Inhaltsverzeichnis. 1. Einleitung Material und Methoden... 32

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1 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Posttranslationale Modifikationen N-Glykosylierung O-Glykosylierung Veränderungen der Glykosylierung bei der Tumorentstehung Lewis Antigene T- und Tn-Antigene Lektine C-Typ Lektine Die Rolle des Calcium-Ions bei der Bindung von Lektinen an Kohlenhydrate Einteilung und Funktion der C-Typ-Lektine Gruppe II Typ-II-Rezeptoren Gruppe III - Collectine Gruppe V NK-Zell-Rezeptoren Gruppe IV Selektine Gruppe VIII Typ-I-Rezeptoren Galectine Funktionen von C-Typ-Lektinen (Glykorezeptoren) im Immunsystem Zielsetzung der Arbeit Material und Methoden Material Chemikalien und Enzyme cdna für die Klonierung der Glykorezeptoren Oligonukleotide Zelllinien Antikörper Glykokonjugate zur Charakterisierung von Glykorezeptoren Gewebe Humane Normalgewebe

2 Humane Gewebezelllysate aus Kolonkarzinomen und korrespondierenden Normalgeweben Humane Gewebezelllysate aus Mammakarzinomen Methoden Molekularbiologische Methoden Klonierungen Herstellung einer Kassette für alle Typ-II-Glykorezeptoren durch Integration neuer Schnittstellen in den pebb-vektor Vektorkarten der pebb-vektoren Klonierung von Typ-I-Glykorezeptoren Polymerase Kettenreaktion (PCR) Subklonierung von DNA-Fragmenten Agarosegelelektrophorese Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarose DNA-Ligation Bakterielle Transformation Präparation von Plasmid-DNA DNA-Sequenzierung Restriktionsverdau von DNA Overlap - PCR Klonierung der Glykorezeptoren Zellbiologische Methoden Auftauen von Zellen Kultivierung von Zellen Transiente Transfektion von Zellen zur Expression der Glykorezeptoren Transiente Transfektion von Zellen und Herstellung von Gesamt-Zelllysaten Proteinchemische Methoden Aufreinigung rekombinanter Glykorezeptoren aus Zellkulturüberständen Herstellung von Gewebezelllysaten aus Tumorgewebeproben SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Proteintransfer im Tank Blot Verfahren Komplexierung rekombinanter Glykorezeptoren Immundetektion von Mitgliedern der CEACAM-Familie mittels mab T Immundetektion mit anti-myc- und anti-ha-antikörpern

3 Immundetektion von MAPKinase Konzentrationsbestimmung rekombinanter, aufgereinigter Glykorezeptoren Coomassie-Färbung von Proteinen Silberfärbung von Proteinen Proteinbestimmung nach Bradford Strippen von Membranen Glykobiologische Methoden Glykokonjugat-ELISA Durchflusszytometrie (FACS-Analysen) Immunzytochemische Analyse von HEK293-Zellen Einbettung von Zellen in Agarose Einbettung von Zellen in Paraffin Immunzytochemische Färbung von in Paraffin-eingebetteten HT29-Zellen mit einem Glykorezeptor Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie Bioinformatische Datenauswertung Ergebnisse Overlap-PCR zur Modifikation des pebb-vektors Klonierung der Extrazellulardomänen 16 verschiedener Glykorezeptoren Expression der Glykorezeptoren Aufreinigung der rekombinanten Glykorezeptoren mittels anti-myc-antikörper- Affinitätschromatographie Überprüfung der Reinheit der über anti-myc-affinitätschromatographie aufgereinigten Glykorezeptoren Quantifizierung der Glykorezeptoren mittels Coomassie-Färbung Kolloidale Coomassiefärbung rekombinant exprimierter Glykorezeptoren Quantifizierung der Glykorezeptoren mittels Immunoblot Einstellung der Komplexzusammensetzung Überprüfung der Bindungsfähigkeit und Bindungsspezifität der Glykorezeptoren an Transfektomen Untersuchung der Bindungsspezifität der Lektine an BSA-Glykokonjugaten Überprüfung der Bindungsfähigkeit und Bindungsspezifität der Glykorezeptoren mittels Western Blot-Analysen

4 3.12 Western Blot-Analysen mit verschiedenen Glykorezeptoren an Gewebezellextrakten von Normalgeweben Überprüfung der Bindungsspezifität mittels SRCLII Erstellung von Glykosylierungsprofilen von Gewebeextrakten aus Kolonkarzinomen und korrespondierenden Normalgeweben unter Einsatz zehn verschiedener Glykorezeptoren Gruppierung der Glykosylierungsprofile der Kolontumoren und der korrespondierenden Normalgewebe Glykosylierungsprofile von Gewebezelllysaten aus Mammakarzinomen Immundetektion mit dem monoklonalen Antikörper T Cluster Analyse der Western Blot-Analysen von Mammakarzinomen Kontrolle der Bindungsspezifität anhand DC-SIGN und SRCLII Kontroll-Untersuchungen an Gewebezelllysaten aus Kolonkarzinomen Kontroll-Untersuchungen an Gewebezelllysaten aus Mammakarzinomen Überprüfung der Einsatzmöglichkeit von rekombinanten Glykorezeptoren zum Nachweis von Glykostrukturen mittels Durchflusszytometrie Einsatz von DC-SIGN und KLRF1 zum Nachweis von Glykostrukturen in der Immunzytochemie und der Immunhistochemie Diskussion Klonierung, Expression und Quantifizierung der Extrazellulardomänen humaner Glykorezeptoren Komplexierung der Glykorezeptoren Überprüfung der Bindungsfähigkeit und Bindungsspezifität der Glykorezeptoren an Kontroll-Glykoproteinen und Transfektomen Untersuchung der Bindungsspezifität im ELISA Western Blot-Analysen mit rekombinanten Glykorezeptoren an Gewebezellextrakten aus Normalgeweben Western Blot-Analysen mit rekombinanten Glykorezeptoren an Gewebezellextrakten aus Kolonkarzinomen und korrespondierenden Normalgeweben Gruppierung der Glykosylierungsprofile der Kolonkarzinome und der korrespondierenden Normalgewebe mittels Cluster-Analysen Western Blot-Analysen mit rekombinanten Glykorezeptoren an Gewebezellextrakten aus Mammakarzinomen Cluster-Analyse der Western Blots von Mammakarzinomen im Vergleich zu einer Normalgewebeprobe

5 4.8 Überprüfung der Einsatzmöglichkeit von rekombinanten Glykorezeptoren zum Nachweis von Glykostrukturen mittels Durchflusszytometrie Einsatz von DC-SIGN und KLRF1 zum Nachweis von Glykostrukturen in der Immunzytochemie Anwendung von DC-SIGN an HEK293-Transfektomen Anwendung von KLRF1 an Paraffin eingebetteten HT29-Zellen Ausblick Zusammenfassung Literaturverzeichnis Danksagung Veröffentlichungen und Förderung Abkürzungsverzeichnis Anhang I. Präfixe II. Einheiten III. Ein- und Drei- Buchstabencode der Aminosäuren IV. cdna-sequenzen aller verwendeten rekombinanten Glykorezeptoren V. Sequenzen aller rekombinanten Glykorezeptoren im pebb-vektor

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