Rheumafaktoren IgM ORG 522M. 96 Tests Immunometrischer Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von IgM Rheumafaktoren. Gebrauchsanweisung

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1 ORGENTEC Diagnostika GmbH Carl-Zeiss-Straße Mainz Tel.: Fax: Rheumafaktoren IgM ORG 522M 96 Tests Immunometrischer Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von IgM Rheumafaktoren Gebrauchsanweisung

2 INHALTSVERZEICHNIS Inhaltsverzeichnis... 2 Einleitung... 3 Methodik... 3 Lieferumfang des Tests... 4 Technische Daten... 4 Erforderliche Laborgeräte... 4 Vorbereitung der Reagenzien... 5 Probenentnahme und Probenvorbereitung... 5 Technische Hinweise... 5 Assaydurchführung... 6 Auswertung der Ergebnisse... 7 Normalwerte... 7 Sensitivität... 7 Spezifität... 7 Kalibrierung... 7 Linearität... 7 Reproduzierbarkeit... 8 Literatur... 8 Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen... 9 Kurzanleitung

3 EINLEITUNG Das Vorkommen von IgM Rheumafaktoren im Serum ist nach der Liste der ACR-Kriterien der grundlegende serologische Indikator zur Diagnose der Rheumatoiden Arthritis (RA). Rheumafaktoren stellen eine Teilgruppe von Immunglobulinen dar, deren Spezifität sich gegen die Fc-Region von IgG richtet. Die Mehrheit der im Normalserum befindlichen Antikörper ist hingegen spezifisch gegen die Fab-Region der Immunglobuline gerichtet, wohingegen die Immunglobuline von Patienten mit Rheumatoider Arthitis größtenteils gegen die Fc-Region gerichtet ist. Obwohl das Vorhandensein eines Rheumafaktors nicht ausschließlich auf Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises beschränkt ist, sind doch Häufigkeit, Ausmaß und Dauer der Seropositivität bezüglich der Rheumafaktoren bei Patienten mit Rheumatoider Arthritis viel ausgeprägter. Die Präva-lenz liegt bei Rheumatoider Arthritis zwischen 75 und 80%. Darüber hinaus findet man jedoch auch Rheumafaktoren im Serum von Patienten mit Infektions- oder Autoimmunerkrankungen Hyperglobulinämien, lymphoproliverativen B-Zell Erkrankungen und in älteren Bevölkerungsschichten. Im allgemeinen sind erhöhte Konzentrationen von Rheumafaktoren mit einem schwereren Krankheitsverlauf assoziiert, wobei die Konzentrationen nicht mit dem Aktivitätsgrad korrelieren. Das Auftreten von IgM Rheumafaktoren kann dem Beginn einer Rheumatoiden Arthritis um Jahre vorangehen. Weiterhin sind hohe Konzenrationen von Rheumafaktoren ein Indikator für das zunehmende Risiko an einer RA zu erkranken. Bei manifestierter RA weisen hohe Konzentrationen von IgM Rheumafaktoren auf eine schlechte Prognose hin. Das Vorkommen von IgG und IgA Rheumafaktoren stellt bei einer Langzeit-RA einen guten prognostischen Indikator für systemische Manifestationen dar. Die ORGENTEC ELISA-Testsysteme zur Bestimmung der unterschiedlichen Rheumafaktorklassen verwenden ausschließlich humane Fc-Fragmente als an die Festphase gekoppeltes Antigen. Somit steht sowohl zur Bestimmung der einzelnen Rheumafaktorklassen, als auch im Rheumafaktor-Screen ein homologes Meßsystem zur Verfügung. Die Verwendung der hier vorgestellten neuen Generation von Enzymimmunoassays ermöglicht nunmehr eine präzise Diskriminierung der verschiedenen Rheumafaktorklassen und verfügt somit über eine höhere diagnostische Wertigkeit. METHODIK Der vorliegende Test ist ein indirekter Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von Rheumafaktoren der Klasse IgM. Die Kavitäten der Mikrotiterplatte sind mit hochreinen Fc- Fragmenten von humanem IgG beschichtet. Auf einer Mikrotiterplatte können 96 Bestimmungen durchgeführt werden. Jede Mikrotiterplatte setzt sich aus 12 einzelnen Streifen mit jeweils 8 Kavitäten zusammen. Bei Bedarf können die Streifen in einzelne Kavitäten zerteilt werden. Die drei Reaktionsschritte stellen sich wie folgt dar: 1. Reaktionsschritt Die Antikörper in den Standards, Kontrollen und in den Patientenproben werden an das immobilisierte Antigen in den Kavitäten gebunden. 2. Reaktionsschritt Das zugegebene Enzymkonjugat (anti-human-igm Meerrettich-Peroxidase) erkennt spezifisch die gebundenen Antigen-Antikörper-Komplexe. 3. Reaktionsschritt Die gebundene Peroxidase setzt ein zugegebenes Substrat (TMB) in ein gefärbtes Produkt um. Auswertung Die optische Dichte der Proben wird in einem ELISA-Photometer bei 450 nm gemessen. Die Farbentwicklung ist direkt proportional zur gesuchten Autoantikörper-Konzentration. 3

4 LIEFERUMFANG DES TESTS Mikrotiterplatte mit 96 abbrechbaren Kavitäten, die beschichtet sind... 1 mit hochgereinigten Fc-Fragmenten von humanem IgG Probenpuffer, Konzentrat, (gelb)... 1 Fläschchen, 20 ml Waschpuffer, Konzentrat... 1 Fläschchen, 20 ml Konjugat... 1 Fläschchen, 15 ml anti-human IgM, Peroxidase konjugiert, gebrauchsfertig (rosa), TMB Substratlösung, 3,3`, 5,5`-Tetramethylbenzidin, gebrauchsfertig... 1 Fläschchen, 15 ml Stopplösung, 1M HCl, gebrauchsfertig... 1 Fläschchen, 15 ml Kontrollen, gebrauchsfertig... je 1 Fläschchen, 1,5 ml - Kontrolle 1 Positivkontrolle - Kontrolle 2 Negativkontrolle Standards A bis E, gebrauchsfertig mit den Konzentrationen:...je 1 Fläschchen, 1,5 ml RF IgM: IU/ml Arbeitsanleitung/Qualitätskontroll-Zertifikat TECHNISCHE DATEN Untersuchungsmaterial Serum oder Plasma Erforderliche Probenmenge 10 µl Probe für eine 1 : 101 Probenvorverdünnung 100 µl verdünnte Probe pro Einzelbestimmung Gesamt-Inkubationszeit 60 Min. bei Raumtemperatur (20-28 C) Meßbereich: 0 bis 500 IU/ml Empfindlichkeit: 1 IU/ml Meßwellenlänge 450 nm Lagerung bei 2-8 C im Kühlschrank ERFORDERLICHE LABORGERÄTE Geräte/Reagenzienvorbereitung - Plattenphotometer mit einem optischen Filter der Meßwellenlänge 450 nm (ggf. Referenzwellenlänge von 620 nm) - Wirbelmischer (Vortex) - Mikropipetten mit Einmalspitzen für 10 µl, 100 µl und 1000 µl, evtl. Multipette - destilliertes Wasser - Meßzylinder für 100 ml und 1000 ml - Gefäß zur Aufbewahrung der Waschlösung 4

5 VORBEREITUNG DER REAGENZIEN Alle Komponenten dieses Testbesteckes liegen bis auf den Probenpuffer und den Waschpuffer gebrauchsfertig vor. Die Lösungen sind nach dem Öffnen der Fläschchen und bei Lagerung im Kühlschrank bei 2-8 C bis zum aufgedruckten Verfallsdatum haltbar. Waschlösung Jede Flasche des Waschpuffer-Konzentrates (20 ml) ist vor Gebrauch durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1000 ml (1 Liter) zu verdünnen. Die verdünnte Waschlösung ist bei einer Lagerung bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar. Probenpuffer Jede Flasche des Probenpuffer-Konzentrates (20 ml) ist vor Gebrauch durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 100 ml zu verdünnen. Der verdünnte Probenpuffer ist bei einer Lagerung bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar. Mikrotiterplatte Es werden je nach Probenaufkommen die nötige Anzahl von Streifen oder Einzelkavitäten in den Rahmen der Mikrotiterplatte eingesetzt. Es sollte unbedingt darauf geachtet werden, daß die verpackte Mikrotiterplatte bereits Raumtemperatur angenommen hat, ehe die Folienverpackung geöffnet wird. Die nicht benötigten Streifen bzw. Kavitäten werden in dem wiederverschließbaren Beutel bei 2-8 C aufbewahrt. Achtung: Werden bei einem Assayansatz nicht alle Streifen bzw. Kavitäten benötigt, muß der Rahmen der Mikrotiterplatte aufbewahrt werden. Nach Beendigung eines Testansatzes sollten die verbrauchten Kavitäten verworfen und der Rahmen der Mikrotiterplatte in den Kit zurück gelegt werden. PROBENENTNAHME UND PROBENVORBEREITUNG Die Bestimmung der Rheumafaktoren wird im Serum oder Plasma durchgeführt. Die Serum- bzw. Plasmaproben werden vor der Messung 1 : 101 mit Probenpuffer verdünnt. 10 µl Probe plus 1000 µl Probenpuffer Serum- und Plasmaproben können gekühlt bei 2-8 C bis zu 5 Tage aufbewahrt werden. Ist eine längere Lagerung beabsichtigt, sollten die Proben aliquotiert und bei -20 C tiefgefroren werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden. Seren und Plasmen mit erhöhten Bilirubinwerten, hämolytische oder lipämische Proben stören die Bestimmung nicht. TECHNISCHE HINWEISE Zur laufenden Kontrolle der Richtigkeit wird empfohlen, jeden Ansatz anhand von Kontrollseren zu überprüfen. 5

6 ASSAYDURCHFÜHRUNG Vor Testbeginn müssen alle Reagenzien sowie die Patientenseren Raumtemperatur angenommen haben. 1. Eine ausreichende Anzahl von Kavitäten bzw. Mikrotiterplatten-Module zum Ansatz von Standards, Kontrollen und Patientenproben vorbereiten. Doppelbestimmungen werden empfohlen. 2. Jeweils 100 µl Standards, Kontrollen und vorverdünnte Patientenproben entsprechend der Plattenbelegung in die Mikrotiterplatte pipettieren. Vorschlag für ein Pipettierschema: A SA SE P2 P.. B SA SE P2 P.. C SB K1 P3 SA - SE: Standards A bis E D SB K1 P3 P1, P2... Pantientenprobe 1, 2... E SC K2 P4 K1: Positivkontrolle F SC K2 P4 K2: Negativkontrolle G SD P1 P5 H SD P1 P5 1. Inkubation: 30 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) 3. Kavitäten entleeren und insgesamt 3 Mal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen. Einwirkzeit des Waschpuffers: mindestens 25 sec. Waschpufferreste müssen vollständig aus den Kavitäten entfernt werden. Hierzu sollte die Mikrotiterplatte mehrere Male kräftig mit der Öffnung nach unten auf eine saugfähige Unterlage ausgeschlagen werden. 4. Jeweils 100 µl Enzymkonjugatlösung in die Kavitäten der Mikrotiterplatte pipettieren. 2. Inkubation: 15 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) 5. Kavitäten entleeren und insgesamt 3 Mal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen. Einwirkzeit des Waschpuffers: mindestens 25 sec. Waschpufferreste müssen vollständig aus den Kavitäten entfernt werden. Hierzu sollte die Mikrotiterplatte mehrere Male kräftig mit der Öffnung nach unten auf eine saugfähige Unterlage ausgeschlagen werden. 6. Jeweils 100 µl TMB Substratlösung in die Kavitäten pipettieren. 3. Inkubation: 15 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) µl Stopplösung in jede Kavität pipettieren und die Platte ca. 5 Minuten stehen lassen. 8. Messung der optischen Dichte aller Proben im Plattenphotometer innerhalb von 30 Minuten bei einer Wellenlänge von 450 nm. Bitte beachten Sie: Alle angegebenen Inkubationszeiten müssen eingehalten werden. Alle Pipettierschritte sind bei allen Inkubationen in einheitlicher Reihenfolge und einheitlichem Zeittakt durchzuführen. 6

7 AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE Eine Standardkurve erhält man durch Auftragen der gemessenen optischen Dichte gegen die vorgegebene Standardkonzentration. NORMALWERTE Im Rahmen einer umfangreichen Normbereichsstudie wurde anhand von Blutspender-Seren mit dem Rheumafaktoren IgM ELISA die folgenden Werte ermittelt: normal < 20 IU/ml erhöht > 20 IU/ml SENSITIVITÄT Die untere Nachweisgrenze beträgt 1 IU/ml. SPEZIFITÄT Die Mikrotiterplatte ist mit hochgereinigten Fc Fragmenten von humanem IgG beschichtet. Der Rheumafaktor IgM Assay erfaßt spezifisch die gegen das genannte Antigen gerichteten Autoantikörper der IgM-Klasse. KALIBRIERUNG Das quantitative Meßsystem für die Rheumafaktoren IgM wurde in relativen Einheiten kalibriert. Die Kalibration wurde unter Einbeziehung des "1st British Standard Preparation 64/2" für Rheumatoide Arthritis vorgenommen. Die WHO Referenzpräparation entspricht für IgM Antikörper 100 IU/ml. LINEARITÄT Für die Verdünnungsexperimente wurden Seren/Plasmen mit hohen Antikörperkonzentrationen in steigenden Verdünnungsstufen (Verdünnung im Probenpuffer) im Assay eingesetzt. Die Ergebnisse sind über den gesamten Meßbereich linear. 7

8 REPRODUZIERBARKEIT In der untenstehenden Tabelle sind die Variationskoeffizienten (VK %), die für die Intra- und die Inter-Assay-Varianzen des Rheumafaktoter IgM Kits ermittelt wurden, aufgeführt. Zur Ermittlung der Intra-Assay-Varianzen wurden drei Seren mit unterschiedlichen Konzentrationen jeweils 24- fach auf einer Platte gemessen. Für die Bestimmung der Inter-Assay-Varianzen wurden drei Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen auf fünf Platten jeweils sechsfach gemessen. Probe Nr. Intra-Assay Mittelwert (IU/ml) Variationskoeffizient (%) Probe Nr. Inter-Assay Mittelwert (IU/ml) Variationskoeffizient (%) 1 29,2 2,4 1 26,7 4, ,3 3, ,9 3, ,4 4, ,1 3,2 LITERATUR 1. Arinbjarnarson S, Jonsson T, Steinsson K, et al. IgA rheumatoid factor correlates with changes in B and T lymphocyte subsets and disease manifestations in rheumatoid arthritis. J.Rheumatol. 1997;24: Borretzen M, Mellbye OJ, Thompson KM, Natvig JB. Rheumatoid Factors. In: Peter JB, Shoenfeld Y, eds. Autoantibodies. 1 ed. Amsterdam: Elsevier, 1996: Brown PB, Nardella FA, Mannik M. Human complement activation by self-associated IgG rheumatoid factors. Arthritis Rheum. 1982;25: Ernst E, Espersen GT, Andersen MV, Grunnet N. RF-classes (IgM, IgG, IgA) in a group of highly active RA-patients in relation to disease activity and treatment. Scand.J.Rheumatol.Suppl. 1988;75: Espersen GT, Ernst E, Vestergaard M, Grunnet N. ELISA estimations of rheumatoid factor IgM, IgA, and IgG in sera from RA patients with high disease activity. DTT treatment studies. Scand.J.Rheumatol.Suppl. 1988;75: Houssien DA, Jonsson T, Davies E, Scott DL. Clinical significance of IgA rheumatoid factor subclasses in rheumatoid arthritis. J.Rheumatol. 1997;24: Jonsson T, Arinbjarnarson S, Thorsteinsson J, et al. Raised IgA rheumatoid factor (RF) but not IgM RF or IgG RF is associated with extraarticular manifestations in rheumatoid arthritis. Scand.J.Rheumatol. 1995;24: Kleveland G, Egeland T, Lea T. Quantitation of rheumatoid factors (RF) of IgM, IgA and IgG isotypes by a simple and sensitive ELISA. Discrimination between false and true IgG-RF. Scand.J.Rheumatol.Suppl. 1988;75:

9 9. Mogk M, Weise I, Welcker M, Oppermann M, Helmke K. Bedeutung der Rheumafaktor-Immunglobulinklassen IgG, IgA und IgM in der Diagnostik rheumatologischer und immunologischer Erkrankungen. Clin.Lab. 1995;41: Paimela L, Palosuo T, Leirisalo-Repo M, Helve T, Aho K. Prognostic value of quantitative measurement of rheumatoid factor in early rheumatoid arthritis. Br.J.Rheumatol. 1995;34: Pope RM. Rheumatoid arthritis: pathogenesis and early recogniti on. Am.J.Med. 1996;100:3S-9S. 12. Scutellari PN, Orzincolo C. Rheumatoid arthritis: sequences. Eur.J.Radiol. 1998;27 Suppl 1:S31-S Swedler W, Wallman J, Froelich CJ, Teodorescu M. Routine measurement of IgM, IgG, and IgA rheumatoid factors: high sensitivity, specificity, and predictive value for rheumatoid arthritis. J.Rheumatol. 1997;24: Winska WH, Thompson K, Young A, Corbett M, Shipley M, Hay F. IgA and IgM rheumatoid factors as markers of later erosive changes in rheumatoid art hritis (RA). Scand.J.Rheumatol.Suppl. 1988;75: HINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN Alle Reagenzien dieser Testpackung dürfen ausschließlich zur in vitro-diagnostik verwendet werden. Die Einhaltung des vorgeschriebenen Protokolls zur Durchführung des Tests ist unbedingt erforderlich. Die Richtlinien zur Durchführung der Qualitätskontrolle in medizinischen Laboratorien sind zu beachten (Mitführen von Kontrollen, Poolseren). Einzelne Komponenten verschiedener Chargen und Testbestecke sollten nicht ausgetauscht werden. Die auf der Verpackung und den Etiketten der einzelnen Komponenten angegebenen Verfallsdaten sind zu beachten. Der Testkit enthält Reagenzien, die aus humanen Serum- oder Plasmabestandteilen hergestellt sind. Die Ausgangsreagenzien wurden mit Immunoassaymethoden auf Antikörper gegen HIV 1, HIV 2, HCV und auf das Hepatitis B Oberflächenantigen untersucht. Alle getesteten Parameter wurden für negativ befunden. Für den Umgang mit Kitreagenzien, Kontroll- und Serumproben sind die Vorschriften zur Unfallverhütung für den Gesundheitsdienst beim Umgang mit potentiell infektiösem Material einzuhalten. Das Untersuchungsmaterial ist stets als potentiell infektiös einzustufen. Unter den gleichen Sicherheitsvorkehrungen sind ebenso Kitreagenzien und Kontrollproben zu handhaben. Die Reagenzien dieses Testbestecks enthalten zum Schutz gegen bakterielles Wachstum Konservierungsmittel; daher ist die Berührung mit der Haut und/oder Schleimhäuten zu vermeiden. Das Substrat TMB (3,3`,5,5`-Tetramethylbenzidin) ist toxisch bei Verschlucken und bei Berührung mit der Haut. Bei Berührung mit der Haut sofort mit viel Wasser und Seife abwaschen. Vermeiden Sie den Kontakt der Peroxidlösung mit leicht oxidierbaren Materialien. Extreme Temperaturschwankungen können zum spontanen Zerfall des Peroxids führen. Ein Kontakt mit der Salzsäure enthaltenden Stopp-Lösung ist zu vermeiden. Bei Hautkontakt unverzüglich und kräftig mit Wasser abwaschen. Alle Geräte sofort nach Gebrauch gründlich reinigen. 9

10 KURZANLEITUNG 10

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