., Clay,T.M., Squarcina,P., Marincola,F.M., Nishimura,M.I., Parmiani,G., Appella,E. and Rivoltini,L. Identification of epitope mimics recognized by CTL reactive to the melanoma/melanocyte-derived peptide MART-(7-5), J.Exp.Med., 8: , 996. Weber,L.W., Bowne,W.B., Wolchok,J.D., Srinivasan,R., Qin,J., Moroi,Y., Clynes,R., Song,P., Lewis,J.J. and Houghton,A.N. Tumor immunity and autoimmunity induced by immunization with homologous DNA, J.Clin.Invest., : 58-6, Rodriguez,F., Zhang,J. and Whitton,J.L. DNA immunization: ubiquitination of a viral protein enhances cytotoxic T-lymphocyte induction and antiviral protection but abrogates antibody induction, J.Virol., 7: , Groettrup,M., Khan,S., Schwarz,K. and Schmidtke,G. Interferon-gamma inducible exchanges of S proteasome active site subunits: why?, Biochimie, 8: 67-7,. 7 Huebener,N., Lange,B., Lemmel,C., Rammensee,H.G., Strandsby,A., Wenkel,J., Jikai,J., Zeng,Y., Gaedicke,G. and Lode,H.N. Vaccination with minigenes encoding for novel 'self' antigens are effective in DNA-vaccination against neuroblastoma, Cancer Lett., 97: - 7,. 8 Huebener,N., Fest,S., Strandsby,A., Michalsky,E., Preissner,R., Zeng,Y., Gaedicke,G. and Lode, H.N. A rationally designed tyrosine hydroxylase DNA vaccine induces specific anti-neuroblastoma immunity. Mol. Cancer Ther., in print 5