Einfluss einer zielgerichteten Aufnahme von Impfantigenen durch dendritische Zellen auf die Aktivierung von T-Zellen

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1 Dissertation Einfluss einer zielgerichteten Aufnahme von Impfantigenen durch dendritische Zellen auf die Aktivierung von T-Zellen Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaft (Dr. rer. nat.) Abteilung für Molekulare und Medizinische Virologie Prof. Dr. med. K. Überla Institute für Hygiene und Mikrobiologie Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Thomas Niezold Bochum, 1. Dezember 2014

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3 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Danksagung Abkürzungsverzeichnis iv v 1 Zusammenfassung 1 2 Einleitung Das Immunsystem Die Rolle der dendritischen Zellen Subpopulationen der dendritischen Zellen Induktion einer Antigen-spezifischen Immunantwort Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz DZ adressierende Vakzine Protein-basierende Vakzine Gen-basierende Vakzine Regulatorische T-Zellen Allgemeine Funktion Rolle bei viralen Infektionen Zielsetzung der Arbeit Materialien Versuchstiere Bakterienstämme Zelllinien Nukleinsäuren Plasmide Oligonukleotide Peptide Antikörper Antikörper für ELISA, Western Blot und Zellseparation Antikörper für FACS basierende Analysen Enzyme Protein-Größenstandards und DNA-Längen-Standards Reagenzien und Lösungen Lösungen i

4 Inhaltsverzeichnis Molekularbiologische Lösungen Medien in der Zellkultur Reagenzsysteme Verbrauchsmaterialien Technische Ausstattung Methoden Molekularbiologische Methoden Polymerase-Ketten-Reaktion Hitzeschocktransformation von Bakterien Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterien Konzentrationsbestimmung von DNA Restriktionsverdau Ligation von DNA Fragmenten Agarose-Gelelektrophorese Gelextraktion Bestimmung des Endotoxingehalts von Plasmid-Präparationen Proteinbiochemische Methoden SDS-PAGE Western Blot Antikörperaufreinigung aus Zellkulturüberständen Zytologische Methoden Kultivierung von Zelllinien Einfrieren und Auftauen von Zelllinien Transfektion mit Polymeren Durchflusszytometrie Bindungstest der DEC205-spezifischen Einzelkettenantikörper Anzucht und Infektiösitätsanalyse des Influenza A Stamms PR/8/ Immunologische Methoden Immunisierung von Mäusen DNA-Elektroporation Peptid-Immunisierung Asthma-Modell Lungenfunktionsanalyse DEREG-Modell Blutentnahme und Serumisolation Isolierung von Lymphozyten Aus der Milz und Lymphknoten Aus dem Blut Aus der Lunge Intrazelluläre Zytokinfärbung Detektion von regulatorischen T-Zellen T-Zellproliferationsnachweis in vitro mittels CFSE Färbung Magnetische Zellseparation ii

5 Inhaltsverzeichnis Diabetes-Modell Durchflusszytometrischer Antikörpernachweis Mikroneutralisationstest ELISA ELISA zur Antikörperbestimmung ELISA zur Zytokinbestimmung Influenza A Virus-Infektionsmodell Influenza-Nachweis mittels quantitativer reverser Transkriptase PCR Histologische Färbung von Lungenschnitten Ergebnisse DEC205 Adressierung des Antigens beeinflusst T-Zellaktivierung Analyse der verwendeten Expressionsplasmide Der Einfluss der direkten Adressierung des Antigens auf die Immunantwort Koapplikation eines genetischen Adjuvans zur Modulation der Immunantwort Direkte Adressierung des Antigens im transgenen Maus Modell Analyse der suppressiven Eigenschaften von induzierten Treg Analyse der suppressiven Eigenschaften von induzierten Treg im Diabetes-Modell in vivo Schicksal von transferierten Antigen-spezifischen T-Zellen Modulation von Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen und deren Einfluss auf die Aktivierung von Effektor T-Zellen in vivo Prophylaktische und therapeutische DNA-Immunisierung in einem Asthma-Modell Verifizierung der reduzierten Immunantwort mit dem gekoppelten OVA Antigen Einfluss der direkten Adressierung des Antigens auf die Ausprägung eines asthmatischen Phänotyps Einfluss von Treg auf die Immunantwort nach einer IAV Infektion Der Einfluss einer subletalen IAV Infektion auf die Funktion der Treg Auswirkung der Treg Depletion auf die Immunantwort nach einer IAV Infektion Diskussion 87 Abbildungsverzeichnis 97 Literaturverzeichnis 99 Lebenslauf 126 iii

6 Danksagung Danksagung Mein ganz besonderer Dank geht an Prof. Matthias Tenbusch für die nie endende Geduld und Hilfsbereitschaft. Seine Unterstützung bei der Verwirklichung von eigenen Ideen sowie seine Diskussionsbereitschaft trugen zu einer deutlichen Bereicherung dieser Arbeit bei. Für die Vergabe des interessanten Themas und dem Interesse an dem steten Fortschritt der Arbeit möchte ich Herrn Professor Klaus Überla danken. Ebenfalls möchte ich mich bei meinem Korreferenten, Prof. Albrecht Bufe, für die Übernahme dieser Verantwortung bedanken. Was die zahlreichen Tiefs dieser Arbeit erst erträglich machte, waren die vielen schönen Abende beim Doppelkopf spielen, auf dem Weihnachtsmarkt, beim Grillen, auf Entspannungstour im Sauerland oder einfach nur ein kühles Feierabendbier nach einem frustrierendem Tag. Vielen lieben Dank speziell an Bianca, Lena, Bettina, Anna, Camilla, Michael, André und Bastian. Weiterhin möchte ich mich bei André, Michael, Manuela, Camilla und Alexa bedanken, die sich mit meinem außergewöhnlichen Schreibstil auseinandergesetzt haben und es trotz dessen nicht Leid waren Passagen mehrfach zu lesen. Durch eure Anmerkungen und Verbesserungsvorschläge konnte die Arbeit überhaupt erst in dieser vorliegenden Form zu Papier gebracht werden. Vielen Dank natürlich auch an alle anderen Mitarbeiter des Lehrstuhls für das tolle und konstruktive Arbeitsklima. Dabei möchte ich Klaus, Regina, Martina, Rosemarie, Heike, Annika und Ulrich besonders hervorheben, die durch ihre produktive Unterstützung mir so manchen Arbeitstag ungemein erleichterten. Auch möchte ich einen Dank an meine Freunde aussprechen, insbesondere Eva, Christina, Frank, Bianca, Camilla und Silke, die mich in meiner Freizeit von der Arbeit ablenken konnten, wodurch ich neue Kraft und Motivation schöpfte. An dieser Stelle möchte ich mich bei meiner immer größer werdenden Familie bedanken, die mich während dieser Zeit immer moralisch unterstützten und am Fortschritt dieser Arbeit interessiert waren, auch wenn sie nicht alles verstanden. iv

7 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis µ Mikro (v/v)... Volumenprozent (w/v).. Gewichtsprozent % Prozent E. coli.. Escherichia coli et al..... am..... und andere alveolare Makrophagen ANOVA analysis of variance APC... Allophycocyanin APS.... Ammoniumperoxidsulfat ATP.... Adenosintriphosphat AU.... verfahrensdefinierte Einheit B BAL... Blutentnahme Bronchoalveoläre Lavage BSA.... Bovine Serum Albumin C c CD..... Challenge Zenti cluster of differentiation cdna.. komplementäre DNA CFSE... Carboxyfluoresceinsuccinimidylester CHO... chinese hamster ovary CIP.... DA.... Da..... calf instestine phosphatase Depletionsanalyse Dalton DEAE.. Diethylaminoethylcellulose DEREG depletion of regulatory T cells DMEM. Dulbecco s Modified Eagle s Medium DMSO. Dimethylsulfoxid ds DT..... DZ..... EAE... doppelsträngig Diphtherietoxin dentrische Zellen experimentelle allergische Enzephalomyelitis EDTA.. Ethyldiamintetraessigsäure ELISA. enzyme linked immunosorbent assay ER..... EZ..... FACS.. endoplasmatisches Retikulum extrazelluläre fluorecence-activated cell sorter FCS.... Fetal Calf Serum FITC... Fluoresceinisothiocyanat g Gramm GFP.... Grün-fluoreszierendes Protein GL..... h Glukoselevel Stunde H&E... Hämatoxylin & Eosin HA.... HBSS.. Hämagglutinin Hank Balanced Salt Solution HEK... human embryo kidney v

8 Abkürzungsverzeichnis HEPES. 2-Ethansulfonsäure IAV.... Influenza A Virus ICOS... induzierbarer Kostimulator ICS.... Ig intracellular cytokine staining Immunglobulin IVR.... in vitro Restimulation IZ k l LB..... intrazelluläre Kilo Liter lysogeny broth LuFu... Lungenfunktionsmessung m m Meter Milli MDCK. Madin-Darby canine kidney MDSC. MHC.. min.... Minuten myeloid-abstammende Suppressorzelle Haupthistokompatibilitätskomplex MTT... 3-(4,5-Dimethylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid n Nano OVA... Ovalbumin P Präparation PAGE.. Polyacrylamid-Gelelektrophorese PAMP.. Pathogen-assoziierte Molekülstruktur PAS.... Periodic Acid Schiff PBS.... Phosphat Buffered Saline PCR... Polymerase-Ketten-Reaktion PD-1... programmed death-1 PE..... PEI.... Phycoerythrin Polyethylenimin PerCP.. Peridinin-Chlorophyll PFU.... Plaque-bildende Einheit RSV.... respiratorischer Synzytial Virus S Sensibilisierung SDS.... Natriumdodecylsulfat TAE.... TrisAcetat-EDTA TBE.... Tris-Borat-EDTA TEMED qrt.... quantitative Reverse Transkriptase N,N,N,N,-Tetramethylethylendiamin TfH.... follikuläre T-Helferzellen Th..... T-Helferzellen TLR.... Toll-like Rezeptor TM.... TNF... transmembran Tumornekrosefaktor Treg.... regulatorische T-Zellen TZA... T-Zellanalyse TZR.... T-Zellrezeptor u.a..... UV..... V VB..... xg ZA..... ZT..... unter anderem ultraviolett Volt virale Beladung fache Zentrifugalkraft Zellanalyse Zelltransfer C..... Grad Celsius vi

9 1 Zusammenfassung 1 Zusammenfassung Dendritische Zellen (DZ) spielen eine Schlüsselrolle bei der Induktion einer Immunantwort. Die direkte Adressierung eines Antigens an den Endozytoserezeptor DEC205 auf DZ führt zu einer verbesserten Antigenpräsentation. Durch die Kombination eines Protein-gekoppelten αdec Antikörpers mit einem Reifungsstimulus für DZ wird eine starke Pathogen-spezifische Immunantwort stimuliert, während in Abwesenheit eines Adjuvans die periphere Toleranz induziert wird. Da bisher nur wenig über DNA Vakzine, die für DEC205-spezifisch Antigen kodieren, bekannt ist, soll in dieser Arbeit deren Einfluss auf das Schicksal Antigen-spezifischer T-Zellen und deren Beteiligung an der Immunität untersucht werden. Die Kopplung von Hämagglutinin an einen Einzelkettenantikörper (EAk), der gegen DEC205 gerichtet ist, führte zu einer erhöhten MHC-II Präsentation und einer verstärkten Proliferation von Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen. Die Präsentation auf MHC-I war ebenfalls erhöht, zeigte aber keine Verbesserung in der Immunantwort gegenüber dem Kontrollkonstrukt. Trotz erhöhter Antigenpräsentation induzierte die DZ-gerichtete DNA-Immunisierung eine geringere zelluläre Immunantwort als das Kontrollkonstrukt. Selbst die Koapplikation des Th1 stimulierenden Zytokines IL-12 hatte keinen Einfluss auf die reduzierten T-Zellantworten. Die induzierten Antikörper aus beiden Gruppen zeigten unabhängig von der IL-12 Koapplikation keine neutralisierenden Eigenschaften auf. Auf Grund der Infiltration von aktivierten T-Lymphozyten in das Lungengewebe entwickelte die Kontrollgruppe deutlich höhere Immunantworten gegen eine Infektion mit dem homologen Influenza A Virus, als die DEC-Gruppe, die zwar die virale Beladung reduzieren konnte aber trotzdem einen vergleichbaren Krankheitsverlauf besaß, wie die naive Gruppe. Sowohl in TCR-transgenen Mäusen, als auch nach einem adoptiven Transfer von Antigen-spezifischen T-Zellen, konnte eine Induktion von regulatorischen T-Zellen nach DZ-gerichteter Immunisierung beobachtete werden. Dieser Effekt war lokal begrenzt und nahm mit zunehmender Entfernung zur Immunisierungsstelle ab. Dabei konnten die suppressiven Eigenschaften nicht auf das verwendete Diabetes Modell übertragen werden. Hingegen konnte die prophylaktische DNA-Immunisierung mit den EAk-Konstrukten im Asthma Modell die Ausbildung des asthmatischen Phänotyps unterdrücken, wobei die unterschiedlichen Konstrukte vermutlich auf verschiedene Arten wirken. Im Gegensatz dazu hat die therapeutische Applikation keinen detektierbaren Einfluss auf die bereits differenzierten Th2 Zellen und den asthmatischen Phänotyp. Die Arbeit zeigt, dass die DNA-Immunisierung mit DZ-gerichteten Konstrukten 1

10 1 Zusammenfassung eher Mechanismen der peripheren Toleranz aktiviert, als eine starke Immunogenität besitzt. Dabei bietet die prophylaktische Immunsierung eine Möglichkeit krankheitsbedingte Symptome im Asthma Modell zu lindern. 2

11 2 Einleitung 2 Einleitung 2.1 Das Immunsystem Das Immunsystem hindert Krankheitserreger daran, in den Organismus höherer Lebewesen einzudringen und entfernt Fremdorganismen sowie eigene fehlerhafte Zellen aus dem Körper. Dabei wird zwischen dem unspezifischen angeborenen und dem spezifischen adaptiven Immunsystem unterschieden. Zudem gibt es die dendritischen Zellen (DZ), die eine Brücke zwischen der angeborenen und adaptiven Immunantwort bilden. Das angeborene Immunsystem bildet die erste Front gegen Pathogene, wobei die erste Verteidigungslinie aus Epithelzellen besteht, die eine physiko-chemische Barriere bilden [97]. Nach Überwindung dieser Barriere werden die Pathogene von patrouillierenden Makrophagen/Monozyten anhand von Pathogen-assoziierten Molekülstrukturen (PAMP) erkannt [155]. Durch Bindung an den Pathogen-erkennenden Rezeptor (PRR) kommt es zu einer Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden, die eine Ausschüttung von inflammatorischen Zytokinen zur Folge haben [155, 104]. Dadurch werden neutrophile Granulozyten zum Infektionsherd gelockt, die diese Pathogene phagozytieren können. Wenn das angeborene Immunsystem die Infektion nicht bekämpfen kann, sorgt es durch die Bildung eines inflammatorischen Milieus für eine Eindämmung der Infektion und gleichzeitig für eine Aktivierung des adaptiven Immunsystems. Im Gegensatz zu der unspezifischen Erkennung von Pathogenstrukturen des angeborenen Immunsystems [95] ist das adaptive Immunsystem in der Lage zwischen einer Vielzahl von Pathogenen spezifisch zu unterscheiden, wodurch ein fein abgestimmtes Netzwerk an Immunzellen je nach Pathogen aktiviert wird. Die Schlüsselrolle spielen dabei die DZ. Dabei kann die Immunantwort nochmal in eine zelluläre und eine humorale Reaktion unterteilt werden. Durch die Aktivierung und Differenzierung von naiven CD4 T-Helferzellen (Th) findet je nach Pathogen eine Verschiebung der Immunantwort zu einer der beiden zuvor genannten Reaktionen statt. Dabei helfen ausdifferenzierte CD4 Th bei der Aktivierung von zytotoxischen CD8 T-Zellen, die wiederum infizierte Zellen erkennen und direkt eliminieren können [71, 72]. Hingegen stimuliert ein anderer CD4 T-Helferzelltyp hauptsächlich die Reifung von B-Zellen, die eine humorale Reaktion prägen und durch die Produktion von Pathogen-spezifischen Antikörpern einen indirekten Einfluss auf die Beseitigung des Eindringlings nehmen können. Im Gegensatz zur Aktivierung und Beseitigung eines eindringenden Pathogens besitzt das Immunsystem ebenfalls Mechanismen, Abwehrreaktionen gegen körpereigene Strukturen zu unterbinden. Die Eliminierung autoreaktiver T- und B- 3

12 2 Einleitung Zellen während ihrer Entwicklung wird als zentrale Toleranz bezeichnet [75]. Die Erkennung von präsentierten körpereigenen Antigenen durch sich entwickelnde T-Zellen im Thymus führt zum programmierten Zelltod der Zellen [114]. Diese negative Selektion gewährleistet eine Reifung von T-Zellen, die nicht durch Proteine des eigenen Organismus aktiviert werden. Während sich die Selektion der T-Zellen im Thymus ereignet, werden die autoreaktiven B-Zellen anhand ihrer Antikörperspezifität im Knochenmark selektioniert [83]. Durch Krankheiten oder genetische Defekte können autoreaktive Zellen der Selektion entkommen und in die Peripherie abgegeben werden. Um weiterhin den Organismus gegen diese autoreaktiven Zellen zu schützen, hat das Immunsystem periphere Toleranzmechnismen entwickelt. Dabei können die autoreaktiven Zellen z.b. in einen unreaktiven Zustand versetzt oder durch die Induktion von regulatorischen T-Zellen (Treg) supprimiert werden. 2.2 Die Rolle der dendritischen Zellen Subpopulationen der dendritischen Zellen Die dendritischen Zellen haben die Aufgabe der Antigenaufnahme und Steuerung der adaptiven Immunantwort durch Aktivierung der T-Zellantwort. Auf Grund der großen Bandbreite an unterschiedlichen DZ, die sich in Abhängigkeit ihrer Funktion, Expression von Oberflächenmarkern, Abstammung, Fähigkeit sich im Organismus zu bewegen oder des Vorkommens unterscheiden lassen, wird hier nur eine grobe Übersicht geschaffen. Die Hauptunterteilung erfolgt dabei anhand der Abstammung der DZ, wobei zwischen plasmazytoiden und konventionellen DZ unterschieden wird. Zusätzlich können durch Infektion de novo inflammatorische Monozyten-abstammende DZ ausgebildet werden [132]. Bei den konventionellen DZ wird weiterhin zwischen wandernden und örtlich begrenzten unterschieden [204]. Des Weiteren werden die DZ nach ihrem Vorkommen eingeteilt, wobei die epidermalen Langerhans-Zellen und dermale DZ in der Haut vorkommen, während die in den peripheren Lymphknoten und der Milz befindlichen DZ anhand der Expression von CD8α unterschieden werden [236]. Während für die Langerhans-Zellen die Beteiligung an einer Immunität gegen Pathogene noch nicht vollständig geklärt ist [235, 113], sind die Eigenschaften der CD8α positiven und negativen DZ besser untersucht und verstanden. Studien zeigten eine Induktion der CD4 und CD8 T-Zellantworten durch CD8α + DZ während einer bakteriellen oder parasitären Infektion [22, 150]. Des Weiteren sind CD8α + DZ hoch effizient im Prozessieren und Präsentieren über MHC-I [199, 61, 52], wodurch sie größtenteils an der Induktion von CD8 T-Zellantworten bei viralen Infektionen beteiligt sind [6, 7, 245]. Die hohe Effizienz exogene Antigene auf MHC-I zu präsentieren, kann durch die Expression von C-Typ Lektin Antigen-Rezeptoren gewährleistet werden, wie z.b. DEC205 [61], CD36 [217] oder 4

13 2 Einleitung DNGR-1 [194]. Im Gegensatz zu den CD8α + DZ sind CD8α - sehr effizient in der Phagozytose und Endozytose von exogenen Pathogenen, sowie deren Präsentation auf MHC-II [236]. Sie sind nicht in der Lage apoptotische Zellen zu internalisieren und mittels Kreuzpräsentation Antigen-spezifische CD8 T-Zellen zu aktivieren [52, 96] Induktion einer Antigen-spezifischen Immunantwort Im unreifen Zustand sind die meisten DZ in peripheren Geweben lokalisiert und nehmen Antigene in Form von Mikroben und Partikeln [92, 162, 182, 215] durch direkte Bindung an einen PRR [188] oder indirekt durch Bindung an Fc-Rezeptoren (Fcγ, Fcɛ [192]) auf. Eine weitere Möglichkeit der Antigenaufnahme stellt die Makropinozytose dar, wobei extrazelluläre Flüssigkeiten und Lösungen durch Bildung großer pinozytotischer Vesikel aufgenommen werden [193]. Durch die Interaktion mit dem Mannose-bindenden Lektin [193] oder dem endozytotischen DEC-205-Rezeptor [98] erfolgt eine Rezeptor-vermittelte Aufnahme des Antigens. Auf Grund dieser unterschiedlichen Mechanismen kann eine sehr effektive Antigenaufnahme gewährleistet werden, wobei eine Antigenkonzentration im pikobis nanomolaren Bereich ausreicht. Exogene Proteine, wie z.b. von replizierenden Mikroben [23], sterbenden oder infizierten Zellen [5], werden durch Endozytose aufgenommen und innerhalb des endosomalen Proteasoms prozessiert. Im gleichen Vesikel erfolgt dann die Beladung des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC)-II. Anschließend werden diese MHC-Peptid-Komplexe auf der Zelloberfläche präsentiert. Im Gegensatz dazu werden die endogenen Proteine, wie z.b. synthetisierte virale Proteine nach einer Infektion, aktiv durch das Proteasom im Zytosol in das endoplasmatische Retikulum (ER) transportiert. Im ER werden die MHC-I Komplexe mit jeweils einem der entstandenen Peptide beladen. Dieser MHC-Peptid-Komplex wird ebenfalls zur Präsentation an die Zelloberfläche transportiert. Zusätzlich sind bestimmte DZ in der Lage über Endozytose aufgenommene Antigene ebenfalls auf MHC-I Komplexen zu präsentieren [61]. Dieser Mechanismus wird als Kreuzpräsentation bezeichnet. Bereits 1976 wurde der Mechanismus der Kreuzpräsentation beobachtet [27, 28], wobei noch keine Aussage über den ausübenden Zelltyp getroffen werden konnte. Später wurde diese Eigenschaft den DZ und Makrophagen zugeschrieben [120, 202, 119]. Durch die fehlende Induktion von CD8 T-Zellantworten nach selektiver Depletion von CD11c + DZ, bewiesen Jung und Kollegen einen direkten Einfluss von konventionellen DZ auf die Kreuzpräsentation [102]. Der bisherige Stand der Forschung verknüpft die Kreuzpräsentation mit CD11c + konventionellen DZ, die eine hohe Expression von CD8α [53, 20, 53, 205, 21, 6] oder CD103 [17, 59] aufweisen. Des Weiteren besitzen CD8α + DZ, die eine hohe Dichte des C-Typ ähnlichen Lektins DEC205 auf der Oberfläche zeigen, eine starke Spezialisierung in der Aufnahme von sterbenden Zellen und spielen eine essentielle Rolle im Schutz 5

14 2 Einleitung gegen einige virale Infektionen, durch MHC-I Präsentation [6, 52, 96]. Außerdem wurde gezeigt, dass DZ, die über den endozytotischen DEC205-Rezeptor Antigene aufgenommen haben, sowohl CD4 als auch CD8 T-Zellen aktivieren können [61]. Neben den konventionellen CD8α + DZ können auch durch Infektion induzierte inflammatorische Monozyten-abstammende DZ eine Kreuzpräsentation aufweisen. Die Aktivierung von dendritischen Zellen erfordert neben der Antigenaufnahme ebenfalls die Erkennung eines PAMP durch PRR. Die PRR unterteilen sich unter anderem in die RIG-I-ähnlichen (RLR), die NOD-ähnlichen (NLR), die Tollähnlichen (TLR) und die C-Typ Lektin Rezeptoren (CLR). Während sich die CLR ausschließlich in der Plasmamembran befinden, kommen die RLR und NLR ausschließlich im Zytoplasma vor. Die TLR Familie ist die am Besten charakterisierte Klasse von PRR. Sie besteht aus 10 bis 15 Rezeptoren, die sich auf das Endosom und die Plasmamembran verteilen [220]. Während die TLR 1, 2, 4, 5 und 6 auf der Plasmamembran lokalisiert und auf die Erkennung von bakteriellen Produkten spezialisiert sind, erkennen die im Endosom befindlichen TLR 3, 7, 8 und 9 virale Nukleinsäuren [152, 54, 87, 141, 130, 142]. Die Bindung an einen TLR induziert eine MyD88-abhängige Signalkaskade [198], die zu einer Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB [4] und somit zu einer Expression von Zytokinen führt. Durch die Rekrutierung eines anderen Adaptorproteins (TRIF) sind die TLR 3 und 4 in der Lage einen MyD88-unabhängigen Signalweg zu aktivieren, der zur Translokation von IRF-3 führt und die Expression von IFNα/β, sowie IFNinduzierbarer Gene stimuliert [249, 241]. Neben den TLR sind auch die RLR in der Lage Genome von dsrna Viren zu detektieren und Typ I IFN zu induzieren. NLR Rezeptoren erkennen hingegen bakterielle Peptidoglykane und induzieren dadurch synergistisch mit den TLR die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen. Neben der Bindung des Pathogens an die PRR können DZ auch durch die Bindung des CD40-Liganden zur Reifung angeregt werden [40, 41]. Auch werden Kombinationen aus den proinflammatorischen Zytokinen IL-1β, IL-6 und dem Tumornekrosefaktor (TNF)-α verwendet, um reife DZ für in vitro Studien oder klinische Immunisierungsstudien zu erhalten [99]. In der Reifungsphase wandern die DZ vom peripheren Gewebe in die sekundären lymphatischen Organe (z.b. Lymphknoten, Milz), um dort vollständig auszureifen. Die Reifung der DZ führt zu einer erhöhten Expression kostimulatorischer Oberflächenmoleküle (z.b. CD80, CD86), während die Rezeptoren zur Antigenaufnahme runterreguliert werden. Die ausgereiften DZ präsentieren in den T-Zellarealen der Lymphknoten die unterschiedlichen MHC-Peptid-Komplexe. Mit Hilfe des T-Zellrezeptors (TZR) werden in den Komplexen präsentierte Peptide von T-Zellen überprüft. Die vollständige Aktivierung einer T-Zelle besteht aus mehreren Signalen. Zu Beginn sollte die Spezifität des TZR mit dem präsentierten Peptid übereinstimmen. Außerdem sollte die Bindung der Zell-Zell-Adhäsionsmoleküle (CD4 oder CD8) an den MHC-Komplex möglich sein. Dabei kann das CD8 Molekül ausschließlich an den MHC-I und das CD4 Molekül ausschließlich an den MHC-II Komplex binden. Um die T-Zelle vollständig zu aktiveren, werden kostimulatorische Signale an die T-Zelle über Liganden-Rezeptor-Interaktionen, wie z.b. CD40 Ligand/CD40 oder 6

15 2 Einleitung CD28/CD80(CD86), und eine Zytokinausschüttung gesendet. In Abhängigkeit der ausgeschütteten Zyokine erfolgt die Differenzierung der naiven CD4 Th-Zellen sowie die Aktivierung der CD8 T-Zellen. Durch den direkten Kontakt mit DZ kommt es zu einer Ausprägung von zytotoxischen T-Lymphozyten (ZTL). Diese CD8 Effektorzellen sind in der Lage infizierte Zellen anhand der Präsentation von Pathogen-abgeleiteten Peptiden in MHC-I Molekülen auf der Zelloberfläche zu erkennen und durch Freisetzung von Granzymen und Perforinen eine Apoptose in der Zielzelle zu induzieren, um diese zu eliminieren [228, 161]. Zusätzlich werden proinflammatorische Zytokine sezerniert, die eine Virusreplikation hemmen und gleichzeitig die lytische Aktivität von NK und CD8 T-Zellen erhöhen [125]. Abbildung 2.1: Mögliche Differenzierung von naiver CD4 T-Helferzelle nach Interaktion mit Antigenpräsentierenden DZ. Quelle: Adaptiert von [173] Neben der Aktivierung der CD8 T-Zellen kommt es zu einer Differenzierung von naiven CD4 T-Zellen (Abb. 2.1). Dabei hängt die Induktion des Subtyps von dem umgebenden Zytokinmilieu, den Antigen-präsentierenden Zellen, sowie den kostimulatorischen Molekülen ab [223, 9]. Für die Ausbildung von Th1 Zellen sind IL-12 und IFN-γ essentiell [230]. Dabei wird IL-12 von den APZ sezerniert, welches wiederum NK Zellen zur Produktion von IFN-γ anregt. Th1 Zellen sind an der Beseitigung von intrazellulären Pathogenen, sowie an Organ-spezifischer Autoimmunität beteiligt [49]. Hauptsächlich produzieren sie IFN-γ, IL-2 und Lymphotoxin α. Während die IFN-γ Produktion essentiell für die Aktivierung von mononukleären Phagozyten und die dadurch erhöhte phagozytotische Aktivität ist [167], wird IL-2 für die Expansion von CD8 Effektorzellen mit zytolytischer Aktivität [107, 73] und die Ausbildung von CD8 Gedächtniszellen [244] benötigt. Zusätzlich wird das sezernierte IL-2 auch von Treg für das Überleben und die Aktivierung benötigt [248]. Im Gegensatz zu den anderen sezernierten Molekülen 7

16 2 Einleitung kann die erhöhte Prodution von Lymphotoxin α, welches zur TNF Superfamilie gehört, zur Entwicklung einer experimentellen autoimmunen Encephalopathie führen [45, 212]. Die Aufnahme von extrazellulären Parasiten durch die DZ führt zu einer Differenzierung der naiven T-Zellen zu Th2 Zellen [49]. Dieser Subtyp von CD4 T-Zellen sorgt für eine bevorzugte Aktivierung der humoralen Immunantwort [166, 172]. Für die Ausprägung sind die Zytokine IL-4 und IL-2 von absoluter Notwendigkeit. Zusätzlich fördert die Sezernierung von IL-6 durch APZ die Th2 Differenzierung und hemmt gleichzeitig den Th1 Typ [56, 55]. Die ausgeprägten Th2 Zellen spielen eine Hauptrolle in der Induktion und Persistenz von allergischen Erkrankungen [207]. Dazu werden die Zytokine, wie IL-4, IL-5, IL-9, IL-13 und IL-25, produziert. Den größten Einfluss auf die Ausprägung eines allergischen Phänotyps hat dabei IL-4. Es ist unter anderem an der Produktion von IgE durch B-Zellen und der Freisetzung von aktiven Metaboliten, wie Histamin und Serotonin, beteiligt [209]. Zusätzlich induziert IL-4 weitere proinflammatorische Moleküle, wie z.b. GM-CSF oder IL6 [58]. IL-5 aktiviert eosinophile Granulozyten [151], während IL-9 einen generellen Einfluss auf Mastzellen, B-Zellen, neutrophile, sowie eosinophile Granulozyten ausübt und durch Attraktion mittels Chemokinen an der allergischen Atemwegsentzündung beteiligt ist [135]. IL-13 ist an der Beseitigung von intrazellulären Pathogenen, wie z.b. Leishmania, beteiligt, führt aber auch zur Aktivierung von eosinophilen Granulozyten, erhöhter Mucinproduktion und einer Hyperreaktivität der Atemwege. Die Sezernierung von IL-25 fördert die Th2 Differenzierung und inhibiert zugleich die Ausprägung von Th17 Zellen durch erhöhte IL-13 Expression, wodurch die Entwicklung von autoimmunen Erkrankungen zunehmen kann [115]. Ebenfalls ist IL-25 bei der Ausbildung allergischer Reaktionen durch Aktivierung von eosinophilen Granulozyten, bei der verstärkten Mucinproduktion und bei der Induktion des IgE Isotyps involviert. Neben der Ausprägung einer allergischen Erkrankung können Th2 Zellen ebenfalls IL-10 produzieren, das als antiinflammatorisches Zytokin bekannt ist. Es sorgt für die Erhaltung der Homöostase angeborener Immunzellen, sowie für die Suppression von Th1 Zellen nach der Beseitigung des Pathogens [47]. Zur Beseitigung von intrazellulären Bakterien und Pilzen können naive CD4 T- Zellen zu Th17 Zellen differenzieren [211, 106, 158]. Die Ausbildung dieses Zelltyps findet in drei Phasen statt und benötigt geringe Mengen TGF-β in der Anwesenheit von IL-6 zur Induktion der Differenzierung. Dadurch wird die Expression des IL-23 Rezeptors hochreguliert und die Sezernierung von IL-21 zur eigenständigen Vermehrung induziert. Die Stabilisierung der Zelllinie wird durch die Bindung von APZ sekretiertem IL-23 erreicht. Die sekretierten Zytokine IL-17A und IL-17F führen zur Induktion von proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen [94, 165]. IL-21 dient der Aktivierung von T-Zellen und NK Zellen sowie der Induktion der Differenzierung von B-Zellen in Plasmazellen oder Gedächtniszellen [118, 133]. Die Expression von IL-22 kann eine inflammatorische Antwort auslösen oder verstärkt den mukosalen Schutz gegen bakterielle Pathogene durch antimikrobielle Peptide und erhöhte Zellproliferation [11]. 8

17 2 Einleitung Durch die Anwesenheit von TGF-β und die Aktivierung über den TZR werden regulatorische T-Zellen (Treg) induziert [203, 191, 101, 43]. Sie dienen zur Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz gegenüber körpereigenen und fremden Antigenen. Nach Beseitigung des Pathogens supprimieren sie die Immunantwort und schützen so vor zu starker Immunpathologie [69, 190]. Die hauptsächlich exprimierten Zytokine sind IL-10, IL-35 und TGF-β. IL-10 ist ein immunsupprimierendes Zytokin und limitiert den Gewebeschaden durch inflammatorische Prozesse [47, 10, 175]. In Kombination mit TGF-β supprimieren sie die IgE Produktion und schwächen somit allergische Entzündungen ab [103]. Einen weiteren Subtyp der CD4 T-Zellen stellen die follikulären Th (TfH) Zellen dar [65, 255]. Sie werden durch IL-6 und IL-21 induziert [237, 171], wobei für die Ausprägung zusätzlich der induzierbare Kostimulator (ICOS) benötigt wird [32, 3]. TfH sind an der Expansion und Differenzierung von B-Zellen beteiligt [82, 86]. Auf Grund ihrer Zytokinexpression werden sie als TfH1, TfH2 und TfH10 bezeichnet. Dabei exprimiert TfH1 IFNγ und produziert IgG2a, TfH2 sezerniert IL-4 und induziert sowohl IgG1 als auch IgE, während TfH10 IL-10 produziert und IgA induziert [65]. Die adaptive Immunantwort ist nicht nur durch die Aktivierung von T-Lymphozyten gekennzeichnet. Zusätzlich werden B-Zellen durch die Interaktion mit ausdifferenzierten CD4 T-Helferzellen aktiviert. Dabei werden zu Beginn große Mengen an IgM produziert, die nach Bindung mit geringer Affinität zur Aktivierung des Komplementsystems führen. Da diese Antikörper als erstes ausgeschüttet werden, bezeichnet man sie auch als natürliche Antikörper. Je nach Pathogen sezernieren die T-Helferzellen unterschiedliche Zytokine, die den Isotyp des Antikörpers wechseln. Während der Differenzierung zu einer Plasmazelle führt die somatische Hypermutation des variablen Bereichs des Antikörpers zu einer erhöhten Affinität zum Antigen. Durch den Wechsel des Isotyps wird hauptsächlich IgG ausgeschüttet. Der IgG Isotyp setzt sich im Menschen aus den Subklassen IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4 zusammen und besitzt ein breites Spektrum an Funktionen, wie z.b. das Neutralisieren von Viren, das Opsonieren von Pathogenen oder die Aktivierung des Komplementsystem. Des Weiteren kann es zur Sezernierung von IgA kommen, das für den Schutz gegen Toxine auf mukosalen Oberflächen verantwortlich ist. Einen der selteneren Isotypen stellt IgE dar. Es sorgt für eine Sensibilisierung von Mastzellen und wird in Folge einer allergischen Reaktion vermehrt produziert. [97, 200] Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz Im Gegensatz zur Induktion einer schützenden Immunität sind DZ ebenfalls in der Lage, periphere Toleranzmechanismen zu aktiveren (Abb. 2.2). Die Induktion der peripheren Toleranz dient als Schutzmechanismus des Immunsystems, um unerwünschte autoreaktive T-Zellantworten zu unterdrücken oder zu beseitigen. Diese autoreaktiven T-Zellen können der Selektion im Thymus entgangen sein 9

18 2 Einleitung [33] oder eine negative Selektion im Thymus gar nicht erst erfahren haben, da die körpereigenen Antigene zur Präsentation den Thymus nicht erreichte haben [153]. In der Peripherie führt die Aufnahme eines körpereigenen Antigens, z.b. von apoptotischen Zellen, zu einer partiellen Reifung der DZ. Dabei kommt es zu einer vermehrten Präsentation von Peptid-MHC-Komplexen, aber ohne die Expression von kostimulatorischen Molekülen wie CD40 oder CD80/CD86 zu induzieren. Die Interaktion Antigen-spezifischer T-Zellen mit partiell gereiften DZ in Abwesenheit kostimulatorischer Signale führt z.b. zur Deletion dieser T- Zellen oder zur Induktion eines anergen Status [66, 84]. Ein weiterer Mechanismus der peripheren Toleranz ist die Induktion von suppressiven Treg, die Antigenspezifische Immunantworten hemmen können. Abbildung 2.2: Einfluss des Reifestadiums einer Antigen-präsentierenden DZ auf die Differenzierung der naiven T-Zellen. Quelle: modifiziert Abbildung [97] Die Interaktion von T-Helferzellen mit unreifen DZ kann zur Deletion dieser T-Zellpopulation führen [163, 29, 185, 48]. Durch in vitro Untersuchungen wurde herausgefunden, dass Antigen-spezifische T-Zellen nach Restimulation ohne Kostimulus die Expression von Genen, die für das Überleben der Zelle notwendig sind, herunterregulieren und einen programmierten Zelltod induzieren [233]. Auch in vivo wurde gezeigt, dass APZ aus dem Knochenmark in der Lage sind T-Zelltoleranz durch Deletion von Antigen-präsentierenden Zellen in Mäusen zu induzieren [124, 2]. Ebenfalls konnte, nach einer direkten Adressierung eines Antigens an unreife DZ, eine Deletion von CD4 und CD8 T-Lymphozyten beobachtet werden [29, 84]. 10

19 2 Einleitung Im Gegensatz zur Deletion können die T-Helferzellen nach der Interaktion mit den unvollständig gereiften DZ auch in einen anergen Zustand verfallen [208, 84, 85, 176, 128, 170]. Dabei konnte herausgefunden werden, dass es durch diese Interaktion zu einer erhöhten Expression des Effektormoleküls CD5 auf den T-Zellen kommt [85]. Des Weiteren wurde beobachtet, dass die eigentliche Kostimulation von T-Zellen sehr viel komplizierter ist, als zuvor angenommen. Neben der bekannten aktivierenden Interaktion zwischen dem CD28 Rezeptor auf der T-Zelle und den CD80/CD86 Molekülen auf den APZ, kann durch die Interaktion zwischen dem CD28 homologen CTLA-4 mit dem CD80/CD86 Molekülen ein inhibierendes Signal auf die T-Zelle übertragen werden [176]. Ein weiteres wichtiges Molekül zur Regulation der peripheren Toleranz stellt programmed death 1 (PD-1) dar. Es besitzt Homologien zum CD28 Rezeptor und übermittelt nach Interaktion mit PD-L1, einem der B7 Familie homologen Molekül, eine negative Stimulation an die T-Zelle [170, 128]. Ein weiterer Mechanismus der peripheren Toleranz ist die Induktion von suppressiven Treg, die eine Untergruppe der CD4 T-Zellen bilden. Sie werden in natürliche und induzierbare Treg unterteilt. Die Eigenschaften dieser Populationen sowie deren Einfluss auf eine virale Infektion wird im Folgenden weiter ausgeführt (vgl ). Die natürlichen Treg spielen nicht nur ein Rolle in der peripheren Toleranz zur Unterdrückung von unerwünschten autoreaktiven T-Zellen, sie werden auch von unterschiedlichsten Pathogenen induziert, um einer eliminierenden Immunantwort zu entkommen und persistent im Wirt zu leben. Dabei reicht das Spektrum an infektiösen Pathogenen in Mäusen von Bakterien, z.b. Heliobacter pylori [180], über Pilze, z.b. Pneumocistis carinii [90], und Protozoen, z.b. Leishmania major [19], bis hin zu Viren, z.b. Friend Virus [57] und Herpes simplex Virus [213]. Auch im Menschen konnte der suppressive Einfluss der Pathogen-induzierten natürlichen Treg auf eine spezifische Immunantwort beobachtet werden [144, 174, 1]. Neben den natürlichen Treg spielen auch die induzierbaren Treg eine große Rolle in der Inhibierung einer Pathogen-spezifischen Immunantwort. Dabei produzieren sie große Mengen des immunmodulatorischen Zytokins IL-10, wodurch es zu einer reduzierten Th1 Differenzierung kommt. 2.3 DZ adressierende Vakzine Protein-basierende Vakzine Die DZ vereinen die Fähigkeit der Aktivierung einer peripheren Toleranz, sowie die Induktion einer schützenden Immunität (vgl ). Nach der Endozytose von Protein-basierenden Vakzinen kommt es in der Regel zu einer MHC-II Präsentation und zur vorrangigen Induktion der humoralen Immunantwort. Da ebenfalls eine zelluläre Immunantwort für einen Schutz gegen viele Pathogene notwendig ist, 11

20 2 Einleitung wurde nach einer Methode gesucht um ZTL effektiv durch Proteinvakzine zu stimulieren. Dabei zeigten die ersten Experimente, dass sich durch die direkte Adressierung von APZ die benötigte Menge an Antigen gegenüber einer herkömmlichen Protein-Immunisierung deutlich reduziert [206]. Zusätzlich zeigte die Adressierung des Antigen an den Fcγ Rezeptor, an MHC-II oder an CD40 eine verbesserte zelluläre, wie auch humorale Immunantwort [39, 206, 68]. Im Laufe der Zeit wurde verstärkt an einer direkten Adressierung von Antigenen an DZ geforscht. Dafür wurden immer mehr potentielle Rezeptoren zur Adressierung von DZ entdeckt [15]. Viele der bisher untersuchten Rezeptoren, wie z.b. CD205 [30, 29], CD206 [105], Clec9A [38, 91] oder DC-SIGN [88], gehören zur Familie der C-Typ Lektine. Die Adressierung dieser Rezeptoren gewährleistet eine Aufnahme, Prozessierung und Präsentation des Antigens auf APZ. DEC205 ist von den hier genannten der am besten charakterisierte Rezeptor. Er hebt sich durch seine hohe Expression auf den DZ des lymphoiden Gewebes [81, 121, 246] sowie durch eine schnelle Antigenpräsentation nach Aufnahme des Antigens [30, 98, 147] deutlich von den Anderen ab. Die Adressierung des Rezeptors erfolgt über einen DEC205-spezifischen Antikörper. Dieser ermöglicht hauptsächlich eine Adressierung von DZ in den T-Zellarealen [121, 246], trotz der Expression des DEC205-Rezeptors auf anderen Leukozyten [93, 246]. Durch die Kopplung eines Antigens an den Antikörper kann dieses spezifisch an DZ in vivo adressiert werden, wodurch es zur Rezeptor-vermittelten Aufnahme, Prozessierung und Komplexierung von Antigen-spezifischen Peptiden auf MHC-II kommt. Auf Grund der Fähigkeit von CD8α + DEC205 + DZ exogene Antigene mittels Kreuzpräsentation auf MHC-I zu präsentieren, ist ebenfalls eine Aktivierung von Antigen-spezifischen CD8 T-Zellen durch die Adressierung dieser DZ Subpopulation möglich [61]. Es wurde beobachtet, dass nach einer Protein-Immunisierung mit einem OVAkonjugierten anti-dec205 Antikörper die Beladungseffizienz [29] und Präsentationsdauer [30] für MHC-I Komplexe größer als für MHC-II Komplexe war. Außerdem wurde festgestellt, dass eine subkutane Protein-Vakzinierung mit dem OVA-konjugierten anti-dec205 Antikörper zu einer partiellen Reifung der adressierten DZ führte [29, 30]. Diese DZ konnten eine kurzzeitige OVA-spezifische T-Zellproliferation anregen, wonach sie auf Grund des fehlenden Kostimulus anschließend in einen anergen Zustand verfielen [29]. In transgenen Mausmodellen wurde zudem gezeigt, dass die subkutane Applikation von Fusionsproteinen aus dem anti-dec205 Antikörper und den Antigenen OVA [148] oder HA [35, 122] zu einer Induktion von Antigen-spezifischen Treg führte, die eine erhöhte Expression von Foxp3 oder CTLA-4 aufwiesen [35]. In einem Diabetes-Modell konnte ferner die Rate an erkrankten Mäusen durch die Hemmung von autoreaktiven CD4 T-Zellen nach Induktion von Antigen-spezifischen Treg gesenkt werden [35]. Ebenfalls konnten die Ausprägung einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) durch die direkte Adressierung des Antigens an DZ, mit Hilfe eines DEC205-spezifischen Antikörpers, verhindert werden [183]. Die Anergie der T-Zellen konnte durch die Koapplikation eines Adjuvans (z.b. anti- 12

21 2 Einleitung CD40 Antikörper [84] und/oder poly IC [31]) mit dem gekoppelten Antikörper umgangen werden. Dabei sorgt das Adjuvans für eine vollständige Reifung der adressierten DZ. Während die Reifung keinen Einfluss auf die Proliferation der interagierenden Zellen hat, konnten Antigen-spezifische T-Zellen durch die Interaktion mit gereiften DZ zu Effektor- und Gedächtniszellen ausdifferenzieren [30]. Durch die Kombination des konjugierten Antikörpers mit einem anti-cd40 Antikörper konnten effektiver IFN-γ produzierende CD8 T-Zellen induziert werden [29] als mit anderen Immunisierungsansätzen, wie z.b. freie Antigene in komplettem Freund-Adjuvans [129] oder ex vivo Reifung und Beladung von DZ aus der Milz [140, 154]. Durch die zusätzliche Verwendung von Reifungsstimuli (anti-cd40 und polyic) konnte ebenfalls eine breite und langzeitige humorale Immunantwort induziert werden [31]. Die Applikation von HIV Gag p24-konjugierten DEC205- Antikörpern in Kombination mit anti-cd40 und polyic induzierte einen mukosalen Schutz gegen ein HIV Gag exprimierendes Vaccinia Virus [231]. Durch die direkte Adressierung eines Melanoma-Antigens in Kombination mit CpG konnte ebenfalls eine Antigen-spezifische CD4 und CD8 T-Zellantwort induziert werden, die zu einem Schutz führte [149] Gen-basierende Vakzine Neben der Protein-Immunisierung besteht auch die Möglichkeit, die benötigten Konstrukte in einem Expressionsplasmid zu kodieren und mit der DNA zu immunisieren. Dadurch wird eine kontinuierliche, langzeitige Expression des Antikörperkonstrukts in situ gewährleistet [247], was eine mehrfache Applikation überflüssig macht. Dabei war die Effektivität des Transfers der DNA in die Zellen recht gering. Erst durch das Anlegen eines elektrischen Feldes, mit Hilfe von elektrischen Pulsen einer geringen Intensität, konnte sehr viel effektiver die DNA in die Zellen eingebracht werden [159]. Dabei permeabilisieren die elektrischen Pulse die Zellmembran und die Plasmid-DNA wird entlang des elektrischen Feldes in die Zelle transportiert [36, 116, 196]. Die Erhöhung der Intensität der elektrischen Impulse führte zwar zu einer verbesserten Genexpression aber auch zu einer stärkeren Zerstörung des Muskelgewebes [239, 240]. Ein weiterer Vorteil gegenüber den Proteinimpfstoffen liegt in der einfachen Herstellung des Expressionsvektors in großen Mengen unter standardisierten Bedingungen und unabhängig vom verwendeten Antigen. Im Gegensatz dazu ist die Produktion des konjugierten anti-dec205 Antikörpers für eine Protein-Vakzinierung mit mehr Aufwand verbunden. Während die Protein-Vakzinierung zusätzliche Reifungsstimuli für DZ benötigt [30, 31, 84, 231], kann die DNA-Immunisierung ohne zugegebenen Kostimulus eine Immunität induzieren [51, 168]. Es wurde gezeigt, dass die DNA selbst mikrobielle CpG Motive als Reifungssignal für DZ enthalten kann [219] oder die Elektroporation selbst eine Inflammation auslöst [136], wodurch die DZ zur Reifung stimuliert werden. Nchinda et al. zeigte, dass die Immunisierung mit einer DNA, die für einen OVA- 13

22 2 Einleitung konjugierten DEC205-spezifischen Antikörper kodierte, zu einer hohen Antigenpräsentation sowohl auf MHC-I als auch auf MHC-II führte [168]. Zusätzlich wurde die Struktur des DEC205-spezifischen Antikörpers soweit verändert, dass anstatt eines vollständigen Antikörpers ausschließlich die variablen Regionen der leichten und schweren Kette mit einem Peptidlinker miteinander verbunden wurden. Dieses als Einzelkettenantikörper (EAk) bezeichnete Konstrukt besitzt gegenüber den vollständigen Konstrukten einige Vorteile. Durch die reduzierte Größe können die EAk einfacher ins Gewebe einwandern [16] und es ist aufgrund der fehlenden Fc Domäne eine mehrfache Applikation möglich, ohne eine neutralisierende Antikörperantwort im Empfänger zu induzieren [51]. Außerdem wird dadurch ein unspezifisches Abfangen der EAk durch Fc Rezeptoren unterbunden. Neben der verbesserten Antigenpräsentation konnte Nchinda ebenfalls zeigen, dass die direkte Adressierung von HIV Gag p41 an DZ durch eine einmalige DNA-Elektroporation ausreichte, um eine schützende Immunantwort gegen ein rekombinantes Gag-exprimierendes Vaccinia Virus in Mäusen zu induzieren [168]. Tenbusch und Kollegen erreichten in Rhesusaffen eine Adressierung des HIV Gag p41 Fragmentes an unreife (CD1a + ) und reife (CD83 + ) myeloide DZ durch DEC205-spezifische Antikörper [225]. Trotz zweimaliger DNA-Immunisierung und Adressierung mit Gag abgeleiteter Antigene an DZ konnten sie keine erhöhte Immunantworten im Affen induzieren. Im Einklang mit der schlechten Immunantwort nach zweimaliger DNA-Immunisierung in Rhesusaffen, beobachtete Grossmann et al. (2009) ebenfalls eine reduzierte Antigen-spezifische Immunantwort nach einer DNA-Prime/Adeno-Boost Immunisierung im OVA-Modell [79]. Erst die Zugabe der Adjuvanzien polyi:c und CpG zu der DNA induzierte eine deutlich verbesserte Immunantwort. Die Verwendung von nicht-replizierenden viralen Vektoren stellt eine weitere Möglichkeit dar, effektiv DNA in eine Zelle zu transferieren. Tenbusch und Kollegen zeigten, dass die Verwendung von adenoviralen Vektoren, die für DEC205-spezifische OVA-konjugierte EAk kodieren, zu einer verstärkten Präsentation auf MHC-I und MHC-II führte, sowie zu einer erhöhten Induktion von polyfunktionalen CD8 T-Zellen [226]. Ähnlich zu den Ergebnissen in der Primatenstudie [225] konnte trotz erhöhter Antigenpräsentation und CD8 T-Zellantworten keine Verbesserung im Tumor-Modell oder nach Infektion mit einem rekombinanten OVA-exprimierenden Vaccinia Virus erreicht werden. Ähnlich zum adenoviralen Vektorsystem war das Vektorsystem des Newcastle Disease Virus ebenfalls in der Lage, eine erhöhte Antigenpräsentation und verbesserte Antigen-spezifische CD8 T-Zellantworten zu induzieren [145]. Aber im Gegensatz zu der adenoviralen Immunsierung war durch die Verwendung des Newcastle Disease Virus ein Schutz gegen eine Infektion mit Gag-exprimierendem Vaccinia Virus beobachtet worden. 14

23 2 Einleitung 2.4 Regulatorische T-Zellen Allgemeine Funktion Die regulatorischen T-Zellen unterteilen sich in natürliche und induzierbare Treg. Natürliche CD4 + CD25 + Foxp3 + Treg reifen im Thymus heran und dienen zur Supprimierung unerwünschter autoreaktiver Immunantworten in der Peripherie [224, 24, 67, 100]. Für die Aktivierung von Treg werden zwei Signale benötigt, Zellkontakt und Antigenerkennung [189, 227, 238]. Es wurde beobachtet, dass Antigen-spezifische Treg effizienter in der Regulation von Toleranz bei Transplantationen [78] oder Autoimmunantworten [221, 224] sind, als Treg mit einer breiten Spezifität. Treg sind außerdem für die Homöostase von Immunzellen unverzichtbar. Eine Depletion von Foxp3 + Treg in erwachsenen Mäusen führte zu ihrem Tod durch hohe Proliferation von lymphoiden Zellen und der Ausprägung einer schweren Immunpathologie binnen drei Wochen [110]. Die Treg sind in der Lage Effektorzellen durch eine direkte Interaktion oder indirekt über den Einfluss auf APZ zu supprimieren [227, 218, 222]. Die Suppression kann dabei durch einen Zell-Zellkontakt [74, 253] oder die Freisetzung von Zytokinen [10, 46] erfolgen. Zum Beispiel führt die Expression des CD4 homologen LAG-3 und Interaktion mit MHC-II auf unreifen DZ zu einer Inhibierung der Reifung [134]. Des Weiteren führt die Interaktion zwischen Treg und DZ über die auf Treg exprimierten Oberflächenproteine CTLA-4 [14] oder TIGIT [250] zu einer Freisetzung von immunsupressiven Molekülen wie IL-10, TGF-β oder IDO. Neben den im Thymus gereiften Treg kann unter bestimmten Bedingungen die Expression von Foxp3 aber auch in der Peripherie in vivo induziert werden, z.b. durch die systemische Applikation von subimmunogenen Dosen eines Antigens [122, 234, 123] oder durch ein starkes TZR-Signal in Kombination mit einer suboptimalen Kostimulation und großen Mengen an TGF-β [122, 254, 43]. Neben der Konvertierung von naiven CD4 + CD25 - T-Zellen in Foxp3 + exprimierende Treg, können auch weitere induzierbare Treg in der Peripherie entstehen, die keinen klassischen Phänotyp besitzen und nur anhand ihrer exprimierten Zytokine unterschieden werden. Dabei unterscheidet man zwischen den IL-10 [186, 44] (Tr1) und TGF-β [64, 80] (Th3) produzierenden induzierbaren Treg. Auf Grund der fehlenden Oberflächenproteine, wie sie von natürlichen Treg exprimiert werden, führen diese Zellen ihre inhibitorische Funktion über lösliche Faktoren aus [179] Rolle bei viralen Infektionen Wie schon zuvor bereits beleuchtet (vgl ), kann es durch eine virale Infektion zur Induktion von Treg in Mäusen und im Menschen kommen. Sie sorgen sowohl für eine Orchestrierung der Immunzellen [143] als auch für einen Schutz des Gewebes vor einer Virus-induzierten Immunpathologie [157]. Dabei wirken sich die suppressiven Effekte auf annähernd jeden Zelltyp aus, der an einer antiviralen 15