DIAGNOSTIK. Dr. med Katharina Kranzer National and Supranational Reference Laboratory Germany

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1 DIAGNOSTIK Dr. med Katharina Kranzer National and Supranational Reference Laboratory Germany

2 Ohne STATE OF THE ART Präanalytik keine STATE OF THE ART Diagnostik

3 Was ist Präanalytik? Alle Prozess die vor dem Labor ablaufen Indikation Probenentnahme Probenvolumen Transportmedium Lagerung Transport (Zeit, Temperatur)

4 Präanalytik - Mykobakterien Sputum > 2ml BAL > 10ml Keine Tupfer Kein Formalin Verarbeitung binnen 24h Lagerung bei 0-4 Grad

5 TB Diagnostik - Minimalprogram Mikroskopie (FM), eine Flüssigkultur, zwei Festkulturen

6 TB Diagnostik - Minimalprogram Mikroskopie (FM), eine Flüssigkultur, zwei Festkulturen Sensitivität LOD Analysezeit Negativ Positive Kommentare

7 TB Diagnostik - Minimalprogram Mikroskopie (FM), eine Flüssigkultur, zwei Festkulturen Sensitivität 50% LOD Analysezeit Negativ Positive Kommentare CFU/ml 24h 24h Subjektiv Unspezifisch (tote SFS, NTM)

8 TB Diagnostik - Minimalprogram Mikroskopie (FM), eine Flüssigkultur, zwei Festkulturen Sensitivität 50% ~100% LOD CFU/ml 1-10 CFU/ml Analysezeit Negativ Positive Kommentare 24h 24h Subjektiv Unspezifisch (tote SFS, NTM) 6 Wochen 7-20 Tage Kontaminationsanfällig Speziesdifferenzierung Resistenztestung

9 TB Diagnostik - Minimalprogram Mikroskopie (FM), eine Flüssigkultur, zwei Festkulturen Sensitivität 50% ~100% ~100% LOD CFU/ml 1-10 CFU/ml 1-10 CFU/ml Analysezeit Negativ Positive 24h 24h 6 Wochen 7-20 Tage 8 Wochen Tage Kommentare Subjektiv Unspezifisch (tote SFS, NTM) Kontaminationsanfällig Speziesdifferenzierung Resistenztestung Geringer Kontamination Makroskop Beurteilung Resistenztestung

10 TB Diagnostik molekulare Diagnostik Test LOD Gen Target Sensitivität mikroskopisch positiv Sensitivität gesamt Xpert MTB/RIF 130 CFU rpob 100% 90% Xpert Ultra CFU IS6110, IS1081, rpob 100% 95% HAIN Genotype MDRplus 160 CFU rpob katg, inha 100% 80-85% Abbott RT MTB RIF/INH CFU pab, IS6110 rpob katg, inha 100% 93% Validierungsstudien für Roche und BD werden zur Zeit durchgeführt, Weitere LPAs z.b. Anyplex MTB/MDR, Nipro NTM+MDRTB

11 Mikroskopisch positive Proben/PCR negative Proben Nachweisgrenze PCR Nachweisgrenze Mikroskopie Colony forming units NICHT TB! Färbeartefakt NTM Norcardien

12 THT und IGRAs zur Diagnose der aktiven TB? Neither IGRA nor TST should be used for the diagnosis of active TB disease

13 THT und IGRAs zur Diagnose der aktiven TB? 3 Labordiagnostik der Tuberkulose Die Diagnose einer Tuberkulose wird durch den Nachweis der Erreger mit mikroskopischen, kulturellen oder molekularbiologischen Verfahren sichergestellt. Der Nachweis einer Immunantwort ermöglicht nicht die Diagnose einer Tuberkulose. Interferon-γ-Release-Assays (IGRA) und Tuberkulin-Hauttest (THT) können allenfalls eine umfassende Diagnostik ergänzen. Als alleinige Untersuchung sind sie nicht geeignet, eine Tuberkulose sicher zu beweisen oder auszuschließen.

14 Molekulare Basis der Antibiotika Resistenz für Erstrangmedikament bei M. tuberculosis Antibiotikum Gen Funktion % Resistenz Isoniazid katg inha ahpc-promotor Katalase-Peroxidase Enoyl-ACP-Reduktase Alkyl-Hydroxid-Peroxidase % ca. 25 % ca. 10 % Rifampicin rpob ß-Untereinheit der RNA- > 95 % Polymerase Fluorquinolone gyra/b DNA-Gyrase A/B 80-90% Amikacin rrs 16S rrna Ca. 80% Capreomycin tly Resistenz Sensitivität Methylase Spezifität? Kanamycin eis N-Acetyltransferase? rpob katg inha RMP 98.1% 98.7% INH 84.3% 99.5% Meta-Analysis: Ling et al., Eur Respir J 2008, Nathavitharana et al. Eur Respir J 2017

15 TB Resistenz Diagnostik molekulare Diagnostik aus Direktmaterial Test Gen Target Sensitivität RMP Spezifität RMP Sensitivität INH Spezifität INH Xpert MTB/ RIF Xpert Ultra rpob 98% 99% IS6110, IS1081, rpob 98% 99% Nicht getestet HAIN Genotype MDRplus Abbott RT MTB RIF/INH rpob katg, inha pab, IS6110 rpob katg, inha 98% 99% 84% 99% 98% 95% 88% 95%

16 MTB Isolierung, Identifizierung und Resistenztestung Wachstum von TB Bakterien, Identifizierung Tage Res. 1st-line Medikamente 1-2 Wochen MDR Res. 2nd-line Medikamente 1-2 Wochen XDR 4-7 Wochen Molekulare Methoden 1-2 Tage MDR/XDR Molekulare Resistenztestungen können/sollen auch aus positiven Kulturen durchgeführt werden Die Verkürzung der Zeitspanne bis zur Detektion der TB Bakterien Adäquate Therapie Transmission resistenter Stämme

17 Molekulare Basis der Antibiotika Resistenz für Zweitrangmedikament bei M. tuberculosis Antibiotikum Gen Funktion % Resistenz Ethambutol embb Arabinosyl-Transferase appr. 60 % Pyrazinamide pnca Pyrazinamidase appr. 95 % Fluorquinolone Amikacin gyra/b rrs DNA-Gyrase A/B 16S rrna 80-90% Ca. 80% Capreomycin tly Methylase? Kanamycin Streptomycin eis rpsl N-Acetyltransferase ribosomal Protein S12? appr. 60 %

18 Phänotypische Resistenzbestimmung M. tuberculosis Im Gegensatz zur üblichen bakteriologischen Resistenztestung beinhaltet die Resistenztestung bei Mykobakterien keine quantitative Resistenzbestimmung. Stattdessen wird nur die Empfindlichkeit gegen eine einzelne Antibiotikakonzentration, die kritische Konzentration, getestet. MGIT = Mycobacteria Growth Indicator Tube Automatisiertes Flüssigkultursystem Am häufigsten angewandtes TB-Kultursystem weltweit Indirekte Messung des Sauerstoffverbrauches (durch bakterielles Wachstum)

19 Wir stehen Ihnen für Fragen jederzeit gerne zur Verfügung nrz@fz-borstel.de