1. Einleitung S Zelladhäsionsmoleküle S Die Immunglobulin-Superfamilie S Das neurale Zelladhäsionsmolekül NCAM S.

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1 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung S Zelladhäsionsmoleküle S Die Immunglobulin-Superfamilie S Das neurale Zelladhäsionsmolekül NCAM S Molekulare Struktur von NCAM S Interaktionen von NCAM und NCAM-vermittelte Signaltransduktionswege S Clathrin-abhängige Endozytose von NCAM S Ziele dieser Arbeit S Material und Methoden S Materialien S Vektoren S Primäre Antikörper S Sekundäre Antikörper S Enzyme S Inhibitoren S Allgemeine Geräte S Allgemeine Verbrauchsmaterialien S Lösungen und Puffer S Radioaktiv markierte Verbindungen S Tiere aus institutseigener Haltung S Zellen S Molekularbiologische Methoden S Allgemeines S. 28

2 Herstellung transformationskompetenter Bakterien S Transformation kompetenter Bakterien S Anlegen einer E. coli Flüssigkultur S Isolierung von bakterieller Plasmid-DNA S Gelelektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäuren S Elution von DNA aus Agarosegelen S Polymerase-Kettenreaktion (PCR) S Spaltung von DNA-Fragmenten durch Restriktionsendonukleasen S Bestimmung von Konzentration und Reinheit von Nukleinsäuren S Präzipitation von DNA mittels Ethanol S DNA-Sequenzierung S Ligation von DNA-Fragmenten S Einbau von Schnittstellen ins NCAM140 Insert für Klonierungen in verschiedene Vektoren S Erzeugung der NCAM140 Mutante δpest S Mutagenese zur Erzeugung der NCAM 140 Mutante T781A S in vitro Transkription S Proteinexpression in Xenopus Oozyten S Haltung von Xenopus laevis S Entnahme von Xenopus-Oozyten S Vereinzelung von Oozyten S Mikroinjektion von crna in Oozyten S Markierung von Oozyten mit 35 S-Methionin S. 38

3 Herstellung von Oozytensolubilisaten S Zellkultur S Kultivierung und Subkultivierung von B35 Zellen S Stabile Transfektion von Säugerzellen S Einfrieren von Zellen S Behandlung von Zellen mit pharmakologischen Substanzen S Behandlung von B35 Zellen mit dbcamp S Biosynthetische Markierung von Säugerzellen S Zelloberflächenbiotinylierung von B35 Zellen S Induktion der Endozytose von Antigen- Antikörper-Komplexen S Herstellung von Zelllysaten S Immunzytochemie S Indirekte Immunfluoreszenz S Indirekte Immunfluoreszenz zum Nachweis der Endozytose von Antigen-Antikörper-Komplexen S Antikörperverdünnungen für die Immunfluoreszenz S Proteinchemische Methoden S Immunpräzipitation von NCAM und L1 aus Oozytensolubilisaten S Immunpräzipitation von NCAM aus Zelllysaten S Proteinbestimmung S Auftrennung von Proteinen durch SDS-PAGE S Coomassie-Färbung von SDS-Polyacrylamidgelen S Fluorographie S Western Blot nach dem Semi-dry Verfahren S. 47

4 Ponceau S-Färbung S Protein-Detektion S Antikörperverdünnungen für Western Blots S Ergebnisse S Untersuchung der Glykosylierung von humanem L1 und humanem NCAM140 in Xenopus Oozyten S Einbau von Schnittstellen in das NCAM140 Insert für Klonierungen in verschiedene Vektoren S Einbau der cdna für humanes NCAM140 in den Klonierungs-vektor pgem -T (Promega) S Einbau der cdna für humanes NCAM140 in den eukaryotischen Transkriptionsvektor pnks2 S S-Methionin-Markierung von L1- und NCAM140-Proteinen in Xenopus Oozyten S Untersuchung des Einflusses der PEST Sequenz auf die Endozytose von humanem NCAM140 in B35 Neuroblastomzellen S Einbau der cdna für NCAM140 in den euk Eukaryotischen Expressionsvektor pcdna3 S Erzeugung von NCAM140 Mutanten S Erzeugung der NCAM140 Mutante NCAM-δPEST S Erzeugung der NCAM140 Mutante NCAM140-T781A S Stabile Transfektion von NCAM negativen B35 Zellen S Untersuchung der Threonin-Phosphorylierung in NCAM140 S. 64

5 Untersuchung der Endozytose von NCAM140 in B35 Neuroblastomzellen S Untersuchung des Einflusses der Deletion der PEST Sequenz und der Mutation T781A von NCAM140 auf das Neuritenwachstum S Zelloberflächenbiotinylierung von NCAM140-WT, NCAM140-δPEST und NCAM140-T781A S Untersuchung des Einflusses der Endozytose auf die Aktivierung von CREB S Diskussion S Zusammenfassung S Literaturverzeichnis S Anhang S. 109

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