Proteine I. Fällung Konzentrationsbestimmung. Dr. Richard Weiss

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1 Proteine I Fällung Konzentrationsbestimmung Dr. Richard Weiss

2 Praktikumsaufbau Tag 1: Konzentrieren Denaturierende und native Fällung Protein Konzentrationsbestimmung Tag 2: Entsalzen Gelchromatographie Dialyse Tag 3: Elektrophorese SDS-PAGE

3 Proteinreinigung Bereits Anfang des 19. Jahrhunderts waren drei einfache Methoden zur Proteinreinigung bekannt: Extraktion zur Anreicherung Ansäuerung zur Ausfällung Kristallisation beim einfachen Stehenlassen einer Lösung

4 Fällung von Proteinen Proteinfällung wird normalerweise als grobe Vorreinigung verwendet, um Kontaminationen (z.b. Salz, Lösungsmittel, Nukleinsäuren, Lipide, etc.), die bei einer späteren Proteinanalysemethode wie SDS-PAGE stören würden, zu entfernen. Außerdem können zu niedrig konzentrierte Proben durch Fällung einkonzentriert werden. Fällung (Präzipitation) von Proteinen tritt auf, wenn Monomere oder kleine Komplexe von gelöstem Protein sich zu großen Aggregaten zusammenschließen die Proteine interagieren eher miteinander als mit dem Lösungsmittel (Wasser).

5 Löslichkeit von Proteinen Wie leicht oder schwer sich ein Protein fällen läßt hängt von seiner Löslichkeit ab: Gut löslich: intrazelluläre Proteine (z.b. Enzyme) Schlecht löslich: strukturbildende Proteine (z.b. Cytoskelett, Membranproteine) Besonders schlecht in wässrigen Medien handhabbar sind die sehr hydrophoben, integralen Membranproteine können nur mit Detergenzien gelöst werden.

6 Löslichkeit von Proteinen Proteine haben polare, apolare und geladene Aminosäuren. Sie lösen sich in Wasser, weil ihre polaren und geladenen Gruppen an der Oberfläche mit den Wassermolekülen interagieren und Wasserstoffbrücken bilden. Amidgruppen (Wasserstoffdonor) und Carbonylgruppen (Wasserstoffakzeptor) der Peptidbindung können zu einem Wassermolekül Wasserstoffbrücken ausbilden Außerdem können die Seitenketten von 11 der 20 Aminosäuren an Wasserstoffbrücken beteiligt sein.

7 Löslichkeit von Proteinen Wasser ist ein Dipol. Der Sauerstoffkern zieht die Bindungselektronen von den Wasserstoffkernen zu sich heran und bewirkt so, daß die Redion um die Wasserstoffkerne eine positive Nettoladung erhält. Aufgrund seine Polarität bildet Wasser eine Hydrathülle um geladene Gruppen und vermindert dadurch elektrostatische Wechselwirkungen zwischen geladenen Molekülen.

8 Säure/Base-Eigenschaften Proteine haben auf Grund ihrer Aminosäurezusammensetzung saure oder basische Eigenschaften. Bei neutralem ph sind die Seitenketten von 3 Aminosäuren positiv geladen und von 2 Aminosäuren negativ. Basische Aminosäuren Saure Aminosäuren

9 Säure/Base-Eigenschaften Die Nettoladung eine Proteins hängt vom ph der umgebenden Lösung ab: ph < pi des Proteins positive Nettoladung ph = pi des Proteins neutrale Nettoladung ph > pi des Proteins negative Nettoladung pi = isolektrischer Punkt

10 Verhalten apolarer Reste Unpolare Moleküle oder Gruppen von Molekülen schließen sich in Wasser zu größeren Aggregaten zusammen = hydrophobe Wechselwirkung Ein unpolares Molekül erzeugt einen Hohlraum im Wasser, der einige Wasserstoffbrücken zwischen den Wassermolekülen zerbricht. Die Wassermoleküle bilden einen Wasserkäfig um das ungeladene Molekül = energetisch ungünstig! Unpolare Moleküle treten in wässriger Lösung nicht primär deshalb zusammen, weil sie eine große Affinität zueinander haben, sondern weil Wassermoleküle untereinander starke Bindungen eingehen.

11 Verhalten apolarer Reste Apolare Reste verringern die Wasserlöslichkeit es bilden sich Komplexe aus Proteinen die ihre apolaren Oberflächen aneinanderlegen. = thermodynamisch günstig

12 Fällungstechniken I) Bei niedriger Salzkonzentration am pi II) Durch anorganische Salze in hoher Konzentration III) Durch selektive Denaturierung IV) Durch organische Lösungsmittel Parameter, die beachtet werden müssen: Proteinkonzentration ph Wert Erhalt der biologischen Aktivität ( Denaturierung) Größe des Proteins Temperatur

13 I) Fällung am isoelektrischen Punkt Am isoelektischen Punkt ist die Nettoladung des Proteins null und seine Löslichkeit am geringsten. Beruht auf elektrostatischen Wechselwirkungen Moleküle mit ähnlichem pi interagieren bevorzugt miteinander Anreicherung bestimmter Proteine

14 I) Fällung am isoelektrischen Punkt

15 I) Effekt geringer Ionenkonzentration H 2 PO 4 - Na + Bei physiologischer Ionenstärke werden die Ladungen der Proteine durch Salzionen kompensiert Je geringer die Ionenkonzentration im Lösungsmittel ist, umso eher neigen die Proteine dazu, ihre Oberflächenladungen gegenseitig durch Aggregatbildung zu kompensieren. Große Aggregate fallen aus. Praxis: Verdünnen oder Dialyse gegen Wasser

16 II) Fällung mit anorg. Salzen Beruht auf hydrophoben Wechselwirkungen Die Eigenschaft eines Salzes, Proteine zu fällen, ist in der Hofmeister-Serie beschrieben. Antichaotrope Salze sind gute und schonende Fällungsmittel (vergrößern hydrophobe Effekte) Chaotrope Salze halten Protein in Lösung (vermindern hydrophobe Effekte)

17 II) Fällung mit Ammoniumsulfat Weit verbreitetes, nicht denaturierendes Fällungsverfahren Prinzip: Stark geladene Ammonium Ionen (NH 4+ ) und Sulfat Ionen (SO 4 2- ) hydratisieren und entziehen den Proteinen die Hydrathülle. Dies führt zur Aggregatbildung der Proteine durch hydrophobe Wechselwirkung. Parameter: Anzahl und Position der polaren und apolaren Gruppen, MW der Proteine, ph-wert und Temperatur. Fraktionierte Fällung: Verschiedene Proteine fallen bei unterschiedlichen (NH 4 ) 2 SO 4 Konzentrationen aus.

18 II) Fraktionierte Fällung Durch hintereinander gereihte Fällungen mit ansteigenden Salzkonzentrationen kann ein Proteingemisch anhand der unterschiedlichen Löslichkeit der Proteine fraktioniert werden.

19 II) Ammoniumsulfat - Durchführung Praktikumsbeispiel: Ausfällen von Immunglobulinen (=Antikörper) aus Kaninchenserum. Serum besteht zu 90% aus Wasser, in dem verschiedene Salze, Mineralien, Proteine, Fette, Zucker u.a. gelöst sind. Das häufigste im Serum gelöste Protein ist das Albumin, weiters sind Immunglobuline, Fibrinogen, Gerinnungsfaktoren u.v.a. Proteine enthalten. Durch seine hohe Löslichkeit fällt Albumin erst bei sehr hohen Salzkonzentrationen aus.

20 II) Ammoniumsulfat - Durchführung Durchführung: Für die Präzipitation von AK variiert die Konzentration an Ammoniumsulfat geringfügig von Spezies zu Spezies. So werden die meisten Kaninchen-Ak bereits bei 40%-Sättigung ausgefällt, während Maus-Ak 45-50%- Sättigung benötigen. Daher ist die 50%-ige Sättigung ein üblicher Bereich, um Ak auszufällen. Durch Zugabe von gesättigter Ammoniumsulfatlösung (4.1M bei 25 C) soll eine Endkonzentration von 2.05M erreicht werden. Die Immunglobuline fallen aus, während ein Großteil des Albumins im Überstand bleibt.

21 II) Ammoniumsulfat - Durchführung Beispiel: Wieviel ml einer gesättigten (4.1M) Ammoniumsulfatlösung müssen zu 1ml Serum zugegeben werden, um eine Endkonzentration von 1.37M zu erreichen? c 1 v 1 = c 2 v x = 1.37 (1+x) 2.73x = 1.37 x = 0.5

22 II) Ammoniumsulfat - Durchführung Beispiel: Wieviel ml einer gesättigten (4.1M) Ammoniumsulfatlösung müssen zu 1ml Serum zugegeben werden, um eine Endkonzentration von 1.33M zu erreichen? Serum Anteile = 1ml 1.37 Amm.Sulf Anteile = x x = 0.5

23 III) Selektive Denaturierung Denaturierung kann durch Änderungen der Temperatur, des phs oder durch Zugabe von organischen Lösungsmitteln erreicht werden. Die Tertiärstruktur des Proteins wird zerstört random coil Struktur Aggregatbildung Aggregatbildung hängt ab von ph und Ionenstärke und findet leichter nahe am pi des Proteins und bei geringer Ionenstärke statt

24 III) TCA Fällung Trichloressigsäure: Irreversible, sehr effiziente Fällung Schnell und einfach: TCA wird der Proteinlösung zugegeben, bis eine Endkonzentration von 10% erreicht ist. 30 min auf Eis, abzentrifugieren Methode der Wahl für analytische Zwecke Wird vor allem zur Einkonzentrierung einer Probe vor der Gelelektrophorese verwendet.

25 IV) Organische Lösungsmittel Beruht auf elektrostatischen Wechselwirkungen Erzeugen ein weniger polares Milieu in der Lösung und reduzieren dadurch die Löslichkeit der Proteine Parameter ähnlich wie bei der Fällung am pi: ph, Proteingröße, Temperatur. Hydrophobe Proteine (Membranproteine) werden durch organische Lösungsmittel jedoch gelöst und nicht ausgefällt! Beispiele: Aceton, Methanol, Ethanol, Propanol,... z.b. Kohn-Fraktionierung von Plasmaproteinen mit kaltem Ethanol

26 Proteinbestimmung Durch komplexen Aufbau der Proteine keine perfekte Proteinbestimmung möglich (Zucker, Prosthetische Gruppen, Nebengruppeneffekte) Verschiedene Ergebnisse bei verschiedenen Tests der gleichen Lösung Gleiche Konzentrationen verschiedener Proteine liefern unterschiedliche Ergebnisse im selben Test. Empfindlich auf Detergenzien und Ionen

27 Bradford Assay Blauer Säurefarbstoff Coomassie-Brillantblue In Gegenwart von Proteinen verschiebt sich das Adsorptions-maximum von Coomassie-Brillantblue von 465 nach 595 nm Stammlösung aus dem Farbstoff, Ethanol und Phosphorsäure wird im Verhältnis 50:1 mit der Proteinlösung gemischt. 10 min R.T. dann Messung bei 595 nm Bindet recht unspezifisch v.a. an Arginin, weniger an Lysin, Histidin, Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin Farbstoff wird dadurch in seiner deprotonierten, anionischen Sulfonatform stabilisiert 595nm

28 Beispiele für Prüfungsfragen

29 Sie wollen ein eher hydrophobes cytoplasmatisches Protein aus einem Zellextrakt mittels einer Serie verschiedener Methoden, u.a. Ammoniumsulfatfällung reinigen. Dazu würden Sie: A) Den Zellextrakt zuerst einmal dialysieren B) Als erstes bei niedriger Salzkonzentration fällen und mit dem Pellet weiterarbeiten C) Als erstes bei hoher Salzkonzentration fällen und mit dem Überstand weiterarbeiten D) Das Protein zuerst mit einer chromatographischen Technik vorreinigen und die Fällung erst am Schluß machen. E) Das Protein zuerst mit einem organischen Lösungsmittel in Lösung bringen

30 Sie möchten eine Proteinlösung vor einer SDS-PAGE rasch und unkompliziert einkonzentrieren. Welche Methode erscheint Ihnen am geeingnetsten? A) Einstellen des phs auf den pi B) Fällung durch Zugabe von 2 Volumen Ethanol C) Fällung durch Zugabe von 1/10 Volumen TCA D) Fällung mit hohen Konzentrationen an Ammoniumsulfat E) Dialyse gegen Wasser

31 Ein Protein ist in Wasser gut löslich wenn: A) Es viele geladene Gruppen auf seiner Oberfläche hat B) Es sehr groß ist C) Es einen hohen pi hat D) Bei niedriger Temperatur E) Es in hoher Konzentration vorliegt

32 Wasser: 1) ist ein Dipol 2) ist ein lineares Molekül 3) ist in der Lage Wasserstoffbrückenbindungen mit Amidresten einzugehen 4) ist in der Lage Wasserstoffbrückenbindungen mit Methylgruppen einzugehen 5) hat eine hohe Dielektrizitätskonstante A) 1, 2, 4 B) 2, 4, 5 C) 1, 4, 5 D) 1, 3, 5 E) 2, 3, 5

33 Welche der folgenden Aminosäuren sind basisch? 1) Lysin 2) Glycin 3) Arginin 4) Aspartat 5) Alanin A) 1, 3 B) 2, 4 C) 2, 3, 5 D) 1, 2, 3 E) 1, 5

34 Wenn der ph kleiner als der pi eines Proteins ist, ist das Protein: A) positiv geladen B) negativ geladen C) ungeladen D) Die Ladung des Proteins ist nicht vom ph abhängig E) Fällt das Protein aus

35 Welche der folgenden Techniken sind native Fällungsmethoden für Proteine? 1) Fällung durch Ionenentzug am pi 2) Fällung mit Ammoniumsulfat 3) Fällung mit TCA 4) Fällung mit Ethanol 5) Fällung durch starke Ansäuerung des Mediums A) 2, 3, 4 B) 1, 2, 4 C) 1, 2, 5 D) 3, 4, 5 E) 1, 4, 5

36 Proteine können bei Dialyse gegen Wasser ausfallen, weil A) sie ihre Oberflächenladungen nicht mehr mit Salzionen kompensieren können B) sie denaturieren und dadurch hydrophobe Bereiche freigelegt werden C) sich der ph Wert der Lösung verändert D) weil in reinem Wasser die hydrophoben Wechselwirkungen stärker sind E) weil der isoelektrische Punkt sinkt

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