Freie Radikale und oxidativer Stress - Peroxiredoxin als Radikalenpuffer im Myokard und Skelettmuskel unter körperlicher Belastung
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- Dagmar Knopp
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1 Aus dem Institut für Kreislaufforschung und Sportmedizin Abteilung für Molekulare und Zelluläre Sportmedizin Deutsche Sporthochschule Köln Geschäftsführender Leiter: Univ.-Prof. Dr. med. Wilhelm Bloch Freie Radikale und oxidativer Stress - Peroxiredoxin als Radikalenpuffer im Myokard und Skelettmuskel unter körperlicher Belastung Von der Deutschen Sporthochschule Köln zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Sportwissenschaft genehmigte Dissertation vorgelegt von Robert R. Renner aus Köln Köln 2008
2 Erster Referent: Univ.- Prof. Dr. Wilhelm Bloch Zweiter Referent: Univ.- Prof. Dr. Heiko Strüder Vorsitzende des Promotionsausschusses: Univ.-Prof. Dr. I. Hartmann-Tews Tag der mündlichen Prüfung:
3 Eidesstattliche Versicherung: Hierdurch versichere ich an Eides Statt: Ich habe diese Dissertationsarbeit selbstständig und nur unter Benutzung der angegebenen Quellen angefertigt; sie hat noch keiner anderen Stelle zur Prüfung vorgelegen. Wörtlich übernommene Textstellen, auch Einzelsätze oder Teile davon, sind als Zitate kenntlich gemacht worden. Hierdurch erkläre ich, dass ich die Leitlinien guter wissenschaftlicher Praxis der Deutschen Sporthochschule Köln in der aktuellen Fassung eingehalten habe. Robert Renner
4 Für meine Mutter, in Gedenken an meinen Vater und für meine Familie. So eine Arbeit wird nie fertig - Man muss sie für fertig erklären, wenn man nach Zeit und Umständen das Mögliche getan hat. Johann Wolfgang von Goethe, Italienreise (1787)
5 Dank Mein ganz besonderer Dank gilt meinem Doktorvater Prof. Dr. Wilhelm Bloch für die Überlassung des Themas und das in mich gesetzte Vertrauen. Eine positive Erfahrung war die immer fachlich kompetente Betreuung und Zusammenarbeit in den letzten Jahren. Besonders erfreulich, das dabei das Menschliche nicht zu kurz kam - jedes Gespräch motivierte und gab positive Impulse und Denkanstöße. Bedanken möchte ich mich bei Prof. Dr. Heiko Strüder für die interessanten Gespräche und Einschätzungen. PD Dr. Klara Brixius danke ich für die fachliche Unterstützung und Orientierung, vor allem für die vielen Ratschläge und die Zeit. Anika Voß und Mojgan Ghilav und allen Mitarbeitern des Instituts für Kreislaufforschung und Sportmedizin, die mir jederzeit mit wertvollen Tipps und Ratschlägen im Dschungel der Verfahren und Laborarbeiten zur Seite standen und auch bei all der Hektik immer ein offenes Ohr hatten. Allen Beteiligten für ihren unverzichtbaren Beitrag zum Gelingen jeder einzelnen Studie sowie allen Doktoranden und Diplomanden für den regen Austausch und die vielen gemeinsam verbrachten Stunden. Ganz besonders danke ich meiner Mutter, die mich jederzeit unterstützt und motiviert hat und meinem Vater, der sicher gerne die Fertigstellung dieser Arbeit erlebt hätte sie haben mir die Voraussetzungen für diesen Weg geebnet. Bei meinen Freunden, die mein Leben mitgeprägt haben, die mir immer zeigen, dass Freundschaft etwas ganz besonderes ist und dass es auch noch andere Dinge im Leben gibt als Arbeit. Robert Renner Oktober 2008, Köln, Deutschland
6 Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis Summary EINLEITUNG Oxidativer Stress Freie Radikale Freie Radikale und körperliche Belastung Freie Radikale und Herzinsuffizienz Freie Radikale und Skelettmuskel Antioxidatives Abwehrsystem Peroxiredoxin Tiermodell Fragestellung MATERIAL UND METHODEN Humanes Myokardgewebe Tierstudie Myokard- und Skelettmuskelgewebe Organisation und Durchführung der Tierstudie Trainingsaufbau Humanes Skelettmuskelgewebe Trainingsaufbau Muskelbiopsie Zusammenfassende Darstellung der Studien Laborgeräte Chemikalien Verbrauchsmaterialien Antikörper Western Blot SDS Gelelektrophorese Semi-dry Blot Verfahren Blocken und Antikörperinkubation Entwicklung und Auswertung Histologie Erstellen von Kryostatschnitten Immunhistochemie Dokumentation der gefärbten Schnittpräparate Densitometrische Auswertung der Immunhistochemie Statistik... 49
7 Inhaltsverzeichnis II 3 ERGEBNISSE Nachweis und Expression von Peroxiredoxin im Myokard Nachweis und Isoform spezifisch erhöhte Expression von Peroxiredoxin im humanen rechten Atrium (RA) im Vergleich zum linken Ventrikel (LV) Verringerte Isoform spezifische Expression von Peroxiredoxin im humanen insuffizienten linksventrikulären Myokard Isoform spezifische Regulation von Peroxiredoxin im murinen linksventrikulärem Myokard von heterozygoten MnSOD +/- Mäusen mit körperlichem Training Nachweis und Expression von Peroxiredoxin im Skelettmuskel Training induzierte Veränderungen der Peroxiredoxin - Isoformen im murinen Skelettmuskel von heterozygoten MnSOD +/- Mäusen Training induzierte Isoform spezifische Expressionsverringerung von Peroxiredoxin im humanen Skelettmuskelgewebe Zusammenfassung aller Studien - Isoform spezifische Regulation von Peroxiredoxin DISKUSSION Untersuchungen im Myokard Unterschiede in der Peroxiredoxin-Expression zwischen rechtsatrialem und linksventrikulärem humanen Myokard Verringerte Peroxiredoxin-Expression im humanen insuffizienten linksventrikulärem Myokard Isoform spezifische Regulation von Peroxiredoxin im murinen Myokard bei MnSOD +/- mit körperlichem Training Untersuchungen im Skelettmuskelgewebe Isoform spezifische Regulation von Peroxiredoxin im murinen Skelettmuskel bei MnSOD +/- mit körperlichem Training Isoform spezifische Regulation von Peroxiredoxin im humanen Skelettmuskel mit körperlichem Training ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS ANHANG Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Internetseiten Erklärung zur Vorabveröffentlichung von Ergebnissen
8 Abkürzungsverzeichnis III Abkürzungsverzeichnis Abkürzung Abb. Bedeutung Abbildung AK Antikörper ATP Adenosintriphosphat BMI BSA Body Mass Index Bovines Serumalbumin bzgl. bezüglich bzw. cm dest. Beziehungsweise Zentimeter destilliert Cu Kupfer DCM Dilatative Kardiomyopathie d.h. das heißt DNA Desoxyribonukleinsäure et al. und andere F Failing g Gramm GPO Glutathionperoxidase GSH Glutathion GSSG Glutathion-Disulfid h Stunde HI Herzinsuffizienz H 2 O Wasser H 2 O 2 IHC Wasserstoffperoxid Immunhistochemie Kap. Kapitel kg Kilogramm l Liter m Meter n Anzahl µ Micro (10-6 )
9 Abkürzungsverzeichnis IV MnSOD Mangan Superoxid Dismutase NADPH n.s. Reduziertes Nicotinamidadenindinucleotidphosphat nicht signifikant NF Non Failing NO Nitric oxide, Stickstoffmonoxid ONOO Peroxinitrit O 2 Superoxid-Anion 1 O 2 Singulett-Sauerstoff OH Hydroxyl-Radikal p Signifikanzniveau PBS Phosphate buffered saline solution (Phosphatpuffer) PFA Prx Paraformaldehyd Peroxiredoxin Prob. Proband RNA ribonucleic acid ROS reactive oxygen species RNS reactive nitrogen species SOD Superoxiddismutase s Sekunde S/min Schläge pro Minute SD Standard Deviation (Standardabweichung) Std Stunde t Zeit Tab. Tabelle TBS Tris-Buffered Saline (Tris(hydroxymethyl-)aminomethan u.a. unter anderem vgl. vergleiche WB Western Blot WT-T Wildtyp Training (Mäuse ohne Enzymmangel der MnSOD) WT-K Wildtyp Kontrolle (Mäuse ohne Enzymmangel der MnSOD) x Mittelwert z.b. zum Beispiel C Grad Celsius
10 Summary Summary Free radicals and oxidative stress Peroxiredoxin as a radical buffer in the heart and skeletal muscle under physical strain. In the present investigation the protein expression of the Peroxiredoxin isoforms 1-6 was examined in human and mice myocardium and skeletal muscle. It had been investigated the protein expression in human non-failing and failing myocardium and the influence of physical training for protein expression in heterozygote mice with decreased expression of the Mangansuperoxid Dismutase 2 (MnSOD(+/-)) and increased myocardium stress. In addition it had been investigated the protein expression in heterozygote mice and human skeletal muscle with physical training. Peroxiredoxins (Prx) are a family of multifunctional antioxidant thioredoxin or glutathione dependent peroxidases. The major functions of Prx comprise in the cellular protection against oxidative stress as well as in the modulation of signaling cascades that apply hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) as a second messenger molecule. So far not much is known about the Protein expression and function of Prx in failing myocardium and skeletal muscle with physical training. The present study provides evidence that the Prx are differentially regulated in failing myocardium and skeletal muscle. For the myocardium the selective downregulation of isoforms point out, that there is a dysregulation of the radikal homeostasis during the development of DCM. These alterations may contribute to an increased oxidative damage and apoptosis of cardiac tissue. Thus, therapeutical interventions on proteins involved in the regulation of oxidative stress may be a future aim for the treatment of heart failure patients. Physical training causes a change of the Expression of the enzyme Peroxiredoxin as a radical buffer and can possibly serve as a protection against reactive substances. The selective adjustment of the Prx Isoformen let assume that in addition also different anti-oxidative systems are adjusted, which were not examined. That could mean that dependent on the basal anti-oxidative protection different adjustment samples of the individual Prx Isoformen are to be observed. Further studies have to show whether a change of the training extent or the intensity would have a similarly regulation.
11 Einleitung 2 1 EINLEITUNG 1.1 Oxidativer Stress Oxidativer Stress entsteht bei einem Ungleichgewicht zwischen Bildung und Abbau von verschiedenen reaktiven Sauerstoffspezies ROS (reactive oxygen species) und der körpereigenen antioxidativen Abwehr (Alfassi, 1999). Sauerstoff ist ein lebenswichtiges Element, daher werden Abweichungen innerhalb eines Normbereichs als physiologisch oxidativer Stress bezeichnet und vom Organismus in der Regel toleriert. Ein erhöhtes Ungleichgewicht hingegen kann zur Induktion von Adaptionsprozessen sowie anderen zellulären Antworten, bis hin zum Zelltod führen. Zell- und Gewebeschäden können den Gesundheitszustand und Alterungsprozess beeinflussen (Cerutti 1985; Chance et al. 1979; Halliwell 1989; Sies 1986; Sies und Cadenas 1985). Neben den ROS, die bei der Zellatmung und durch Enzyme (Oxidasen) (Cerutti 1985; Darr und Fridovich 1994) entstehen, sind auch reaktive Stickstoffspezies (RNS), wie Stickstoffmonoxid (NO) Stressoren für die Zellen. NO ist ein Signalmolekül, das unter anderem die Entspannung von glatten Muskelzellen um die Blutgefäße kontrolliert. Den durch RNS hervorgerufenen Stress bezeichnet man als nitrosativen Stress (Hausladen et al., 1996). Neben den endogenen Faktoren, wie z.b. Zellatmung, Immunabwehr oder oxidierende Enzyme spielen auch exogene Faktoren bei der Entstehung von oxidativem Stress eine Rolle. Exogene Faktoren sind zahlreich und können beispielsweise durch Sauerstoff-, Nährstoffmangel, hyper- und hypoosmotische Konzentrationen von Substanzen, durch Alkohol, Nikotin, Medikamente, aber auch durch UV-Licht und Röntgenstrahlung, psychische sowie physische Stressfaktoren hervorgerufen werden (Huang et al., 1999). Darüber hinaus gibt es noch viele weitere toxisch wirkende Faktoren, die hier nicht aufgeführt sind. Auch intensive körperliche Belastung, Erkrankungen oder operative Eingriffe am Herzen, an den Gefäßen, Organtransplantationen oder Atemnot können zu einer Entstehung von freien Radikalen und damit zu oxidativem Stress führen. Freie Radikale werden in der Pathogenese (Fehrenbach et al., 2001) von Krankheiten und teilweise auch für die Ätiologie verantwortlich gemacht (Diplock, 1994; Wisemann & Halliwell, 1996). Die endogenen und exogenen Faktoren
12 Einleitung 3 aktivieren direkt oder indirekt meist dieselben Signalkaskaden und Transkriptionsfaktoren. Die aktivierten Signalsysteme bestehen aus Enzymen, den sogenannten Proteinkinasen, die Gene aktivieren, welche dann auf die Zellen wirken. Die Transkriptionsfaktoren sind wichtige Zielmoleküle dieser Signalketten, die an bestimmte DNA-Sequenzen binden und dadurch das betreffende Gen sowie deren Proteine und damit die Zellen steuern. Ob eine Proliferation, eine Stabilisierung oder eine Apoptose der Zelle stattfindet, hängt von der Dauer und der Stärke des Stresses, aber auch von der Stabilisierungskapazität der Zelle ab, wobei diese im Alter abnimmt (Rensing et al., 2005). Erkrankungen wie bspw. degenerative Veränderungen der Skelettmuskulatur oder Herzmuskelschwäche sind die Folge der Akkumulation von Schäden oder der Apoptose bei sich nicht mehr teilenden postmitotischen Zellen, also Nerven-, Skelett- und Herzmuskelzellen. Bei Endothelien, Epithelien, Fibroplasten, glatten Muskelzellen und Immunzellen, den mitotischen Zellen ist die replikative Seneszenz Ursache für Dysfunktionen und spielt z.b. bei der Atherosklerose eine wichtige Rolle (Rensing et al., 2005). 1.2 Freie Radikale Die für den oxidativen Stress verantwortlichen freien Radikale sind sehr kurzlebige (Asmus et al., 2000), hochreaktive Moleküle oder Atome, die mindestens ein ungepaartes Elektron in ihrer äußeren Elektronenschale besitzen. Um sich zu stabilisieren oxidieren sie andere Moleküle, indem sie diesen ein Elektron entreißen. Diese Kettenreaktion hat eine hohe Reaktivität, ist stark zytotoxisch und kann Zellen und Gewebe auf vielfältige Art, vor allem über Veränderungen von Proteinen, Lipiden und der DNA schädigen (Dröge, 2002). Das Superoxidanionradikal (O - 2 ), Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ) und das Hydroxylradikal (OH - ) werden als reaktive Sauerstoffspezies (ROS) bezeichnet. Stickstoffmonoxid (NO) und das Peroxinitrit (ONOO - ) werden reaktive Stickstoffspezies (RNS) genannt. Der Organismus bildet durch verschiedene Prozesse schon unter physiologischen Bedingungen fortlaufend freie Radikale. Dabei haben freie
13 Einleitung 4 Radikale in geringen Konzentrationen eine wichtige Funktion und gelten als Second Messenger. Sie haben u.a. die Aufgabe der Regulation der Apoptose bei bspw. entarteten Zellen (z.b. Krebs), der Immunabwehr und der Aktivierung von Transkriptionsfaktoren, die wiederum für die Aktivierung von Genen zuständig sind. Aber auch bei der Modulation der Expression von Strukturgenen, die antioxidative Enzyme kodieren und bei der intrazellulären Kalziumkonzentration (Dröge, 2002). Andererseits können freie Radikale in zu großer Anzahl und bei unzureichender antioxidativer Abwehr in unterschiedlichen Zellkompartimenten Schäden anrichten. Sie können ebenso eine Apoptose induzieren, allerdings bei gesunden Zellen oder Gene aktivieren, die die Expression inflammatorischer Cytokine oder Adhäsionsproteine kodieren. Durch ihre Instabilität können freie Radikale u.a. Mutationen und Bruchstellen in den DNA, Induktionen einer Lipidperoxidation der Lipoproteine oder der Zellmembran, Oxidationen und Inaktivierung von Proteinen und Enzymen verursachen. Entweder können die Schäden von ROS, RNS und anderen Stressoren repariert oder verhindert werden oder aber sie führen zu Zelltod, Erkrankungen oder Altern (Rensing et al., 2005; Dröge, 2002) Freie Radikale und körperliche Belastung Vor allem bei körperlicher Belastung (Davies et al., 1982) und im Alterungsprozess (Rensing et al., 2005) wird eine Steigerung der Produktion von freien Radikalen beobachtet (Abb. 1). Im Körper werden freie Radikale unter anderem während der oxidativen Phosphorylierung, als Nebenprodukt der energiereichen ATP-Produktion in den Mitochondrien gebildet (Thannickal et al., 2000). Dabei gilt die mitochondriale Atmungskette als die hauptsächliche Quelle intrazellulärer Entstehung, ist aber gleichzeitig auch ein Ziel für schädigende Effekte der freien Radikale (Ott et al., 2007). Schon bei physiologischer Stoffwechselaktivität entweichen 1-3 % der Elektronen (Askew, 2002; Chance at al., 1979) u.a. aus dem Komplex I und Komplex III (Beyer et al., 1992; Valko et al., 2007). Die dadurch entstehende Elektronenleckage führt zur Bildung von freien Radikalen wie dem Superoxidanionenradikal.
14 Einleitung 5 Weitere Quellen für die Entstehung sind das Xanthinoxidasesystem, die Regulationswege der NADPH-Oxidase, der Lipooxygenase, der Cyclooxygenase und der Stickstoffmonoxidsynthase (Andrew et al., 1999; Fehrenbach et al., 2001). Alter Körperliche Aktivität Kardiovaskuläre Erkrankungen H 2 O O 2 Sauerstoff NAD(P)H-Oxidase Xanthin-Oxidase O. 2 1e - - 1e -- Cytochrom c-oxidase Superoxidanionradikal SOD H 2 O 2 Wasserstoffperoxid Fe, Cu 2e -. OH Hydroxylradikal Zelltod Zelluläre Dysfunktion Abb. 1: Bildung von freien Radikalen und ROS (eigene Darstellung, modifiziert nach Kyaw M. et al, 2004). Bei der für aerobe Lebewesen unerlässlichen Reaktion der Energiegewinnung in der Atmungskette entstehen freie Radikale durch eine unvollständige Reduktion von Sauerstoff (O 2 ). Durch die Aufnahme eines Elektron entsteht aus dem Sauerstoff zunächst das reaktive, kurzlebige Superoxidanionenradikal, das spontan und durch die katalytische Aktivität der Superoxiddismutase (SOD) in das Wasserstoffperoxid übergeht. Das membranpermeable Wasserstoffperoxid ist ein wichtiges Molekül, da es relativ stabil ist und aus diesem Grund weite Diffusionsstrecken zurücklegen kann. Es besitzt neben seinen oxidierenden Eigenschaften auch die Besonderheit, Elektronen von Metallionen aufzunehmen (Haber-Weiss-
15 Einleitung 6 bzw. Fenton-Reaktion), wodurch hochreaktive Hydroxylradikale entstehen (Cohen, 1994), die dann in einem nächsten Schritt zu Wasser oxidieren können. Das Hydroxylradikal ist im Vergleich zu Wasserstoffperoxid hoch reaktiv und reagiert sofort nach Entstehung weiter. Durch ihre hohe Reaktivität reagieren Hydroxylradikale mit den meisten Biomolekülen und können diese auf vielfältige Weise schädigen. Daneben gibt es noch das kurzlebige Singulettsauerstoff, ein energetisch höherer Zustand des molekularen Sauerstoffs (Saltmann, 1989), das durch Energieabsorption entsteht. Diese aufgenommene Energie kann dann an andere Moleküle abgegeben werden, wodurch der Radialcharakter entsteht. Desweiteren haben die Superoxidanionradikale die Fähigkeit, mit Stickstoffmonoxid zu Peroxynitrit zu reagieren, welches mit Stickstoffmonoxid zu den reaktiven Stickstoffspezies zählt (Byrne et al., 2003). Wenn die Konzentration von Stickstoffmonoxid steigt, dann konkurrieren die Superoxiddismustase und das Stickstoffmonoxid um die vorhandenen Superoxidanionradikale, die mit Stickstoffmonoxid dreimal schneller reagieren als mit der Superoxiddismutase (Wolin, 2000). Neben physiologischen weist Peroxynitrit auch pathophysiologische Aktivitäten auf, beispielsweise fördert es die Inaktivierung der Mitochondrienatmung in Herzmuskelzellen, welche einer Hypoxie bzw. einer Ischämie und Reperfusion unterliegen. Peroxynitrit kann ferner das Gleichgewicht zwischen zellulärer Kinasen- und Phosphatasenwirksamkeit zerstören und antioxidative Enzymsysteme hemmen (Wolin et al., 2002). Weiterhin sind Leukozyten eine bedeutende Quelle freier Radikale. Im Rahmen ihrer Abwehrfunktion wandern sie bei inflammatorischen Prozessen in das entzündete Gewebe ein und produzieren dort freie Radikale, was oxidative Schäden auslösen kann (Cannon et al., 1994; Fielding et al., 1993; Dröge, 2002). Leukozyten können bei den inflammatorischen Prozessen zudem indirekt die Bildung freier Radikale verstärken, indem sie Cytokine freisetzen, die zu rezeptorvermittelten Stimulationen von Enzymen führen. Diese können dann wiederum freie Radikale produzieren, wie z.b. die Lipooxygenase oder die NADPH-Oxidase (Flohe et al., 1997), die bei einer Immunantwort
16 Einleitung 7 Superoxidanionenradikale freisetzen, die durch verschiedene Reaktionen zu Wasserstoffperoxid und weiter zu Hydroxylradikal umgesetzt werden. Bei körperlicher Aktivität gibt es noch weitere Mechanismen, die zu einer verstärkten Bildung von freien Radikalen führen. Hypoxie führt über die Aktivierung der Xanthinoxidase und über die Autooxidation von Katecholaminen zu vermehrter Bildung freier Radikale (Hellsten et al., 1997; Evans et al., 2001). So werden durch das Enzym Xanthinoxidase nach der Reperfusion von ischämischem Gewebe explosionsartig Sauerstoffradikale freigesetzt (Granger et al., 1981). Vor allem bei intensiver körperlicher Belastung scheint die Xanthinoxidase eine Rolle zu spielen. Es kommt dabei durch Hypoxie zu einem verstärkten Abbau des ATP und nachfolgend zu Hypoxanthin, welches zusammen mit dem wieder vorhandenen Sauerstoff zu Harnsäure umgewandelt wird. Als Folge entstehen Superoxidradikale und Wasserstoffperoxid, die Gewebeschäden induzieren können (Yamanaka et al., 1992). Dies ist neben intensiver körperlicher Belastung auch z.b. bei Herzerkrankungen der Fall. Eine weitere potentielle Quelle von ROS Radikalen ist die Aktivierung der induzierbaren NO-Synthase (inos). Stimuli sind bspw. Bakterien oder inflammatorische Cytokine. Neben Zellen des Immunsystems ist auch in Muskelzellen eine Expression der inos nachweisbar (Adams et al., 1997) und möglicherweise könnte ein belastungsinduzierter Anstieg zu höheren Stickstoffmonoxid-Konzentrationen beitragen. Alle Isoformen der NOS (nitric oxide synthase) synthetisieren in einer Reaktion Stickstoffmonoxid (NO). NO gehört wie Peroxinitrit zu den nitrosativen Stressoren und hat zahlreiche spezifische Aufgaben, u.a. Botenstoff und Stoffwechselregulator. NO als transzellulärer Botenstoff ist an zahlreichen physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt (Moncada et al., 1991). Es wird durch bestimmte Enzyme, den NO-Synthasen (NOS) aus Arginin und Sauerstoff gebildet. Es gibt vier bekannte Isoenzyme, das endotheliale (enos), neuronale (nnos), induzierbare (inos) und mitochondriale (mtnos). Im Vergleich zu anderen radikalen ist NO relativ langlebig und wenig reaktionsfreudig, kann sich aber schnell im Körper verbreiten. Es ist als Signalmolekül unter EDGFR (endothelium derived relaxing factor) bekannt und wirkt auf die glatte Muskulatur. Auch kann es u.a. die Neubildung von Gefäßen (Angiogenese)
17 Einleitung 8 induzieren (Weidner et al., 1992; Ziche et al., 1997). Bei der Bildung neuer Blutgefäße kommt es in dessen weiteren Verlauf zu Endothelproliferation, Auswanderung von Endothelzellen und Freisetzung von Proteasen (Rakusan 1995). In hohen Konzentrationen können die NO-Moleküle zu Peroxynitrit-Ionen reagieren. Diese sind äußerst reaktiv und können Lipidperoxidation und DNA- Schäden herbeiführen sowie Proteine oxidieren. Wie bei der normalen physiologischen Energiegewinnung in den Mitochondrien, bei der bis zu 3 % nicht zu Wasser, sondern zu Superoxid umgewandelt werden (Askew, 2002; Chance at al., 1979), ist auch bei körperlicher Belastung anzunehmen, dass Sauerstoffradikale bei gesteigerter Sauerstoffaufnahme in einem definierten Verhältnis relativ zum zellulär aufgenommen Sauerstoff gebildet werden. Jedoch gibt es Untersuchungen, die das nicht bestätigen (Chance et al., 1979). Die bedeutendsten Schädigungsmechanismen freier Radikale stellen Membranschädigungen durch Lipidperoxidation und DNA Schäden dar (Dröge, 2002). Die Lipidperoxidation führt zu einer reduzierten Fluidität der Zellmembran, die Unfähigkeit, Ionengradienten zu erhalten, zu Zellschwellungen und Gewebeentzündungen (Alessio, 1993). In einer Tierstudie konnte gezeigt werden, das Langstreckenlauf zu verstärkter Lipidperoxidation in der Niere und der Skelettmuskulatur führt. Ebenso konnte gezeigt werden, dass verstärkte Proteinoxidationen, die zu Zellschäden führen können, bei intensiver körperlicher Belastung zu beobachten sind (Semin et al., 2000). Freie Radikale können zu einer Änderung der Desoxyribose-Einheit innerhalb der DNA und damit zu Strangbrüchen und Basenmodifikationen führen. Die Entstehung oxidativer mtdna-läsionen wird im wesentlichen durch Wasserstoffperoxid und weniger durch Hydroxylradikale verursacht, was in der besseren Diffusionsfähigkeit von Wasserstoffperoxid begründet scheint (Cadenas et al, 2000). Eine erhöhte Wasserstoffperoxidproduktion der inneren oder äußeren Mitochondrienmembran verursacht einen Zuwachs an oxidierten mtdna-basen und Strangbrüchen (Cadenas et al., 2000). Eine Schädigung der DNA durch körperliche Belastung wird in unterschiedlichen Untersuchungen angenommen, wobei direkte Nachweise fehlen (Leeuwenburgh et al., 2001).
18 Einleitung Freie Radikale und Herzinsuffizienz Bei vermehrter Freisetzung freier Radikale oder bei Defiziten des antioxidativen Schutzsystems, können Schäden auftreten, die als Ursache zahlreicher chronischer Krankheiten gesehen werden, wie beispielsweise Herz-Kreislauf- Erkrankungen. Dies entsteht bei Akkumulation der Schäden oder bei replikativer Seneszenz, dem Altern (Rensing et al., 2005). Bei pathophysiologisch erhöhter Bildung freier Radikale kann durch eine geringere Verfügbarkeit des NO eine endotheliale Dysfunktion entstehen. Der endothelialen Dysfunktion wird eine bedeutende Rolle bei der Entstehung der Atherosklerose zugeschrieben (Forstermann et al., 1988; Yang und Ming, 2006). Die Atherosklerose nimmt innerhalb der Herz-Kreislauf-Erkrankungen eine zentrale Stellung ein, da mit der Progression der Erkrankung das Risiko für Bluthochdruck, koronare Herzkrankheit (KHK) und Herzinfarkt steigt. Eine wesentliche Rolle für die Entstehung der Atherosklerose spielt vor allem die oxidative Veränderung von low density Lipoproteinen (LDL) (Berliner und Heinecke, 1996). Die anschließende Entstehung von Intimaschäden führt zu Einbußen der Gefäßwandelastizität und der Endothelfunktion (Mügge et al., 1998; Yuan et al., 1998). Daraus entstehen atherosklerotische Plaques, die zu Verschlüssen und damit zu Herzinsuffizienz führen können. Bei einer Herzinsuffizienz kommt es myokardial und vaskulär zu einer erheblichen Steigerung von freien Radikalen (Sawyer et al., 2002; Ide et al., 2000). In einer Tierstudie mit chronischer linksventrikulärer Drucküberlastung wurde gezeigt, dass freie Radikale an der Entwicklung einer Herzinsuffizienz beteiligt sind (Dhalla et al., 1996). Unter dem Begriff Herzinsuffizienz versteht man eine Funktionsstörung des Herzens, in deren Folge nicht genügend Blut durch die Körperperipherie gepumpt wird, um die Durchblutung aller Organe zu gewährleisten und damit ihren metabolischen Bedarf zu decken (Hoppe et al., 2005). Es wird unterschieden zwischen Rechts-, Linksherz und Globalinsuffizienz, die akut oder chronisch sein kann. Die Einteilung des Schweregrades wird nach der New York Heart Association in vier Gruppen eingeteilt: ohne (I), leicht (II), mittlere (III) oder schwere (IV) (Pschyrembel, 2002). Die Herzinsuffizienz ist kein eigenständiges Krankheitsbild, sondern vielmehr ein klinisches Syndrom, das verschiedene Ursachen haben kann. Ein Drittel der Herzinsuffizienz ist die
19 Einleitung 10 Folge von koronaren Herzerkrankungen, ein zweites Drittel die einer Kardiomyopathie (McMurray et al., 1998; Cowie et al., 1999). Die Kardiomyopathien unterscheiden sich in einer hypertrophen Form, bei der die Zunahme der Ventrikelstärke im Vordergrund steht und einer dilatativen Form. Die häufiger vorkommende dilatative Kardiomyopathie (DCM) charakterisiert sich durch eine starke Vergrößerung und eine eingeschränkte systolische Funktion des linken Ventrikels (Dec et al., 1994). Die DCM selbst lässt sich nicht heilen, eine deutlich lebensverlängernde und qualitätsteigernde Therapieoption besteht in einer Herztransplantation (Smith et al., 2003). Nach der Framingham-Studie gilt als Hauptursache für die Herzinsuffizienz der Bluthochdruck und die KHK (Ho et al., 1993). Die verschiedenen Ursachen resultieren letztlich in einer unzureichenden Myokardfunktion, die dazu führt, das das Herzzeitvolumen unter Belastung nicht ausreichend gesteigert werden kann. Die Folge ist eine vorzeitige Ermüdung. Bei gestörter kardialer Funktion werden kompensatorische Mechanismen aktiviert, die ihrerseits wieder zur Verschlechterung der Herzinsuffizienz beitragen können. Die häufigsten Mechanismen sind Hypertrophie, Myozytenverlust und vermehrte Fibrose (Jessup und Brozena, 2003). Die Hypertrophie kann neben anderen Mechanismen auch durch Radikale (Nakagami et al., 2003) ausgelöst werden. Auch in den Arterien der Peripherie findet sich Endothelzellen vermitteltes Remodelling der Gefäßwände (Huonker, 2001, 2004). Es entwickeln sich weitere endotheliale Dysfunktionen mit verminderter blutflussabhängiger Vasodilatation unter körperlicher Belastung. Die Ischämie hat zur Folge, das sich die Belastbarkeit immer weiter verschlechtert (Vescovo et al., 1998). Bei der Herzinsuffizienz treten auch funktionelle und strukturelle Veränderungen im Skelettmuskel auf (Coats et al., 1994; Clark et al., 2006; Witte et al., 2007), die auf molekularen Mechanismen basieren. Komplizierte Interaktionen zwischen den Mechanismen spielen hierbei eine wichtige Rolle. So führt bspw. die bei der Herzinsuffizienz auftretende Ischämie zu einer Expression von antioxidativen Stressproteinen im Skelettmuskel (Mestril et al, 1995; Tanonaka et al., 2004; Genth-Zotz et al., 2004). Stressproteine sind vermutlich am Energiemetabolismus, der Signaltransduktion und der Myosintransformation, im Sinne der musklulären Anpassung an veränderte metabolische Bedingungen
20 Einleitung 11 beteiligt, wie sie bei Herzinsuffizienz oder körperlichem Training vorliegen. Während früher die Schonung von Patienten mit Herzinsuffizienz angezeigt war, zeigte sich bei einigen Studien (Sullivan et al, 1988; Freimark et al., 2007), dass körperliches Ausdauer- und Krafttraining eine zusätzliche Therapiemöglichkeit bei Herzinsuffizienz, Myokardinfarkt, koronarem Bypass oder Herztransplantation (Fletcher et al., 1996) bietet. Auch in der Herzchirurgie, z.b. bei Herzinfarkt oder bei Operationen mit Herz- Lungen-Maschine, spielen freie Radikale und die Ischämie ein große Rolle. Obwohl hier die Reperfusion des ischämischen Myokards das Überleben sichern kann, führt paradoxerweise genau diese Reperfusion zu einer Schädigung des Endothel- und Myokardgewebes (Kloner, 1993). Bei der Ischämie steht schnell keine Energie mehr zur Verfügung, es entsteht ATP- Mangel, ein starker Stressor für die Zelle und daraufhin Hypoxanthin. Bei einer Reperfusion des ischämischen Gewebes werden durch das Enzym Xanthinoxidase explosionsartig Sauerstoffradikale freigesetzt (Granger et al., 1981). Bei der Reperfusion wandelt die Xanthin-Oxidase das bei der Ischämie entstandene Hypoxanthin mit dem wieder vorhandenen Sauerstoff zu Harnsäure um (Abb. 2). Es entstehen Superoxidradikale und Wasserstoffperoxid, was auch den anschließenden Gewebeschaden erklärt. Dies kann auch bei hochintensiver körperlicher Belastung der Fall sein. Tossios und Mehlhorn, 2004 haben gezeigt, dass ein Einsatz des Antioxidants und Radikalfänger wie N-Acetylcystein in der Herzchirurgie zu reduziertem oxidativen Stress bei kardioplegischem Herzstillstand führt. In der Primär- und Sekundärprävention wird der regelmäßigen körperlichen Belastung insgesamt eine gesundheitsfördernde und lebensverlängernde Wirkung zugeschrieben. Hierfür wird unter anderem die Verbesserung der körpereigenen Abwehr verantwortlich gemacht. Es wurde nachgewiesen, dass ein individuell dosiertes Ausdauertraining die Herzarbeit ökonomisiert und damit den myokardialen Sauerstoff reduziert (Hedback et al., 1990). In einigen Tiermodellstudien konnten Erhöhungen der antioxidativen Kapazität am Skelettund Herzmuskel nachgewiesen werden. Die Anpassung durch Training zeigte sich hierbei in einer Aktivitätssteigerung von antioxidativen Systemen (Jenkins,
21 Einleitung ; Ji, 1995; Leeuwenburgh et al., 1994). Wenn durch körperliches Training die Expression von Antioxidantien beeinflusst wird, kann damit eventuell eine Grundlage für eine zukunftsorientierte mögliche Nutzung körperlichen Trainings in der Prävention und Rehabilitation geschaffen werden. Abb. 2: Xanthinoxidase-Reaktion bei Ischämie Reperfusion. ATP = - Adenosintriphosphat; ADP = Adenosindiphosphat; O 2 = Sauerstoff; O 2 = Superoxid (nach Tossios und Mehlhorn, 2004) Freie Radikale und Skelettmuskel Der Skelettmuskel verfügt über ein hohes adaptives Potential, um auf Trainingsreize und Stress mit strukturellen und physiologischen Veränderungen zu reagieren. Die Muskeladaption erfolgt über mehrere Mechanismen, wie die Änderung von Proteinisoformen, Faserneubildung oder Faserteilung (Splicing), Hypertrophie von Fasern und Faserabbau. Die Isoformen der Myosinschwerketten (MHC) bestimmen auf Proteinebene im wesentlichen die kontraktilen Eigenschaften einer Faser und charakterisieren den Muskel (Pette und Staron, 1997). Eine Neubildung von Muskelfasern erfolgt durch Satellitenzellen, die unter dem Einfluss von myogenen Differenzierungsfaktoren differenzieren. Freie Radikale spielen im Zusammenhang mit körperlicher Belastung eine Rolle als Signal- und Modulatormoleküle, sie haben Einfluss auf die kontraktile Funktion (Reid, 2001) und bei der Regulation redoxsensitiver Transkriptionsfaktoren des Skelettmuskels. Beim Effekt auf die kontraktile
22 Einleitung 13 Funktion führt eine moderate Steigerung des myozellulären freien Radikalengehalts zu einer optimalen Muskelkontraktilität (Modell Reid, 2001) (Abb. 3). Bei z.b. höherer körperlicher Belastung oder Ischämie kommt es jedoch zu einer Zunahme freier Radikale, dann dreht sich der prokontraktile Effekt in einen suppressiven um (Reid, 1998). Bei einer Zugabe von Antioxidantien führt nicht die Oxidation, sondern die Reduktion des zellulären Redoxstatus zu einer Abnahme der muskulären Kraftentwicklung. Diese Effekte durch freie Radikale scheinen strukturelle Modifikationen von Myosin, Actin und anderen Proteinen hervorzurufen (Reid, 2001), während sie andererseits die Kalziumsensitivität der Myofilamente reduzieren (Andrade et al., 1998) und zu einer Störung der myozellulären Kalziumregulation führen (Westerblad und Allen, 1991). Im Gegensatz zu den freien Radikalen übt Stickstoffmonoxid bereits eine suppressive Wirkung auf die Kontraktilität des Muskels aus (Reid 2001). Die Vielzahl von Anpassungsvorgängen auf körperliches Training sind bspw. veränderte Expressionsmuster myofibrillärer Proteine, Änderung der Enzymaktivität im Energiestoffwechsel, Kapillardichtezunahme und muskuläre Substratspeicher. Ein weiterer Faktoren ist z.b. die Hochregulierung von protektiven Mechanismen zur Toleranzentwicklung (Ji, 1995). Nicht trainierte Skelettmuskel zeigen im Vergleich zu anderen Geweben eine geringere Kapazität antioxidativer Schutzsysteme (Ji, 2002), die der Organismus jedoch bei Bedarf durch die gute Adaptionsfähigkeit schnell nach oben regulieren kann. Abb. 3: Einfluss des zellulären Redoxstatus auf die kontraktile Funktion des Skelettmuskels (Modell nach Reid, 2001).
23 Einleitung Antioxidatives Abwehrsystem Körperliche Belastung bezüglich der Auswirkungen auf den menschlichen Organismus ist schon oft untersucht worden. Studien haben gezeigt, dass regelmäßiges körperliches Training das Leben verlängern kann (Crawford et al., 1992; Hambrecht et al., 2000) und zu einer Vielzahl von physiologischen Veränderungen führt. Es wird dabei unterschieden zwischen Veränderungen direkt nach einer Belastung, sowie nach mittel- und langfristigen Belastungen. Eine kritische Größe ist hierbei die Intensität und der Umfang der Belastung. Die Reaktionsformen des Organismus sind entsprechend komplex. Hohe Belastungen führen zu wiederholten Stressantworten und können zur Schwächung des Systems führen, während regelmäßige körperliche Belastung eine Verbesserung der körpereigenen Abwehr, beispielsweise gegen oxidativen Stress und freie Radikale durch Hochregulierung von antioxidativen Systemen erreicht (Jenkins, 1988; Ji, 1995; Leeuwenburgh et al., 1994) (siehe Abb. 4). Abb. 4: Körperliches Training kann je nach Intensität zu einem Schutz führen oder die Bildung von freien Radikalen beschleunigen (modifiziert nach Bloch und Schmidt, 2005). Auch zeigen Studien, dass ein individuell dosiertes und kontrolliertes Ausdauertraining die mechanische Herzarbeit infolge einer Ökonomisierung auf
24 Einleitung 15 gegebenen Belastungsstufen vermindert und so den myokardialen Sauerstoffverbrauch reduziert (Hedbach et al., 1990). Ebenso kann Training den systemischen Gefäßwiderstand senken, womit wiederum auch der Blutdruck absinkt (Cornelissen et al., 2005). Der Körper passt sich bei chronisch körperlicher Belastung im Sinne eines Trainingseffekts an. So wurden bei Ausdauertrainierten weniger freie Radikale nachgewiesen als bei untrainierten Vergleichsprobanden mit gleicher Belastung (Jenkins, 1988). Die Bildung von freien Radikalen ist unvermeidlich und daher besitzen Organismen ein antioxidatives Abwehrsystem (Abb. 5). Ein ausgewogenes Verhältnis zwischen freiwerdenden Radikalen und antioxidativen Regulationsmechanismen ist unerlässlich, um die Oxidationsschäden einzudämmen. Die Zellen haben dazu zahlreiche Schutzmechanismen entwickelt. Sie zeigen präventive Schutzvorrichtungen, bei denen die Radikale schnell entschärft oder gar nicht erst entstehen können sowie reaktive Maßnahmen, die Schäden beseitigen oder die Apoptose einleiten. Alter Körperliche Aktivität Kardiovaskuläre Erkrankungen Lipoperoxide Vit E,Se-GPx Phopholipasen Oxidierte Proteine Protesome, Macroxiproteinasen Oxidierte DNA Endonukleasen, Ligase H 2 O O 2 Sauerstoff NAD(P)H-Oxidase Xanthin-Oxidase O. 2 1e - - 1e -- Cytochrom c-oxidase SOD SOD SOD Superoxidanionradikal Vit C H 2 O 2 Wasserstoffperoxid 1 O 2 Singulet-Sauerstoff Karotinoide Ferretin, Transferrin Fe, Cu 2e - OH. Hydroxylradikal Vit C, Harnsäure Zelltod Zelluläre Dysfunktion Abb. 5: Schematische Darstellung: Bildung freier Radikale mit antioxidativem Abwehrsystem (eigene Darstellung, modifiziert nach Kyaw M. et al, 2004).
25 Einleitung 16 Bei der Prävention von oxidativem Stress werden reaktive Übergangsmetallionen, vor allem Kupfer und Eisen durch Proteine wie Ferrin, Transferrin, Coeruloplasmin und Metallothionein inaktiviert. Die Metalle werden dabei chelatiert oder direkt oxidiert. Dadurch werden Lipidperoxidationen und DNA-Schäden durch katalytisch wirksame Matallionen verhindert. Die Antioxidantien können eingeteilt werden in enzymatische und nichtenzymatische. Nichtenzymatische Antioxidantien sind Substanzen, die Radikale entschärfen, indem sie Elektronen leicht abgeben. Das Thioredoxin- und Glutathionsystem stellen in der aeroben Zelle die zentralen antioxidativen Mechanismen dar. Dabei ist Glutathion (GSH), ein Tripeptid eines der wichtigsten zellulären Antioxidantien. GSH wird in der Zelle hergestellt, kommt in hohen zellulären Konzentrationen vor und wird bei seiner Wechselwirkung mit freien Radikalen zu GSSG oxidiert. Es kann direkt mit reaktiven Sauerstoffspezies reagieren, dient aber im wesentlichen als Substrat für die Glutathionperoxidase, die für die Elimination von Lipidperoxiden sorgt. GSH spielt darüber hinaus eine zentrale Rolle bei der Genexpression, die pro- und antiinflammatorische Proteine kodiert. Zu niedrige GSH-Konzentrationen haben eine Verschlechterung der Immunabwehr zur Folge. Neben weiteren zellulären Antioxidantien spielen Bilirubin, Harnsäure, Flavonoide oder die mit der Nahrung aufzunehmenden Vitamine A, C und E eine Rolle, wobei Vitamin E Lipide vor der Peroxidation durch Radikale schützt und Vitamin C vor allem bei dem Recycling von zellulären Antioxidantien hilft. Bei erhöhtem oxidativem Stress, bspw. durch körperliche Anstrengung, falsche Ernährung, Rauchen, Alterungsprozessen oder Krankheiten wird eine maßvolle Supplementierung von essentiellen Antioxidantien empfohlen. Jedoch ist die therapeutische Wirkung diesbezüglich umstritten (Vina et al., 2000). Weiterhin wichtig sind Thioredoxine, die wie alle Proteine mit einer Thiolgruppe (-SH) Enzyme mit antioxidativer Aktivität sind und auch bei der Regulation des Immunsystems eine Rolle spielen. Nach seiner Oxidation wird Thioredoxin durch die Thioredoxinreduktase (TRxR), einem Enzym mit Selencystein-Gruppe am aktiven Zentrum, reduziert. Die Thioredoxinreduktase ist unter anderem am Abbau von Lipidperoxiden und Wasserstoffperoxid beteiligt, ebenso, wie an der
26 Einleitung 17 Rückumwandlung des Ascobyl-Radikal in Ascorbinsäure. Ähnlich wie Thiordoxin spielt auch das Glutathion eine wichtige Rolle als Antioxidant. Peroxiredoxin und andere antioxidative Enzyme schützen die Zelle vor Schädigung durch oxidativen Stress. Bei der enzymatischen Abwehr werden reaktive Sauerstoffspezies mittels antioxidativer Enzyme reduziert und wandeln sie damit in weniger oder nicht reaktive Moleküle um. Die Superoxiddismutase, Katalase und Glutathionperoxidase werden in einem genau regulierten Gleichgewicht exprimiert. Zu den wichtigsten Enzymen gehört die Superoxiddismutase (SOD), die das Superoxid-Anion-Radikal in Wasserstoffperoxid umwandelt, welches keine radikalen Eigenschaften aufweist, aber zu dem hochreaktiven Hydroxylradikal reagieren kann. Damit bildet die SOD die erste Verteidigungslinie gegenüber oxidativem Stress. Es gibt drei Metall-abhängige Isoformen dieses Enzyms, die sich auch durch ihr Vorkommen unterscheiden. Die Kupfer- und Zink-abhängige Form (CuZnSOD) liegt fast ausschließlich im Zytoplasma (SOD1), in gewissen Mengen aber auch im Extrazellulärraum (SOD3), z.b. im Skelettmuskel vor (Fattman et al., 2003; Van Remmen et al., 2003). Die Mangan-abhängige Superoxiddismutase (MnSOD oder SOD2) ist in den Mitochondrien lokalisiert und von großer Bedeutung für das Überleben. Versuche mit knock-out Mäusen haben gezeigt, dass der Ausfall eines der SOD-Enzyme vor allem problematisch ist, wenn das mitochondriale Enzym betroffen ist, da gerade dort viel Superoxid entsteht. Wird das Mn-Enzym der Mitochondrien (SOD2 -/- ) vollständig inaktiviert, wachsen die embryonalen Mäuse nicht normal und sterben kurz nach der Geburt. Fehlt das CuZnSOD, treten Ausfälle am Gehirn oder Lungenschäden auf (Straßburger et al., 2005; Melov S, 2002). Das durch die Superoxiddismutase entstandene Wasserstoffperoxid wird von den Enzymen Katalase und Glutathionperoxidase (GPO) unschädlich gemacht, indem es zu Wasser und Sauerstoff umgewandelt wird. Die GPO kommt sowohl im Zytosol als auch in den Mitochondrein vor, eliminiert auch Lipidperoxide und benötigt Glutathion als Kofaktor. Das oxidierte Glutathion (GSSG) kann vor allem durch die Glutathionreduktase regeneriert werden. Bei der Regeneration werden verschiedene Elektronentransportketten genutzt, wobei NADPH und NADH als Elektronendonatoren dienen.
27 Einleitung 18 Im Zusammenhang mit der bekannten protektiven Wirkung von regelmäßigem Training stellt sich die Frage nach den Mechanismen, über die freie Radikale den Schutz vor oxidativem Stress verbessern und inwiefern trainingsinduzierte Veränderungen der freien Radikalkonzentration in die zelluläre Steuerung eingreifen. Die Verminderung der Produktion von freien Radikalen, wie sie für den basalen Level von H 2 O 2 unter Ausdauertraining gezeigt werden konnte (Venditti, et al., 1999), ist eine wichtige trainingsinduzierte Anpassung. Studien zeigen, dass insbesondere Ausdauertraining zu einer gewebsspezifischen Erhöhung der antioxidativen Kapazität, z.b. in der Skelett- und Herzmuskulatur (Jenkins, 1988; Ji, 1995) führte. Ausdauertraining im Tiermodell führte zu einer Steigerung des Gehalts an Antioxidantien und antioxidativen Enzymen in Herzund Skelettmuskulatur (Powers et al., 1993; Leeuwenburgh et al., 1994). Körperliches Training führte auch zu einer Reduktion der mitochondrialen H 2 O 2 - Produktion (Leeuwenburgh et al., 2001) und zu einer Unterdrückung der stimulierten Freisetzung von freien Radikalen aus Leukozyten (Gabriel et al., 1994; Pyne et al., 2000). Die trainingsinduzierte Anpassung zeigt sich dabei in einer Steigerung der Aktivität antioxidativer Enzyme, wie der Glutathionperoxidase und der Superoxiddismutase, sowie dem Gehalt von antioxidativem Glutathion (Rush et al., 2003). Auch zeigt sich bei regelmäßigem Training eine Verstärkung der Reparaturmechanismen, wie beispielsweise Hitzeschockproteine und der Hämoxygenase-1 (Niess et al., 1999; Fehrenbach et al, 2000). Hitzeschockproteine sind Stressproteine, die eine wichtige zellprotektive Funktion erfüllen. Sie haben eine Chaperonfunktion und helfen damit bei der korrekten Faltung von Proteinen, bei der Einschleusung von wichtigen Proteinen in die Mitochondrien, beim Transport im Zytoplasma und an den Ribosomen. Hitzeschockproteine eliminieren phagozytierendes Material, sind in die Degradierung von abnormalen Proteinen involviert und spielen eine Rolle als Regulatorproteine (Fehrenbach und Nies, 1999; Knowlton, 1997; Moseley, 1998). Weiter sind sie im Rahmen der Antigenpräsentation ein wichtiger Faktor (Moseley, 2000; Arnold-Schild et al., 1999). In Studien bei Tieren und Menschen ist eine erhöhte Expression von Hitzeschockproteinen im Skelett-
28 Einleitung 19 und Herzmuskel, aber auch in Leber und Niere nach längerer Belastung gemessen worden (Kregel, 2002; Rensing et al., 2005) Jedoch ist die trainingsinduzierte Anpassung der antioxidativen Mechanismen von sehr unterschiedlichen Faktoren abhängig und trotz einer Reihe von Studien, die den protektiven Effekt von Training zeigen, sind die Mechanismen und Bedingungen, die zu einer Protektion führen noch nicht ausreichend aufgeklärt. Je nach Intensität und Umfang des körperlichen Trainings dürfte es einen Schwellenwert (Bloch und Schmidt, 2004) geben, ab dem der oxidative Stress dramatisch erhöht ist (Davies et al., 1982; Packer, 1986). Diese Schwelle scheint sich durch adäquates Training und eine Anpassung an oxidativen Stress zu erhöhen (Leeuwenburgh und Heinecke, 2001). Dabei dürften der individuelle Trainings-, Gesundheits- und Genetik-Status eine Rolle spielen (Ohno et al., 1988; Alessio und Goldfarb, 1988), aber auch Alter und Geschlecht. 1.4 Peroxiredoxin Peroxiredoxin (Prx) kommt in vielen Organismen, von Archaebakterien bis hin zu Säugern vor, was auf das Alter und die Bedeutung dieser Enzyme schließen lässt (McGonigle et al., 1998). Peroxiredoxin zählt zu der Gruppe der zellulären Antioxidantien und schützt die Zelle durch den katalytischen Abbau reaktiver Sauerstoffverbindungen vor oxidativem Stress, darüber hinaus ist Prx an der Modulation zellulärer Signalwege beteiligt (Wood et al., 2003; Flohe et al., 2003). Zusätzlich scheinen sie Funktionen in der metabolischen Regulierung und der zellulären Differenzierung zu haben (Hofmann et al., 2002). Da die molekulare Leistungsfähigkeit von Prx im Vergleich zu der Katalase und der Selen enthaltenen Glutathionperoxidase kleiner ist, scheinen sie überwiegend unter Stressbedingungen erforderlich zu sein. Das antioxidativ wirksame Enzym Peroxiredoxin besitzt Thioredoxin-abhängige Peroxidaseaktivitäten und gehört zu der Familie der Peroxidasen. Diese werden in Zusammenhang mit zentralen Lebensprozessen wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose gesehen. Peroxidasen reduzieren Peroxide bei gleichzeitiger Oxidation eines Kosubstrats. Bei den Peroxiredoxin liegt die Besonderheit darin, dass sie sowohl Peroxidase als auch Kosubstrat sind, das Enzym wird selbst während
29 Einleitung 20 der Reaktion oxidiert. Peroxiredoxin übt eine Schutzfunktion aus, indem es Wasserstoffperoxid gezielt zur Oxidation von Cystein verwendet. Peroxiredoxin haben dafür ein Cystein in ihrem aktiven Zentrum. Peroxiredoxine (Prx) Abb. 6: Darstellung über die Deaktivierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) ablaufenden Reaktionswege. Rot eingekreist ist Peroxiredoxin (Prx) Thioredoxin-abhängig bei der Reduktion von Wasserstoffperoxid zu Wasser (modifiziert nach LabFrontier 2004). Für die antioxidative Schutzfunktion der Peroxiredoxin und ihre Struktur spielen die intramolekulare, hochkonservierte Cysteinreste eine entscheidende Rolle. Nach deren Anzahl und Lokalisation werden die Peroxiredoxin-Isoformen in drei Gruppen unterteilt. Die bisher bekannten sechs Isoformen (Prx 1-6) bei Säugetieren (Rhee et al., 2001) werden den Untergruppen 2-Cys, atypischen 2- Cys und 1-Cys zugeordnet (Tab. 1). Die Reaktionsmechanismen dieser Gruppen sind unterschiedlich. 1-Cys Peroxiredoxin werden am N-terminalen Cys-SH durch Peroxide zu Sulfensäure (Cys-SOH) oxidiert, die durch nichtphysiologische Thiole reduziert werden kann. Ob Thioredoxine die Funktion der Regeneration erfüllen, ist noch nicht sicher (Krnajski et al., 2001).
30 Einleitung 21 Bei den 2-Cys Peroxiredoxinen erfolgt auch eine Oxidation zur Sulfensäure. Wobei die typischen 2-Cystein-Peroxiredoxine Homodimere sind und wie die monometrisch aufgebauten atypischen 2-Cystein-Peroxiredoxine neben dem Cys-SH einen weiteren, an der Peroxidasereaktion beteiligten C-terminalen Cysteinrest besitzen. Während es bei den typischen 2-Cystein-Peroxiredoxinen zu einer Ausbildung einer intermolekularen Disulfidbrücke zwischen dem Cys- SOH und dem C-terminalen Cysteinrest der Untereinheit kommt, bildet sich bei den atypischen 2-Cystein-Peroxiredoxinen eine intramolekulare Disulfidbrücke. Die Reduktion der Disulfidbrücken und die Regenerierung des Cys-SH erfolgt hier durch Thioredoxin. Davon gehört nur Prx 6 zu der 1-Cys Gruppe, während Prx 1-4 der 2-Cys und Prx 5 ein Mitglied der atypischen 2-Cys ist, deren Thioredoxin-abhängige Peroxidase Aktivität Thioredoxin, Thioredoxin-Reduktase und NADPH als Reduktionssystem benutzt. Basierend auf der Aminosäure-Homologie ist besonders die Homologie zur N-terminalen Region von Bedeutung, welche die Cysteinreste des reaktiven Zentrums wie auch die Thiol-spezifische Antioxidanz-Aktivität enthält (LabFrontier, 2004; Hofmann et al., 2002; Wood et al., 2003). Isoform Prx 1 Prx 2 Prx 3 Prx 4 Prx 5 Prx 6 Untergruppen 2-Cystein 2-Cystein 2-Cystein 2-Cystein atypisches 2-Cystein 1-Cystein Lokalisation Cytosol, Nucleus Cytosol, Membrane Mitochondria Cytosol, Golgi, Secreted, Membrane Mitochondria, Peroxisome, Cytosol Cytosol Tab. 1: Die sechs Peroxiredoxin (Prx)-Isoformen mit Untergruppen und Lokalisation (modifiziert nach Wood et al, 2003). Die Isoenzymformen von Säugetieren befinden sich unterschiedlich verteilt in den Zellkompartimenten. Peroxiredoxin 1 findet sich im Cytosol und Nucleus, Peroxiredoxin 2 im Cytosol und in der Membran, während Peroxiredoxin 3 nur in den Mitochondrien und Peroxiredoxin 4 sowohl im Cytosol, Golgi, Sekret als auch in der Membran vorkommt. Peroxiredoxin 5 zeigt eine vielfältige Verteilung und ist neben den Mitochondrien beispielsweise auch in den Peroxisomen, aber
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