Aus der Abteilung für Neuroanatomie Der Ruhr-Universität Bochum Prof. Dr. med. Rolf Dermietzel

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1 Aus der Abteilung für Neuroanatomie Der Ruhr-Universität Bochum Prof. Dr. med. Rolf Dermietzel Untersuchungen zur Autoimmunität gegen ionotrope Glutamatrezeptoren bei Multiple Sklerose- und Rasmussen Enzephalitis-Patienten Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universtät Bochum vorgelegt von Jürgen Trippe aus Dortmund 2013

2 Dekan: Prof. Dr. med. K. Überla Referent: Prof. Dr. med. P. M. Faustmann Korreferent: Prof. Dr. rer. nat. M. Hollmann Tag der mündlichen Prüfung:

3 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Zielsetzung Material und Methoden Verwendete Primer Molekularbiologische Methoden Agarose-Gelelektrophorese Restriktion von DNA-Molekülen Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Polymerasekettenreaktion (PCR) Auffüllen von überhängenden 5`-DNA-Enden Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten Ligation von DNA-Molekülen Transformation in E.coli-Bakterien Plasmid-DNA-Präparation im kleinen Maßstab Plasmid-DNA-Präparation im mittleren Maßstab Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Sequenzierung von DNA Zellkultur Verwendete Zelllinien Kultivierung von HeLa DP-Zellen Kultivierung von HEK293-Zellen Transfektion von Zellen mittels Calciumphosphatmethode Proteinbiochemische Methoden Isolierung von Proteinen mittels Anti-c-myc-Agarose SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Western-Blot Optimierung der Methode von Western Blot-Analysen rekombinanter Glutamatrezeptorproteine Verwendete Blutseren sowie deren Auswertung in Western Blot-Analysen Ergebnisse Klonierung der Glutamatrezeptoren Klonierung von GluA Klonierung von GluK2, GluN1 und GluN2B

4 4.2. Expression der Glutamatrezeptoren in HeLa-Zellen Affinitätschromatographische Aufreinigung der Rezeptoren GluA3 und GluN Western Blot-Analysen von Blutseren gegen den Glutamatrezeptor GluA Western Blot-Analysen von Blutseren gegen den Glutamatrezeptor GluN Auswertung der Western Blot-Analysen in der Konferenz für GluN Statistische Auswertung der Daten Diskussion Zusammenfassung Literaturverzeichnis

5 Abkürzungsverzeichnis AMPA α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid ATP Adenosintriphosphat BSA Rinder-Serum-Albumin CIAP Calf Intestine Alkaline Phosphatase cdna (copy)desoxyribonukleinsäure dntp Desoxyribonukleosidtriphosphat DTT Dithiothreitol EDTA Ethylendiamin-N,N,N,N -tetra-essigsäure FCS fetel calf serum GST Glutathion-S-Transferase HEK human emryonic kidney HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N -2-ethan-sulfonsäure IFT Immunfluoreszenztest IgG/IgM Immunglobulin G/M kda kilo Dalton LB-Medium Luria Bertani-Medium MAG myelinassoziiertes Glykoprotein MBP basisches Myelinprotein MRT Magnetresonanztomographie MS Multiple Sklerose NMDA N-methyl-D-aspartat OD optische Dichte PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PBS phosphate buffered saline PCR Polymerasekettenreaktion PCV packed cell volume PLP Proteolipidprotein RE Rasmussen-Enzephalitis RNA Ribonukleinsäure RT Raumtemperatur SDS Sodiumdodecylsulfat Sf Spodoptera frugiperda TE Tris/EDTA-Puffer 3

6 TEB TEMED TG TMD Tris/EDTA/Borsäure N,N,N,N -Tetramethylethylendiamin Tris/Glycin-Puffer Transmembrandomäne 4

7 Abbildungsverzeichnis Abb. 1: Übersicht der Familie der ionotropen Glutamatrezeptoren... 8 Abb. 2: Schematische Struktur einer Glutamatrezeptoruntereinheit... 9 Abb. 3: Western Blot-Analyse der in HeLa-Zellen exprimierten Glutamatrezeptor-Untereinheiten Abb. 4: Western Blot-Analyse der Affinitätsaufreinigung der beiden Glutamatrezeptoren GluN1 und GluA Abb. 5: Western Blot-Analysen mit Blutseren von RE-Patienten gegen den Glutamatrezeptor GluA Abb. 6: Western Blot-Analysen mit Blutseren gegen den Glutamatrezeptor GluA Abb. 7: Western Blot-Analysen mit Seren von MS-Patienten gegen den Glutamatrezeptor GluN Abb. 8: Western Blot-Analysen mit Seren von Kontrollpersonen gegen den Glutamatrezeptor GluN Tabellenverzeichnis Tab. 1: Verwendete Blutseren sowie deren Nomenklatur Tab. 2: Verwendete Restriktionsenzyme und Primer für die Subklonierung der Glutamatrezeptoren Tab. 3: Bewertung der Western Blot-Analysen Tab. 4: Statistische Daten der untersuchten Personen

8 1 Einleitung Neurodegenerative Erkrankungen sind seit Jahrzehnten Gegenstand intensiver klinischtherapeutischer und biomedizinischer Grundlagenforschung. Die Ätiologie dieser Erkrankungen, zu denen unter anderen auch die Multiple Sklerose (MS) gehört, ist weitgehend unbekannt. Prävalenz und Inzidenz der Multiplen Sklerose weisen geographische Besonderheiten mit einem starken Nord-Süd-Gefälle, bzw. Warm-Kalt- Gefälle auf. Während in Skandinavien und Nordamerika die höchsten Prävalenz- und Inzidenzwerte bestehen, ist die Erkrankung in der schwarzen Bevölkerung Afrikas quasi unbekannt (Rosati, 2001). Die Erkrankung befällt vorwiegend jüngere Menschen ( Lebensjahr), wobei Frauen in einem Verhältnis 2-3:1 deutlich häufiger betroffen sind. Auch eine genetische Komponente ist bei der MS bekannt. So konnte gezeigt werden, dass eine Konkordanz von monozygoten Zwillingen gegenüber dizygoten Zwillingen besteht. Migrationsstudien der WHO belegen eindrucksvoll, dass Menschen, die aus Gebieten stammen, in denen die MS nicht bekannt ist, auch dann nicht an MS erkranken, wenn sie in ein Hochrisikoland auswandern (Limmroth und Kastrup, 2003). Die MS ist eine Autoimmunerkrankung, die hauptsächlich durch aktivierte T- Lymphozyten vermittelt wird. Immunologische und inflammatorische Prozesse werden gegen anatomische Strukturen gerichtet. Diese Strukturen sind vor allem die Oligodendrozyten und das Myelin sowie die Axone selbst. Die Abläufe des inflammatorischen Prozesses sind überaus komplex. Der pathophysiologische Ablauf ist bisher noch nicht vollständig aufgeklärt. In der Regel wird das zentrale Nervensystem durch die Blut-Hirn-Schranke gegenüber Immunzellen gut geschützt. Bei der MS kommt es jedoch zu einem Zusammenbruch dieser Schranke aufgrund von pathologischen Veränderungen, was zu einer Infiltration der Immunzellen in das Hirngewebe führt. Als potentielle Kandidaten der autoaggressiven Immunantwort werden Erreger bzw. Proteine angeführt. Hierbei scheinen die Proteine Sequenzhomologien zu den Strukturproteinen des menschlichen Myelins aufzuweisen. Als hauptsächliche Kandidaten hierfür sind das Proteolipidprotein (PLP), das etwa 50 % des Proteingehalts der Myelinscheiden ausmacht, das myelinassoziierte Glykoprotein (MAG), das basische Myelinprotein (MBP) sowie das Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) zu nennen (Limmroth und Kastrup, 2003). Die Ausprägung der Multiplen Sklerose hängt im Wesentlichen von der Schädigung des Nervensystems ab und ist in der Symptomatik sehr variabel und vielfältig. Häufige Symptome sind Lähmungen an den Extremitäten, Sehstörungen, Empfindungs- und 6

9 Gleichgewichtsstörungen. Daneben gibt es aber auch unspezifische und diffuse Symptome, die gerade zu Beginn der Erkrankung verkannt werden können. Bis heute gibt es keinen diagnostischen Test, der die sichere Diagnose der Multiplen Sklerose erlaubt. Vielmehr bedient man sich einer Kombination aus klinischen und paraklinischen Befunden. Im Zeitalter der Magnetresonanztomographie (MRT) finden hier neue Zusatzbefunde Eingang in die Diagnostik. Die so genannten McDonald-Kriterien bilden hier ein probates Mittel, die Diagnose zu stellen (McDonnald et al.; 2001). In ihr werden MRT-Befunde berücksichtigt (Polman et al., 2005). Auch die unterschiedlichen Verlaufsformen der Erkrankung zeigen die Variabilität der MS. 85 % der Erkrankten zeigen einen schubförmigen Verlauf. Hierbei kommt es nach einem Schub zu einer unterschiedlich vollständig verlaufenden Rückbildung der Symptome bevor erneut ein Schub auftritt. Etwa die Hälfte dieser Patienten zeigt nach mehreren Jahren eine schleichende Verschlechterung, in der Regel ohne dass wesentliche Verbesserungen der klinischen Symptomatik dazwischen liegen ( sekundäre Progression ). 15 % der MS-Betroffenen haben bereits zu Beginn, ohne erkennbare Schübe, einen schleichend progredienten Verlauf ( primär progrediente MS ). Wie bereits eingangs erwähnt, sind vor allem Oligodendrozyten Angriffspunkte für die fatalen inflammatorischen Prozesse bei der MS. In derartigen Entzündungsherden schütten aktivierte Lymphozyten und Makrophagen große Mengen an Glutamat aus (Pitt et al., 2000). Die extrazellulär erhöhten Glutamatkonzentrationen führen dann zu einer Glutamat- Exzitotoxizität. Verantwortlich für diese Exzitotoxizität werden ionotrope Glutamatrezeptoren gemacht. Ihre Überaktivierung führt zu einem erhöhten Ca 2+ -Einstrom in die Oligodendrozyten, was schließlich eine Apoptose auslöst (Matute et al., 2001; Sanchez-Gomez et al., 2003). Erst seit Neuerem weiß man, dass neben den AMPA- und Kainat-Rezeptoren auch NMDA-Rezeptoren in Oligodendrozyten exprimiert werden (Salter & Fern, 2005; Karadottir et al., 2005). Während die AMPA- und Kainat- Rezeptoren sich hauptsächlich am Zellkörper befinden, konnten die NMDA-Rezeptoren an den Fortsätzen der Oligodendrozyten, die die Myelinhüllen im Zentralnervensystem bilden, identifiziert werden (Salter & Fern, 2005). Als Antwort auf eine chemische Ischämie in vitro erfolgt beispielsweise die Ca 2+ -Akkumulation in Myelinscheiden durch NMDA-Rezeptoren (Micu et al., 2006). Somit könnten gerade diese Rezeptoren bei der Degeneration von Myelin eine wichtige Rolle spielen und Auslöser für die Demyelinisierung sein (Micu et al., 2006). 7

10 Ionotrope Glutamatrezeptoren Nicht-NMDA-Rezeptoren NMDA-Rezeptoren delta-rezeptoren AMPA- Rezeptoren Kainat- Rezeptoren GluN1 11 GluN2A GluN2B GluN2C GluN2D GluN3A GluN3B GluD1 GluD2 GluA1 GluA2 GluA3 GluA4 geringe Affinität hohe Affinität GluK1 GluK2 GluK3 GluK4 GluK5 Abbildung 1: Übersicht der Familie der ionotropen Glutamatrezeptoren (die Abbildung wurde mir freundlicherweise von Hannah Trippe überlassen). Glutamat spielt eine wichtige Rolle als Neurotransmitter bei exzitatorischen Prozessen im Zentralnervensystem, wobei es zwei große Familien von Glutamatrezeptoren gibt. Die ionotropen Glutamatrezeptoren sind Ionenkanäle, die durch Bindung des Agonisten Kationen in die Zelle einströmen lassen und somit die Zellmembran depolarisieren. Die metabotropen Glutamatrezeptoren sind Rezeptoren, die nach Bindung des Agonisten über G-Proteine das Signal in die Zelle weiterleiten. In der Familie der ionotropen Glutamatrezeptoren wurden bislang drei pharmakologisch unterscheidbare Unterfamilien charakterisiert, die nach ihren bevorzugten Agonisten AMPA-, Kainat- und NMDA-Rezeptoren benannt sind (siehe Übersichtsartikel von Hollmann & Heinemann, 1994; Dingledine et al., 1999). Bei einer vierten Unterfamilie, den delta-rezeptoren, bestehend aus den Rezeptoren GluD1 und GluD2 (Lomeli et al., 1993), ist bis heute der Agonist nicht bekannt. Alleine bei den Säugern konnten 18 8

11 verschiedene Gene für die Rezeptoruntereinheiten (4 AMPA-, 5 Kainat-, 7 NMDA- und 2 delta-rezeptoren) identifiziert werden (Abbildung 1). Die Interaktion von vier gleichen oder unterschiedlichen Untereinheiten führt zu einem tetrameren funktionellen Rezeptorkomplex, der sowohl in vivo als auch in Koexpressionsstudien in heterologen Expressionssystemen untersucht werden kann. Die Ausbildung von heteromeren Rezeptorkomplexen ist hierbei beschränkt auf die Mitglieder jeweils einer Unterfamilie (Wenthold et al., 1992). Die Struktur einer Rezeptoruntereinheit Abbildung 2: Schematische Struktur einer Glutamatrezeptoruntereinheit. Die Domänen S1 und S2 bilden die Agonistenbindestelle. Die Transmembranbereiche sind durch die Domänen A, B und C dargestellt. Die Domäne P bildet mit weiteren drei Rezeptoruntereinheiten die eigentliche Pore (die Zeichnung wurde mir freundlicherweise von Hannah Trippe zur Verfügung gestellt). 9

12 ist bei allen ionotropen Glutamatrezeptoren recht ähnlich. Sie verfügen alle über drei transmembrane Domänen (TMD A, TMD B, TMD C) und besitzen zwischen der TMD A und der TMD B eine Haarnadelschleife, die sich von der intrazellulären Seite her in die Plasmamembran hineinzieht (Abbildung 2). Diese Haarnadelschleife bildet zusammen mit den entsprechenden Schleifen der drei anderen Untereinheiten die eigentliche Pore aus, die nach Rezeptoraktivierung durch einen Agonisten für Ionen durchlässig wird. Während die C-terminale Region, die eine PDZ- Domäne enthält, intrazellulär liegt, befindet sich die N-terminale Region extrazellulär. Bereiche dieser Region (Schleife S1) bilden zusammen mit der extrazellulären Schleife S2 die Agonistenbindestelle aus (Stern-Bach et al., 1994). Eine seltene neurologische Erkrankung, bei der Antikörper gegen Glutamatrezeptoren eine mögliche Rolle in der Ätiopathogenese spielen könnten, ist die Rasmussen-Enzephalitis (RE). Bei dieser Erkrankung kommt es zu einer chronischen unihemisphärischen Enzephalitis. Die Krankheit tritt vorwiegend bei Kindern auf und führt zu epileptischen Anfällen, wobei es im Endstadium zu Halbseitenlähmungen, zu Halbseitenblindheit sowie lang andauerndem Muskelzucken von Arm, Bein oder Gesicht auf einer Seite kommt (Bien und Elger, 2005). Bisher konnte das primäre Antigen, welches für die heftige Immunreaktion verantwortlich ist, nicht identifiziert werden konnten Rogers et al. nachweisen, das Kaninchen, die mit dem Glutamatrezeptor GluA3 immunisiert worden waren, ähnliche Symptome wie RE-Patienten zeigen (Rogers et al., 1994). Mit Seren dieser Patienten war es darüber hinaus möglich, Ionenströme an kultivierten, fötalen Mäuseneuronen zu erzeugen (Twyman et al., 1995). Dieses spricht dafür, dass die Antikörper gegen GluA3 selbst in der Lage sind, Glutamatrezeptoren zu aktivieren. Ein ähnliches Verhalten konnte auch bei RE-Patientenseren detektiert werden (Twyman et al., 1995). Allerdings zeigen neuere Studien, dass GluA3-Antikörper nicht spezifisch für die Rasmussen-Enzephalitis sind und auch bei anderen neurologischen Krankheiten nachgewiesen werden können (Wiendl et al., 2001; Watson et al., 2004). Eine weitere Erkrankung, die in der neueren Literatur stark diskutiert wird, ist die Anti- NMDA-Rezeptor-Enzephalitis. Im Jahre 2005 wurde von Vitaliani et al. ein Syndrom beschrieben, bei der junge Frauen zunächst an einer akuten Psychose litten und sich im Verlauf der Krankheit Halluzinationen sowie schwere Verhaltensstörungen und Bewegungsanomalien entwickelten. Darüber hinaus wurden bei allen vier untersuchten Patientinnen Ovarialteratome festgestellt (Vitaliani et al., 2005). Detaillierte Untersuchungen zeigten, dass alle Patientinnen spezifische Autoantikörper gegen NMDA- Rezeptoren besaßen (Dalmau et al., 2007). Die Analyse der folgenden Veröffentlichungen 10

13 zu dieser Krankheit zeigte sehr deutlich, dass die Besonderheit der Anti-NMDA-Rezeptor- Enzephalitis ein nahezu typischer, in Phasen gegliederter klinischer Verlauf ist (Dalmau et al., 2008; Prüß et al., 2010). Im Folgenden kommt es schließlich zu einer Verschlimmerung der Symptome. In 75 % der Fälle bilden sich neben epileptischen Anfällen auch schwere Bewusstseinsstörungen und Dyskinesien sowie eine Hypoventilation aus. In diesem progredienten Stadium der Erkrankung ist eine Beatmung des Patienten erforderlich. In den letzten Jahren stieg die Anzahl der diagnostizierten Fälle sprunghaft an. Dabei wurde festgestellt, dass Frauen auch ohne Tumor mit Abstand am häufigsten von der Anti- NMDA-Rezeptor-Enzephalitis betroffen sind. Beschrieben wurde die Krankheit mittlerweile auch bei Männern und bei einem relativ hohen Anteil an Kindern mit vorwiegend psychiatrischen Symptomen. Ungefähr 40 % der Patienten waren dabei jünger als 18 Jahre (Florance et al., 2009). Die Diagnoseerstellung beruht auf dem Nachweis von Antikörpern gegen die NMDA- Rezeptoruntereinheit GluN1 im Serum wie auch im Liquor der Patienten. Genauere Untersuchungen zeigten, dass die Antikörper gegen ein extrazelluläres Epitop der GluN1- Untereinheit gerichtet sind (Dalmau et al., 2008). Eine standardisierte Bestimmung der Autoantikörper erfolgt in der Regel über einen indirekten Immunfluoreszenztest (IFT). Hierbei wurden Zelllinien eingesetzt, die mit den Untereinheiten GluN1 und GluN2 rekombinant transfiziert worden waren (Irani et al., 2010). Mit Hilfe der Western Blot-Analyse von rekombinanten Glutamatrezeptorproteinen sollen vorhandene Antikörper gegen Glutamatrezeptoren in Seren von MS-Patienten, RE- Patienten und Kontrollpersonen direkt nachgewiesen werden. 11

14 2 Zielsetzung Glutamat und seine spezifischen ionotropen Rezeptoren scheinen eine wichtige Rolle sowohl in der Neurodegeneration als auch in der neuronalen Regeneration zu spielen. Antikörper gegen ionotrope Glutamatrezeptoren konnten bei einigen neuronalen Erkrankungen identifiziert werden. Hierzu gehören beispielsweise die Rasmussen- Enzephalitis und die paraneoplastische Enzephalitis. Das Vorhandensein von Antikörper gegen ionotrope Glutamatrezeptoren bei Multipler Sklerose wurde bisher nicht untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurden 56 Seren untersucht, von denen 25 Seren von Patienten mit einem schubförmigen Verlauf einer Multiplen Sklerose stammten. Weitere 8 Seren wurden von Patienten mit Rasmussen-Enzephalitis entnommen, sowie zusätzlich 23 Seren von Kontrollpatienten. Um eine Aussage über die Häufigkeit von anti-glutamatrezeptor-antikörpern bei MS-, Rasmussen- und Kontrollpatienten zu machen, sollen die Seren der drei Gruppen in Western Blot-Analysen untersucht werden. Dazu werden die Glutamatrezeptoruntereinheiten GluA3, GluK2, GluN1 und GluN2B heterolog in eukaryonten Zellen exprimiert, die dabei erhaltenen Proteine aufgereinigt und durch SDS- Gelelektrophorese aufgetrennt. Die Proteine werden auf Nitrozellulosemembranen geblottet und die Blots mit Seren der drei oben genannten Gruppen zur Detektion möglicher Autoantikörper inkubiert. 12

15 3 Material und Methoden 3.1 Verwendete Primer Die verwendeten Oligonukleotidprimer (100 µm) stammten von der Firma biomers.net GmbH, Ulm. P461_GluK2 forward: 5 -AGGCAAGCTGCACATGATG-3 TP155_GluK2 revers: 5 -GAATTCTCTAGATGCCATGGTTTCTTTACCTG-3 P424_GluN1 forward: 5 -GGCTTCACAGAAGTGCGAT-3 TP137_GluN1 revers: 5 -GAATTCTCTAGAGCTCTCCCTATGACGGG-3 P423_GluN2B forward: 5 -ACGACACCTTCGTGGACC-3 TP136_GluN2B revers: 5 -GAATTCTCTAGAGACATCAGACTCAATACTAG Molekularbiologische Methoden Agarose-Gelelektrophorese Die Analyse und Aufreinigung von DNA-Fragmenten entsprechend ihrer Größe erfolgte durch Agarosegele. Die Agarosekonzentration lag, je nach Größe der aufzutrennenden DNA-Moleküle, zwischen 0,8% und 2,0% (w/v) in 1x TEB. Die Elektrophorese erfolgte in einer horizontalen Elektrophoresekammer bei V für ca. 90 Minuten. Als Laufpuffer diente 1x TEB-Puffer mit 0,5 µg/ml Ethidiumbromid. Nach der elektrophoretischen Trennung wurden die DNA-Banden durch Bestrahlung mit UV-Licht sichtbar gemacht. 1x TEB-Puffer: 90 mm Tris/HCl, ph 7,9 90 mm Borsäure 2 mm EDTA Restriktion von DNA-Molekülen Zur Restriktion doppelsträngiger DNA wurden Restriktionsendonukleasen nach Angaben des Herstellers verwendet. In der Regel wurden Restriktionen in einem Volumen von 20 µl oder 30 µl unter den jeweiligen enzymspezifischen Pufferbedingungen und bei der empfohlenen Temperatur durchgeführt. War die DNA noch mit RNA verunreinigt, wurde dem Restriktionsansatz 1 µl RNaseA (10 mg/ml) zugesetzt. Die Restriktion wurde durch Zugabe von ¼ Volumen des 5x DNA-Probenpuffers gestoppt und anschließend eine Agarosegelelektrophorese (3.2.1) durchgeführt. 13

16 5x Probenpuffer: 25% (v/v) Ficoll 400 0,1% (w/v) Bromphenolblau 0,1% (w/v) Xylencyanol in 1x TEB Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Die Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte mit dem entsprechenden Kit der Firma Eppendorf. Dazu wurde die gewünschte DNA-Bande mit einem Skalpell aus dem Agarosegel ausgeschnitten, gewogen und mit 3x Volumen (in µl) an Bindungspuffer pro mg Gelstück versetzt. Die Agarose wurde unter leichtem Schütteln in einem Heizblock bei 50 C ca. 10 Minuten inkubiert. Der Ansatz wurde auf eine Säule gegeben und 1 Minute bei rpm in der Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen und die Säulenmatrix mit 800 µl Waschpuffer gewaschen, indem erneut wie oben zentrifugiert wurde. Um die Säulenmatrix von dem restlichen Waschpuffer zu befreien, wurde erneut für 1 Minute zentrifugiert. Die an die Matrix gebundene DNA wurde durch Zugabe von 30 µl Elutionspuffer und anschließender Zentrifugation (Tischzentrifuge rpm, 1 Minute, RT) von der Matrix eluiert. Die Ausbeute wurde durch eine erneute Agarosegelelektrophorese (3.2.1) abgeschätzt Polymerasekettenreaktion (PCR) Zur Amplifizierung von DNA-Fragmenten wurde die Polymerasekettenreaktion (Saiki et al., 1988) eingesetzt. In einem Reaktionsvolumen von 50 µl wurden 10 ng DNA-Matrize, je 50 pmol der beiden Primer, je 0,2 mm dntps und 0,5 µl Phusion DNA-Polymerase in HF-Reaktionspuffer (1x) zusammengegeben. Die PCR wurde zunächst mit einem dreiminütigen Schritt bei 98 C gestartet. Anschließend wurde die PCR mit 30 Zyklen fortgesetzt, wobei jeder Zyklus folgende Schritte umfasste: Denaturierung: 45 Sekunden bei 98 C Hybridisierung der Primer an die DNA-Matritze: 45 Sekunden bei T (Hybridisierung) Elongation: 60 Sekunden bei 72 C Die Hybridisierungstemperatur (T (Hybridisierung)) wurde anhand folgender Formel für die verwendeten Primer abgeschätzt: T (Hybr.) = 4(G+C)+2(A+T)-2 14

17 Nach erfolgter PCR wurden die Reaktionsansätze mittels Agarosegelelektrophorese (3.2.1) und anschließender Gelelution der gewünschten Bande (3.2.3) aufgereinigt Auffüllen von überhängenden 5 -DNA-Enden Sollten überhängende 5 -DNA-Enden von restringierten DNA-Fragmenten (3.2.2) aufgefüllt werden, wurde diese in NEB4-Puffer in Anwesenheit der vier dntps (je 0,05 mm) sowie 1 unit Klenow-Enzym für 30 Minuten bei 25 C inkubiert. Die Inaktivierung des Enzyms erfolgte für 20 Minuten bei 75 C. Die DNA-Fragmente wurden anschließend gelelektrophoretisch aufgereinigt (3.2.3) Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten Zur Vermeidung von Religationen bei späteren Klonierungen wurden die freien 5`- Phosphatgruppen der Vektoren entfernt. Hierzu wurden zu den Restriktionansätzen (3.2.2) 15 Minuten vor Ende der Restriktion 1 unit Alkalischer Phosphatase (CIAP: Calf Intestine Alkaline Phosphatase) zugegeben. Anschließend wurde eine Agarosegelelektrophorese (3.2.1) durchgeführt, die Bande ausgeschnitten und aus dem Gel eluiert (3.2.3) Ligation von DNA-Molekülen Für Ligationsreaktionen wurden 50 ng vom geschnittenen, dephosphorylierten Vektor (3.2.6), ein 3facher molarer Überschuss an DNA-Fragmenten bzw. PCR-Fragmenten sowie 5u T4-DNA Ligase in Ligationspuffer eingsetzt. Die Reaktion erfolgte in einem Volumen von µl für 4-16 Stunden bei 16 C. Anschließend wurde der gesamte Ansatz verwendet, um das Konstrukt in kompetente E.coli-Bakterien zu transformieren (3.2.8). 10x Ligationspuffer: 500 mm Tris/HCl, ph 7,5 100 mm MgCl mm DTT 10 mm ATP 250 µg/ml BSA Transformation in E.coli-Bakterien 200 µl kompetenter E.coli-Bakterien (freundlicherweise von Frau Christina Klein zur Verfügung gestellt) wurden auf Eis aufgetaut und dann mit einem Ligationsansatz (3.2.7) vermischt. Wenn es sich um eine Retransformation handelte, wurden 1-2 ng Plasmid-DNA 15

18 eingesetzt. Nach 30minütiger Inkubation auf Eis wurde ein Hitzeschock für 90 Sekunden bei 42 C durchgeführt. Es wurde kurz auf Eis abgekühlt und der Ansatz unter sterilen Bedingungen auf LB-Amp-Platten ausplattiert. Anschließend erfolgte eine Inkubation der Platten bei 37 C über Nacht. LB-Amp-Platten: 1,5% (w/v) Bacto-Agar 100 µg/ml Ampicillin in LB-Medium LB-Medium: 10 g/l NaCl 10 g/l Pepton 5 g/l Hefeextrakt ph 7,0 (eingestellt mit NaOH) Plasmid-DNA-Präparation im kleinen Maßstab Zunächst wurden 2,5 ml LB-Medium, welches 100 µg/ml Ampicillin enthielt, mit einer Einzelkolonie angeimpft. Die Kultur wurde dann über Nacht im Warmluftschüttler bei 37 C und ca. 200 rpm inkubiert. 1,5 ml der Bakterienkultur wurden abgenommen und 1 Minute bei rpm in der Tischzentrifuge zentrifugiert. Das Bakteriensediment wurde in 100 µl Lösung I gut resuspendiert und mit 200 µl Lösung II versetzt. Nach vorsichtiger Durchmischung wurden 150 µl Lösung III zugegeben, der Ansatz erneut durchmischt und 5 Minuten bei rpm in der Tischzentrifuge zentrifugiert. Der flüssige Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und einer Phenol-Chloroform-Extraktion unterzogen. Hierzu wurde dem Ansatz 400 µl eines Phenol-Chloroform-Gemisches (1:1) zugesetzt, extensiv gemischt und 5 Minuten in einer Tischzentrifuge bei rpm zur Phasentrennung zentrifugiert. Der wässrige Überstand wurde abgenommen, mit 400 µl Chloroform versetzt und erneut gut durchmischt. Nach 5minütiger Zentrifugation unter obigen Bedingungen wurde der wässrige Überstand mit 1ml absolutem Ethanol vermischt und 15 Minuten bei rpm zentrifugiert. Das dabei entstandene Sediment wurde mit 500 µl 75%igem Ethanol gewaschen, im Membranpumpenvakuum getrocknet und in 20 µl TE-Puffer aufgenommen. 16

19 Lösung I: 50 mm Glukose 10 mm EDTA 25 mm Tris/HCl, ph 7,9 Lösung II: 0,2 M NaOH 1% (w/v) SDS Lösung III: 3 M Kaliumacetat, ph 5,2 TE-Puffer: 10 mm Tris/HCl, ph 7,4 0,1 mm EDTA Plasmid-DNA-Präparation im mittleren Maßstab 50 ml LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin wurde in einem 250 ml Erlenmeyer-Kolben mit 50 µl einer Minipräp-Kultur angeimpft und über Nacht bei 37 C bei ca. 160 rpm im Warmluftschüttler inkubiert. Alternativ wurden die Kulturen auch aus Glyzerin-Stocks von plasmidhaltigen Bakterien angeimpft. Die Plasmid-DNA-Präparation erfolgte mit Hilfe des JETstar-Kits der Firma Genomed nach Angaben des Herstellers. Zunächst wurden die Bakterien bei 4000 rpm (Minifuge) für 20 Minuten sedimentiert und anschließend in 4 ml Lösung E1 komplett resuspendiert. Es wurden 4 ml Lösung E2 zugegeben, vorsichtig invertiert und für 5 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Nach Zugabe von 4 ml Lösung E3 wurde extensiv gemischt und dann 10 Minuten bei rpm (16.000xg, Sorvall RC5B Plus, HB6-Rotor, RT) zentrifugiert. In der Zwischenzeit wurde eine Säule mit 10 ml Lösung E4 äquilibriert. Der Überstand nach der Zentrifugation wurde komplett auf die Säule gegeben. Nachdem die Säule zweimal mit je 10 ml Lösung E5 gewaschen worden war, erfolgte die Elution der Plasmid-DNA durch Zugabe von 5 ml Lösung E6. Der Durchfluss wurde mit 3,5 ml Isopropanol versetzt, gut gemischt und 30 Minuten bei rpm (siehe oben) zentrifugiert. Das entstandene Sediment wurde mit 1 ml 75%igem Ethanol gewaschen, im Membranpumpenvakuum getrocknet und in 100 µl TE-Puffer gelöst. 17

20 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Die Konzentration von Nukleinsäurelösungen wurde durch Messung der optischen Dichte (OD) bei 260 nm bestimmt. Hierbei entspricht eine OD von 1 einer Konzentration von ungefähr 40 µg/ml für doppelsträngige DNA. Um die Reinheit der Nukleinsäurelösungen zu bestimmen, wurde zusätzlich die OD bei 280 nm gemessen. Für reine DNA-Lösungen liegt das Verhältnis OD 260nm /OD 280nm bei 1, Sequenzierung von DNA Die Sequenzierung von DNA-Molekülen erfolgte nach einer modifizierten Sanger- Strategie (Sanger et al., 1977). Es wurde der Kapillarsequenzierer 3130xl der Firma Applied Biosystems verwendet. Die Sequenzierungen wurden von Annette Tolle und Björn Peters durchgeführt. 3.3 Zellkultur Verwendete Zelllinien HeLa-Zellen sind humane Epithelzellen und wurden aus einem Zervix-Karzinom isoliert (Gey et al., 1952). Der Subklon HeLa DuPont (DP) kann als einschichtiger Zellrasen (Monolayer-Kulur) gehalten werden. Bei HEK293-Zellen handelt es sich um eine stabile Zelllinie aus menschlichen embryonalen Nierenzellen, die durch Transformation mit gescherter, adenoviraler DNA in Tumorzellen überführt wurden Kultivierung von HeLa DP-Zellen Monolayer-Kulturen von HeLa DP-Zellen wurden bei 37 C in einem Feuchtrauminkubator bei 7% CO 2 und 90% Luftfeuchtigkeit gehalten. Als Nährmedium diente DMEM-Medium mit 10% FCS (fetel calf serum). Zum Zeitpunkt der Konfluenz wurde das Medium abgenommen und die Zellen durch eine Trypsinlösung (0,025% (w/v) Trypsin in MEM- Medium) mit Hilfe einer Pipette aus den 75 cm 2 -Flaschen herausgespült. Alle zwei Tage wurden die Zellen 1:4 ausgedünnt und mit neuem Nährmedium (s.o.) versetzt. Überbehaltene Zellen wurden verworfen oder auf 8,5 cm Kulturschalen ausgesät Kultivierung von HEK293-Zellen Monolayer-Kulturen von HEK293-Zellen wurden bei 37 C in einem Feuchtrauminkubator bei 8% CO 2 und 90% Luftfeuchtigkeit gehalten. Als Nährmedium diente entweder JMEM oder DMEM mit 10% FCS. Zunächst wurde das alte Medium abgenommen und die Zellen 18

21 mit 10 ml PBS gewaschen. Dann wurde 1ml Trypsin/EDTA (0,05% (w/v) Trypsin) auf die Zellen gegeben und fast vollständig wieder abgenommen. Nach einer Minute konnten die Zellen mit 10 ml Nährmedium vom Boden der 75 cm 2 -Flaschen gespült werden. Die Zellen wurden einmal pro Woche passagiert und ein Mediumwechsel wurde alle drei Tage durchgeführt. Überzählige Zellen wurde verworfen oder auf 8,5 cm Kulturschalen ausgesät. PBS-Puffer: 8 g/l NaCl 0,2 g/l KCl 1,44 g/l Na 2 HPO 4 0,24 g/l KH 2 PO Transfektion von Zellen mittels Calciumphosphatmethode Die Transfektion von HeLa-Zellen und HEK293-Zellen wurde nach der Calciumphosphat- Kopräzipitationsmethode (Graham et al., 1973) durchgeführt. Vor der Transfektion wurden die auf 8,5 cm Kulturschalen ausgesäten Zellen mit frischem DMEM (mit 10% FCS) versetzt und für drei Stunden bei 37 C und 3% CO 2 inkubiert. Für die Transfektion wurden 55 µl CaCl 2 (2 M) und µg Plasmid-DNA mit Tris/HCl (10 mm, ph 7,6) auf 550 µl aufgefüllt. Die Mischung wurde tropfenweise unter Schütteln zu 550 µl HBS (2x) gegeben. Zur Ausbildung des Präzipitats wurde der Ansatz erschütterungsfrei 30 Minuten bei RT stehen gelassen. Danach wurde der Ansatz auf eine Kulturschale verteilt und über Nacht bei 37 C und 3% CO 2 inkubiert. Am nächsten Tag erfolgten ein Mediumwechsel und eine weitere Inkubation für 24 Stunden bei 37 C und 8% CO 2 (bzw. 7% CO 2 bei HeLa-Zellen). HBS (2x): 50 mm HEPES 1,5 mm Na 2 HPO mm NaCl ph 7,13 mit NaOH eingestellt 19

22 3.4 Proteinbiochemische Methoden Isolierung von Proteinen mittels Anti-c-myc-Agarose Die folgenden angegebenen Mengen beziehen sich auf die Aufreinigung von sechs 8,5 cm- Kulturschalen. Das Medium wurde von den 8,5 cm-kulturschalen abgenommen und jeweils 1 ml PBS zugegeben. Mit einem Zellschaber wurden die Zellen vom Boden der Kulturschalen abgekratzt und in 15 ml Falcon-Röhrchen überführt. Die Zellen wurden bei RT für 5 Minuten bei 2000 rpm (Heraeus Labofuge 400R) sedimentiert. Der Überstand wurde abgegossen und die Zellen mit dem fünffachen Volumen des PCVs (packed cell volume) an Schwellpuffer (1x) resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation unter obigen Bedingungen wurde der Überstand verworfen und die Zellen in dem zweifachen PCV an Schwellpuffer (1x) aufgenommen. Die Zellen wurden nun 15 Minuten auf Eis inkubiert und in einen Douncer überführt. Durch das zwanzigmalige Auf- und Abbewegung des Pistills wurden die geschwollenen Zellen aufgeschlossen, wobei die Zellkerne intakt blieben. Das gesamte Lysat wurde in ein 15 ml Falcon-Röhrchen überführt und in der Heraeus Labofuge 400R zentrifugiert (2000 rpm, 5 Minuten, 4 C). Der verbliebene Überstand wurde vorsichtig von den sedimentierten Kernen abgenommen und mit dem einfachen Volumen an Solubilisierungspuffer (2x) versetzt. Es folgte eine 15minütige Inkubation unter ständigem Schwenken bei RT. Die nicht vollständig solubilisierten Bestandteile wurden durch eine Zentrifugation (Heraeus Labofuge 400R, 2500 rpm, 5 Minuten, RT) abgetrennt und der Überstand in ein neues 15 ml Falcon-Röhrchen überführt. Für die Äquilibrierung der Affinitätsmatrix wurden 150 µl Anti-c-myc-Agarose (Sigma) dreimal mit 500 µl Solubilisierungspuffer (1x) gewaschen. Die nötige Zentrifugation bei den Waschschritten erfolgte für 1 Minute bei 2000 rpm in der Tischzentrifuge. Die äquilibrierte Anti-c-myc-Agarose wurde nun zu den solubilisierten Lysaten gegeben und für eine Stunde bei RT unter ständigem Schwenken inkubiert. Danach wurde die Probe 5 Minuten bei 2000 rpm zentrifugiert (Heraeus Labofuge 400R, RT) und die Affinitätsmatrix wie bereits oben bei der Äquilibrierung beschrieben gewaschen. Zur Elution der Proteine wurde die Affinitätsmatrix mit 200 µl Laemmli- Puffer (2x) versetzt und für 90 Sekunden (!) auf 95 C erhitzt. Die Proben konnten nun bei - 20 C gelagert werden. 20

23 Schwellpuffer (10x): 100 mm HEPES/KOH, ph 7,9 15 mm MgCl mm KCl Solubilisierungspuffer (2x): 2x PBS 2% Triton X100 Laemmli-Puffer (2x): 100 mm Tris/HCl, ph 6,8 100 mm ß-Mercaptoethanol 25% (v/v) Glycerin 4% (w/v) SDS 0,1% (w/v) Bromphenolblau SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Die Proteinproben wurden durch eine SDS-PAGE (Laemmli, 1970) analysiert. Es wurden 7,5%ige Trenngele mit den Dimensionen 8 cm x 10 cm x 0,1 cm verwendet. Die elektrophoretische Trennung erfolgte in vertikalen Elektrophoresekammern. Zunächst wurde der untere Bereich der Gelplatten mit einem Stopfgel, dessen Zusammensetzung der des Trenngels entsprach, verschlossen. Nach dem Auspolymerisieren des Stopfgels wurde das Trenngel zwischen die beiden Gelplatten gegossen und sofort mit 2-Propanol überschichtet, um eine gerade Oberfläche des Trenngels zu gewährleisten. Nach dem das Trenngel auspolymerisiert war, wurde das 2-Propanol entfernt, ein ca. 1 cm langes Sammelgel gegossen und ein Gelkamm zum Formen der Taschen eingefügt. Zum Starten der Polymerisationsreaktion wurden Ammoniumperoxodisulfat und TEMED unmittelbar vor dem Gießen zugesetzt. Die Elektrophorese erfolgte bei 15-20mA und wurde beendet, wenn der Farbstoff das Stopfgel fast durchwandert hatte. 21

24 Trenngel/Stopfgel (7,5%): 3,75 ml Acrylamid/Bisacrylamid (30:0,8) 3,75 ml Lower Tris (4x) 7,5 ml Wasser 100 µl Ammoniumperoxodisulfat (20%ig) 100 µl TEMED Sammelgel (4%): 1,3 ml Acrylamid/Bisacrylamid (30:0,8) 2,5 ml Upper Tris (4x) 6,2 ml Wasser 100 µl Ammoniumperoxodisulfat 100 µl TEMED Laufpuffer (1x): 25 ml TG (10x) 2,5 ml SDS (10%) 222,5 ml Wasser Lower Tris (4x): 375 mm Tris/HCl, ph 8,8 0,1% (w/v) SDS Upper Tris (4x): 125 mm Tris/HCl, ph 6,8 0,1% (w/v) SDS TG (10x): 250 mm Tris 2,5 M Glycin ph 8,3 22

25 3.4.3 Western Blot Zum Nachweis von Proteinen wurden Western Blot-Analysen durchgeführt, wobei zunächst eine Trennung der Proteine in einer denaturierenden SDS-PAGE (3.4.2) erfolgte. Nach der Gelelektrophorese wurde das Sammelgel abgetrennt und die Nitrocellulosemembran (Protran BA85, Schleicher &Schuell) zusammen mit dem Trenngel in Blotpuffer äquilibriert. Nach dem Zusammenbau der Blotapparatur erfolgte der Transfer der Proteine auf die Nitrocellulosemembran über Nacht bei 4 C und 1 Watt (20 V, 50 ma). Die Blotapparatur wurde auseinandergebaut und die Nitrocellulosemembran in Ponceau S-Färbelösung gelegt, um den Transfererfolg zu überprüfen. In der Regel wurde die Nitrocellulosemembran an dieser Stelle in kleine Streifen geschnitten, um diese dann später mit den humanen Seren zu inkubieren. Nach der vollständigen Entfärbung der Membranen wurden diese in 20 ml Blocklösung für 30 Minuten auf dem Schüttler zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen inkubiert. Anschließend wurden die Membranen dreimal für 5 Minuten mit PBST gewaschen und mit einer Erstantikörperlösung in einem Gesamtvolumen von 10 ml versetzt (1:3000 Verdünnung in PBST für anti-myc 9E10, 1:1000 Verdünnung in PBST für humane Seren). Die Inkubation erfolgte unter leichtem Schwenken für eine Stunde bei RT. Es wurde erneut dreimal für 5 Minuten mit PBST gewaschen. Die Inkubation mit dem Zweitantikörper erfolgte in einem Gesamtvolumen von 10ml (1:3000 Verdünnung in Blockpuffer für Anti-mouse-Antikörper (IgG), 1:25000 Verdünnung in Blockpuffer für ein Gemisch aus Anti-human-Antikörper (IgG/IgM)) ebenfalls für eine Stunde unter leichtem Schwenken auf einem Schüttler. Anschließend wurden erneut dreimal 5 Minuten mit PBST gewaschen und die Membranen auf eine Frischhaltefolie gelegt. Zur Detektion wurde auf jede Membran ca. 300 µl eines 1:1 Gemisches der Detektionsreagenzien (Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate von Pierce) gegeben. Anschließend wurde ein Photofilm belichtet und nach einer Expositionszeit von Minuten entwickelt. Blotpuffer: 20% (v/v) Ethanol 0,01% (w/v) SDS in TG (1x) PBST: 0,05 (w/v) Tween 20 in PBS (1x) 23

26 Blocklösung: 4% (w/v) Magermilchpulver in PBST Ponceau S-Färbelösung: 2% (w/v) Ponceau S 30% (w/v) Trichloressigsäure 30% (w/v) Sulfosalicylsäure 3.5. Optimierung der Methode von Western Blot-Analysen rekombinanter Glutamatrezeptorproteine Im Folgenden werden eine Reihe von Experimenten vorgestellt, die zur Optimierung der Detektion von Autoantikörpern bei MS-Patienten dienten. Die meisten dieser Versuche sind in Masterarbeiten beschrieben (Angela Orth, Masterarbeit 2007; Katja Steinke, Masterarbeit 2008). Um eine bestmögliche Detektion von Autoantikörpern bei Western Blot-Analysen zu erhalten, wurden verschiedene Inkubationsbedingungen von Angela Orth getestet. Hierbei zeigte sich, dass sich unspezifische Signale reduzieren lassen, wenn die Inkubationen mit dem Zweitantikörper in 4 %iger Magermilchlösung (in PBST) erfolgt. Ebenso führte eine affinitätschromatographische Aufreinigung der Glutamatrezeptoren über ihre tags zu einer wesentlichen Reduktion. Unspezifische Signale in Western Blot-Analysen mit Blutseren konnten leider nicht vollkommen eliminiert werden. Es hat sich deshalb als sinnvoll erwiesen, zusätzlich eine Negativkontrolle bei den Analysen durchzuführen. In der Regel wurden deshalb Extrakte aus transfizierten Zellen (+) und nicht transfizierten Zellen (-) parallel analysiert. Dieses hat den Vorteil, dass unspezifische Signale leichter identifiziert werden können, da sie sowohl in der (+)-Spur wie auch in der (-)-Spur auftreten. Eine weitere wichtige Beobachtung von Angela Orth war, dass sich die Glutamatrezeptoren wesentlich besser in HEK293-Zellen exprimieren lassen als in HeLa- Zellen. Darüber hinaus hat Angela Orth 25 MS-Seren, 8 RE-Seren und 23 Kontroll-Seren auf Anwesenheit von Autoantikörpern gegen Glutamatrezeptoren getestet. Bei den von ihr hierzu verwendeten GluD2-Rezeptoren (über His-tag gereinigt) und GluN2C-Rezeptoren (über myc-tag gereinigt) konnten in Western Blot-Analysen keine positiven Signale detektiert werden. Von sechs getesteten Seren gegen den Glutamatrezeptor GluA3 war ein Kontroll-Serum positiv. 24

27 Zeitlich überlappend durchgeführte Experimente mit den Glutamatrezeptoren GluA3 und GluN1 mit MS-Seren zeigten, dass in einer Western Blot-Analyse einige Seren gegen GluN1 positiv getestet wurden. Die Schwärzungen des Röntgenfilms traten jedoch hauptsächlich im hochmolekularen Bereich auf. In Abbildung 3 sind solche Schwärzungen im oberen Bereich des Films zu erkennen. Es lag die Vermutung nahe, dass es sich dabei um Rezeptor-Aggregate handeln könnte. Eine eingehende Analyse zeigte, dass die auftretenden Banden bei hohen Molekulargewichten tatsächlich aus Monomer- Untereinheiten bestanden. Hierzu wurden Experimente durchgeführt, bei denen nach SDS- PAGE die Rezeptoraggregate ausgeschnitten wurden. Die Proteine wurden anschließend eluiert, präzipitiert und erneut auf einer SDS-PAGE in Gegenwart von stark denaturierendem Harnstoff im Laemmli-Puffer aufgetragen. Hierbei konnten nach Western Blot-Analyse ausschließlich monomere Rezeptoruntereinheiten detektiert werden. Autoantikörper lassen sich nicht nur in einer Western Blot-Analyse nachweisen, sondern sie können auch durch Bindung an einen von eukaryotischen Zellen exprimierten Rezeptor untersucht werden (ELISA-Prinzip). Um derartige Experimente machen zu können, wurden von Katja Steinke in ihrer Masterarbeit Glutamatrezeptoren N-terminal mit einem myc-epitop versehen und in HEK293-Zellen, Sf9-Zellen und Xenopus laevis-oozyten exprimiert. Bei den anschließend durchgeführten Luminometer-Messungen konnte kein Blutserum mit Sicherheit positiv getestet werden. Die als Positivkontrolle verwendeten myc-antikörper lieferten hingegen brauchbare bis sehr gute Ergebnisse. Um die erhaltenen Ergebnisse zu verifizieren, wurden mit den verwendeten Seren auch Western Blot- Analysen durchgeführt. Fünf der sieben verwendeten Blutseren waren eindeutig positiv gegenüber dem Glutamatrezeptor GluN1 (über myc-tag gereinigt). Wie bereits oben erwähnt, wurden mit der Glutamatrezeptoruntereinheit GluN2B aufgrund von Degradation keine weiteren Experimente durchgeführt. Dieses gilt ebenso für die Rezeptoruntereinheit GluK2. Aus nicht erklärbaren Gründen war das Reaktionsgefäß mit dem Klon nicht mehr auffindbar Verwendete Blutseren sowie deren Auswertung in Western Blot-Analysen Nachdem ein Antrag bei der Ethik-Kommission in Bochum und Münster gestellt und genehmigt worden war, wurden von Herr PD Dr. Haase (Knappschaftskrankenhaus Recklinghausen; seit 2012 Heilig Geist-Krankenhaus in Köln) 56 Blutseren zur Verfügung gestellt. Von diesen 56 Seren waren 42 Doppelblutentnahmen bei 21 Patienten. Bei den restlichen 14 Blutseren handelte es sich um Einzelseren. Bei den somit zu analysierenden 35 Patientenseren waren auch Kontrollpatienten (gesunde Personen), die nicht an MS 25

28 erkrankt waren. Welche Seren Kontrollseren oder Patientenseren waren, war vor den Western Blot-Analysen sowie deren Auswertung nicht bekannt. Um aber die Anzahl der Kontrollpatienten (gesunde Patienten) zu erhöhen, wurde bei 13 Lehrstuhl-Mitarbeitern ebenfalls Blut entnommen. Darüber hinaus wurden mir von Herrn Dr. C. Bien (Universitätsklinikum Bonn; seit 2011 Krankenhaus Mara in Bethel) freundlicherweise 8 Blutseren überlassen, deren Spender an RE erkrankt waren. Aus der Tabelle 1 wird nach der Dekodierung ersichtlich, welche von den 35 Patientenseren Kontrollpatienten (10 Seren) bzw. MS-Patienten (25 Seren) sind. Hinter den verwendeten Patientenkürzeln ist jeweils die von mir benutzte Seren-Nummer angegeben. Stehen zwei oder drei Seren-Nummern hinter dem Patientenkürzel, so handelt es sich dabei um Patienten, bei denen zwei bzw. dreimal Blut abgenommen wurde. Tabelle 1: Verwendete Blutseren sowie deren Nomenklatur. Die Patientenkürzel bestehen jeweils aus der Abkürzung des Nach- und Vornamens, wobei die Reihenfolge bei den Kontrollseren (Lehrstuhlmitarbeitern) umgekehrt ist. Des Weiteren sind die entsprechenden Geburtsdaten hinter dem abgekürzten Namen angegeben. Intern wurden von mir die Patientenkürzel durch eine Serum-Nummer ersetzt. Die verwendete Serum-Nummer ist hinter dem Patientenkürzel angegeben. Sind zwei oder drei Seren-Nummern angegeben, so wurde den Patienten zu verschiedenen Zeitpunkten mehrmals Blut abgenommen. MS-Seren JI Serum 1 Serum 26 KF Serum 5 WM Serum 7 Serum 57 GM Serum 8 Serum 30 RH Serum 11 Serum 35 HA Serum 12 Serum 31 LU Serum 13 Serum 34 SD Serum 15 Serum 56 FM Serum 16 Serum 51 BL Serum 17 Serum 18 HN Serum 36 BS Serum 37 CE Serum 38 CM Serum 39 TR Serum 40 SA Serum 41 SD Serum 42 HC Serum 43 WE Serum 44 NA Serum 45 Serum 49 KM Serum 46 PM Serum 47 Serum 52 LM Serum 48 LM Serum 50 Serum 55 SW Serum 53 26

29 Kontrollseren RM Serum 2 Serum 27 SJ Serum 3 Serum 28 DM Serum 4 Serum 24 KB Serum 6 Serum 33 DS Serum 9 Serum 29 DJ Serum 10 Serum 25 HS Serum 14 Serum 32 HD Serum 19 Serum 20 HH Serum 21 Serum 22 KD Serum 54 Kontrollseren (Lehrstuhlmitarbeiter) RT Serum 61 JT Serum 65 NC Serum 101 CK Serum 102 SK Serum 103 SK Serum 104 CS Serum 105 CS Serum 106 DT Serum 107 BP Serum 108 MH Serum 109 SS Serum 110 TB Serum 111 RE-Seren AR Serum 265 Serum 274 Serum 414 PT Serum 266 CM Serum 332 JP Serum 334 Serum 388 JM Serum 379 Entsprechend den unter 3.5. gemachten Erfahrungen wurden für die Western Blot- Analysen jeweils Streifen von Nitrocellulosemembranen verwendet, auf der eine (+)-Spur und eine (-)-Spur geblottet waren. Dieses sollte die Identifizierung von möglichen Signalen bei Seren gegen Glutamatrezeptorproteine oder deren Aggregate erleichtern. Da die Größe der Aggregate bei Affinitätsaufreinigungen etwas unterschiedlich waren, wurde als Positivkontrolle der myc-antikörper jeweils mitgetestet. Nach Durchführung der Western Blot-Analysen wurden die Röntgenfilme eingescannt. Es wurden anschließend 27

30 Einzelabbildungen erstellt, auf denen ein analysiertes Serum sowie die Positivkontrolle mit myc-antikörper dargestellt waren. Für die Beurteilung der Röntgenfilme wurden vier Gutachter ausgewählt, die entsprechend gute Erfahrungen darin besaßen: Dr. Angela Orth (AO), Dr. Katja Steinke (KS), Dr. Ralf Trippe (RT) und Prof. Dr. Michael Hollmann (MH). Jeder Gutachter beurteilte selbstständig die Abbildungen der Röntgenfilme. Hierbei konnte ein Votum abgegeben werden, welches eine positive, möglicherweise positive oder negative Beurteilung beinhaltete. Keinem Gutachter war bekannt, welches Serum von einem MS-Patienten, Rasmussen-Patienten oder einer Kontrollperson stammte. Anschließend wurde konferiert und auf Basis der Einzelbeurteilungen in einer Diskussionsrunde eine gemeinsame Entscheidung getroffen. 28

31 4 Ergebnisse 4.1. Klonierung der Glutamatrezeptoren Um humane Seren von MS-Patienten auf mögliche Autoantikörper gegen Glutamatrezeptoren in Western Blot-Analysen untersuchen zu können, wird ein geeignetes Expressionssystem zur Produktion von Testantigenen benötigt. Ein solches stellt das eukaryote Expressionsplasmid pcdna/to/myc-his (= T-Rex-Vektor) der Firma Invitrogen dar. Hier lassen sich die cdnas, die für Glutamatrezeptoren aus der Ratte kodieren, einklonieren und heterolog in humanen HeLa- oder HEK293-Zellen exprimieren. Da die Sequenzhomologien der Glutamatrezeptoren zwischen Ratte und Mensch bei ca. 98% liegen, ist zu erwarten, dass humane Autoantikörper auch die Glutamatrezeptoren der Ratte erkennen. Es werden durch die Expression Fusionsproteine erhalten, die an ihrem C- terminalen Ende ein myc-epitop sowie sechs Histidinreste besitzen. Mit einem monoklonalen Antikörper (9E10) gegen das myc-epitop, lässt sich die Expression der Rezeptoren leicht immunologisch verfolgen. Sowohl das myc-epitop als auch der His-tag können für eine affinitätschromatographische Aufreinigung verwendet werden Klonierung von GluA3 Die cdna des Glutamatrezeptors GluA3 wurde aus dem Ursprungsklon pbluescript SK(-) GluA3(flop) mit den Restriktionsenzymen BglII/PvuII herausgeschnitten (3.2.2) und über eine Gelelektrophorese (3.2.1) mit anschließender Gelelution (3.2.3) gereinigt. Bei der Restriktion war zu berücksichtigen, dass der komplette kodierende Bereich der cdna in den richtigen Leserahmen des Plasmids (pcdna/to/myc-his, Version B) kloniert werden mußte. Darüber hinaus war es notwendig, das vorhandene Stopp-Codon zu mutieren. Dieses war jedoch relativ einfach, da die Erkennungsschnittstelle BglII direkt das Stopp- Codon entfernte. Die überhängenden 5 -Enden der cdna wurden durch das Klenow- Enzym aufgefüllt (3.2.5) und anschließend in den mit EcoRV blund end linearisierten, dephosphorylierten Vektor (3.2.6) ligiert (3.2.7). Nach Transformation in E.coli-Bakterien (3.2.8) wurden Plasmid-Präparationen in kleinem Maßstab durchgeführt (3.2.9) und die Orientierung der cdna im Vektor durch Restriktionsanalyse bestimmt. Von einem Klon wurde eine Plasmid-Präparation im mittleren Maßstab durchgeführt (3.2.10) und die Identität durch Sequenzierung (3.2.12) verifiziert. 29

32 4.1.2 Klonierung von GluK2, GluN1 und GluN2B Für die Klonierung wurden die cdnas der Glutamatrezeptoren aus folgenden Ausgangsklonen verwendet: GluK2(Q) in psgem, GluN1 in psgem und GluN2B in psgem. Die Klonierungsstrategie wurde hierbei so gewählt, dass jede cdna in zwei Fragmenten (5 - und 3 -Fragment) in das Plasmid kloniert wurde. Dabei wurden die 5 - Fragmente aus den bereits oben erwähnten cdnas gewonnen und die 3 -Fragmente mittels PCR amplifiziert. Bei diesen PCRs wurden 3 -Primer verwendet, die das Stopp-Codon mutierten und die eine singuläre Restriktionsschnittstelle für die spätere Klonierung einführten. In der folgenden Tabelle sind die verwendeten Restriktionsenzyme für den jeweiligen Ursprungsklon angegeben. Tabelle 2: Verwendete Restriktionsenzyme und Primer für die Subklonierung der Glutamatrezeptoren. Zielklon GluN1-T-Rex GluN2B-T-Rex GluK2-T-Rex Ausgangsklon GluN1/pSGEM GluN2B/pSGEM GluK2(Q)/pSGEM 5 -Fragment BamHI / SphI BamHI / NdeI EcoRI / NgoMIV forward-primer P424 P423 P461 reverse-primer TP137 TP136 TP Fragment SphI / XbaI NdeI / XbaI NgoMIV / XbaI Vektor BamHI / XbaI BamHI / XbaI EcoRI / XbaI Für die 3 -Fragmente wurden die PCRs mit den angegebenen Primern durchgeführt (3.2.4). Die PCR-Fragmente wurden durch Gelelektrophorese mit anschließender Gelelution gereinigt und mit den in Tabelle 2 angegebenen Restriktionsenzymen geschnitten. Nach erneuter Aufreinigung konnten sowohl die 5 -Fragmente wie auch die 3 -Fragmente in einer Ligation mit den in Tabelle 2 restringierten, dephosphorylierten Vektoren (pcdna/to/myc-his, Version A) eingesetzt werden. Nach Transformation in E.coli-Bakterien wurden Plasmid-Präparationen in kleinem Maßstab durchgeführt und die korrekte Klonierung durch Restriktionsanalyse überprüft. Anschließend wurden für jeden neuen Klon Plasmid-Präparationen im mittleren Maßstab durchgeführt und die Identität durch Sequenzierung bestimmt. 30