Die Expression und Regulation des Wachstumsfaktors PlGF in humanen und murinen, vaskulären Endothelzellen in vitro BACHELORARBEIT

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1 Melanie Hofmann Die Expression und Regulation des Wachstumsfaktors PlGF in humanen und murinen, vaskulären Endothelzellen in vitro eingereicht als BACHELORARBEIT an der HOCHSCHULE MITTWEIDA UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES Fakultät Mathematik/Naturwissenschaften/Informatik angefertigt am Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung in Braunschweig Mittweida 2010

2 Eidesstattliche Erklärung I EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG Die vorliegende Arbeit wurde in der Abteilung Regulation und Differenzierung des Helmholtz- Zentrums für Infektionsforschung (HZI) Braunschweig unter der Leitung von Dr. Herbert A. Weich angefertigt. Hiermit erkläre ich an Eides Statt, dass ich die Arbeit selbstständig und nur unter Zuhilfenahme der ausgewiesenen Hilfsmittel angefertigt habe. Mittweida, den 31. August 2010 Melanie Hofmann

3 Inhaltsverzeichnis II INHALTSVERZEICHNIS ABBILDUNGSVERZEICHNIS... IV TABELLENVERZEICHNIS... V ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS... VI 1 EINLEITUNG Aufbau der Plazenta Der villöse Trophoblast und seine Differenzierung Angiogenese Angiogenese bei der Entstehung von Krebs VEGF-Rezeptor-Tyrosinkinase-System VEGF Liganden-Familie VEGF-Rezeptoren Der Placental Growth Factor (PlGF) PlGF-Syntheseorte Mögliche Stimulatoren der PlGF-Expression Ziel dieser Arbeit MATERIAL UND METHODEN Materialliste Geräte Chemikalien, Reagenzien und Zusätze Puffer und Lösungen Proteine und Enzyme Antikörper Zellkulturmaterial Zellbiologisch wirksame Substanzen Synthetische Oligonucleotide Kits Primäre Zellkulturen Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) Susanne Norgall-Microvascular Endothelial Cells (SNO-MECs) Zellkultur Auftauen und Einfrieren von Zellen Medienwechsel Subkultivierung von Zellen Zellzählung In-vitro Stimulationsversuche PMA-Stimulation TNF-α-Stimulation FCS Stimulation ECGF/ECGS-Stimulation Nachweismethoden Sandwich-ELISA RNA-Isolation cdna-synthese... 23

4 Inhaltsverzeichnis III Die Polymerasekettenreaktion (PCR) Lysatherstellung und BCA-Proteinbestimmung Western Blot ERGEBNISSE Nachweis des PlGF Proteins in Lysaten humaner Plazenta Nachweis über die Western Blot Methode Quantifizierung mit Hilfe des PlGF Sandwich-ELISA Untersuchung der PlGF Expression in Lysaten humaner Endothelzellen Quantifizierung der PlGF-Expression in Zellüberständen von humanen und murinen Endothelzellen PlGF-Expression in Zellüberständen von Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) PlGF-Expression in Zellüberständen von End C57BI/6, SNO-MECs und SNO-MEC Subclonen Stimulation der PlGF-Expression humaner und muriner Endothelzellen in vitro Konzentrations- und zeitabhängige Stimulation mit PMA Konzentrationsabhängige Stimulation mit TNF-α Konzentrationsabhängige Stimulation mit FCS Konzentrationsabhängige Stimulation muriner Endothelzellen mit ECGF Konzentrationsabhängige Stimualtion humaner Endothelzellen mit ECGS DISKUSSION Vergleich der PlGF-Expressionsrate zwischen Synzytiotrophoblasten der Plazenta und humanen Endothelzellen Vergleich der PlGF-Expressionsrate zwischen humanen und murinen Endothelzellen Einfluss von ECGF/ECGS auf die PlGF-Expressionsrate Einfluss der PKC-Aktivierung durch PMA auf die PlGF-Expression Abhängigkeit der PlGF-Expression von TNF-α Inhibierung der PlGF-Expression durch FCS Ausblick ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS DANKSAGUNG... 53

5 Abbildungsverzeichnis IV ABBILDUNGSVERZEICHNIS Abb. 1.1 Schematischer Aufbau der humanen Plazenta... 1 Abb. 1.2 Schematischer Ablauf der Angiogenese... 3 Abb. 1.3 Allgemeine Aktivierung eines Tyrosinkinase-Rezeptors... 4 Abb. 1.4 Übersicht der VEGF-Liganden und ihrer Rezeptoren... 5 Abb. 1.5 Signalkaskaden in Abhängigkeit von der Phosphorylierung der Tyrosine im Tyrosinkinasebereich... 6 Abb. 1.6 Strukturmodel des PlGF-1 und schematische Darstellung der Rezeptorbindungen des PlGF, VEGF-A und VEGF-B... 7 Abb. 2.1 Schematische Darstellung eines spezifischen Sandwich-ELISA Abb. 2.2 Detektion von Proteinen auf Membranen Abb. 3.1 Western Blot mit Lysaten aus humaner Plazenta Abb. 3.2 PlGF-Konzentrationen in humanen Plazenta-Lysaten Abb. 3.3 Vergleich der PlGF-Konzentrationen zwichen Plazenta- und HUVEC-Lysat Abb. 3.4 PlGF-Zeitkinetik in HUVEC, p Abb. 3.5 PlGF Zeitkinetik in SNO-MECs, p Abb. 3.6 Untersuchung der PlGF-Genaktivität mittels PCR Abb. 3.7 PlGF-Konzentrationsbestimmung in verschiedenen SNO-MEC Subklonen Abb. 3.8 PlGF-Konzentration in Abhängigkeit zur Zeit unter Einfluss von PMA Abb. 3.9 PlGF-Konzentration in Abhängigkeit zur PMA-Konzentration Abb PlGF-Konzentration in Abhängigkeit zur PMA-Konzentration Abb PlGF-Konzentration in Abhängigkeit zur TNF-α-Konzentration Abb PlGF-Konzentration in Abhängigkeit zur TNF-α-Konzentration Abb PlGF-Konzentration in Abhängigkeit zur FCS-Konzentration Abb PlGF-Konzentration in Abhängigkeit zur FCS-Konzentration Abb PlGF-Konzentration in Abhängigkeit zur ECGF-Konzentration Abb PlGF-Konzentration in Abhängigkeit zur ECGS-Konzentration... 41

6 Tabellenverzeichnis V TABELLENVERZEICHNIS Tab. 1.1 Expression von PlGF in Geweben von Mensch und Maus... 8 Tab. 2.1 Herkunft der eingesetzten Geräte Tab. 2.2 Herkunft der verwendeten Chemikalien, Reagenzien und Zusätze Tab. 2.3 Zusammensetzung der verwendeten Puffer und Lösungen Tab. 2.4 Herkunft der eingesetzten Proteine und Enzyme Tab. 2.5 Übersicht über die Herkunft der verwendeten Antikörper Tab. 2.6 Übersicht der Verwendeten Zellkultur-Medien Tab. 2.7 Übersicht der eingesetzten Zellkulturen Tab. 2.8 Herkunft der verwendeten zellbiologisch wirksamen Substanzen Tab. 2.9 Übersicht der eingesetzten Primer Tab Herkunft der verwendeten Kits Tab PCR-Reaktionsansatz Tab Übersicht der eingesetzten PCR-Programme Tab Primer für die PCR... 25

7 Abkürzungsverzeichnis VI ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS AP alkalische Phosphatase ATP Adenosintriphosphat BAEC Rinderaortaendothelzellen BCIP 5-Bromo-4-Chloro-3'-Indolyphosphate p- Toluidine Salt BSA Bovine Serum Albumin ca circa cdna complementary deoxyribonucleic acid DAG Diacylglycerine DEPC Diethylpyrocarbonate DMSO Dimethylsulfoxid DNA deoxyribonucleic acid dntp Desoxyribonukleosidtriphosphate ECGF endothelial cell growth factor ECGS endothelial cell growth supplement ECL enhanced chemiluminescence EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EGF endothelial growth factor ELISA enzyme-linked immunsorbent assay FCS fetal calf serum FGF fibroblast growth factor Flk-1 fetal liver kinase-1 Flt-1 fms-like tyrosinkinase-1 for forward HIF-1 hypoxia-inducible factor-1 HRP horseradish peroxidase HUVEC human umbilical vein endothelial cells HZI Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung IgG Immunglobulin G KDR kinase insert domain containing receptor Min Minute mrna messenger ribonucleic acid

8 Abkürzungsverzeichnis VII nb NBT NJ NP-1 OD PBS PBS PCR PDGF Pen/Strep PKC PlGF PMA PVDF rev RNA RNase RT RTase SDS Sek sflt-1 SNO-MEC TBE TBS TBST TGF-β TMB TNF-α Tris u.a. USA UV VEGFR-1/2/3 nicht beschrieben Nitro-Blue Tetrazolium Chloride New Jersey Neurophilin-1 Optische Dichte Phosphatgepufferte Salzlösung Sodiumperborate polymerase chain reaction platelet derived growth factor Penicillin/Streptomycin Proteinkinase C placental growth factor Phorbol-12-Myristate-13-Acetate Polyvinylidenfluorid reverse ribonucleic acid Ribonuklease Raumtemperatur reverse transcriptase sodium dodecylsulfate Sekunde lösliche fms-like Tyrosinkinase-1 Susanne Norgall-microvascular endothelial cells TRIS-Borat-EDTA Tris-buffered Saline Tris-buffered Saline Tween 20 transforming growth factor beta Tetramethylbenzidin Tumornekrosefaktor-α Tris(hydroxymethyl)-aminomethan Unter anderem United States of America Ultraviolett vascular endothelial growth factor receptor- 1/2/3

9 Einleitung 1 1 EINLEITUNG 1.1 Aufbau der Plazenta Die Plazenta ist ein nur während der Schwangerschaft auftretendes Gewebe im Uterus. Dieses wird aus fetalem (Chorion) und maternalem (Endometrium) Gewebe gebildet. Die humane Plazenta ist im ausgereiften Zustand etwa 600g schwer und hat einen Durchmesser von 15 bis 20 cm. Zwischen dem Chorion und der basalen Dezidua, die auch als maternale Basalplatte bezeichnet wird, befindet sich der intervillöse Raum. Dieser ist mit maternalem Blut gefüllt und wird von der Dezidua aus durch bindegewebige Septen in Kotyledonen unterteilt. Die Kotyledonen bestehen aus ca. 40 Zottenbäumen. Aufgebaut sind diese Zotten aus fetalem Bindegewebe und innenliegenden Blutgefäßen und werden von Zytotrophoblastenzellen umhüllt. Durch diese Zytotrophoblastenschicht erfolgt der Austausch von Nährstoffen, Gasen und die Produktion von Hormonen. Der direkte Kontakt von mütterlichem und fetalem Blut wird jedoch nie hergestellt (s. Abb. 1.1). Abb. 1.1 Schematischer Aufbau der humanen Plazenta. (aus Cochard et al., 2002) Der villöse Trophoblast und seine Differenzierung Der villöse Trophoblast ist die äußerste Zellschicht des in der menschlichen Plazenta vorkommenden Zottenbaumes. Dieser besteht aus einer Lage proliferierender Stammzellen mit direktem Kontakt zu dem Zytotrophoblasten und einer zweiten Lage, den multinuklearen Synzytiotrophoblasten. Diese

10 Einleitung 2 Lage besitzt keine laterale Zellgrenze, denn der Synzytiotrophoblast entsteht nur durch Fusion von Zytotrophoblastenzellen (Huppertz, 2005). Nur durch ständige Fusionen kann der Synzytiotrophoblast aufrechterhalten werden, da dieser aufgrund seines hohen Differenzierungsgrades die Fähigkeit zur Teilung und Regeneration verloren hat. Der villöse Trophoblast agiert wie ein klassisches Epithel: Altes Zellmaterial wird in sogenannten Synzytialknoten von der Plazenta abgegeben, die dann ins mütterliche Blut übergehen und von der Mutter entsorgt werden (Huppertz, 2005). Somit bildet der Trophoblast die strukturelle Grenze zwischen dem mütterlichen und dem fetalen Kompartiment. 1.2 Angiogenese Angiogenese bezeichnet die Entstehung neuer Blutgefäße (Kapillaren), überwiegend durch Sprossung aus einem vorgebildeten Kapillarsystem. Hiervon ist die Vaskulogenese zu unterscheiden, der primären Ausbildung des Gefäßsystems während der Embryonalzeit. Die Angiogenese ist während der Embryonalperiode für die Entwicklung des Embryos von großer Bedeutung. Beim ausgereiften Individuum tritt sie vor allem dann auf, wenn ein vermehrtes Blutgefäßwachstum benötigt wird, z.b. bei der Wundheilung oder dem Aufbau der Uterusschleimhaut (Volkmann, 2004). Als Voraussetzung für den koordinierten Ablauf einer Gefäßneubildung müssen Zellen, lösliche Faktoren und die extrazelluläre Matrix in komplexer Weise zusammenwirken (Berse, 2007). Die Wachstumsfaktoren binden dann an spezifische Rezeptoren, welche sich auf der Oberfläche von Endothelzellen befinden, die bereits Vorläufer-Blutgefäße auskleiden. Endothelzellen sind spezialisierte, flache Zellen, welche die Innenseite der Blutgefäße auskleiden. Sie können Gefäße bilden und hohen Blutdrücken in den Gefäßen standhalten. Zur Angiogenese kommt es durch die Aktivierung der Endothelzellen, wodurch diese ihren Zellkontakt verlieren und Proteasen sekretieren, welche die Basalmembran abbauen. Die Basalmembran ist die Grenze zwischen Endothelzellschicht und der vaskulären glatten Muskelschicht. Die Endothelzellen beginnen zu proliferieren und wandern entlang des Konzentrationsgefälles durch die aufgelöste Basalmembran. Die Blutgefäße wachsen somit in den Tumor und es entsteht somit ein neuer Kreislauf, so dass das Blut zirkulieren kann. Um zu migrieren, zu proliferieren und die Basalmembran sowie die extrazelluläre Matrix abzubauen, verändern Endothelzellen die Struktur ihres Zytoskelletes, exprimieren spezifische Oberflächenmoleküle und bilden proteolytische Enzyme. Bei der Regulation der Angiogenese spielen die Faktoren und Rezeptoren eine äußerst wichtige Rolle. Bei einer falschen Regulation in der Expression der Liganden und Rezeptoren kann es zu verschiedenen Krankheitsbildern, wie Arteriosklerose, Bluthochdruck, Tumorwachstum und Präeklampsie kommen. Eine Signalkaskade, mit dem Ziel die Regulation und Sekretion von verschiedenen proangi-

11 Einleitung 3 ogenen Wachstumsfaktoren (wie z.b. VEGF, PlGF, Ang1, Zytokine) zu erhöhen, die dann in der Umgebung abgegeben werden, wird z.b. durch eine lokale Hypoxie erzeugt. Wenn das Verständnis über die Expressionsregulation und Funktion der Gene für die Liganden und Rezeptoren verbessert wird, können neue Ansätze zur Therapie und Medikamentenentwicklung entwickelt werden (Carmeliet, 2007) Angiogenese bei der Entstehung von Krebs Im Gewebeverband benötigen menschliche Zellen zu ihrer Versorgung Sauerstoff und Nährstoffe und können deshalb nur in einem Umkreis von μm von Blutgefäßen überleben. Bei den meisten soliden Tumoren tritt deshalb bei einer Größe von 3-5 mm 2 ein Wachstumsstillstand ein, da die Versorgung der Tumorzellen durch Diffusion nicht mehr ausreicht. Durch den Anschluss an das Blutgefäßsystem sind das weitere Wachstum des Tumors und eventuelle Metastasierung möglich. Bei der Angiogenese in Tumoren werden dann Endothelzellen vorhandener Blutgefäße aktiviert. Diese teilen sich und produzieren proteolytische Enzyme. Nach der Proliferation migrieren die Endothelzellen in Richtung des Tumors und schließen ihn an das Blutgefäßsystem an (s. Abb. 1.2). Abb. 1.2 Schematischer Ablauf der Angiogenese. (A) Aktivierung der Endothelzellen durch proangiogene Wachstumsfaktoren (z.b. VEGF) (B) Abbau der Basalmembran der Blutgefäße durch Proteinasen (C) Migration und Proliferation endothelialer Zellen zum angiogenen Reiz hin (D) Aufbau einer Basalmembran um neugebildete Blutgefäße und Verbindung der neuen Blutgefäße (aus Berse, 2005) 1.3 VEGF-Rezeptor-Tyrosinkinase-System Tyrosinkinasen sind eine Gruppe von Proteinen aus der Familie der Proteinkinasen, deren Aufgabe die reversible Übertragung eines Phosphatrestes auf die Hydroxygruppe der Aminosäure Tyrosin

12 Einleitung 4 eines anderen Proteins ist. Dadurch wird die Aktivität des Zielproteins beeinflusst, weshalb Tyrosinkinasen als Teil von Rezeptorsystemen einen wichtigen Beitrag zur Signalübertragung leisten. Außerdem bilden Tyrosinkinasen den intrazellulären Teil des Tyrosinkinase-Rezeptorsystems, über das beispielsweise Signale von Wachstumsfaktoren weitergegeben werden. Abb. 1.3 Allgemeine Aktivierung eines Tyrosinkinase-Rezeptors. (A) Der Ligand bindet an die Rezeptor-Tyrosinkinase, (B) wodurch es zur Homo- oder Hetero-Dimerisierung und zur Phosphorilierung des Tyrosinrestes kommt. Dadurch wird die Protein-Tyrosinkinase unter Verbrauch von ATP aktiviert. (C) Es kommt zur Phosphorilierung weiterer Tyrosinreste, da eine Signalweiterleitung durch Phosphorilierungskaskaden erfolgt (aus Holm et al., 2008) VEGF Liganden-Familie Das VEGF/VEGFR-System (vascular endothelial growth factor) stellt das bisher am besten erforschte System in der Vaskulo- und Angiogeneseforschung dar. Die VEGFs zählen zu den Wachstumsfaktoren und den sogenannten Zytokinen, körpereigene hormonähnliche Botenstoffe, die auf Zellen eine aktivierende Wirkung ausüben und sie zu Teilung und Vermehrung anregen können. Identifiziert und sequenziert wurden die VEGF-Wachstumsfaktoren durch Leung et al. im Jahre 1989 (Berse, 2005). Es existieren fünf Liganden VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D sowie PlGF welche an drei Tyrosinkinase-Rezeptoren VEGFR-1, VEGFR-2 und VEGFR-3 binden, wo sie eine Rezeptordimerisierung und - aktivierung induzieren (s. Abb. 1.3). Die dadurch aktivierte Kaskade übermittelt Signale bis an den Zellkern und löst dort entsprechende Reaktionen aus (s. Abb. 1.5) (Mross, 2008). Zusätzlich können bestimmte Isoforme aus der VEGF-Familie an Neurophilin (NP)-1 und -2 binden, welche als Co-

13 Einleitung 5 Rezeptoren der drei Rezeptor-Tyrosinkinasen VEGFR-1, VEGFR-2 und VEGFR-3 dienen und die Gefäßfunktionen regulieren, welche von VEGFR-2 und VEGFR-3 vermittelt werden. Zu diesen Gefäßfunktionen zählen die Angiogenese und Lymphangiogenese. Prozesse die entscheidend für das Tumorwachstum und die Metastasenbildung sind (Cao, 2009). Man zählt die VEGFs zu einer strukturell verwandten Superfamilie von Wachstumsfaktoren, die auch den PDGF (platelet-derived growth factor), den PlGF (placental growth factor) sowie den TGF-ß (transforming growth factor beta) umfassen. Die Mitglieder dieser Familie sind sekretierte, dimere Glykoproteine mit einem Molekulargewicht von ungefähr 40 kda. Jeweils zwei Monomere verbinden sich über vier Disulfidbrücken zu einem Dimer. Die VEGFs bevorzugen hierbei die Bildung von Homodimeren. Allerdings sind Heterodimere zwischen VEGF-A und PlGF, VEGF-A und VEGF-B sowie zwischen VEGF-C und VEGF-D beschrieben worden (Mross, 2008). Zur Regulation der VEGF-Sekretion laufen in der Zelle komplexe Mechanismen ab. Eine wichtige Rolle spielt hierbei die Induktion der Transkription des VEGF-Gens durch Hypoxie (Berse, 2005), also einem Sauerstoffmangel im arteriellen Blut oder im Gewebe von Organismen, wodurch es zur Stabilisierung des Transkriptionsfaktors HIF-1 (hypoxia-inducible factor) kommt. Abb. 1.4 Übersicht der VEGF-Liganden und ihrer Rezeptoren VEGF-Rezeptoren Die VEGF-Rezeptoren sind Mitglieder der Rezeptor-Tyrosinkinase Familie. Bisher wurden hiervon drei (VEGFR-1, VEGFR-2 und VEGFR-3) in den 1990er Jahren charakterisiert. VEGFR-1 entspricht dem Flt-1

14 Einleitung 6 (fms-like receptor tyrosine kinase), VEGFR-2 dem KDR (kinase insert domain containing receptor) oder dem Flk-1 (fetal liver kinase-1) in der Maus und VEGFR-3 dem Flt-4. Man findet diese drei Rezeptoren vorwiegend auf Blutgefäß-, Lymphgefäß- sowie Endothelzellen, jedoch wurde der VEGFR-1 auch auf Mamma-, Kolon- und Pankreaskarzinomzellen und Trophoblasten nachgewiesen, sowie VEGFR-1 und VEGFR-2 auch auf Monozyten, Megakaryozyten, hämatopoetischen Stammzellen und Mesangiumzellen der Niere. Die Rezeptoren VEGFR-1 und VEGFR-2 bestehen aus sieben Immunglobulin (Ig) ähnlichen extrazellulären Domänen, wobei beim VEGFR-3 die fünfte Ig-ähnliche Domäne durch eine Disulfidbrücke ersetzt ist. Die Bindung des Liganden erfolgt bei den VEGF-Rezeptoren in Höhe der zweiten und dritten Ig-ähnlichen Domäne. Die vierte Domäne vermittelt die Dimerisierung der Rezeptoren, welche für die Aktivierung der Rezeptoren notwendig ist. Die tyrosinhaltige Abschnitte der intrazellulären Kinase-Domäne können durch Phosphorylierung unterschiedliche Signalkaskaden initiieren, die dann über unterschiedliche Signaltransduktionswege ablaufen (s. Abb. 1.5) (Mross, 2008). Abb. 1.5 Signalkaskaden in Abhängigkeit von der Phosphorylierung der Tyrosine im Tyrosinkinasebereich (aus Mross, 2008) Durch solche Signalkaskaden kommt es u.a. zur Aktivierung des inaktiven PKCs (Proteinkinase C). Proteinkinasen sind Enzyme, die eine Übertragung einer Phosphatgruppe von ATP auf Proteine katalysieren (Phosphorylierung). Durch die Aktivierung dieses PKCs ist dieses in der Lage, sich an die Zellmembran zu lagern und somit weitere Reaktionen für eine Zellantwort auszulösen (Koolmann, 1994). VEGFR-1 und VEGFR-2 sind bei der Bildung und Aufrechterhaltung von Blutgefäßen beteiligt, während VEGFR-3 hauptsächlich in der Lymphangiogenese involviert ist (Olsson et al., 2006).

15 Einleitung Der Placental Growth Factor (PlGF) Die vorliegende Bachelorarbeit beschäftigt sich mit der Regulation der Genexpression des placental growth factors (PlGF) in Endothelzellen. Der Wachstumsfaktor PlGF wurde durch Zufall von der Arbeitsgruppe um Graziella Persico entdeckt, deren eigentliches Ziel es war, die cdna für Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase aus einer PlazentacDNA-Bibliothek zu klonieren (Hauser, 1992). Der menschliche PlGF zählt zur Gruppe der VEGFs, da er mit diesen nahe verwandt ist (Maglione et al., 1991). Vor allem in der cysteinreichen Domäne zeigen beide einen hohen Grad an Sequenzhomologie. VEGF-A ist in der Lage an den VEGF-Rezeptor 1 (Flt-1) als auch an den VEGF-Rezeptor-2 (Flk-1) zu binden, während PlGF nur mit dem VEGF-Rezeptor- 1 eine Bindung eingeht (s. Abb. 1.6). Abb. 1.6 Strukturmodel des PlGF-1 und schematische Darstellung der Rezeptorbindungen des PlGF, VEGF-A und VEGF-B. In dem schwarzem Kreis ist eine dreiminensionale Struktur des PlGF-1 abgebildet, wobei in in der weißen Markierung ein Cysteinmotiv zu sehen ist. VEGFR-1 und VEGFR-2 bestehen aus 7 Immunglobulin-ähnlichen Domänen, einer Transmembranregion und einer Tyrosinkinase-Domäne. VEGFR-1 existiert außerdem als lösliche Form (svegfr-1), welche aus den sieben immunglobulin-ähnlichen Domänen aufgebaut ist. Die VEGFR-1 Rezeptoren gehen Bindungen mit PlGF, VEGF-A und VEGF-B ein, wobei die Neurophilin-1 Rezeptoren ausschließlich an PlGF und der VEGFR-2 Rezeptor ausschließlich an VEGF-A binden. (aus De Falco et al., 2002) Bislang sind drei unterschiedlich lange Unterformen des humanen PlGF beschrieben, welche alle von einem einzigen, differentiell gespleißten Gen (beim Menschen auf dem Chromosom Nummer 14) transkribiert werden. Yang et al. (Yang et al., 2003) entdeckte in HUVECs (human umbilical vein endothelial cells) und den menschlichen Trophoblasten noch eine vierte Splicingform des PlGF-Gens. Die Sequenz dieser PlGF-4 Form entspricht der Sequenz von PlGF-3, mit dem Unterschied, dass PlGF- 4 eine Heparinbindedomäne aufweist, welche bisher nur von PlGF-2 bekannt war. Der PlGF der Maus

16 Einleitung 8 ist auf dem Chromosom 12 kodiert und dem humanen PlGF-2 sehr ähnlich. Beide besitzen eine Heparinbindungsstelle. VEGF wurde als wichtiger Regulator der physiologischen und pathologischen Angiogenese beschrieben (Folkman und Shing, 1992). Bereits das Fehlen eines einzigen VEGF-Allels verursacht Defekte in der Blutgefäßentstehung, die mit dem Überleben von Mäuseembryonen nicht vereinbar sind (Carmeliet et al., 1996). Das Maus-PlGF wird durch 7 Exons auf dem Chromosom 12 kodiert. Durch eine gezielte Zerstörung (targeted disruption) der Bereiche 3, 4 und 6 kann eine Inaktivierung des PlGF-Gens erreicht werden (Carmeliet, 2001). Mäuse, deren PlGF-Expression verhindert ist (PlGF -/- ), sind im Gegensatz zu VEGF -/- Tieren überlebensfähig. Ebenfalls konnte bisher kein Einfluss von PlGF auf die Vaskulogenese oder die pränatale Angiogenese festgestellt werden (Carmeliet, 2001). Das PLGF generell das Wachstum von Gefäßen beeinflussen kann, ist in zahlreichen Studien der letzten drei bis vier Jahre nachgewiesen worden. Beispielsweise beschrieben Ziche et al. (Ziche et al., 1997), dass PlGF-1 in vivo (in der Kaninchenkornea) Angiogenese induzieren kann. In vitro wiesen sie eine stimulierende Wirkung auf Endothelzellmigration und -proliferation nach (Ziche et al., 1997) PlGF-Syntheseorte Tab. 1.1 Expression von PlGF in Geweben von Mensch und Maus. (+) PlGF wird exprimiert; (-) wird nicht exprimiert; (nb) nicht in der Quelle belegt (modifiziert nach: Persico et al., 1999) Mensch Gehirn + - Herz + - Niere - - Leber - - Lunge + + Bauchspeicheldrüse - - Plazenta + + Skelettmuskel + + glatter Muskel nb - Milz nb - Hoden nb + Schilddrüse + + Maus Die Expression von PlGF wurde schon in einigen Geweben und Organen untersucht (Persico et al., 1999). So wurde sie neben der Plazenta in Hirn, Herz und Lunge sowie im Skelettmuskel und in der Schilddrüse festgestellt. Dagegen konnte keine PlGF Expression in Niere, Leber und Pankreas, glattem Muskel, Milz und Hoden gefunden werden. In Endothelzellen humaner Umbilikalvenen (HUVEC`s), in

17 Einleitung 9 Rinderaortaendothelzellen (BAEC s) und in Pulmonalarterienendothelzellen von Kälbern (CPA`s) konnte ebenfalls PLGF Sezernierung nachgewiesen werden, in den (glatten) Gefäßmuskelzellen aber nicht (Persico et al., 1999) (s. Tab. 1.1) Mögliche Stimulatoren der PlGF-Expression Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) gehört zu den Phorbolestern und aktiviert die Protein-Kinase C aufgrund seiner Strukturähnlichkeit zu deren natürlichem Ligand und Aktivator Diacylglycerine (DAG) (Nishizuka, 1984). Durch seine PKC-aktivierende Eigenschaft ist PMA außerdem ein Induktor für die VEGFR-1-Expression, der Ausschüttung des natürlichen Rezeptors von PlGF (Hornig et al., 2000) Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) Der Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) ist ein Zytokin des Immunsystems, welches bei Entzündungsvorgängen beteiligt ist und hauptsächlich von Makrophagen, aber auch anderen Zelltypen, wie Lymphozyten und Endothelzellen, sezerniert wird. TNF-α kann Zellen zur Proliferation, Apoptose, Differenzierung und zur Ausschüttung anderer Zytokine anregen Fetal Calf Serum (FCS) Fetales Kälberserum (FCS) ist der Hauptbestandteil vieler Nährmedien und wird aus dem Blut von Rinderfeten gewonnen. Es enthält eine Vielzahl von Proteinen, von denen heute noch nicht alle bekannt sind. Unter diesen Proteinen befinden sich unter anderem Wachstumsfaktoren die für die Kultur von Endothelzellen essenziell sind Endothelial Cell Growth Factor (ECGF) ECGF (endothelial cell growth factor) ist ein Extrakt, welches aus dem Hirn von Rindern gewonnen wird. Es enthält Wachstumsfaktoren wie den fibroblast growth factor (FGF)-1 und FGF-2, weitere Bestandteile sind nicht genau geklärt. Für die Kultur von Endothelzellen ist ECGF ein wachstumsfördernder Bestandteil Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) ECGS (endothelial cell growth supplement) ist stofflich identisch zu ECGF und ebenfalls ein wachstumsfördernder Bestandteil des Kulturmediums humaner Zellen.

18 Einleitung Ziel dieser Arbeit Das Ziel dieser Arbeit besteht darin, dass Vorkommen und die Regulation des Proteins PlGF in Bezug auf Stimulation mit verschiedenen Faktoren und Mediatoren zu untersuchen. Hierzu existieren schon Vorarbeiten und Publikationen, welche jedoch hauptsächlich aus Northern Blots, RT-PCR und micro arrays stammen, d.h. sich auf Transkripte des Gens beziehen. Da bekannt ist, dass PlGF in sehr hohen Konzentrationen in den Trophoblasten der Plazenta exprimiert wird, soll die PlGF-Konzentration im Plazentagewebe genau quantifiziert und in ein Verhältnis zur Konzentration in Endothelzellen gesetzt werden. Einen wichtigen Aspekt dieser Arbeit bildet somit die exakte Quantifizierung des Vorkommens von PlGF in den Überständen von murinen und humanen Endothelzellen, sowie die Regulation der PlGF- Expression dieser Zellen, mit Hilfe bestimmter Zytokine und Wachstumsfaktoren. Um diese Quantifizierung erreichen zu können, wird ein hochempfindlicher Sandwich-ELISA eingesetzt.

19 Material und Methoden 11 2 MATERIAL UND METHODEN 2.1 Materialliste Geräte Tab. 2.1 Herkunft der eingesetzten Geräte Gerät Analysenwaage, A200S Trans Blot SD Semi Dry Brutschrank Labotec Inkubator C200 Multiscan 8-Kanal-Photometer Ex-405 Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer Pipetten, LABMATE (0,5-10; 2-20; ; µl) Sicherheitswerkbank, Herasafe HS12 Thermocycler, TProfessional Basic 96 Wasserbad Zell-Counter, CASY-1 Zentrifuge, 5417R Zentrifuge, 5417C Thermomixer, 5437 Elektrophoresis Power Supply, PS 608 Ultra Turrax T Hersteller Sartorius, Göttingen Bio-Rad, München Bolo Tec, Göttingen Labsystem, Finnland Nanodrop Technologies, Wilmington (USA) Abimed Analysen-Technik, Langenfeld Heraeus, Hanau Biometra, Göttingen Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel Schärfe System, Reutlingen Eppendorf, Hamburg Eppendorf, Hamburg Eppendorf, Hamburg GibcoBRL, USA Ika, Staufen Chemikalien, Reagenzien und Zusätze Die Laborchemikalien wurden von folgenden Firmen in analysenreiner Qualität bezogen: Tab. 2.2 Herkunft der verwendeten Chemikalien, Reagenzien und Zusätze Material Acrylamid (Rotiphorese Gel 30) BCIP color development substrate Dimethylsulfoxid (DMSO) DMEM Hersteller Roth, Karlsruhe Promega, Madison (USA) Serva, Heidelberg Sigma-Aldrich, Steinheim

20 Material und Methoden 12 Material EDTA Ethanol Ethidiumbromid Gelatine Glutamin Heparin Natrium Isopropanol Isotonische Salzlösung, CASY ton Magnesiumchlorid, 25mM Milchpulver (Blotting Grade Blocker) Natrium-Azetat NBT color development substrate Nicht essentielle Aminosäuren PBS-Tabletten Penicillin/Streptomycin (100x) Schwefelsäure Sequencing grade solution dntp`s TMB-Reagenz Trizol Trypsin/EDTA (10x) Tween 20 (Polyoxyethylene-sorbitan Monolaurate) β-mercaptoethanol Hersteller Sigma-Aldrich, Steinheim J.T. Baker, Deventer (Niederlande) Carl Roth GmbH, Karlsruhe Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Serva, Heidelberg J.T. Baker, Deventer (Niederlande) Roche, Reutlingen Promega, Madison (USA) Bio-Rad, München Merck, Darmstadt Promega, Madison (USA) Gibco Invitrogen Corporation, Karlsruhe Gibco Invitrogen Corporation, Karlsruhe PAA, Pasching (Österreich) Merck, Darmstadt GE-Healthcare, Wien Kementec Diagnostics, Kopenhagen (Dänemark) Invitrogen, Karlsruhe PAA, Pasching (Österreich) Sigma-Aldrich, Steinheim Serva, Heidelberg Puffer und Lösungen Alle Lösungen, Puffer und Medien wurden mit deionisiertem, über eine Milli-Q Filteranlage (Millipore) aufgereinigtem Wasser angesetzt. Tab. 2.3 Zusammensetzung der verwendeten Puffer und Lösungen Material Alkalische Phosphatase-Puffer Zusammensetzung 100mM Tris-Cl (ph 9,0), 150mM NaCl, 1mM MgCl 2

21 Material und Methoden 13 Material Zusammensetzung Assay Puffer (human PlGF-2 ELISA) 0,05%(v/v) Tween 20, 1%(w/v) BSA in PBS Assay Puffer (human sflt-1 ELISA) 1%(w/v) BSA in PBS Assay Puffer (mouse PlGF ELISA) 1%(w/v) BSA in PBS Blockpuffer (human PlGF ELISA) 0,1 %(v/v) Tween 20, 2%(w/v) BSA in 2x PBS Blockpuffer (human sflt-1 ELISA) 3%(w/v) Milchpulver in PBS DEPC-Wasser (RNase frei) 0,2%(v/v) DEPC in H 2 O (2x autoklaviert) Elektrophoresepuffer (1x) 25mM Tris, 197mM Glycin, 0,1%(w/v) SDS in H 2 O Gelatine Lösung 1%(w/v) Gelatine in PBS; 0,45 µm filtriert Green Go Taq Flexi Buffer 5x Promega, Madison (USA) Milchpuffer 50%(w/v) Milchpulver in TBS SDS-Sammelgel (7,5 %) 3 ml H 2 O, 1,25ml Sammelgelpuffer, 0,75ml Acrylamid (30%(v/v)), 100µl APS (10%(w/v)), 10µl TEMED SDS-Sammelgelpuffer 0,5M Tris-Cl, 0,4%(w/v) SDS, ph 6,8 SDS-Sample Buffer (4x) 4ml H 2 O, 1ml 0,5M Tris-Cl (ph 6,8), 0,8ml Glycerol, 1,6ml SDS (10%), 0,2ml Bromphenolblau (0,05%), 5%(v/v) β- Mercaptoethanol SDS-Trenngelpuffer 1,5M Tris-Cl, 0,4%(w/v) SDS, ph 8,8 TBE-Puffer (10x) 0,89M Tris-OH, 0,89M Borsäure, 0,02M EDTA TBS (1x) 20mM Tris-Cl, 150mM NaCl, ph 8 TBST 0,05%(v/v) Tween 20 in TBS Transferpuffer (1x) 48mM Tris-Cl, 20%(v/v) Methanol, 39mM Glycin, 0,037%(w/v) SDS, ph 8,2 Trenngel (15%) 2,3ml H 2 O, 2,3ml Trenngelpuffer, 5,4ml Acrylamid (30%(v/v)), 100µl APS (10%(w/v)), 10µl TEMED Waschpuffer (human PlGF, mouse PlGF ELISA) 0,05%(v/v) Tween 20 in PBS Waschpuffer (human sflt-1 ELISA) 50mM Tris-Cl, 0,2%(v/v) Tween 20; ph 8

22 Material und Methoden Proteine und Enzyme Tab. 2.4 Herkunft der eingesetzten Proteine und Enzyme Material Bovine Serum Albumin (BSA) rekombinantes human PlGF-2 rekombinantes human sflt-1 rekombinantes mouse PlGF-2 sflt-1(6) Streptavidin-Poly-Horseradish peroxidase Streptavidin-Poly-Horseradish peroxidase Taq-Polymerase Hersteller Sigma-Aldrich, Steinheim ReliaTech, Wolfenbüttel ReliaTech, Wolfenbüttel R&D Systems, USA ReliaTech, Wolfenbüttel Pierce, IL, USA R&D Systems, USA Promega, Madison (USA) Antikörper Tab. 2.5 Übersicht über die Herkunft der verwendeten Antikörper Material anti-plgf K1425 anti PlGF K1425, biotinyliert anti-human PlGF (#178/G10) anti-human PlGF (#178/G10), biotinyliert anti-mouse IgG-HRP Konjugat anti-rabbit IgG AP Konjugat anti-vegfr-1 791, biotinyliert (Protein A gereinigt) goat anti-mouse PlGF-2, biotinyliert mouse anti-vegfr-1 Clon Flt 19 (Protein G gereinigt) rat anti-mouse PlGF-2 Hersteller ReliaTech, Wolfenbüttel ReliaTech, Wolfenbüttel ReliaTech, Wolfenbüttel ReliaTech, Wolfenbüttel Promega, Madison (USA) Promega, Madison (USA) ReliaTech, Wolfenbüttel R&D Systems, USA ReliaTech, Wolfenbüttel R&D Systems, USA Zellkulturmaterial Die für die Zellkultur verwendeten Medien wurden bei 121 C und 2 bar, für 20 Min 2 x autoklaviert oder über Filter (verschiedene Volumina, 0,22 und 0,45µm, Millipore Corporation, Billercia, USA) sterilfiltriert. Zellkulturmaterialien wurden als sterile Einmalartikel von folgenden Firmen bezogen: Becton Dickinson, USA

23 Material und Methoden 15 Greiner Bio-One, Frickenhausen Nunc, Wiesbaden Sarstedt, Nümbrecht Tab. 2.6 Übersicht der Verwendeten Zellkultur-Medien Medium MBE-Medium Heidelberger Art Endothelial Cell Media MV, PromoCell Zusammensetzung / Hersteller 15 %(v/v) FCS, 1%(w/v) Pen/Strep, 1%(w/v) Glutamin, 1%(v/v) n.e. Aminosäuren, 100µg/ml ECGF, 50µg/ml Heparin, 50µM β- Mercaptomethanol in DMEM Heidelberg Growth Medium enthält zusätzlich: 5%(v/v) FCS, 4 µl/ml ECGS, 90 µg/ml Heparin, 1µg/ml Hydrocortison, 1%(w/v) Pen/Strep Tab. 2.7 Übersicht der eingesetzten Zellkulturen Zellen Zelltyp Ursprungsorgan Quelle HUVEC, p4-9 Endothelzelle humane Nabelschnur Cambrex, USA SNO-MEC, p23-40 Endothelzelle Mauslunge HZI SNO-MEC Subclone C9 Endothelzelle Mauslunge HZI Zellbiologisch wirksame Substanzen Tab. 2.8 Herkunft der verwendeten zellbiologisch wirksamen Substanzen Material ECGF bovine FCS FCS PMA TNF-α ECGS Hersteller HZI, Braunschweig Biowest, Nuaille (Frankreich) PromoCell, Heidelberg Sigma-Aldrich, Steinheim Sigma-Aldrich, Steinheim PromoCell, Heidelberg

24 Material und Methoden Synthetische Oligonucleotide Die für die PCR verwendeten Primer wurden u.a. bei der Firma Operon, Köln synthetisiert. Tab. 2.9 Übersicht der eingesetzten Primer Primer Größe des PCR-Produkt [bp] Sequenz 5 3 Quelle h/m β-actin (for) GACGAGGCCCAGAGCAAGAG-3 K. Greger h/m β-actin (rev) ATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3 K. Greger mplgf (for) CACTTGCTTCTTACAGGTCC-3 Feeney, 2003 mplgf (rev) CACCTCATCAGGGTATTCAT-3 Feeney, Kits Tab Herkunft der verwendeten Kits Material First-Strand cdna Synthesis Kit mouse PlGF-2 DuoSet ELISA Development kit ECL Western blotting detection reagents BCA Protein Assay Kit Hersteller GE Healthcare, Buckinghampshire (UK) R&D Systems, USA Pierce, Rockford (USA) Pierce, Rockford (USA) 2.2 Primäre Zellkulturen Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) Die verwendeten Nabelschnurendothelzellen (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) wurden ursprünglich aus den Venen der Nabelschnur isoliert und sind von der Firma Lonza (Schweiz) bezogen worden. Da diese Endothelzellen ein adhärentes Verhalten aufweisen, bilden sie während ihres Wachstums in-vitro Monolayer auf dem Boden von Kulturgefäßen aus. Zu Beginn der Forschungsarbeit sind diese Zellen in Passage drei aufgetaut und bis Passage fünf kultiviert worden. Um diese für spätere Experimente zur Verfügung zu haben wurden sie mit dieser Passage in flüssigem Stickstoff eingefroren. Für die erneute Kultivierung ist je ein CryoTube TM, mit ca Zellen in einer T25- Zellkulturflasche (25 cm 2 ) ausgesät worden, welche mindestens eine Stunde vor der Kultivierung mit 1%iger Gelatine-Lösung beschichtet wurde. In Endothelial Cell Medium MV konnten ideale Wachs-

25 Material und Methoden 17 tumsbedingungen hergestellt werden, so dass die Zellen bereits nach zwei Tagen konfluent waren. Alle Experimente sind in den Passagen fünf bis neun durchgeführt worden Susanne Norgall-Microvascular Endothelial Cells (SNO-MECs) Die murinen SNO-MECs (Susanne Norgall Microvascular Endothelial Cells) sind in derselben Arbeitsgruppe in einer vorangegangenen Arbeit von Susanne Norgall isoliert worden und stammen aus Blutgefäßen der Mauslunge. In-vitro bilden diese Endothelzellen in Zellkulturgefäßen, aufgrund ihrer Adhärenz, ebenfalls Monolayer. Aufgetaut wurden diese Zellen in Passage 23, wobei sie hierbei in Kulturflaschen mit einer 1%igen Gelatinebeschichtung ausgesät wurden. Die Experimente erfolgten bis Passage 40. Die Zellen zeigen ein sehr schnelles Wachstum, das hier verwendete Medium ist MBE-Medium Heidelberger Art. Für die Experimente standen zusätzlich Subklone dieser Endothelzellen zur Verfügung, welche in Passage 61 aufgetaut wurden. 2.3 Zellkultur Alle Zellkulturarbeiten sind an einer sterilen Sicherheitswerkbank von Heraeus (Herasafe H12, Hanau) durchgeführt worden. Als Kultivierungsgefäße dienten Zellkulturflaschen mit einer Kultivierungsoberfläche von 25 cm 2 (T-25) oder 6-Well-Multischalen. Diese Gefäße wurden mit 1% Gelatine in PBS beschichtet, um die Adhärenz der Zellen zu gewährleisten. Kultiviert wurden die Zellen im Brutschrank bei 37 C, 5% CO 2 und einer relativen Luftfeuchte von 95% Auftauen und Einfrieren von Zellen Da alle verwendeten Zellen zur längeren Lagerung in flüssigem Stickstoff aufbewahrt wurden, mussten sie für alle folgenden Arbeiten aufgetaut werden. Die Zellen wurden deshalb aus dem Stickstofftank geholt und bei -70 C zwischengelagert, um möglicherweise noch enthaltenen Stickstoff entweichen zu lassen. Anschließend wurde das CryoTube TM in ein 37 C warmes Wasserbad überführt, bis die Zellen getaut waren. Die Zellen wurden nun in ein mit Medium vorgelegtes Zentrifugenröhrchen überführt und dieses ist mit 800 rpm bei RT für fünf Minuten abzentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet in einer definierten Menge an Medium gelöst. Diese Suspension wurde in eine T-25 Zellkulturflasche (25 cm 2 Kulturfläche) gegeben und auf ein Endvolumen von 5 ml aufgefüllt. Inkubiert wurde im Brutschrank, wie oben beschrieben, bei 37 C, 5% CO 2 und bei einer relativen Luftfeuchte von 95%. Das Einfrieren von Zellen setzt eine sterile Herstellung des Einfriermediums aus Vollmedium mit 20% FCS und 10 % DMSO voraus. Dabei wirkt DMSO (Dimethylsulfoxid) als Gefrierschutzmittel und verhindert Kristallbildung innerhalb und außerhalb der Zellen. Die für die Langzeitlagerung vorgesehe-

26 Material und Methoden 18 nen Zellen wurden von der Kulturoberfläche abgelöst, in Medium aufgenommen und abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde anschließend im gekühlten Einfriermedium resuspendiert und unmittelbar danach auf die Einfrier-Vials aufgeteilt, um dann zum schonenden Herunterkühlen in einem Behälter mit Isopropanol (Cryo Freezing Container) für mindestens 12h bei -70 C zwischengelagert zu werden. Am Folgetag konnten die Vials in den Stickstofftank zur Langzeitlagerung bei -196 C überführt werden Medienwechsel Da nach einer gewissen Zeitspanne, je nach Wachstumsgeschwindigkeit der Zellen, bestimmte Medienzusätze mit der Zeit verbraucht waren oder bei einer Temperatur von 37 C langsam zerfallen, benötigen alle verwendeten Endothelzellkulturen zur Erhaltung ihrer Zellvitalität regelmäßig einen Wechsel des Mediums. Dieser Medienwechsel wurde bei schnellwachsenden Kulturen alle zwei bis drei Tage mit auf 37 C vorgewärmtem frischen Medium durchgeführt. Dafür wurde unter der Sterilwerkbank das alte Medium abgesaugt und frisches hinzugegeben. Eine Übersicht der verwendeten Medien ist in Tab. 2.6 aufgeführt Subkultivierung von Zellen Adhärente Zellen wachsen in der Regel nicht mehr weiter, wenn die Kulturschale von den Zellen komplett eingenommen wurde. Haben die Zellen also eine konfluente einlagige Zellschicht (Monolayer) ausgebildet, mussten sie vom Boden des Zellkulturgefäßes abgelöst und eine Subkultur mit geringer Zelldichte angelegt werden (Passagierung). Die dafür häufigste Methode ist die enzymatische Ablösung mit Hilfe von Trypsin/EDTA-Lösung. Dabei ist zu beachten, dass die Zellen mit dem aktiven Trypsin nicht zu lang in Kontakt treten, da Trypsin/EDTA die Zelloberflächenrezeptoren stark angreift. Nach dem Entfernen des Mediums und zweimaligen Waschen mit calcium- und magnesiumfreien PBS konnte durch Zugabe von Trypsin/EDTA die enzymatische Ablösung erfolgen. Der Ablösevorgang wurde mit Vollmedium abgestoppt und die Zellen sind mit einer Dichte von mindestens Zellen/cm 2 in einem neuen Kulturgefäß ausgesät worden Zellzählung Zur Bestimmung der Zellzahl wurden zwei Methoden angewendet, die nachfolgend genauer vorgestellt werden: Elektronische Zählung: Casy 1 Cell Counter und Analyse System TT Optische Zählung: Neubauer-Zählkammer

27 Material und Methoden Casy1 Cell Counter Das elektronische Zellzählgerät arbeitet nach dem Widerstandsprinzip. Zur Messung der Zellzahl wurden 50 µl der Zellprobe in 10 ml einer isotonischen, partikelreinen Salzlösung (CASYton) mit definierter Leitfähigkeit gelöst. Ein Aliquot wurde anschließend mit konstanter Strömungsgeschwindigkeit durch eine Kapillare definierter Geometrie gesaugt. Beim Durchtritt durch die Messkapillare verdrängten die Zellen eine ihrem Volumen entsprechende Menge der Elektrolytlösung. Dadurch kam es zu einer Widerstandserhöhung entlang der Kapillarstrecke, welche als Impuls gemessen wurde. Die Anzahl der aufgezeichneten Impulse entsprach der Anzahl der Zellen in der Probe Neubauer-Zählkammer Zur Überprüfung der Zellzahl wurde seltener als der Casy1 Cell Counter die Neubauer-Zählkammer eingesetzt. Für diese Zählung sollte die Konzentration der Zellsuspension idealerweise 10 5 Zellen/ml betragen. Die Zellsuspension wurde in die Zählkammer gefüllt. Diese besteht aus neun 1 mm 2 großen Quadraten. Bei einer Tiefe von 0,1 mm beträgt das Volumen der beinhaltenden Lösung 0,1 µl. Zur sicheren Bestimmung der Zellzahl wurden mindestens vier der großen Quadrate ausgezählt und davon der Mittelwert bestimmt. Die Berechnung der Zellzahl/ml ergibt sich aus dem ermittelten Mittelwert multipliziert mit dem Faktor Die Gesamtzellzahl berechnet sich aus dem Volumen der Zellsuspension mal der Zellzahl pro ml. 2.4 In-vitro Stimulationsversuche Um herauszufinden, in welcher Form die Expression des Proteins PlGF der verwendeten Endothelzellen beeinflusst werden kann, wurden diese mit verschiedenen Stimulatoren und Wachstumsfaktoren behandelt. Für alle Stimulationen sind konfluent gewachsene Zellen in 24-well-Platten mit einer Dichte von 1-1,5 x 10 4 Zellen/cm 2 subkultiviert worden. Die Inkubation erfolgte für 72 bzw. 96 h bei 37 C und 5 % CO PMA-Stimulation Zur Stimulation mit PMA (Phorbol-12-Myristate-13-Acetate) wurden die Endothelzellen mit Konzentrationen im Bereich von von 0-50 ng/ml stimuliert. Dies geschah durch die Zugabe der gewünschten PMA-Konzentration zum Endothelzell-Vollmedium.

28 Material und Methoden TNF-α-Stimulation Die Stimulation mit TNF-α (Tumornekrosefaktor-α) erfolgte nach demselben Prinzip wie die Stimulation mit PMA. Hierbei wurden jedoch Konzentrationen im Bereich von 0-20 ng/ml TNF-α eingesetzt FCS Stimulation FCS (fetal calf serum) spielt für die Lebensfähigkeit der Endothelzellen in-vitro eine essenzielle Rolle. Daher ist davon auszugehen, dass in FCS enthaltende Substanzen für die Expression des Wachstumsfaktors PlGF ebenfalls eine regulierende Wirkung ausüben. Um im Medium die verschiedenen Konzentrationen an FCS zu erhalten, wurde vor Beginn der Stimulation ein Medium mit allen Supplementen bis auf FCS erstellt. Anschließend wurden die Zellen in Medium mit einem FCS-Gehalt im Bereich von 0-30% kultiviert ECGF/ECGS-Stimulation Der endothelial cell growth factor (ECGF) bzw. das endothelial cell growth supplement (ECGS) sind ebenfalls essenzielle Bestandteile für das Wachstum der Endothelzellen in Kultur. ECGF wird hierbei im murinen und ECGS im humanen Medium zugesetzt. Es wurden ebenfalls Medien mit allen Supplementen bis auf ECGF/ECGS angefertigt, somit konnten die Zellen mit ECGF-Konzentrationen im Bereich von µg/ml und ECGS-Gehältern im Bereich von 0-8 µl/ml kultiviert werden. 2.5 Nachweismethoden Sandwich-ELISA Der ELISA (enzyme-linked immunsorbent assay) stellt ein Testsystem dar, mit dessen Hilfe Antigenmengen quantitativ bestimmt werden können. Dabei dient eine Enzym-Substratumsetzung als Indikatorreaktion. Mit Hilfe dieses Assays können Proteine und Viren sowie Hormone, Toxine und Pestizide in verschiedenen Proben z.b. in Blutseren, Milch oder Urin quantitativ nachgewiesen werden. Bei der praktischen Durchführung unterscheidet man zwischen dem direkten und dem indirekten ELISA. Beim direkten ELISA wird das Antigen durch einen Detektionsantikörper nachgewiesen. Im Gegensatz zur indirekten Methode, bei der ein erster Antikörper spezifisch an das Antigen bindet, wird ein zweiter Detektionsantikörper benötigt, der gegen den ersten Antikörper gerichtet ist. Beim hier durchgeführten indirekten Sandwich-ELISA verwendet man zwei Antikörper die mit verschiedenen Epitopen spezifisch an das nachzuweisende Antigen gebunden werden. Zunächst wird der erste Antikörper (coating Antikörper) unspezifisch über hydrophobe Wechselwirkungen an einem festen Träger immobilisiert, z.b. einer 96-well-Platte. Die nachzuweisende Probe sowie der Standard

29 Material und Methoden 21 mit bekannten Konzentrationen werden anschließend in die Wells gegeben und inkubiert. Während dieser Zeit bindet der an die Platte gebundene Antikörper das in der Probe nachzuweisende Antigen. Überschüssiger Antikörper wird nach der Inkubationsphase durch sorgfältiges Waschen entfernt und ein zweiter biotingekoppelter Antikörper wird zugegeben. Dieser bindet wieder spezifisch an ein Epitop des Analyten. An den so entstandenen Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplex kann durch die selektive Bindung von Streptavidin an Biotin, welches mit der Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiert ist, gebunden werden. Abb. 2.1 Schematische Darstellung eines spezifischen Sandwich-ELISA. (modifiziert nach: Dieses Enzym oxidiert nach Zugabe von TMB (Tetramethylbenzidin) zu einem Radikal (blau). Mit Hilfe von Schwefelsäure wird das Enzym inaktiviert und es erfolgt ein Farbumschlag nach gelb. Aus der Farbintensität der Probe ergibt sich die Konzentration des Antigens, wenn diese von einer erstellten Kalibrierfunktion aus den Standards abgelesen wird. Die Farbintensität ist umso intensiver, desto größer die Antigenkonzentration in der Probe ist (s. Abb. 2.1) (Glick und Pasternak, 1995). Durchführung des human PlGF-Sandwich ELISA: Der humane PlGF-Sandwich ELISA wurde zur Konzentrationsbestimmung von PlGF in Überständen humaner Zellen sowie in Lysaten von Plazentagewebe und HUVEC-Zelllysaten durchgeführt. Zuerst wurde eine 96-well-Platte über Nacht bei 4 C mit 50 µl/well anti-human PlGF (#178/G10; c = 500 µg/ml, Endkonzentration 1 µg/ml, verdünnt in PBS) beschichtet. Ungebundene Antikörper wurden am folgenden Tag durch dreimaliges Waschen mit Waschpuffer (0,05% Tween 20 in PBS) ent-

30 Material und Methoden 22 fernt. Um unspezifische Bindungen zu vermeiden, wurde mit 200 µl/well Blockpuffer (0,1% Tween 20, 2% BSA in 2x PBS) für 2,5 Stunden bei RT blockiert. Anschließend wurde die Platte wieder dreimal mit Waschpuffer gewaschen. Dann mit 100 µl/well Standard (c = 1 µg/ml, Standardreihe von 1 ng/ml bis 0,016 ng/ml, verdünnt in 0,05% Tween 20, 1% BSA in PBS; ReliaTech) und den Proben (verdünnt in 0,05% Tween 20, 1% BSA in PBS) für eine Stunde bei RT inkubiert. Nach dem nächsten Waschvorgang wurde für eine Stunde bei RT mit dem biotinylierten Detektionsantikörper (0,5 µg/ml, verdünnt in 0,05% Tween 20, 1% BSA in PBS; ReliaTech) inkubiert. Nach Ablauf der Zeit folgte ein erneuter Waschvorgang und die Wells wurden mit 50 µl/well Streptavidin-Poly-HRP-Konjugat (1:50, 1:1000 Endverdünnung; Pierce, 1 mg/ml) für 20 Min inkubiert. Vor der Zugabe des Substrates erfolgten erneut drei Waschschritte. Die Oxidation des TMB-Farbreagenz (Kementec Diagnostics) durch das Enzym wurde durch eine Blaufärbung sichtbar. Die Reaktion ist nach 5 bis 30 Min bei deutlicher Blaufärbung durch Zugabe von 50µl/well 0,5M Schwefelsäure gestoppt worden. Nach erfolgtem Farbumschlag wurde die Gelbfärbung mit einem Multiscan 8-Kanal-Photometer Ex405 bei einer Wellenlänge von 450/620nm gemessen. Durchführung des mouse PlGF- Sandwich ELISA: Der mouse PlGF-Sandwich ELISA wurde zur Konzentrationsbestimmung von PlGF in Überständen muriner Zellen durchgeführt. Hierzu wurde das DuoSet ELISA Development Kit (R&D Systems, Minneapolis, USA) verwendet RNA-Isolation Bei der Isolation von RNA aus Zellmaterial werden die Zellen in ein organisches Lösungsmittel aufgenommen, wodurch diese lysieren und eine Abtrennung der RNA von anderen Molekülklassen wie Proteinen oder Lipiden ermöglicht wird (Wink, 2004). Da bei der kompletten RNA-Isolation RNase frei gearbeitet wird, sollte mit DEPC-Wasser (2x autoklaviert) gearbeitet werden. Durch das vorangegangene Autoklavieren des DEPC-Wassers wird die Aktivität der RNasen zerstört (Mülhardt, 2006). Durchführung: Die RNA-Isolation erfolgte mittels eines Trizol-Protokolls nach der Anleitung des Herstellers GIBCO- BRL (saure Phenolmethode). Dabei wurden die Zellen einer konfluenten T25-Flasche nach Entfernen des Mediums mit PBS gewaschen. Anschließend wurde 1 ml TRIzol-Reagenz (Gibco BRL, Karlsruhe) auf die Zellen gegeben, die bei einer fünf minütigen Inkubationszeit bei RT lysierten. Danach wurde die Lösung homogenisiert. Die Suspension wurde anschließend in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und nach Zugabe von 200 µl Chloroform gemischt, bis eine homogene, weißliche Emulsion entstand. Durch 15-minütiges Zentrifugieren (11000 rpm, 4 C, 15 Min) wurde die RNA von den Proteinen und der DNA getrennt. Proteine und DNA sammeln sich in der unteren, trüben, organischen

31 Material und Methoden 23 Phase, während sich die RNA in der unteren, klaren, wässrigen Phase befindet. Diese klare Phase wurde nach der Zentrifugation mit einer 100µl Pipette vorsichtig abgenommen und in ein neues Reaktionsgefäß gegeben (insgesamt ca. 500 µl). Nach Zugabe von 500 µl Isopropanol wurde wieder gut gemischt, jedoch nicht auf dem Vortexer. Die RNA-Extraktion kann hier unterbrochen und die bisher gewonnene RNA-Chloroform-Isopropanol-Suspension (ca ml) bei -20 C über mehrere Tage konserviert werden. Nachdem die Suspension für 10 Min zentrifugiert wurde (11000 rpm, 4 C, 15 Min), wird die RNA als kleines Pellet am Boden des Reaktionsgefäßes sichtbar. Der Überstand wurde nun abgenommen und das Pellet mit 200 µl Ethanol (100%) durch mehrmaliges Resuspendieren mit einer Pipette gewaschen und wieder abzentrifugiert (15 Min, rpm, 4 C). Der Überstand wurde wieder abgenommen und das Pellet bei RT getrocknet. Zuletzt wurde es in 100 µl DEPC-Wasser mit 10 µl 3M Natriumacetat und 250 µl Ethanol (100%) gelöst und über Nacht bei -20 C gelagert. Um die Konzentration an isolierter RNA zu bestimmen, wurden 150 µl des Ansatzes entnommen und für 20 Min bei rpm und 4 C zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgenommen und das verbleibende Pellet getrocknet. Nach dem Trocknungsvorgang wurde es in 10 µl DEPC-Wasser durch 15 minütiges Erhitzen bei 60 C gelöst. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte am Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer. Dabei wurde die OD bei 260 und 280nm gemessen cdna-synthese Für ein anschließendes PCR-Verfahren muss die RNA zuerst in die DNA umgeschrieben werden, da diese nicht direkt amplifiziert werden kann. Hierfür benötigt man eine Reverse Transkriptase (RTase), ein Enzym, das eine komplementäre DNA (cdna) von der RNA erstellt. Die cdna-synthese funktioniert mit Hilfe des poly(a)-schwanzes am 3 -Ende der mrna, an den ein Oligo(dT)-Primer komplementär angelagert wird. Dieser liefert dann die 3 OH-Gruppe für die RTase. Diese RTase synthetisiert anschließend, mit vier verschiedenen dntps, eine Kopie der mrna. So entsteht ein cdna mrna Hybrid. Nachdem die mrna durch alkalische Hydrolyse abgebaut wurde, erhält man anschließend die einzelsträngige cdna (Nicholl, 1995). Durchführung: Die cdna wurde mit Hilfe des First-Strand cdna Synthesis Kits der Firma GE Healthcare synthetisiert. Als Probenmaterial dienten 5 µg RNA.

32 Material und Methoden Die Polymerasekettenreaktion (PCR) Die PCR (polymerase chain reaction) ist eine wichtige Methode der Molekularbiologie, mit der man eine bestimmte Zielsequenz schon mit wenigen Schritten stark amplifizieren kann (Nicholl, 1995). Sie diente in der vorliegenden Arbeit zum Nachweis des PlGF-Gens in Endothelzellen. Zur Vervielfältigung benötigt man außer der DNA noch zwei Primer. Zur Erzeugung dieser Primer müssen etwa 20 zusammenhängende Nucleotide beider Doppelstränge bekannt sein. Von diesen kurzen Oligonucleotiden gibt es jeweils einen forward und einen reverse Primer (s. Tab. 2.9). Sie dienen während der PCR als Startpunkte für die DNA-Synthese der Doppelstränge. Des Weiteren werden die vier Nucleotide, Puffer, der Templatestrang sowie ein synthetisierendes Enzym, die Polymerase, benötigt. Hierfür wird meist die Taq-Polymerase des Bakteriums Thermus aquaticus eingesetzt. Da das Bakterium in heißen Quellen lebt, weißt das Enzym ein Aktivitätsmaximum bei 74 C auf. Ein PCR-Zyklus besteht grundsätzlich aus drei Schritten: Der Denaturierung, wobei durch kurzzeitiges Erhitzen der Lösung auf ca. 95 C die beiden DNA-Stränge voneinander getrennt werden. Der nächste Schritt ist die Hybridisierung mit den Primern. Hier wird durch Abkühlen auf die Primer-spezifische Annealingtemperatur eine Hybridisierung der Primer mit jeweils einem dazu komplementären Einzelstrang der DNA ermöglicht. Da die Primer im großen Überschuss zugegeben werden, erfolgt praktisch keine Rückbildung des Doppelstranges aus den beiden Einzelsträngen. Der dritte Schritt ist die Extension. Nach Erhitzen der Lösung auf die optimale Reaktionstemperatur der Taq-Polymerase kommt es durch die Polymerase zur Verlängerung der beiden Primer in 5 3 Richtung. Die Folge ist die Replikation der beiden Stränge. Der Zyklus aus Denaturierung, Hybridisierung der Primer und Extension kann je nach Stabilität der Reagenzien und Art des PCR-Gerätes bis zu zwischen 30- und 40-fach wiederholt werden, so dass vom Amplifikat viele hundert Millionen Kopien vorliegen. Zur Dokumentation der Transkripte werden die Probenansätze und Standards elektrophoretisch in einem 1%igem Agarosegel aufgetrennt und analysiert. Durch eine Anfärbung der DNA mit Ethidiumbromid wurde diese im Gel unter UV-Licht sichtbar. Die Menge des interkalierenden Farbstoffes ist hierbei proportional zur DNA-Menge in der Probe. Durchführung: Für diese Arbeit wurden PCR-Ansätze für das PlGF-Gen durchgeführt. Es wurde bei jedem Versuch eine PCR mit β-actin-primern als Positivkontrolle für das Vorhandensein von mrna durchgeführt, da dieses Gen in jeder Zelle aktiv ist. Zu Beginn der PCR wurde ein Reaktionsmix aus cdna, Magnesiumchlorid, 5x Puffer (Green Go Taq Flexi Buffer 5x), dntps, Taq-Polymerase, for/rev Primern und Wasser erstellt (s. Tab. 2.11) und homogenisiert. Die verwendeten Primer sind in Tab dargestellt. Nach Erstellung der PCR-Ansätze wurden diese in den PCR-Block gestellt und die PCR im Thermocycler nach spezifischer Programmeingabe gestartet (s. Tab. 2.12).

33 Material und Methoden 25 Tab PCR-Reaktionsansatz. Agenzien Konzentration Eingesetzte Menge [µl] dntps 2,5 mm 1,6 MgCl 2 25 mm 1,2 PCR-Puffer 5x 4,0 Primer (for) 10 µm 2,5 Primer (rev) 10 µm 2,5 Taq-Polymerase - 0,25 cdna (1:100) - 2,0 DEPC-H 2 O - 5,95 Gesamtmenge - 20 Zum Nachweis der Transkripte folgte eine Agarose-Gelelektrophorese. Hierzu wurde ein 1%iges Agarosegel in die Gelkammer gegossen. Nach Abkühlen des Geles wurde die Kammer mit 1x TBE-Puffer aufgefüllt. Als Größenmarker diente ein 100bp DNA Ladder von dem 6 µl auf das Gel aufgetragen wurden. Die amplifizierten DNA-Sequenzen der einzelnen Proben wurden zu je 10 µl in die Geltaschen pipettiert. Im Anschluss daran wurde die Kammer verschlossen und die Elektrophorese mit 90 V für eine Stunde gestartet. Danach konnten die Banden unter UV-Licht sichtbar gemacht werden. Tab Übersicht der eingesetzten PCR-Programme. Gen PCR-Programm (`=min, ``=sek) β-actin 1x(95 C, 5`) 29x(94 C, 60``/55 C, 60``/72 C, 90``) 1x(72 C, 5`) 1x(15 C, 24h) mplgf 1x(95 C, 5`) 28x(94 C, 45``/57 C, 60``/72 C, 90``) 1x(72 C, 5`) 1x(15 C, 24h) Tab Primer für die PCR. (rev = reverse, for = forward Primer). Die Primer wurden über die Firma Operon (Köln) bezogen) Primer PCR Produkt [bp] Sequenz 5 3 h/m β-actin (for) GACGAGGCCCAGAGCAAGAG-3 h/m β-actin (rev) ATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3 mplgf (for) CACTTGCTTCTTACAGGTCC-3 mplgf (rev) CACCTCATCAGGGTATTCAT-3

34 Material und Methoden Lysatherstellung und BCA-Proteinbestimmung Herstellung von Gewebelysat Für die Herstellung von Lysaten aus Plazentagewebe wurde gefrorenes Gewebe in 1 ml RIPA-Puffer mit RNase-Inhibitor homogenisiert. Hierzu wurde das Gewebe und der Puffer mit Hilfe eines Dispergiergerätes (Ultra Turrax T) zerkleinert. Anschließend wurden die Proben für 5 Min bei 3000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Gefäß überführt und die Proben bei -70 C gelagert Herstellung von Zell-Lysat Bei der Herstellung von Endothelzell-Lysat wurden Zellen einer konfluent gewachsenen T-75 Zellkulturflasche lysiert. Dafür wurde das Medium der Zellen abgenommen, die Zellen einmal mit PBS gewaschen und anschließend 1 ml RIPA-Buffer auf die Zellen gegeben. Nachdem sich diese vom Boden abgelöst hatten, wurden sie in ein Eppendorfgefäß überführt und bei -70 C eingefroren BCA-Proteinbestimmung Die Bestimmung des Gesamtproteingehalts der Lysate erfolgte mittels des BCA TM Protein Assay Kits. Hierfür wurden 1-3 µl Zell-/Gewebe-Lysat eingesetzt Western Blot SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS) Bei der SDS-Gelelektrophorese kommt es durch Reptation der Probemoleküle entlang der porösen Polyacrylamidmatrix zur Auftrennung der Proteine. Das Tensid SDS kann hierbei an den Proteinen angelagert werden, wodurch es zur Entstehung eines SDS-Protein-Komplexes kommt. Die Proteine haben dadurch eine negative Ladung, vergleichbar hydrodynamische Eigenschaften und unterscheiden sich lediglich in ihrer Größe. Der SDS-Protein-Komplex wandert anschließend im elektrischen Feld zum Plus-Pol (Rehm und Letzel, 2010). Für die SDS gibt es grundsätzlich zwei Varianten, die reduzierende und die nicht-reduzierende Methode. Bei der reduzierenden Methode wird dem Probenpuffer 2-Mercaptoethanol als reduzierendes Agens zugesetzt. Durch 2-Mercaptoethanol werden Disulfidbrücken reduziert und Quartär- sowie Tertiärstrukturen zerstört, wodurch komplexe Proteine in ihre Untereinheiten zerfallen. Durchführung: Zu Beginn wurde die Trenngellösung angemischt und zwischen die Glasplatten, bis ca. 2 cm vor deren Oberkante, in der aufgebauten Gießstation gegossen. Auf das Gel ist eine Schicht aus Ethanol gegossen worden, um einen geraden Abschluss des Gels zu ermöglichen. Nach 20 Min Polymerisation wurde der Ethanol abgegossen und das neu pipettierte Sammelgel darauf gegeben. Nach dem Einsetzen des Kammes wurde das Gel wieder für 15 Min auspolymerisiert.

35 Material und Methoden 27 Das fertige Gel wurde in die Elektrophoresekammer überführt und 1x Elektrophoresepuffer zugegeben. Die Proben wurden anschließend in 4x SDS-Probenpuffer mit 5% β-mercaptoethanol verdünnt und bei 95 C für 5 Min reduziert. Pro Geltasche wurden bis zu 50 µg Protein aufgetragen. Zusätzlich zu den Proben sind 6 µl Protein-Standard in das Gel geladen worden. Die Auftrennung erfolgte zunächst bei 100 V für 15 Min, bis die Proben aus den Geltaschen und vor das Sammelgel gelaufen waren. Anschließend wurde die Spannung auf 200 V erhöht und nach ca. 45 Min die Elektrophorese beendet. Das Gel wurde aus der Apparatur entnommen und 15 Min in Transferpuffer gelagert Semi-Dry-Blotting-Verfahren Im Semi-Dry-Blotting-Verfahren werden Proteinmuster eines SDS-Gels elektrophoretisch auf eine adsorbierende Membran übertragen. Beim Blotten wird das Acrylamidgel luftblasenfrei auf eine spezielle proteinbindende Membran aus Polyvinylidendifluorid (PVDF) gelegt, umrahmt von jeweils zwei Lagen Filterpapier. Vor dem Blott sollte das Gel Min in Transferpuffer inkubieren um die SDS- Konzentration im Gel zu senken, da dieses den Transfer kleinerer Polypeptide beeinträchtigen kann. Im Gegensatz dazu kann die Zugabe von Methanol im Transferpuffer die Bindung der Proteine an die Membran erheblich stärken. Durchführung: Der Western-Blot ist mit der Semi-dry-Blotting Apparatur von BIORAD durchgeführt worden. Die eingesetzte Membran bestand aus Polyvinylidenfluorid (PVDF), welche vor dem Blot mit Methanol benetzt und kurz mit deionisiertem Wasser abgespült wurde. Das Blotting-Sandwich, zusammengesetzt aus 4 Lagen Blottingpapier (Whatman Paper), PVDF-Membran, Gel und nochmals 4 Lagen Blottingpapier, wurde nach gutem Befeuchten mit Transferpuffer in die Blotting-Apparatur eingesetzt. Nach dem Verschließen der Kammer erfolgte das Blotten bei 15 V für 25 Min Immunoblot Der Immunoblot ist eine immunologische Methode, welche zur Sichtbarmachung spezieller Proteine auf einer Membran dient. Der Nachweis wird hierbei durch spezifisch bindende Antikörper ermöglicht (Rehm und Letzel, 2010). Vor der eigentlichen Proteindetektion müssen alle freien Stellen auf der Membran abgesättigt werden, damit die Antikörper spezifisch binden können und nicht unspezifisch an diesen freien Stellen auf der Membran haften. Der erste, primäre Antikörper ist nicht enzymmarkiert. Der zweite Antikörper, welcher selektiv den primären Antikörper erkennt, ist mit einem Enzym konjugiert. Dies ist entweder die alkalische Phosphatase (AP) oder die Meerrettich-Peroxidase (HRP). AP-konjugierte Antikörper können dann mit farbgebenden Substraten direkt angefärbt werden, während HRPkonjugierte Antikörper die Oxidation von Luminol katalysieren und somit eine Chemolumineszenz

36 Material und Methoden 28 auslösen. Diese ECL-Reaktion ist etwa 10mal sensitiver als die Blotentwicklung mit AP. Die Visualisierung erreicht man durch Auflegen eines Röntgenfilms für einige Sekunden bis Minuten, wonach die Proteinbanden durch Schwarzfärbung auf dem Film sichtbar werden (s. Abb. 2.2). Abb. 2.2 Detektion von Proteinen auf Membranen. (modifiziert nach: Raem und Rauch, 2007) Durchführung: Unmittelbar nach dem Blot wurde die Membran zunächst für 30 Min bei RT oder über Nacht bei 4 C in Blockpuffer (Blotting grad Blocker) gegeben, um die nicht besetzten Stellen auf der Membran zu blockieren. Danach ist der erste Antikörper (anti-human PlGF (#178/G10): 1:2000; anti-plgf K1425: 1:500, ReliaTech), verdünnt in 10% Milch (0,1% Fett) + TBS, nach einem dreifachen Waschvorgang für jeweils 5 Min in TBST, auf die Membran gegeben und für 60 Min bei RT auf dem Schüttler inkubiert worden. Es folgte ein erneuter Waschvorgang zur Entfernung ungebundener Antikörper. Der zweite Antikörper (anti-mouse IgG-HRP Konjugat: 1:10000, Promega; anti-rabbit IgG AP Konjugat: 1:2000, Promega), verdünnt in 10% Milch (0,1% Fett) + TBST, wurde zugegeben und für 60 Min mit der Membran inkubiert. Nicht gebundene Antikörper wurden mit TBST abgewaschen. Danach folgte der AP- bzw. ECL-Nachweis.

37 Material und Methoden 29 Für den AP-Nachweis wurden 66 µl NBT und 33 µl BCIP in 10 ml AP-Puffer gelöst und auf die Membran gegeben. Nach Min war eine deutliche Anfärbung der Proteine zu erkennen. Für den ECL-Nachweis wurden die ECL Western-Blot Reagenzien (ECL Western blotting detection reagents) 40:1 vermischt und ca. 2 ml dieser Lösung auf der Membran verteilt. Nach 2 Min wurde diese Lösung abgekippt und die Membran in Folien eingepackt. Die am zweiten Antikörper gebundene Meerrettich-Peroxidase oxidierte das Luminol des ECL, wodurch ein Lichtsignal abgegeben wurde. Dieses konnte mittels Röntgenfilmauflage (Amersham Hyperfilm ECL) registriert und im Anschluss daran dokumentiert werden.

38 Ergebnisse 30 3 ERGEBNISSE 3.1 Nachweis des PlGF Proteins in Lysaten humaner Plazenta Aus vorangegangenen Experimenten ist bekannt, dass PlGF in hohen Mengen in den Trophoblasten der Plazenta exprimiert wird (Hauser und Weich, 1993). Um die Menge von PlGF, die in der menschlichen Plazenta exprimiert wird, quantitativ zu erfassen, sind Lysate aus Plazentagewebe angefertigt worden. Aus diesen wurde die Proteinkonzentration bestimmt. Im Anschluss daran wurde eine Analyse dieser Lysate mittels Western Blot und human PlGF-Sandwich-ELISA durchgeführt. Im ELISA konnte die genaue Konzentration von dem vorkommenden Wachstumsfaktor quantitativ bestimmt werden Nachweis über die Western Blot Methode In seiner natürlichen Form kommt PlGF-1 und PlGF-2 als Dimer mit einer Molekülmasse von kda vor. Bei Aufspaltung der Disulfidbrücken, durch Reduktion mit anschließendem Zerfall in seine Untereinheiten, entstehen Monomere mit einem Molekulargewicht von kda. Mittels einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurden die Proteine der Lysatproben aufgetrennt und mit Hilfe eines Semi-dry Blot auf eine Membran transferiert. Der Wachstumsfaktor PlGF wurde im Anschluss mit Antikörpern detektiert. Hierzu wurde ein monoklonaler Antikörper aus der Maus, welcher an PlGF-1 und PlGF-2 bindet, genutzt. Der zweite anti-mouse IgG Antikörper war HRP konjugiert und es wurde anschließend der ECL-Nachweis durchgeführt. In Abb. 3.1 ist der Röntgenfilm des Western Blottes abgebildet. Es hatten sich Banden im Bereich von 25 kda, 55 kda und 95 kda gezeigt kda 55 kda 25 kda Abb. 3.1 Western Blot mit Lysaten aus humaner Plazenta. (1) Plazentaprobe A (reduziert) (2) Plazentaprobe B (reduziert).

39 PlGF-Konzentration [ng/mg Protein] Ergebnisse 31 Bei einer entsprechenden Molekülmasse von 25 kda erkannte man die Banden der Monomere des PlGF-Proteins. Da PlGF-2 im Gegensatz zu PlGF-1 an seinem Carboxylende eine 21-Aminosäure-lange Heparinbindedomäne aufweist (De Falco et al., 2002), entstanden jeweils zwei Banden im Bereich von 25 kda und 55 kda, wobei die Banden im Bereich von 55 kda die nicht reduzierten Dimere zeigten. Die etwas schwereren Proteine stellten jeweils die PlGF-2 Formen dar. Banden, die bei einem Molekulargewicht von 95 kda zu sehen waren, standen in keinem Zusammenhang zu dem PlGF- Protein, da es sich hier um eine unspezifische Bindung des Antikörpers an ein Protein handelte Quantifizierung mit Hilfe des PlGF Sandwich-ELISA Nachdem das Vorkommen des Proteins im Western Blot nachgewiesen werden konnte, sollte die genaue Konzentration an PlGF ermittelt werden. Diese wurde mittels PlGF-Sandwich-ELISA, der die Gesamt-PlGF-Konzentration in humanen Proben erfassen konnte, quantifiziert. Die Gesamt-PlGF- Konzentration umfasst hierbei den Gehalt an freiem und komplexiertem PlGF in den Lysaten. Die Abb. 3.2 zeigt die ermittelten PlGF Konzentrationen in den beiden Plazenta-Proben. Um einen vergleichbaren Wert zu erhalten, musste vor dieser Messung eine Proteinkonzentrationsbestimmung gemacht werden. Die erhaltene PlGF-Konzentration konnte so in ein Verhältnis zur Proteinmenge in der Probe gesetzt werden. 3,0 2,5 Plazenta (A) 2,0 1,5 Plazenta (B) 1,0 0,5 0,0 Abb. 3.2 PlGF-Konzentrationen in humanen Plazenta-Lysaten. Aus einem Plazenta-Gewebe wurden zwei Lysate (Doppelbestimmung) erstellt und die PlGF-Konzentration mittels ELISA quantifiziert. Die Konzentration der Probe A beträgt 2,58 ng/mg Protein und enthält im Vergleich zu Probe B somit das 1,7-fache von dem Wachstumsfaktor.

40 PlGF-Konz. [ng/mg Protein] Ergebnisse Untersuchung der PlGF Expression in Lysaten humaner Endothelzellen Es ist bekannt, dass PlGF von Endothelzellen relativ stark exprimiert wird (Hauser und Weich, 1993). In der Plazenta wird PlGF ausschließlich von den Trophoblasten synthetisiert, welche aus zwei Schichten bestehen: einer Lage proliferierender Stammzellen mit direktem Kontakt zum Zytotrophoblasten und den Synziotrophoblasten, welche durch Fusion der Zytotrophoblasten entstehen (Huppertz und Herrler, 2005). Da PlGF von diesen Schichten wiederum nur von Synziotrophoblasten sezerniert wird und diese durch ihre fusionierende Eigenschaft schwer in Kultur zu halten sind, wurden alle weiteren Experimente mit Endothelzellen durchgeführt. Diese sind leichter zu kultivieren und für Untersuchungen der Genexpression ausreichend. Durch Quantifizierung des PlGF-Gehalts im Zell-Lysat von HUVECs konnte ein Vergleich zur PlGF- Konzentration in der Plazenta hergestellt werden. Die Quantifizierung wurde mittels human PlGF- Sandwich ELISA durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Abb. 3.3 dargestellt. Hier beträgt die PlGF-Konzentration im HUVEC-Lysat 2,51 ng/mg Protein. Vergleicht man diesen Wert mit der ermittelten PlGF-Konzentration in der Plazenta, so sind diese Konzentrationen annähernd gleich hoch. Da in der Plazenta ausschließlich Synziotrophoblasten PlGF sezernieren, befand sich im Zell-Lysat eine größere Anzahl an Zellen, welche zur PlGF-Expression in der Lage waren. Schlussfolgernd war festzustellen, dass Synziotrophoblasten größere Mengen an PlGF sezernieren als Endothelzellen, da sie nur einen kleinen Prozentsatz der Zellen in der Plazenta ausmachen. 3,0 2,5 Plazenta (A) HUVEC-Lysat 2,0 Plazenta (B) 1,5 1,0 0,5 0,0 Abb. 3.3 Vergleich der PlGF-Konzentrationen zwichen Plazenta- und HUVEC-Lysat. Das HUVEC-Lysat wurde aus HUVEC, p9 erstellt.

41 PlGF-Konz. [ng/ml] Ergebnisse Quantifizierung der PlGF-Expression in Zellüberständen von humanen und murinen Endothelzellen Endothelzellen sezernieren Wachstumsfaktoren direkt in das umgebende Medium. Somit war es möglich, durch Messung der PlGF-Konzentration in den Überständen der Zellen, die Menge an freigesetztem PlGF genau zu quantifizieren. Um die natürliche PlGF-Expression der in Folgeversuchen stimulierten Endothelzellen genau zu dokumentieren, wurden Zeitkinetiken erstellt. Zu diesem Zweck wurde in genau definierten Zeitabständen die PlGF-Konzentration im ELISA ermittelt PlGF-Expression in Zellüberständen von Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) HUVECs (15x10 3 Zellen/cm 2 ) sind in 24 Well Platten, mit je 1 ml Medium/well kultiviert worden. Die Überstände wurden alle 24 Stunden entnommen und im human PlGF-Sandwich ELISA gemessen. Die Konzentration stieg von 0,16 ng/ml am ersten Tag bis zu einer Konzentration von 4,4 ng/ml am sechsten Tag (s. Abb. 3.4). Ab dem dritten Tag stieg die PlGF-Konzentration auf Werte über 0,5 ng/ml. Da Werte in diesem Bereich im ELISA optimal zu messen sind, wurden die Überstände für Stimulationen mit den humanen Zellen immer am dritten Tag nach der Kultivierung mit dem Stimulationsfaktor entnommen. 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, Zeit [Tage] Abb. 3.4 PlGF-Zeitkinetik in HUVEC, p7. Konzentrationsbestimmung von Überständen zwischen dem 1. und 6. Tag. Die Balken zeigen die absolute Standardabweichung (σ).

42 PlGF-Konzentration [pg/ml] Ergebnisse PlGF-Expression in Zellüberständen von End C57BI/6, SNO-MECs und SNO-MEC Subclonen In vergangenen Experimenten konnte gezeigt werden, dass HUVECs hohe Konzentrationen an PlGF exprimieren (Hauser und Weich, 1993). Dies konnte zu Beginn der Arbeit bestätigt werden. Mit murinen Endothelzellen sind hingegen bisher kaum Studien zur PlGF-Expression durchgeführt worden. In der Arbeit von Georg Richter (Richter, 2008) konnte jedoch auf mrna-ebene gezeigt werden, dass Endothelioma-Zellen und SNO-MECs das Gen für PlGF aufweisen. Infolgedessen wurden Endothelioma C57BI/6 und SNO-MECs kultiviert. Es stellte sich heraus, dass die Endothelioma-Zellen kein PlGF sezernierten. Die SNO-MECs hingegen, zeigten eine Expression des PlGF-Gens (s. Abb. 3.5). Da der Gehalt an PlGF im Überstand vom zweiten zum achten Tag nur sehr gering anstieg, sollte ein SNO-MEC Subklon detektiert werden, welcher eine höhere Konzentrationen an PlGF freisetzt Zeit [Tage] Abb. 3.5 PlGF Zeitkinetik in SNO-MECs, p24. Konzentrationsbestimmung von Überständen am 2., 4. und 8. Tag. Zu diesem Zweck wurden sechs Subklone, welche in einer früheren Arbeit isoliert wurden, in Kultur genommen und auf Vorhandensein des Gens bzw. deren PlGF-Gehalt untersucht. Die Subklone wurden auf mrna-ebene mittels PCR analysiert und der PlGF-Gehalt im Medium anschließend mittels mouse-plgf-elisa quantifiziert. Das PCR-Ergebnis ist in Abb. 3.6 dargestellt. In Abb. 3.6B zeigten alle Subklone eine Bande im Bereich von 200 bp, was belegt, dass alle das PlGF Gen in einer Exon-Region involviert hatten. Der SNO-MEC Subklon C9 lässt zudem eine stärkere Bande erkennen, welche auf eine höhere Konzentration an mrna und demzufolge eine stärkere Expression des Proteins zurückzuführen war.

43 PlGF-Konzentration [pg/ml] Ergebnisse bp bp A B Abb. 3.6 Untersuchung der PlGF-Genaktivität mittels PCR. (A) β-actin PCR (Postivkontrolle) (B) mplgf-pcr (1) 100 bp-marker (2) Subklon C10 (3) Subklon C9 (4) Subklon A7 (5) Subklin D7 (6) Subklon B10 (7) Subklon B10 (8) neg. Kontrolle Im ELISA konnte dieses Ergebnis erneut bestätigt werden (s. Abb. 3.7). Der SNO-MEC Subklon C9 lag mit einer Konzentration von 165 pg/ml nach zwei Tagen ein Fünffaches über der Konzentration der normalen SNO-MECs (30,9 pg/ml, Abb. 3.5). Ebenso lag die Konzentration über allen anderen Subklonen. 180 C D8 A C9 B A7 B D7 D8 C10 D7 C10 1. Tag 2. Tag Abb. 3.7 PlGF-Konzentrationsbestimmung in verschiedenen SNO-MEC Subklonen. Bestimmung von Überständen nach je 24 und 48 Stunden. 3.4 Stimulation der PlGF-Expression humaner und muriner Endothelzellen in vitro Um nähere Einblicke in die Physiologie des Wachstumsfaktors PlGF zu erlangen, wurde die Regulation der Genexpression durch verschiedene Zytokine und Wachstumsfaktoren untersucht. Dafür wurden die Zellen mit genannten Faktoren stimuliert und anschließend die PlGF-Konzentration im ELISA

44 PlGF-Konzentration [ng/ml] Ergebnisse 36 quantifiziert. Diese Fragestellung war 1994 Thema in einer Dissertation von Bernhard Barleon (Barleon, 1994), in der sie mit Hilfe des Northern-Blots analysiert worden ist. Ein Vergleich der Ergebnisse dieser und der vorangegangenen Arbeit wird in der anschließenden Diskussion näher erläutert Konzentrations- und zeitabhängige Stimulation mit PMA PMA ist ein Phorboldiester zur Aktivierung der Proteinkinase C. Da es die Angiogenese stimuliert (Nishizuka, 1984), sollte nun untersucht werden, ob sich dies auch auf die Expression von PlGF auswirkt. Die HUVECs wurden mit je 20 ng/ml PMA im Medium stimuliert und der Anstieg der Konzentration an PlGF im Überstand wurde alle 24h gemessen. Das folgende Balkendiagramm (s. Abb. 3.8) zeigt die Ergebnisse dieser zeitabhängigen Stimulation. Die normale PlGF-Konzentration der HUVECs stieg mit fortlaufender Zeit bis auf einen Wert von 4,4 ng/ml an, wobei die mit PMA stimulierten Zellen mit einer PlGF-Konzentration von ca. 0,5 ng/ml keinen Anstieg zeigten. 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, Zeit [Tage] PMA normal Abb. 3.8 PlGF-Konzentration in Abhängigkeit zur Zeit unter Einfluss von PMA. HUVECs, p6 wurden stimuliert mit 20 ng/ml PMA und aller 24h Überstand entnommen. Die senkrechten Balken zeigen die absolute Standardabweichung (σ). Nach diesem Ergebnis sollte nachgewiesen werden, ob außerdem eine Dosis-Abhängigkeit von PMA vorliegt. Dies wurde mit humanen (HUVEC, s. Abb. 3.9) und mit murinen (SNO-MEC Subklon C9, s. Abb. 3.10) Endothelzellen getestet. Bei Stimulation der humanen Zellen war mit 5 ng/ml PMA im Medium ein leichter Anstieg der PlGF-Konzentration zu erkennen. Ab einem PMA-Gehalt von 20 ng/ml war keine deutliche Änderung mehr zu vernehmen.

45 PlGF-2 Konzentration [pg/ml] PlGF-Konzentration [ng/ml] Ergebnisse 37 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0, PMA-Konzentration [ng/ml] Abb. 3.9 PlGF-Konzentration in Abhängigkeit zur PMA-Konzentration. HUVEC, p8 wurden stimuliert mit unterschiedlichen Konzentrationen an PMA und es wurde am 3. Tag der Überstand entnommen. Die Balken zeigen die absolute Standardabweichung (σ). Die Stimulation der murinen Endothelzellen zeigte keine bedeutende Veränderung der PlGF- Konzentration. Die SNO-MECs sezernierten demnach, bei jedem PMA-Gehalt im Medium, ca. 20 pg/ml PlGF PMA-Konzentration [ng/ml] Abb PlGF-Konzentration in Abhängigkeit zur PMA-Konzentration. SNO-MEC C9 Subklone, p79 wurden stimuliert mit unterschiedlichen Konzentrationen an PMA und es wurde am 4. Tag der Überstand entnommen. Die Balken zeigen die absolute Standardabweichung (σ) Konzentrationsabhängige Stimulation mit TNF-α Ähnlich wie bei PMA wurden verschiedene Konzentrationen an Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) zum Medium hinzugegeben. Die HUVECs (s. Abb. 3.11) wiesen in Anwesenheit von diesem Stimulations-

46 PlGF-Konzentration [pg/ml] PlGF-Konzentration [ng/ml] Ergebnisse 38 faktor eine etwas höhere PlGF-Expression auf als ohne diesen. Es kam demnach zu einem Konzentrationsanstieg von 0,2 auf 0,3 ng/ml PlGF. Jedoch war mit ansteigender Dosis kein großer Unterschied mehr zu erkennen. 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0, , TNF-α-Konzentration [ng/ml] Abb PlGF-Konzentration in Abhängigkeit zur TNF-α-Konzentration. HUVEC, p8 wurden stimuliert mit unterschiedlichen Konzentrationen an TNF-α und es wurde am 3. Tag der Überstand entnommen. Die Balken zeigen die absolute Standardabweichung (σ). Die Stimulation der SNO-MECs zeigte einen eindeutigen Anstieg der PlGF-Konzentration mit ansteigendem TNF-α-Gehalt im Medium (s. Abb. 3.12) , TNF-α-Konzentration [ng/ml] Abb PlGF-Konzentration in Abhängigkeit zur TNF-α-Konzentration. SNO-MEC C9 Subklone, p79 wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen an TNF-α stimuliert und es wurde am 3. Tag der Überstand entnommen. Die Balken zeigen die absolute Standardabweichung (σ).

47 PlGF-Konzentration [ng/ml] Ergebnisse 39 Ohne diesen Faktor sezernierten die Zellen 23 pg/ml PlGF, mit 1 ng/ml TNF-α bereits ca. 62 pg/ml und bei einer TNF-α-Konzentration von 20 ng/ml konnten Konzentrationswerte des Wachstumsfaktors von ca. 300 pg/ml detektiert werden, was einem 13-fachen Anstieg der Konzentration entspricht Konzentrationsabhängige Stimulation mit FCS Fetales Kälberserum (FCS) war einer der Hauptbestandteile der eingesetzten Nährmedien, sowohl für HUVECs als auch für SNO-MECs. Da in FCS eine Vielzahl von Proteinen und Wachstumsfaktoren enthalten sind, welche Einfluss auf die PlGF-Expression haben könnten, wurden die Zellen ohne FCS und mit unterschiedlichen Konzentrationen im Medium kultiviert. Anschließend wurden die Konzentrationsänderungen von PlGF mittels ELISA untersucht. Bei der Stimulation der HUVECs war zu sehen, dass die Zellen ohne FCS im Vergleich zu Ansätzen mit FCS sehr hohe Konzentrationen an PlGF ausschütteten (s. Abb. 3.13). Mikroskopische Beobachtungen zeigten in diesem Zusammenhang, dass die Zellen ohne FCS sehr wenig bis gar nicht an dem Boden des Zellkulturgefäßes adhärierten. Bei einer Konzentration ab 5% FCS im Medium war eine gute Anheftung der Zellen zu beobachten. Die PlGF-Konzentration bei dieser Konzentration an FCS fiel auf ein Viertel ab. Es war ein Konzentrationsunterschied von 0,8 ng/ml auf 0,2 ng/ml sichtbar. 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0, FCS-Konzentration [%] Abb PlGF-Konzentration in Abhängigkeit zur FCS-Konzentration. HUVEC, p9 wurden stimuliert mit unterschiedlichen Konzentrationen an FCS und es wurde am 3. Tag der Überstand entnommen. Die Balken zeigen die absolute Standardabweichung (σ). Wie zu erwarten, konnte dieses Ergebnis mit den SNO-MEC C9 Subklonen bestätigt werden. Bei einer Kultivierung ohne FCS konnten PlGF-Konzentrationen von 1,066 ng/ml nachgewiesen werden. Mit ansteigender FCS-Konzentration war ein Abfall des PlGF-Gehalts im Überstand zu verzeichnen (s.

48 PlGF-Konzentration [ng/ml] PlGF-Konzentration [pg/ml] Ergebnisse 40 Abb. 3.14). Bei einem Zusatz von 5% FCS im Medium konnte nur ein Fünftel der PlGF-Konzentration im Vergleich zum Zusatz von 0% FCS nachgewiesen werden. In Gleicherweise zeigten die murinen Endothelzellen bei einer Kultivierung ohne FCS keine Anheftung am Zellkulturboden FCS-Konzentration [%] Abb PlGF-Konzentration in Abhängigkeit zur FCS-Konzentration. SNO-MEC C9 Subklone, p79 wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen an FCS stimuliert und es wurde am 3. Tag der Überstand entnommen. Die Balken zeigen die absolute Standardabweichung (σ) Konzentrationsabhängige Stimulation muriner Endothelzellen mit ECGF ECGF (Endothelial cell growth factor) ist ein für das optimale Wachstum muriner Endothelzellen wichtiger Bestandteil des Nährmediums. Im Normalmedium war dieser mit einer Konzentration von 100 µg/ml enthalten ECGF-Konzentration [µg/ml] Abb PlGF-Konzentration in Abhängigkeit zur ECGF-Konzentration. SNO-MEC C9 Subklone, p79 wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen an ECGF stimuliert und es wurde am 4. Tag der Überstand entnommen. Die Balken zeigen die absolute Standardabweichung (σ) um

49 PlGF-Konzentration [ng/ml] Ergebnisse 41 Bei mikroskopischer Beobachtung des Zellwachstums war zu erkennen, dass die Endothelzellen mit einer ECGF-Konzentration von 100 µg/ml nach drei Tagen eine höhere Zelldichte aufwiesen als ohne ECGF. In Abb ist zu erkennen, dass die PlGF-Konzentration mit höher werdendem ECGF-Anteil im Medium steigt. Dieses Ergebnis bestätigt sich ebenfalls durch die zunehmende Zelldichte bei steigender PlGF-Konzentration Konzentrationsabhängige Stimualtion humaner Endothelzellen mit ECGS ECGS (endothelial cell growth supplement) ist ähnlich wie ECGF für murine Endothelzellen ein wichtiger Bestandteil des Nährmediums humaner Endothelzellen. Mit ansteigender ECGS-Konzentration war in den Überständen ebenfalls eine erhöhte PLGF-Expression zu erkennen (s. Abb. 3.16). Da es auch in diesem Fall mit steigendem ECGS-Gehalt im Medium zu einer erhöhten Zelldichte kam, ist ein Zusammenhang der Zelldichte mit der PlGF-Konzentration zu vermuten. 2,0 1,5 1,0 0,5 0, ECGS-Konzentration [µl/ml] Abb PlGF-Konzentration in Abhängigkeit zur ECGS-Konzentration. HUVEC, p9 wurden stimuliert mit unterschiedlichen Konzentrationen an ECGS und es wurde am 3. Tag der Überstand entnommen. Die Balken zeigen die absolute Standardabweichung (σ).