Prof. Dr. med. K. Überla Prof. Dr. med. A. Reinacher-Schick

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1 Aus der Medizinischen Klinik des Knappschaftskrankenhauses Bochum Langendreer - Universitätsklinik - der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. Wolff Schmiegel Prognostische Bedeutung von KRAS- und BRAF-Mutationen in der Erstlinien-Chemotherapie des metastasierten kolorektalen Karzinoms mit Oxaliplatin und Fluoropyrimidinen Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Nina Mareike Bruns aus Dortmund 2012

2 Dekan: Referent: Korreferent: Prof. Dr. med. K. Überla Prof. Dr. med. A. Reinacher-Schick PD Dr. med. K.-H. Bauer Tag der Mündlichen Prüfung:

3 Abstract Bruns, Nina Mareike Prognostische Bedeutung von KRAS- und BRAF-Mutationen in der Erstlinien-Chemotherapie des metastasierten kolorektalen Karzinoms mit Oxaliplatin und Fluoropyrimidinen Problem: Das kolorektale Karzinom (KRK) ist derzeit in Europa die zweithäufigste tumorbedingte Todesursache. Bei Erstdiagnose weisen etwa 25% der Patienten eine Fernmetastasierung auf. Durch die Einführung neuer Chemotherapeutika konnte die Prognose des mkrk deutlich verbessert werden. Dabei kommt der Identifikation von Biomarkern eine entscheidende Bedeutung zu. Methode: Die hier untersuchten Gewebeproben stammen von Patienten aus einer prospektiv randomisierten Phase-III-Studie der AIO zur Erstlinientherapie des mkrk mit Oxaliplatin und Fluoropyrimidinen (Oxaliplatin und Capecitabin (CAPOX) oder Oxaliplatin und infusionales 5-Fluorouracil (5-FU, FUFOX)). Das untersuchte Teilkollektiv unterschied sich in Bezug auf Alter, Geschlecht und Therapie nicht vom Gesamtkollektiv aller Studienpatienten. Die DNA wurde aus pseudonymisierten, formalinfixierten, Paraffin-eingebetteten Tumorgewebeproben (FFPE) extrahiert. Mit Hilfe des QIAmp DNA Mini Kits wurden 7 KRAS-Mutationen in den Kodons 12 und 13 detektiert. Im BRAF-Gen wurde gezielt die Hotspot-Mutation V600E analysiert. Nur Tumoren mit Wildtyp-KRAS-Status wurden auf eine BRAF-Mutation hin untersucht. Der Mutationsstatus der Gene wurde mit dem Remissionsverhalten, progressionsfreien Überleben und Gesamtüberleben korreliert. Ergebnis: Eine KRAS-Mutation wurde in 75 der 205 (36,6%) verfügbaren Tumoren nachgewiesen. Eine BRAF V600E-Mutation wurde in 13 von 130 (10,0%) Tumoren mit Wildtyp-KRAS detektiert. 87 der 205 Patienten (42,4%) wiesen entweder eine KRAS- oder eine BRAF-Mutation auf. Patienten mit KRAS-Mutationen zeigten eine signifikant geringere Remissionsrate als Patienten mit KRAS-Wildtyp-Status (44,4% vs. 63,0%, p=0,012). Patienten mit KRAS-Wildtyp zeigten ein tendenziell besseres medianes Gesamtüberleben (18,9 Monate, 95%-KI: 14,7-23,2) als Patienten mit einer KRAS-Mutation (16,1 Monate, 95%-KI: 14,7-17,6). War eine KRASoder BRAF-Mutation vorhanden, fiel das Gesamtüberleben signifikant kürzer aus (15,6 Monate, 95%-KI: 12,4-18,8; p=0,013). Das mediane PFS war bei Patienten mit KRAS- und BRAF-Wildtyp (7,6 Monate, 95%-KI: 6,5-8,6) und Patienten mit KRAS- oder BRAF-Mutation (7,5 Monate, 95%-KI: 4,9-10,0) nicht unterschiedlich (p=0,89). 136 der 205 Patienten erhielten eine Folgetherapie. 80% der Patienten wurden mit einer Irinotecanhaltigen Zweitlinientherapie behandelt. 30% der Patienten erhielten den Anti-EGFR-Antikörper Cetuximab. Bei Patienten ohne Folgetherapie zeigte sich bzgl. des Postprogressionsüberlebens kein wesentlicher Unterschied. Bei den mit Irinotecan behandelten Patienten zeigte sich ein Trend zu einem günstigeren Postprogressionsüberleben in der KRAS-Wildtyp-Gruppe (p=0,072). Insbesondere KRAS-Wildtyp-Patienten mit einer Cetuximab-haltigen Folgetherapie profitierten erwartungsgemäß hinsichtlich des Gesamtüberlebens (p=0,087). Diskussion: Patienten mit einer KRAS- oder einer BRAF-Mutation weisen unter einer Oxaliplatin- und Fluoropyrimidin-haltigen Erstlinientherapie eine signifikant geringere Ansprechrate auf als Patienten mit Wildtyp-Tumoren. Auch das Gesamtüberleben der Patienten mit Mutation ist signifikant kürzer. Beim PFS zeigt sich hingegen kein Unterschied. Die potenzielle Oxaliplatin-Resistenz bei der Ansprechrate von mutierten Tumoren ist für die weitere Therapie von KRK von großer Bedeutung. Möglicherweise könnte dies mit der Expression des Reparaturproteins ERCC-1 zusammenhängen, das eine Platinresistenz bei verschiedenen Tumoren vermitteln kann. In Bezug auf eine Folgetherapie und das Gesamtüberleben profitierten Patienten besonders von einer Cetuximab-haltigen Therapie, wenn ein KRAS-Wildtyp vorlag, was den bekannten prädiktiven Wert einer KRAS-Mutation für eine Anti-EGFR-Therapie bestätigt.

4 Meiner Familie, Else und Heinz Adamik und Dominik

5 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Epidemiologie und Risikofaktoren des kolorektalen Karzinoms Pathologie und Klassifikation Molekulares Progressionsmodell des kolorektalen Karzinoms Klinik, Diagnostik und Früherkennung Therapie Etablierte und potenzielle Biomarker beim kolorektalen Karzinom Mikrosatelliteninstabilität p SMAD Die Rolle der KRAS- und BRAF-Mutationen beim kolorektalen Karzinom KRAS und Prognose BRAF und Prognose Zielsetzung Material und Methoden Material Methodik Statistik Ergebnisse Beschreibung des Patientenkollektivs Häufigkeit von KRAS- und BRAF-Mutationen Korrelation mit klinischen Variablen Korrelation mit dem Therapieansprechen Korrelation mit dem Überleben Progressionsfreies Überleben Gesamtüberleben Möglicher Einfluss von Folgetherapien Diskussion Zusammenfassung Literaturverzeichnis Danksagung 9. Lebenslauf - 1 -

6 Verzeichnis der Abkürzungen AAPC attenuierte adenomatöse Polyposis coli AIO Arbeitsgemeinschaft Internistische Onkologie APC Adenomatosis polyposis coli AS Aminosäure BMI Body-mass-index BRAF Rapidly growing fibrosarcoma type B CAPOX Capecitabin + Oxaliplatin CEA Carcino-embryonales Antigen CIMP CpG-Island-Methylatorphänotyp CIN Chromosomale Instabilität DALMs Dysplasia associated lesion or mass DNA Desoxyribonukleinsäure EGFR Epidermal-Growth-Factor-Receptor ELK-1 Ets Like gene 1 ERCC-1 Excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 1 Et al. Et alii FAP Familiäre Adenomatosis polyposis Koli FFPE Formalin-fixierte, Paraffin eingebettete Gewebeproben FOLFIRI Folinsäure + Fluorouracil + Irinotecan, 14-tägiges Protokoll FOLFOXIRI Folinsäure + Fluorouracil + Irinotecan + Oxaliplatin FOLFOX Folinsäure + Fluorouracil + Oxaliplatin, 14-tägiges Protokoll FOS FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog FS Folinsäure 5-FU Fluorouracil FUFIRI Fluorouracil + Irinotecan + Folinsäure, wöchentliches Protokoll FUFOX Fluorouracil + Folinsäure + Oxaliplatin, wöchentliches Protokoll HNPCC Hereditäres nicht-polypöses kolorektales Krebssyndrom (Lynch-Syndrom) HR Hazard ratio IFL Irinotecan + Fluorouracil + Leucovorin - 2 -

7 ILCT International Lung Cancer Trial kda Kilodalton KI Konfidenzintervall KRAS Kirsten Rat Sarcoma KRK Kolorektales Karzinom LOH Loss of heterozygosity LV Leukovorin MAP Mitogen-activated protein MEK MAP-Kinase-Kinase MIN Mikrosatelliteninstabilität MSI Mikrosatelliteninstabilität N Numerus/Anzahl NSCLC non-small cell lung carcinoma N-Kategorie Lymphknoten-Kategorie M Männlich Meta Metachrone Metastasierung mkrk Metastasiertes kolorektales Karzinom MMR-System Mismatch repair system M-Kategorie Metastasenkategorie Mut Mutation OS Overall Survival P Probability-value P53 Protein 53 PFS Progressionsfreies Überleben SMAD Sma and Mad related protein S-Phase Synthesephase Syn Synchrone Metastasierung T-Kategorie Tumor-Kategorie ÜLR Überlebensrate UICC Union internationale contre le cancer VEGF Vascular Endothelial Growth Factor Vs. Versus W Weiblich WT Wildtyp - 3 -

8 Verzeichnis der Tabellen Tab. 1 Stadieneinteilung nach UICC modifiziert nach Wittekind et al., Prognose: O Connell, J Natl Cancer Inst Tab. 2 Geräte und Materialien Tab. 3 Korrelation mit klinischen Variablen Tab. 4 Darstellung des Therapieansprechens Tab. 5 Korrelation zwischen Remissionsverhalten und KRAS- und BRAF-Mutation

9 Verzeichnis der Abbildungen Abb. 1 Progressionsfreies Überleben nach KRAS-Mutations-Status Abb. 2 Progressionsfreies Überleben nach KRAS-/BRAF-Status Abb. 3 Gesamtüberleben nach KRAS-Mutationsstatus Abb. 4 Gesamtüberleben nach KRAS-/BRAF-Mutationsstatus Abb. 5 Postprogressionsüberleben nach KRAS-Mutationsstatus bei Patienten, die keine Zweitlinientherapie erhielten (n=82) Abb. 6 Postprogressionsüberleben nach KRAS-Mutationsstatus bei Patienten, die eine Irinotecan-haltige Zweitlinientherapie erhielten (n=116) Abb. 7 Postprogressionsüberleben nach KRAS-Mutationsstatus bei Patienten, die eine Cetuximab-haltige Folgetherapie erhielten (n=41) Abb. 8 Postprogressionsüberleben nach KRAS-Mutationsstatus bei Patienten, die eine Irinotecan-haltige Zweitlinientherapie ohne eine Cetuximab-Gabe erhielten (n=75)

10 1. Einleitung 1.1. Epidemiologie und Risikofaktoren des kolorektalen Karzinoms Das kolorektale Karzinom (KRK) ist der häufigste maligne Tumor des Gastrointestinaltraktes. Mit mehr als Neuerkrankungen pro Jahr in Deutschland gilt es bei Männern nach dem Prostata- und bei Frauen nach dem Mammakarzinom als das am zweithäufigsten diagnostizierte Karzinom ( ). Das KRK ist bei beiden Geschlechtern die zweithäufigste krebsbedingte Todesursache. Insgesamt versterben pro Jahr in Deutschland circa Patienten an den Folgen eines KRKs. Die relative 5- Jahres-Überlebensrate liegt für Männer bei 52% und für Frauen bei 55% (Krebs in Deutschland, 2008). Das individuelle Lebenszeitrisiko für die Erkrankung an einem KRK liegt in Deutschland bei 4-6% (Nelson et al., 1999). Das mittlere Erkrankungsalter beträgt für Männer 69 Jahre und für Frauen 79 Jahre. Nach dem 50. Lebensjahr ist eine Verdopplung der Neuerkrankungen und Mortalität pro Lebensdekade zu beobachten (Nelson et al., 1999). Ein deutlich erhöhtes Erkrankungsrisiko besteht bei der familiären Adenomatosis polyposis Koli (FAP) und dem hereditären nicht-polypösen kolorektalen Krebssyndrom (HNPCC; Lynch-Syndrom). Circa 90-95% der KRK sind sporadischen Ursprungs und entstehen vermutlich multifaktoriell. Entscheidend bei den Risikofaktoren ist insbesondere ein westlicher Lebensstil (Fuchs et al., 1999; Almendingen et al, 2001; Bingham et al., 2003; Kim JH et al, 2007; Zandonai et al., 2012). Das Risiko für ein KRK ist ebenso durch regelmäßigen Alkohol- und Nikotinkonsum erhöht (Takeshita et al., 2000; Almendingen et al., 2001; Pedersen et al., 2003; Tiemersma et al., 2003). Des Weiteren zählen Bewegungsmangel und Übergewicht (BMI über 25 kg/m²) zu den Risikofaktoren (Giacosa et al., 1999; Friedenreich et al., 2002; Giovannucci et al., 2003; Wei et al., 2004). Verwandte ersten Grades von KRK-Patienten über bzw. unter 50 Jahren gehören ebenfalls einer Risikogruppe an, da sie mit einem Karzinomrisiko von 10% bzw. 30% überdurchschnittlich häufig erkranken (Fuchs et al., 1994). Zudem sind Patienten mit einer Colitis ulcerosa gefährdet, an einem KRK zu erkranken. Das Risiko beträgt 18% nach 30 Jahren Erkrankungsdauer (Eaden, 2004)

11 Ebenfalls ist bei einem Morbus Crohn von einem erhöhten Risiko auszugehen. Allerdings ist die Datenlage noch spärlich und die Meinungen schwanken zwischen keinem erhöhten Risiko und einem erhöhten Risiko für ein KRK von 3,5- bis 7-fach (Greenstein et al., 1981; Persson et al., 1994; Rubio et al., 2008) Pathologie und Klassifikation Als KRK werden alle malignen epithelialen Primärtumoren des Kolons und des Rektums bezeichnet. Fast ausschließlich handelt es sich um eine drüsige Differenzierung im Sinne eines Adeno-Karzinoms. Nichtepitheliale Tumoren im Kolon sind selten. Ungefähr die Hälfte aller Fälle hat ihren Ursprung im Rektum und circa 25% der Fälle treten im Sigma auf. Die übrigen Karzinome entstehen annähernd ähnlichen Anteils im Caecum, Colon ascendens, Transversum und Descendens. Zudem können Mehrfachkarzinome auftreten, wobei metachrone von synchronen Karzinomen unterschieden werden. Unter einer metachronen Metastasierung versteht man Metastasen, die später als 4 Monate nach der Diagnosestellung des Primärtumors auftreten. In etwa 70% liegt ein Adenokarzinom intestinalen Typs vor, wobei verschiedene Differenzierungsgrade (G1-G3) unterschieden werden. In etwa 20% der Adenokarzinome liegt ein muzinöses Karzinom und in weniger als 10% liegen seltenere histologische Varianten vor. Basis der Entstehung eines KRKs ist in weit über 90% der Fälle die sog. Adenom- Karzinom-Sequenz mit der sukzessiven Akkumulation genetischer Abberationen. Aufgrund einer mehrstufigen Sequenz genetischer Ereignisse, bei der Tumorsuppressorgene inaktiviert und Onkogene aktiviert werden, entsteht aus einem Mikroadenom über ein makroskopisch erkennbares Adenom das Karzinom. Ein erhöhtes Entartungsrisiko weisen Adenome größer 1 cm, villöse Adenome und Adenome mit höhergradigen Epitheldysplasien auf. Aus diesem Grund werden diese Polypen als advanced adenoma bezeichnet. Allgemein wird akzeptiert, dass die Tumorprogression entlang der Adenom-Karzinom-Sequenz mehr als 10 Jahre dauert. Weitere präkanzeröse Vorläuferläsionen stellen flache Adenome ( flat adenomas ) (Soetikno et al., 2008) und flach-erhabene und flache Epitheldysplasien bei Kolitis

12 assoziierten Karzinomen dar, die aber mittels moderner Endoskopietechniken zunehmend besser erkennbar werden. Die Prognose von Patienten mit KRK ist wesentlich abhängig von der Eindringtiefe des Tumors in die Darmwand (T-Kategorie), dem Befall regionaler Lymphknoten (N-Kategorie) und dem Vorhandensein von Fernmetastasen (M-Kategorie). Die klinische Einteilung und die Beschreibung der anatomischen Tumorausbreitung (Staging) erfolgt nach der TNM-Klassifikation (Wittekind et al., 2003) und der daraus abgeleiteten Stadieneinteilung der UICC. In der unten aufgeführten Tabelle 1 sieht man die TNM-Klassifikation der 6. Auflage, wie sie bisher verwendet wurde. Aktuell wurde die 7. Auflage der TNM-Klassifikation eingeführt, in welcher einige Änderungen vorgenommen wurden. Überlebensraten sind bei der neuen Klassifikation allerdings noch nicht vorhanden ( Tabelle 1: Stadieneinteilung nach UICC modifiziert nach Wittekind et al., Prognose: O Connell, J Natl Cancer Inst UICC-Stadium TNM-System Anteil 5-Jahres-Überlebensrate UICC 0 Tis, N0, M0 UICC I T1-2, N0, M0 15% % UICC II A T3, N0, M % 85% UICC II B T4, N0, M0 72% UICC III A T1-2, N1, M0 83% UICC III B T3-4, N1, M % 64% UICC III C jedes T, N2, M0 44% UICC IV jedes T, jedes N, M % 5-7%; bei resektablen Leber-/ Lungenmetastasen 25-40% Bereits bei Diagnosestellung finden sich bei ungefähr 25% der Patienten Metastasen, die insbesondere in der Leber lokalisiert sind. Bei Lebermetastasen liegt in 80-90% eine nicht-resektable Situation vor. 50% aller Patienten mit einem kurativ resezierten KRK der Stadien I bis III entwickeln im Laufe ihrer Erkrankung Metastasen (Geoghegan, 1999). Bei Patienten eines resezierten Karzinoms mit dem Stadium II treten in 15-30% der Fälle Metastasen auf und bei einem Stadium III-Karzinom entwickeln sich in 16-60% Metastasen. Bei dem UICC-Stadium I sind Metastasen in der Folge selten

13 1.3. Molekulares Progressionsmodell des kolorektalen Karzinoms Die Basis der Entstehung des KRKs ist entlang der sog. molekularen Adenom- Karzinom-Sequenz, auch genannt das Progressions-Modell. Hiernach entsteht die Neoplasie nicht aufgrund einer einzelnen genetischen Veränderung, sondern resultiert aus einer sukzessiven Akkumulation unterschiedlicher Alterationen verschiedener Tumorsuppressor- bzw. Onkogene (Kinzler und Vogelstein, 1998). Der Karzinomentstehung liegt eine genetische Instabilität zugrunde. Unterschieden werden heute hierbei die chromosomale Instabilität (CIN) und die Mikrosatelliteninstabilität (MIN). Bei 85% aller sporadischen KRK lässt sich ein CIN-Phänotyp nachweisen. Dies bedeutet, dass chromosomale Verluste oder ein Zugewinn genetischen Materials vorliegen. Am Anfang der Kaskade der genetischen Alterationen beim KRK beim CIN-Typ steht die biallelische Inaktivierung des APC-Gens. Durch diese Inaktivierung werden über verschiedene Zwischenstationen die Zellproliferation, Zellzykluskontrolle und Apoptoseinhibition beeinflusst (Heppner und Groden, 2000). Nachfolgend sind aktivierende Mutationen des KRAS-Onkogens und Alterationen auf dem Chromosom 18, auf welchem sich insbesondere die Gene SMAD4, SMAD2 und DCC befinden, nachweisbar. Für die Progression zu einem Karzinom sind letztendlich Mutationen im Gen des Tumorsuppressorgens p53 auf dem Chromosom 17p verantwortlich. In 15% der KRK findet man hingegen keinen CIN-Phänotyp, sondern eine Mikrosatelliteninstabilität (MIN/MSI) (Aaltonen et al., 1993). Neben der chromosomalen Instabilität und der Mikrosatelliteninstabilität kann als weiterer Phänotyp der CpG-Island-Methylatorphänotyp (CIMP) auftreten. Dieser zeigt eine epigenetische Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen, welche bei familiären Karzinomsyndromen typischerweise Keimbahnmutationen aufweisen wie Rb, BRCA, VHL oder p16. Häufig gehen CIMP-positive KRK mit einer MSI einher, was auf eine Promotormethylierung des Mismatch-Reparatur-Gens MLH1 zurückzuführen ist (Issa, 2008). Die Entstehung einer Mikrosatelliteninstabilität beruht auf einem Defekt im MMR- System. Dieser geht entweder aus einer somatischen/ hereditären Mutation in einem MMR-Gen oder einer Hypermethylierung des MLH1-Promotors hervor (Grandy, 2004). Ein Expressionsverlust des MLH1-Gens liegt in 70% aller sporadischen KRK vor (Cunningham et al., 1998). Bei HNPCC-Fällen liegt mit einer Häufigkeit von 90% eine Mikrosatelliteninstabilität vor, somit kann bei einer - 9 -

14 unauffälligen Mikrosatellitenanalyse eine HNPCC weitestgehend ausgeschlossen werden Klinik, Diagnostik und Früherkennung Aufgrund der unspezifischen Symptome und seines oft langen klinisch stummen Vorhandenseins bleibt das KRK häufig zunächst unbemerkt. Da es keine zuverlässigen Frühsymptome gibt, wird eine Krebsfrüherkennung empfohlen. Diese ist seit 2002 in das gesetzliche Vorsorgeprogramm aufgenommen. Als Warnzeichen gelten Stuhlunregelmäßigkeiten, Ileus und Blut im Stuhl. Jede plötzliche Änderung der Stuhlgewohnheit im Alter von über 40 Jahren, beispielsweise eine veränderte Stuhlbeschaffenheit, Wechsel von Obstipation und Diarrhö, Ileuserscheinungen oder Blutbeimischung zum Stuhl sowie eine ungeklärte Gewichtsabnahme, Anämie und Schmerzsymptome können einen Hinweis auf ein KRK darstellen. Im Rahmen der Krebsfrüherkennung wird ab dem 50. Lebensjahr für Nicht- Risikopersonen ein fäkaler Okkultblut-Test (FOBT/ Guaiak-Test) mit einer digitalrektalen Untersuchung empfohlen. Zudem sollte ab dem 55. Lebensjahr eine Koloskopie durchgeführt werden, die bei unauffälligem Befund und fehlenden Risikofaktoren im Abstand von zehn Jahren wiederholt wird. Im Vergleich zu allen anderen Maßnahmen der Früherkennung besitzt die Koloskopie die höchste Sensitivität und Spezifität und wird somit als Goldstandard angesehen. Studien zeigten, dass durch eine Polypektomie bei einer Koloskopie die Inzidenz von kolorektalen Karzinomen um 66-90% gesenkt wird (Winawer et al., 1993; Citarda et al., 2001). Bei unklarer Symptomatik mit Tumorverdacht ist eine Koloskopie unerlässlich Therapie Die Therapie beim KRK erfolgt nach histologischer Sicherung stadienabhängig. Anzustreben ist grundsätzlich die kurative Resektion. Das Standardverfahren in der Chirurgie ist die elektive radikale En-bloc-Resektion des befallenen Darmabschnittes mit systematischer Entfernung des Lymphabflussgebietes

15 Perikolische Lymphknotenmetastasen treten in der Regel maximal circa zehn Zentimeter entfernt vom Tumorrand auf, die Lymphknotendissektion sollte bis zum zentralen Gefäßabgang erfolgen. Eine adjuvante Chemotherapie ist bei Patienten mit einem Tumor im UICC-Stadium I nicht indiziert. Im Stadium II kann eine adjuvante 5-FU-basierte Chemotherapie nach Beratung und Aufklärung des Patienten empfohlen werden ( Kann -Empfehlung) (Schmiegel et al., 2008), da durch Studien ein Überlebensvorteil bei dieser Therapie von 3-5% belegt wurde (Quasar Collaborative G., 2007). Bei Hochrisikopatienten (T4, Tumor-Perforation, Ileus, <10 Lymphknoten) sollte eine adjuvante Chemotherapie erwogen werden (Schmiegel et al., 2008). Im UICC-Stadium III soll eine adjuvante Chemotherapie durchgeführt werden ( Soll -Empfehlung) (Schmiegel et al., 2008). Empfohlen wird derzeit das FOLFOX-Schema (LV5FU2+Oxaliplatin) aufgrund einer Studie, welche eine signifikante Überlegenheit für die FOLFOX-Chemotherapie gegenüber einer 5-FU- Chemotherapie zeigte (Andre et al., 2004; DeGramont et al., 2007; Andre et al., 2009). Besteht eine Unverträglichkeit gegenüber Oxaliplatin oder ist der Allgemeinzustand reduziert, soll eine Monotherapie mit oralen Fluoropyrimidinen durchgeführt werden. Neoadjuvante Therapieverfahren spielen in erster Linie bei Rektumkarzinomen eine Rolle. Insbesondere bei den UICC-Stadien II und III soll eine neoadjuvante Radio- oder Radiochemotherapie durchgeführt werden. In Studien konnte gezeigt werden, dass eine präoperative Radiotherapie eine bessere Wirksamkeit erzielt als eine postoperative Therapie (Sauer et al., 2004). In Bezug auf das therapeutische Vorgehen werden die Patienten mit einem metastasierten KRK nach der klinischen Situation und dem Therapieziel in drei klinische Gruppen eingeteilt. Zu der Gruppe 1 gehören die Patienten mit primär resektablen Leber- und/oder Lungenmetastasen. Bei Patienten der zweiten Gruppe wird eine intensivierte systemische Therapie angestrebt. Zu dieser Gruppe gehören operable Patienten mit potenziell resektablen Metastasen nach einer Konversionstherapie sowie Patienten mit tumorbedingten Symptomen, raschem Progress oder Organkomplikationen. Bei der Gruppe 3 kann eine weniger intensive Therapie appliziert werden, welche bei Patienten mit multiplen Metastasen ohne Option für Resektion nach Metastasenrückbildung, ohne tumorbezogene Symptome oder Organkomplikation und/oder schwerer Komorbidität angewandt wird. Auch bei Patienten über 75 Jahren kann mit einer Monotherapie begonnen werden

16 Eine Resektion von Metastasen (Gruppe 1) ist nur bei 10-20% aller Patienten möglich (Adson, 1987; Goldberg et al., 1998). Durch die erfolgreiche Entfernung von Lebermetastasen ist eine 5-Jahres-Überlebensrate von 25-40% zu erreichen (Nagorney, 1987). Die Datenlage für eine perioperative Therapie bei resektablen Lebermetastasen ist nicht eindeutig. Vermutlich verbessert die perioperative Therapie mit FOLFOX das rezidivfreie Überleben. Eine Verbesserung des Gesamtüberlebens konnte bislang nicht gezeigt werden (Wieser et al., 2010). Bei Patienten der zweiten Gruppe wird eine intensivierte systemische Therapie angestrebt. Bei Leber- und/oder Lungenmetastasen und im Einzelfall auch bei anderen Lokalisationen ist daher bei Diagnose und im Verlauf zu überprüfen, ob eine Resektion technisch möglich ist. Bei primärer Irresektabilität der Metastasen soll mit einer neoadjuvanten systemischen Chemotherapie begonnen werden, um ggf. eine sekundäre Metastasenresektion zu erreichen (Konversionstherapie). Derzeit stehen mehrere Erstlinientherapien mit hohen Remissionsraten zur palliativen Behandlung des metastasierten KRKs zur Verfügung. Dabei ist das orale Capecitabine dem intravenösen 5-FU/Folinsäure gleichzusetzen. Die Kombinationen von 5-FU/FS mit Oxaliplatin als auch mit Irinotecan sind einer Monotherapie mit 5-FU überlegen. (De Gramont et al., 2000; Douillard et al., 2000; Seymour et al., 2007). Oxaliplatin ist ein Dritt-Generations-Platinanalogon, welches durch Derivate, die bei der Biotransformation von Oxaliplatin entstehen, zu Inter- und Intrastrang-Quervernetzungen in der DNA führt. Die Folge ist ein Abbruch der DNA-Synthese und somit eine antitumorale Wirkung. Irinotecan ist ein Camptothecinderivat, welches die Topoisomerase 1 hemmt. Dadurch kommt es zu einem Abbruch der DNA-Replikation und damit letztendlich zur Apoptose. Somit ist Irinotecan pharmakologisch ein Zytostatikum. Durch die synergistische Wirkung von 5-FU/FS und Oxaliplatin beispielsweise werden Remissionsraten von bis zu 50% erreicht (Giacchetti et al., 2000). Somit sollte aufgrund der höheren Ansprechrate bei der Gruppe 2 eine Kombinationstherapie (2-fach Chemotherapie + monoklonaler Antikörper oder 3- fach Chemotherapie (FOLFOXIRI)) gewählt werden. Als monokolonale Antikörper können beispielsweise Cetuximab oder Bevacizumab zum Einsatz kommen. Cetuximab bindet an den EGF-Rezeptor, welcher auf den Tumorzellen vermehrt exprimiert wird. Cetuximab führt in einer Kombinationstherapie vor allem zu einer Erhöhung der Remissionsraten, während das progressionsfreie Überleben nur moderat verbessert wird (van Cutsem et al., 2009; Bokemeyer et al., 2009)

17 Cetuximab scheint ferner das Gesamtüberleben zu verbessern (van Cutsem, 2010). Bei Patienten der Gruppe 3 mit Metastasen ohne Aussicht auf Rückbildung kann als Erstlinientherapie auch eine Monotherapie eingesetzt werden. Bei Progress unter einer Monotherapie sollte eine weitere Substanz hinzu genommen werden. Bei einem Großteil der Patienten wird im Verlauf der Erkrankung Irinotecan oder Oxaliplatin eingesetzt. Ob eine Irinotecan- oder Oxaliplatin- Kombination gewählt wird, sollte anhand des Toxizitätsspektrums festgemacht werden. Bei den Irinotecan-Kombinationen sollten insbesondere Diarrhön Beachtung finden und bei der Oxaliplatin-Kombination muss an die kumulative Neurotoxizität (PNP) gedacht werden. Vergleicht man die 5-FU-Protokolle, ist ein Vorteil bei den 14-tägigen FOLFIRI- und FOLFOX-Therapien gegenüber den wöchentlichen FUFIRI- und FUFOX-Protokollen erkennbar. Ebenfalls Anwendung in der Erstlinientherapie finden antiangiogenetische Substanzen. Bei Bevacizumab handelt es sich um einen monoklonalen Antikörper gegen den Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). In Studien konnte gezeigt werden, dass Bevacizumab in Kombination mit einer Chemotherapie das progressionsfreie Überleben und zum Teil auch das Gesamtüberleben der Patienten verbessern kann (Hurwitz et al., 2003; Kabbinavar et al., 2005; Saltz et al., 2008). Die Ansprechrate wird weniger deutlich verbessert (Hurwitz et al., 2003; Saltz et al., 2008). Bevacizumab kann sowohl in Kombination mit Oxaliplatin als auch in Irinotecan-haltigen Protokollen eingesetzt werden. Ebenfalls für die Erstlinien-Chemotherapie zugelassen ist die Integration von Cetuximab in eine Kombinationschemotherapie. In der so genannten CRYSTAL- Studie wurde der Effekt der Zugabe von Cetuximab zum FOLFIRI-Protokoll untersucht. Es wurden 599 Patienten mit einem mkrk mit dem FOLFIRI-Protokoll behandelt und weitere 599 Patienten erhielten FOLFIRI plus Cetuximab (van Cutsem et al., 2009). Es zeigte sich bei der alleinigen Gabe von FOLFIRI ein signifikant kürzeres PFS (8,0 vs. 8,9 Monate, p=0,048). Zu der EGFR-Antikörper- Therapie liegt bereits eine randomisierte Phase III Studie vor. Es wurde gezeigt, dass bei einer Vortherapie mit Fluoropyrimidinen, Irinotecan oder Oxaliplatin oder einer Kontrainidikation gegen diese Medikamente bei Patienten mit immunhistochemisch nachweisbarem EGFR durch Cetuximab eine Verbesserung des Gesamt- oder PFS erreicht werden kann (Jonker et al., 2007)

18 Bei Patienten mit Wildtyp-KRAS zeigte sich ein verlängertes PFS (9,9 vs. 8,7 Monate; HR=0,68; 95%-Konfidenzintervall (KI): 0,50-0,94) und ein verlängertes Gesamtüberleben (24,9 vs. 21,0 Monate, HR=0,84; 95%-KI: 0,64-1,11) bei der Zugabe von Cetuximab im Vergleich zu Patienten mit KRAS-Mutationen (PFS: FOLFIRI+Cetuximab vs. FOLFIRI=7,6 vs. 8,1 Monate; p=0,07; OS: FOLFIRI +Cetuximab vs. FOLFIRI=17,5 vs. 17,7 Monate; p=0,44). In der sogenannten OPUS-Studie wurde der Effekt von Cetuximab in Kombination mit einer FOLFOX-Therapie betrachtet (FOLFOX, n=168 vs. FOLFOX+Cetuximab, n=169) (Bokemeyer et al., 2009). Es zeigte sich bei der Zugabe von Cetuximab zur FOLFOX-Therapie eine Verbesserung der Ansprechrate (61% vs. 37%, p=0.011) und des PFS (7,7 Monate vs. 7,2 Monate, HR=0,57; p=0,163) bei KRAS- Wildtyp-Tumoren. Bei den Karzinomen mit einer KRAS-Mutation hingegen zeigte sich im Therapiearm mit Cetuximab+FOLFOX ein tendenziell schlechteres Ansprechen (33% vs. 49%, p=0,106) und ein verringertes PFS (5,5 vs. 8,6 Monate; HR=1,830; p=0,192). Wie aus den beiden Studien ersichtlich wird, kommt es durch den monoklonalen Antikörper Cetuximab nur bei KRAS-Wildtyp-Tumoren zu einem gewünschten positiven Effekt. Aus diesem Grund ist die Zulassung beschränkt auf Patienten mit einem KRAS-Wildtyp-Status des Tumorgewebes. Hingegen konnte die Verbesserung des Überlebens durch Cetuximab bei Patienten mit Wildtyp-KRAS exprimierendem Tumor sowohl in der COIN-Studie (Maughan et al., 2010) als auch in der Nordic-Studie (Tveit et al., 2011) nicht bestätigt werden. Eine Ursache dafür können verschiedene Chemotherapiekombinationen sein. Cetuximab scheint mit infusionalem 5-FU und mit Irinotecan besser synergistisch zu wirken als mit oralem 5-FU und/oder Oxaliplatin (Maughan et al., 2010; Tveit et al., 2011). Zudem wurde die Addition von Cetuximab zu einer Kombination aus Capecitabine, Oxaliplatin und Bevacizumab als Erstlinientherapie beim KRK untersucht. Die Kombination beider Antikörper hat in der CAIRO2-Studie (CAPOX/Bevacizumab±Cetuximab) zu einer signifikanten Verschlechterung des PFS geführt (Punt et al., 2008), so dass die Kombination zweier monoklonaler Antikörper beim KRK derzeit nicht zu empfehlen ist. Bei Progress unter einer Erstlinientherapie sollte zu einem alternativen Therapieprotokoll gewechselt werden. Für die Auswahl der Zweitlinientherapie sind die chemotherapeutische Vorbehandlung, die therapiefreie Zeit, das

19 Therapieziel sowie die individuelle Patientensituation entscheidend. Grundsätzlich stehen aufgrund der zunehmenden Vielfalt an Medikamenten mehrere Optionen zur Auswahl. Die Therapie sollte bis zum Progress der Erkrankung durchgeführt werden. Infolge einer Erstlinientherapie gemäß dem Irinotecan-haltigen Protokoll kann im Anschluss mit einer Oxaliplatin-haltigen Therapie behandelt werden und umgekehrt (Wong et al., 1999). Durch dieses Verfahren kann in 30-70% eine Wachstumskontrolle erreicht werden (Grothey et al., 2004; Tournigand et al., 2004). Auf eine 5-FU-Monotherapie sollte eine Irinotecan-Monotherapie oder die FOLFOX- Therapie folgen (Cunningham et al., 1998; Rothenberg et al., 2003). Die Zweitlinientherapie mit Irinotecan nach Versagen einer Fluorouracil-Monotherapie erbrachte im Vergleich mit BSC oder 5FU/FS einen deutlichen Vorteil im Gesamtüberleben (Cunningham et al., 1998; Rougier et al., 1998). Ebenfalls von den Vorläufertherapien bestimmt werden die Drittlinientherapien Etablierte und potenzielle Biomarker beim kolorektalen Karzinom Mikrosatelliteninstabilität Wie bereits erwähnt, kann in 15% der KRK eine Mikrosatelliteninstabilität aufgefunden werden, zu welcher es aufgrund einer Schädigung des zellulären DNA-Mismatch-Reparatur-Systems gekommen ist. In Bezug auf die Prognose bei Vorliegen einer Mikrosatelliteninstabilität ist die Datenlage divergent. Einige zunächst publizierte Studien konnten zeigen, dass bei Patienten mit einer MSI im Stadium II und III die Prognose nach einer 5-FU-basierten Chemotherapie besser war als bei mikrosatellitenstabilen Tumoren (Hemminiki et al., 2000; Watanabe et al., 2001). In anderen Studien jedoch wiesen Patienten mit MSI-positiven Tumoren keinen Benefit von einer 5-FU-basierten Chemotherapie auf (Carethers et al., 2004). So untersuchten auch Ribic et al. den Benefit einer 5-FU-basierten adjuvanten Chemotherapie bei Patienten mit einem KRK im Stadium II oder III. Insgesamt wurden 570 Patienten in die Studie eingeschlossen, von denen 287 Patienten keine adjuvante Therapie erhielten. Patienten mit einer hochfrequenten MSI zeigten eine bessere 5-Jahres-Überlebensrate als Patienten mit einer niedrigfrequenten MSI bzw. ohne MSI (hazard ratio for death 0,31; 95%-KI: 0,14-0,72; p=0,004). In Bezug auf eine adjuvante 5-FU-basierte Chemotherapie wurde das Gesamtüberleben bei Patienten mit einer niedrigfrequenten MSI bzw. ohne

20 eine MSI verlängert (hazard ratio for death 0,72; 95%-KI: 0,53-0,99; p=0,04), bei Patienten mit einer hochfrequenten MSI zeigte sich jedoch kein Benefit (Ribic et al., 2003). In der sogenannten FOCUS-Studie von Braun et al., welche die größte Studie zu dieser Fragestellung darstellt, wurden 1628 Patienten, die adjuvant mit Irinotecan behandelt wurden, bezüglich progressionsfreiem und Gesamtüberleben untersucht. Eine MSI konnte nur selten nachgewiesen werden (4,4%). Es zeigte sich keine prognostische Relevanz bezüglich der Veränderungen der Mikrosatelliten (Braun et al., 2008) p53 Das Tumorsuppressorprotein p53 ist als Transkriptionsfaktor an der Expression von Genen beteiligt, die für die Kontrolle des Zellzyklus, der Induktion der Apoptose oder der DNA-Reparatur verantwortlich sind. Auf diese Weise inhibiert es das Wachstum genetisch alterierter und somit potentiell neoplastischer Zellen. Es hat eine Molekularmasse von 53 kda. Das zugehörige TP-53- Tumorsuppressorgen ist auf Chromosom 17p13.1 lokalisiert. Ein Verlust der Heterozygotät (loss of heterozygosity; LOH) dieses Chromosoms kann in 75% aller KRK nachgewiesen werden, eine somatische Mutation ist in 40-60% vorhanden (Cunningham et al., 1992; Forslund et al., 2001). Bezüglich der Prognose bei einer Mutation oder einer LOH ist die Datenlage in der Literatur kontrovers. Morrin et al. wiesen nach, dass eine Korrelation zwischen einer Mutation in p53 weder mit dem UICC-Stadium, noch der Tumordifferenzierung oder dem 5-Jahres-Überleben besteht (Morrin et al., 1994). In anderen Studien hingegen wurde belegt, dass eine p53-mutation einen negativen Effekt auf die Prognose beim KRK erzielt. In der Untersuchung von Pricolo et al. beispielsweise betrug das 5-Jahres-Überleben bei Patienten ohne Mutation 75% und bei einer vorhandenen TP53-Mutation 21% (p=0.01) (Pricolo et al., 1996) SMAD4 Wie bereits erwähnt, ist ein weiteres wichtiges Tumorsuppressorgen das SMAD4, welches auf dem langen Arm des Chromosoms 18 an der Stelle 18q21.1 lokalisiert ist. Es sind acht verschiedene SMAD-Gene und Proteine bekannt,

21 welche in drei verschiedenen funktionellen Gruppen klassifiziert werden: Die Rezeptor regulierten R-SMADs, die inhibitorischen I-SMADs sowie die commonmediator Co-SMADs, dessen einziger Vertreter das SMAD4 ist. Dieses spielt eine zentrale Rolle im TGF-beta-Signalweg. SMAD4 hat so einen Einfluss auf Zellproliferation, Zelldifferenzierung, Zellmigration, Zellzykluskontrolle, Apoptose, Angiogenese, Immunmodulation sowie Zell-Zell-Kontakte und die extrazelluläre Matrix. Eine Reihe von genetischen und zellbiologischen Arbeiten konnten SMAD4 als Tumorsuppressorprotein im Kolon etablieren (Schwarte-Waldhoff, 2003). Einer Studie von Salovaara et al. zufolge war keine SMAD4-Expression in 20 von 53 unselektierten KRK auffindbar (38%). Eine reduzierte Expression fand in weiteren 15 KRK statt (28%). Somit liegt der Schluss nahe, dass eine Abwesenheit von SMAD4 bzw. eine reduzierte Expression eine entscheidende Rolle bei der Entstehung von KRK spielt (Salovaara et al., 2002). Auch im menschlichen Kolongewebe konnte gezeigt werden, dass der SMAD4-Verlust entlang der Progression hin zu invasiven und metastasierten Stadien zunimmt (Miyaki et al., 1999; Maitra et al., 2000; Reinacher-Schick et al., 2004). Alazzouzi et al. untersuchten 86 Patienten mit einem KRK im Stadium UICC III. Patienten mit einer hohen SMAD4-Expressionsrate zeigten ein signifikant längeres Überleben als Patienten mit einer niedrigen Expression (p 0,025) (Alazzouzi et al., 2005). In Bezug auf die adjuvante Therapie konnte gezeigt werden, dass Patienten mit einer normalen SMAD4-Expression bei einer 5-Fluorouracilbasierten Chemotherapie sowohl beim Gesamtüberleben als auch beim progressionsfreien Überleben mehr profitierten (Boulay et al., 2002) Die Rolle der KRAS- und BRAF-Mutationen beim kolorektalen Karzinom Zu der Familie der RAS-Protoonkogene gehören KRAS, NRAS und HRAS. Die RAS-Protoonkogene kodieren für kleine, monomere Guaninnucleotid-bindende Proteine (G-Proteine) mit einem Molekulargewicht von 21 kda. RAS-Onkogene sind wichtig für das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung (Wittinghofer und Pai, 1991; Bazan et al., 2002). Die RAS-Proteine sind eine zentrale Komponente bestimmter mitogener Signalkaskaden, besonders für die Zellproliferation, die an Rezeptoren (insbesondere EGFR) zur Wachstumsstimulation beginnen und im Zellkern ihr Ende finden (Egan et al., 1993). Zunächst wird nach

22 Aktivierungsschritten durch Wachstumsfaktoren RAS in einen aktiven Zustand gewandelt. Das aktive GTP-RAS aktiviert die MAP-Kaskade: Die RAF-Kinase wird durch Bindung an das GTP-RAS aktiv und aktiviert durch Phosphorylierung die MAP-Kinase-Kinase (MEK). Diese wiederum phosphoryliert die MAP-Kinase, welche in dem nun aktiven Zustand für den Übergang in den Zellkern verantwortlich ist. ELK-1, ein Transkriptionsfaktor, wird aktiviert und das FOS-Gen transkribiert, wodurch das FOS-Protein entsteht. Dieses bildet mit dem JUN- Protein einen Komplex, der als AP1 bezeichnet wird. Durch den AP1-Komplex können weitere Gene, die für die Zellproliferation wichtig sind, aktiviert werden. In erster Linie sind diese in der Mitose bei dem Übergang der G1- in die S-Phase von Bedeutung. Im Allgemeinen treten Mutationen im RAS-Gen bei circa 30% aller humanen Tumoren auf, jedoch mit einer ziemlich variablen Inzidenz bei den verschiedenen Krebsarten. Im KRK liegt eine KRAS-Gen-Mutation mit einer Häufigkeit von circa 30-40% vor (Kampman et al., 2000; Bleeker et al., 2001; Esteller et al., 2001; Bazan et al., 2002; Di Nicolantonio et al., 2008). Bei Adenomen unter einem Zentimeter treten in weniger als 10% KRAS-Mutationen auf und bei größeren Adenomen und Karzinomen konnten in bis zu 50% der Fälle Veränderungen im RAS-Gen nachgewiesen werden (Vogelstein et al., 1988). Über 90% der Mutationen wurden im Kodon 12 und 13 gefunden, seltener sind Mutationen im Kodon 61 (Bazan et al., 2002). Die Mutationen haben eine Veränderung des Proteins mit einer reduzierten GTPase-Aktivität und einer verringerten Interaktion mit GTPase-aktivierendem Protein (GAP) zur Folge, was zu einer vermehrten Aktivität der Signalkaskade führt. In Bezug auf die Adenom-Karzinom-Sequenz wird die RAS-Mutation in die frühe Phase der Adenomentstehung eingeordnet und ist in erster Linie für die Progression zum größeren Adenom verantwortlich (Vogelstein et al., 1988). Eine weitere wichtige Rolle in dem RAS/RAF/MEK/MAP-Signalweg kommt beim KRK dem BRAF-Gen zu. Bei den RAF-Proteinen (rapidly growing fibrosarcoma) handelt es sich um Serin-Threonin-Proteinkinasen. Es gibt die Isoformen ARAF, BRAF und CRAF. Davies hat als Erstbeschreiber 2002 berichtet, dass eine BRAFmissense-Mutation mit einer Häufigkeit von 66% in malignen Melanomen und mit einer geringeren Häufigkeit in einer Vielzahl anderer Tumoren vorkommt (Davies et al., 2002)

23 In der Literatur wird das Vorkommen einer BRAF-Mutation mit einer Häufigkeit von circa 5-10% beschrieben (Davies et al., 2002; Fransen et al., 2004; Di Nicolantonio et al., 2008; Lièvre et al., 2010). So explorierten Fransen et al. in einer Studie das Vorkommen einer BRAF-Mutation in 130 kolorektalen Tumoren. Es zeigte sich eine Häufigkeit von 11,5% (Fransen et al., 2004). In der Studie von Di Nicolantonio et al. wurden 113 Patienten mit einem mkrk untersucht. Mit einer Häufigkeit von 9,7% aller 113 Patienten konnte eine BRAF-Mutation nachgewiesen werden. Ein mutiertes BRAF trat in 11 von 79 Patienten mit einem KRAS-Wildtyp auf (13,9%) (Di Nicolantonio et al., 2008). Es konnte gezeigt werden, dass eine Mutation im BRAF- und KRAS-Gen nicht gleichzeitig vorkommt (Fransen et al., 2004). So fand man in einer Studie in 4 von 43 Tumoren (9,3%) eine BRAF-Mutation und in 13 weiteren Tumoren (30,2%) eine KRAS-Mutation (Yoshitake et al., 2007). Ebenso scheint es eine Korrelation mit einer Mikrosatelliteninstabilität zu geben. Samowitz et al. zeigten, dass in 5% mikrosatellitenstabiler Tumoren und in 51,8% mikrosatelliteninstabiler Karzinome eine BRAF-Mutation vorhanden war. Auch Fransen et al. fanden eine signifikante Korrelation zwischen einer BRAF-Mutation und einer Mikrosatelliteninstabilität (Fransen et al., 2004). In mikrosatellitenstabilen Tumoren korreliert diese BRAF- Mutation mit einem schlechten Gesamtüberleben und dem Hypermethylierungsphänotyp (CIMP, CpG Island Methylator Phenotype) (Samowitz et al., 2005). Bezugnehmend auf den Hypermethylierungsphänotypen konnte auch in einer anderen Untersuchung gezeigt werden, dass CIMP mit einer hohen Rate an Mikrosatelliteninstabilität sowie BRAF-Mutationen assoziiert ist (Ogino et al., 2007) KRAS und Prognose Ob KRAS-Mutationen mit einer schlechten Prognose, der Invasionstiefe, dem Tumorstadium, der Lokalisation und dem Gesamtüberleben bei Patienten mit KRK korreliert sind, ist nicht vollständig geklärt (Finkelstein et al., 1993; Troungos et al., 1997; Cerottini et al., 1998; Samowitz et al., 2000). Der Zusammenhang von Tumorstadium und KRAS-Mutation wurde schon zu früher Zeit untersucht. So führten Oliva et al. beispielsweise bereits 1990 eine Studie bei 58 Patienten mit einem KRK durch. Es wurde eine KRAS-Mutation in 24,1% (14 Fälle)

24 nachgewiesen. Ein Zusammenhang zwischen einer Mutation und dem Tumorstadium konnte nicht gezeigt werden (Oliva et al., 1990) wurde in einer Studie von Troungos et al. zwar eine positive Korrelation zwischen dem Vorhandensein einer KRAS-Mutation und der Invasionstiefe des Tumors nachgewiesen, zwischen der Mutation und den regionalen Lymphknotenmetastasen aber kein Zusammenhang gefunden (Troungos et al., 1997). Bezüglich der Prognose kamen viele Studien zu dem Ergebnis, dass das Vorhandensein einer KRAS-Mutation mit einem verkürzten Überleben verbunden ist und somit der KRAS-Status ein möglicher Prognosefaktor sein könnte. In einer Studie von Lee et al. wiesen Patienten mit mutierten KRAS-Genen im UICC-Stadium I und II ein verkürztes Gesamtüberleben im Vergleich zu Patienten ohne Mutationen auf. Das relative Mortalitätsrisiko bei diesen Stadien betrug ungefähr 95%. Aus diesem Grund ist möglicherweise besonders in den frühen Stadien das Vorliegen einer KRAS-Mutation ein Prognosefaktor bezüglich des Überlebens (Lee et al., 1996). Auch Ahnen et al. konnten nachweisen, dass KRAS-Mutationen im UICC-Stadium II mit einer schlechten Prognose einhergehen. So betrug das 7-Jahres-Überleben in dieser Studie bei Patienten mit Mutationen 58% und bei der Kontrollgruppe 86%. Die Hazard ratio (HR) in Bezug auf das Sterben betrug 4,5 (95%-KI: 1,7-12,1; p=0,012) (Ahnen et al., 1998). Samowitz et al. untersuchten in einer großen Studie 1413 Patienten mit einem kolorektalen Karzinom und konnten in 32% der Tumoren eine KRAS-Mutation nachweisen. Eine KRAS-Mutation im Kodon 13 war verbunden mit einer erhöhten Mortaliät von 40% (95%-KI: 0,95-2,0) (Samowitz et al., 2000). Winder et al. untersuchten 342 Patienten mit einem KRK. Eine KRAS-Mutation wurde mit einer Häufigkeit von 28% nachgewiesen und es konnte gezeigt werden, dass Patienten mit einer Mutation im Kodon 12 (G12V-Mutation) ein signifikant kürzeres Gesamtüberleben aufwiesen als Patienten mit einem Wildtypen (HR=2,56 (1,15-5,69)). Bei Nachweis anderer Mutationen hingegen zeigte sich ein verbessertes Gesamtüberleben im Vergleich zu Wildtyppatienten (HR=0,44-0,99) (Winder et al., 2009). Auch in Hinblick auf den Einfluss von KRAS auf den Therapieerfolg gehen die Meinungen in der Literatur auseinander. Interessanterweise profitieren sowohl Patienten mit Tumoren im Stadium II als auch Patienten mit einer KRAS-Mutation im Stadium III gemäß einer Studie von

25 Ahnen et al. nicht von einer adjuvanten 5-FU-basierten Chemotherapie (Ahnen et al., 1998). In einer neueren Arbeit der Quasar Collaborative Group hingegen wurde bei 3239 Patienten mit einem KRK im Stadium II, die entweder mit Fluorouracil und Folinsäure (n=1622) behandelt oder der reinen Beobachtung (n=1617) unterzogen wurden, eine signifikant höhere Sterberate bei der reinen Beobachtung gesehen (370 Todesfälle vs. 311 Todesfälle, 95%-KI: 0,70-0,95, p=0,008). Auch die Rezidivrate war bei den Patienten, die keine Chemotherapie erhielten, signifikant höher (359 Rezidive vs. 293 Rezidive, 95%-KI: 0,67-0,91, p=0,001) (Quasar Collaborative Group, 2007). In der Studie von Ahnen et al. wurde als Weiteres die Prognose in Abhängigkeit von dem KRAS-Status untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass das 7-Jahres-Überleben beim Wildtyp- KRAS im Stadium III allerdings durch die 5-FU-basierte Chemotherapie positiv im Vergleich zu KRAS-mutierten Tumoren beeinflusst wird. In anderen Studien wurde hingegen kein Zusammenhang zwischen dem klinischen Benefit und einer KRAS- Mutation bei adjuvant behandelten KRK gezeigt (Westra et al., 2005; Fuchs et al., 2009). Bezüglich des Zusammenhangs einer adjuvanten FOLFOX-Therapie und der Prognose bei KRAS-Mutationen sind derzeit keine Studien publiziert. Beim mkrk ist die Datenlage bei der Frage der Korrelation des KRAS-Status und des Therapieansprechens ebenso nicht eindeutig. Während in der Studie von Rosty et al. keine signifikante Korrelation zwischen einem Ansprechen auf die palliative Chemotherapie mit 5-FU und KRAS-Mutationen gesehen wurde (Rosty et al., 2001) und ebenso in der Studie von Ince et al. bei Mutationen im KRAS-Gen beim mkrk keine Lebensverlängerung durch die Zugabe von Bevacizumab zu IFL (Irinotecan+5-FU+Leucovorin) erreicht wurde (Ince et al., 2005) und auch in einer Studie von Ogino et al. keine signifikante Korrelation zwischen dem KRAS- Status und dem Ansprechen auf eine Therapie mit Gefitinib gezeigt werden konnte (Ogino et al., 2005), war in einer anderen Studie hingegen bei Patienten, die eine palliative Therapie mit CPT-11 (Irinotecan) nach Therapieversagen von 5-FU- Kombinationen erhielten, bei KRAS-positiven Tumoren eine signifikant schlechtere Prognose zu beobachten (Nemunaitis et al., 1997). Einen wichtigen Beitrag zum Therapieverhalten bei KRAS-Mutationen konnten die OPUS- und die CRYSTAL-Studie leisten, welche ebenfalls zeigen, dass eine KRAS-Mutation mit einem schlechteren Therapieansprechen assoziiert ist

26 In der OPUS-Studie wurde der Effekt von Cetuximab in Kombination mit einer FOLFOX-Therapie betrachtet (FOLFOX, n=168 vs. FOLFOX+Cetuximab, n=169) (Bokemeyer et al., 2009). Bei Kombination von FOLFOX und Cetuximab zeigte sich bei KRAS-Wildtyp-Tumoren eine Verbesserung der Ansprechrate (61% vs. 37%, p=0,011) und des PFS (7,7 Monate vs. 7,2 Monate, HR=0,57; p=0,163) im Vergleich zur alleinigen FOLFOX-Therapie. Bei Karzinomen mit einer KRAS- Mutation hingegen zeigte sich im Therapiearm mit Cetuximab+FOLFOX ein tendenziell schlechteres Ansprechen im Vergleich zur alleinigen Chemotherapie (33% vs. 49%, p=0,106). Ein gleiches Ergebnis zeigte sich in der neueren OPUS- Studie, bei der neue Gewebeproben untersucht wurden (Bokemeyer et al., 2011). Durch die Zugabe von Cetuximab zu FOLFOX-4 ergab sich bei Patienten mit KRAS-Wildtyp ein verlängertes progressionsfreies Überleben (HR=0,567; p=0,0064) und eine Verbesserung der Ansprechrate (OR=2,551, p=0,0027). In der CRYSTAL-Studie wurden 599 Patienten mit einem mkrk mit dem FOLFIRI-Protokoll behandelt und 599 Patienten mit FOLFIRI plus Cetuximab (van Cutsem et al., 2009). Bei Patienten mit einem Wildtyp-KRAS zeigte sich ein verlängertes progressionsfreies Überleben bei der Zugabe von Cetuximab (9,9 vs. 8,7 Monate; HR=0,68; 95%-KI: 0,50-0,94) und ein tendentiell verlängertes Gesamtüberleben (24,9 vs. 21,0 Monate, HR=0,84; 95%-KI: 0,64-1,11). Werden nur Patienten mit KRAS-Mutationen betrachtet, besteht sowohl beim progressionsfreien Überleben (FOLFIRI+Cetuximab: 7,6 vs. FOLFIRI: 8,1 Monate; p=0,07) als auch bei dem Gesamtüberleben (17,5 vs. 17,7 Monate bei FOLFIRI alleine; p=0,44) kein Vorteil durch die Addition von Cetuximab. Zu einem ähnlichen Ergebnis kam auch die wesentlich kleinere Studie von Lièvre et al., in welcher bei 13 von 30 Patienten mit einem mkrk Mutationen im KRAS-Gen gefunden werden konnten. Es erfolgte eine Therapie mit Cetuximab, wobei bei den 11 Respondern bei keinem Patienten eine KRAS-Mutation vorhanden war. Bei 19 Patienten mit einer Resistenz gegen Cetuximab hingegen konnte in 68,4% der Fälle eine Mutation nachgewiesen werden (Lièvre et al., 2006). Es wurde ebenso in den nächsten beiden genannten Studien gezeigt, dass bei Vorhandensein einer KRAS-Mutation das Therapieansprechen oder die Prognose schlechter sind. In der Studie von Di Nicolantonio et al. wiesen 30% von 113 untersuchten Patienten eine KRAS-Mutation auf. Eine Resistenz bezüglich der Therapie mit Cetuximab oder Panitumumab konnte signifikant nachgewiesen werden (p=0,011) (Di Nicolantonio et al., 2008). In der Studie von Amado et al. wurde eine

27 Panitumumab-Therapie in Abhängigkeit von dem KRAS-Status untersucht. Es stellte sich heraus, dass das progressionsfreie Überleben bei Patienten mit einem KRAS-Wildtyp-Status signifikant besser war als bei einem mutierten KRAS (95%- KI: 0,34-0,59 vs. 95%-KI: 0,73-1,36, p 0,0001) (Amado et al., 2008). Studien, die den Zusammenhang zwischen dem KRAS-Status und dem Ansprechen auf eine oxaliplatinhaltige Therapie bei einem KRK im UICC Stadium IV untersuchen, waren bislang rar. Im Verlauf der Erstellung dieser Arbeit wurde die MRC FOCUS Studie publiziert. Diese zeigte, dass eine KRAS- oder BRAF- Mutation zwar mit einem schlechteren Gesamtüberleben (95%-KI: 1,20-1,65, p 0,0001) und einem verringerten progressionsfreien Überleben (95%-KI: 1,00-1,36, p=0,05) zusammenhänge, durch eine Mutation das Ansprechen auf eine Irinotecan- oder Oxaliplatintherapie allerdings nicht beeinflusst werde. Somit profitierten Patienten mit einem mutierten KRAS oder BRAF ebenso von einer solchen Therapie (Richman et al., 2009). Eine weitere Studie zu einer Oxaliplatintherapie ist die CAIRO-Studie, welche untersuchte, ob es bei einer sequentiellen oder kombinierten Gabe von Capecitabine, Irinotecan und Oxaliplatin einen Unterschied im Therapieansprechen gibt. Es konnte gezeigt werden, dass die Art der Gabe das Gesamtüberleben nicht wesentlich beeinflusst (Koopman et al., 2007) BRAF und Prognose In Bezug auf die Prognose eines KRK liegen bisher weniger Studienergebnisse in Korrelation mit BRAF als für KRAS vor, die verschiedenen Ergebnisse divergieren jedoch auch hier. Hinsichtlich der Inzidenz und dem prognostischen Einfluss von Biomarkern beim KRK untersuchten Roth et al Gewebeproben der adjuvanten PETACC 3-Studie von Van Cutsem et al. mit 3278 Patienten. Für den Tumormarker BRAF wurden keine signifikanten Unterschiede bezüglich des Vorkommens in den einzelnen Tumorstadien gefunden. Eine Mutation in BRAF wurde sowohl im Stadium II als auch im Stadium III mit 8% evaluiert. Auch in Bezug auf die Prognose zeigte sich kein signifikanter Unterschied (BRAF: St. II: p=0,89, St. III: p=0,26) (Roth et al., 2010). Demgegenüber ist allerdings eine Studie publiziert, in welcher Patienten mit einer BRAF-Mutation ein signifikant schlechteres Gesamtüberleben hatten als Patienten mit BRAF-Wildtyp (median