1. Allgemeines. 2. Das Epstein-Barr-Virus. 3. Diagnostik

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1 MIKROGEN Gebrauchsinformation recomblot EBV IgG IgM/IgA recomblot EBV IgG recomblot EBV IgM/IgA Immunoblot-Test mit rekombinant produzierten und gelelektrophoretisch aufgetrennten Antigenen zur Bestimmung von IgG- oder IgM- und IgA-Antikörpern gegen das Epstein-Barr-Virus (EBV) in humanem Serum oder Plasma. 1. Allgemeines Der recomblot EBV ist ein qualitativer in-vitro-test zum Nachweis und zur Identifizierung von IgG- Antikörpern (Artikel-Nr. 4502) und von IgM-Antikörpern bzw. von IgA-Antikörpern (Artikel-Nr. 4503) gegen Epstein-Barr-Virus (EBV) in Humanserum oder -plasma. Die Tests erlauben durch die elektrophoretische Auftrennung der Antigene im Unterschied zu EIA oder Spottests auf einen Blick eine Aussage über die spezifischen Antikörper, die verschiedenen Krankheitsstadien zugeordnet sind. 2. Das Epstein-Barr-Virus Das Epstein-Barr-Virus (EBV), 1964 erstmals in Patienten mit Burkitt-Lymphom beschrieben, ist eines der am weitesten verbreiteten Viren des Menschen. Es gehört zur Gruppe der Herpesviren, die eine Vielzahl anderer humanpathogener Viren (z.b. Herpes-simplex-Virus, Varizella-zoster-Virus, Zytomegalie-Virus) beinhaltet. Nach der Erstinfektion verbleibt EBV lebenslang in B-Lymphozyten und Epithelien des Nasen- Rachenraums. Nach Übertragung durch den Speichel führt EBV bei Kleinkindern zu Infektionen, die jedoch häufig asymptomatisch oder subklinisch verlaufen. Bei Jugendlichen zwischen 14 und 20 Jahren kommt es zu einem zweiten Ansteckungsgipfel und in bis zu 2/3 der Fälle kann sich das Krankheitsbild der infektiösen Mononukleose (Pfeiffer'sches Drüsenfieber, kissing disease ) entwickeln. Klinische Symptome sind Appetitlosigkeit und Abgeschlagenheit, Fieber, Ausschlag, Pharyngitis, Tonsillitis, Lymphadenopathie, Leukozytose, Kopf- und Gliederschmerzen sowie hepatische Störungen. Sie sind auf die Infektion und lytische Vermehrung des Virus in B-Lymphozyten und der folgenden Immunantwort zurückzuführen. In seltenen Fällen kann es zu schwerwiegenden Komplikationen wie hämolytischer Anämie, Pneumonie, neurologischen Erscheinungen oder kardiologischen Störungen kommen. Über 90 % der Erwachsenen sind seropositiv und noch Virusträger oder -ausscheider, da EBV lebenslang in B- Lymphozyten und bestimmten Epithelzellen persistiert. Wie bei anderen Herpesviren können bei Patienten mit Immundefekten oder unter Gabe von Immunsuppressiva Reaktivierungen erfolgen; bei diesen können die IgG/M/A-Antikörpertiter gegen frühe EBV-Antigene erneut ansteigen. Durch EBV infizierte B-Lymphozyten immortalisieren, d.h. sie können unbegrenzt proliferieren. Diese normalerweise vom Immunsystem kontrollierte bzw. unterdrückte Eigenschaft kann eine Reihe von malignen Erkrankungen zur Folge haben: Lymphoproliferative Erkrankungen bei Immundefizienzen bedingt durch Erkrankung (z.b. AIDS) oder Gabe von Immunsuppressiva (polyklonale Lymphome) oder zusammen mit Chromosomenveränderungen das Burkitt-Lymphom. Mit weiteren Co-Faktoren verursacht EBV das Nasopharynx-Karzinom, das hauptsächlich in den südlichen Provinzen Chinas auftritt und dort die häufigste maligne Erkrankung ist. Während der Vermehrung des Virus läuft eine kaskadenartige Bildung von verschiedenen Regulationsproteinen in der frühen Phase ( immediate early, early antigens ; EA) und später von Strukturproteinen ( Virus capsid antigens ; VCA und Membranproteine; MA) ab. Im latenten Zustand werden nur wenige Antigene, darunter EBNA 1-6 (Epstein-Barr nukleäre Antigene ) gebildet. 3. Diagnostik Bei der serologischen EBV-Diagnostik mittels Immunfluoreszenz-Test mit infizierten und zur EBV- Vermehrung induzierten Zellen werden hauptsächlich Antikörper gegen drei Antigenklassen unterschieden: EA - frühe Antigene, VCA- Kapsid/-Strukturantigene und EBNA-nukleäre Antigene, die während der latenten Phase exprimiert werden. Nach Infektion lassen sich hauptsächlich IgM- und IgA-Antikörper gegen die frühen Antigene, etwas später VCA-IgM nachweisen. Anti-EA- und anti-vca-p23-igg sind ebenfalls früh nach Erstinfektion zu finden, während typischerweise anti-ebna-1 erst Wochen bis Monate nach Infektion zu finden ist

2 recomblot EBV IgG IgM/IgA Gebrauchsinformation MIKROGEN Letzteres trifft allerdings auch auf anti-vca-p18-igg zu. Durch das zeitlich versetzte Auftreten der Antikörper gegen verschiedene EBV-Antigene ist auch eine Einteilung in die verschiedenen Infektionsstadien (Erstinfektion, Persistenz, Reaktivierung) möglich. Da für das Virus bis heute kein proliferatives System zur Verfügung steht, ist die Antigengewinnung für serologische Tests nicht sehr effektiv; zudem können nur in geringem Maß definiert gereinigte EBV- Proteine eingesetzt werden. Aus diesem Grund wurden in den letzten Jahren rekombinante Antigene entwickelt, die nun einen gezielten Einsatz relevanter Epitope für diagnostische Fragestellungen erlauben. Im recomblot EBV werden rekombinante Antigene verwendet, die zwei Vertreter der frühen Antigene (EA), zwei Viruskapsidantigene (VCA), ein spätes Membranantigen sowie ein nukleäres Antigen, das in latent infizierten Zellen gebildet wird, beinhalten (siehe Tabelle 1). Tabelle 1: Relevante EBV-Antigene und rekombinante Analoga EBV-Antigen-Gruppen Abkürzung Rekombinantes Antigen Early antigens EA r-p54, r-p138* Viruskapsid/Strukturantigene VCA r-p23, r-p18 Nukleäres Antigen EBNA-1 r-p72* Membranantigen MA r-gp250/350* *Bei den rekombinanten Antigenen r-p138, r-p72 und r-gp250/350 wurden nur deren immunreaktive Segmente verwendet, weshalb sie ein geringeres Molekulargewicht als die originalen EBV-Antigene aufweisen. Diese in der Western-Blot-Technik eingesetzten Antigene ermöglichen auf einen Blick den Nachweis und die Identifizierung von IgG-, IgM-, oder IgA-Antikörpern, die spezifische Schlüsselproteine von EBV sind. In nur einem Testansatz erhält man einen Überblick der Antikörper-Reaktivitäten gegen die wichtigsten Antigenklassen. Ferner dient der Western-Blot dazu, die Ergebnisse von Enzymimmunoassays (EIA) und indirekten Immunfluoreszenztests (IFT) zu ergänzen. Dies führt zu einer größeren Sicherheit bei der Diagnosestellung im Labor und man erhält Hinweise auf das Erkrankungsstadium. 4. Testprinzip Die verwendeten gereinigten, rekombinanten Antigene (s. Tabelle 1) werden mittels SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt (SDS-PAGE). Die EBV-Proteine werden dann elektrophoretisch auf eine Nitrozellulose-Membran übertragen (Western-Blotting). Die Membran wird anschließend zur Blockierung freier Bindungsstellen mit einer Proteinlösung inkubiert, gewaschen und in Streifen geschnitten. Zum Nachweis von EBV-spezifischen Antikörpern werden die Streifen mit der verdünnten Serum- oder Plasmaprobe inkubiert, wobei die Antikörper sich an die Antigene auf den Streifen anlagern. Nicht gebundene Antikörper werden anschließend abgewaschen und die Streifen in einem zweiten Schritt mit anti-human-igg, -IgM bzw. -IgA inkubiert, das mit Meerrettich-Peroxidase gekoppelt ist. Mit einer durch die Peroxidase katalysierten Färbereaktion werden spezifisch gebundene Antikörper nachgewiesen. Falls eine Reaktivität gegen eines der EBV-Proteine gefunden wird, erscheint diese als dunkle Bande auf dem Streifen. Als Reaktionskontrolle ist am oberen Ende der Streifen - unter der Nummer - eine Bande mit antihuman-immunglobulin aufgetragen, die bei jedem Serum eine Reaktion zeigen muss

3 MIKROGEN Gebrauchsinformation recomblot EBV IgG IgM/IgA 5. Packungsinhalt Die Reagenzien einer Packung reichen für 20 Bestimmungen. Jeder Reagenziensatz enthält: 100 ml Waschpuffer (fünffach konzentriert) Enthält Tris-Puffer, NaCl, Detergenz, Konservierungsmittel und Protein 45 ml Chromogenes Substrat Tetramethylbenzidin (TMB, gebrauchsfertig) 2 Stück Inkubations-Schalen mit je 10 Vertiefungen 1 Vorentwickelter Kontrollstreifen (kitspezifisch) 1 Gebrauchsinformation 1 Auswertebogen 5.1. recomblot EBV IgG Jeder Reagenziensatz enthält zusätzlich zu den unter Punkt 5 aufgeführten Komponenten: 5.2. recomblot EBV IgM/IgA 2 Stück Röhrchen mit 10 fortlaufend nummerierten Western-Blot-Teststreifen beschichtet mit EBV-Antigenen. 80µl Positiv IgG-Serumkontrolle (Rote Verschlusskappe) Humaner Ursprung, anti-hiv-1/2, anti-hcv und HBs-Ag negativ 60 µl Anti-human IgG Konjugat (tausendfach konzentriert, Grüne Verschlusskappe) Aus Kaninchen, enthält NaN 3. Jeder Reagenziensatz enthält zusätzlich zu den unter Punkt 5 aufgeführten Komponenten: 2 Stück Röhrchen mit 10 fortlaufend nummerierten Western-Blot-Teststreifen beschichtet mit EBV-Antigenen. 80 µl Schwachpositiv IgM- und IgA-Serumkontrolle (Blaue Verschlusskappe) Humaner Ursprung, anti-hiv-1/2, anti-hcv und HBs-Ag negativ 100 µl Anti-human IgM Konjugat (fünfhundertfach konzentriert, Lila Verschlusskappe) Aus Kaninchen, enthält NaN µl Anti-human IgA Konjugat (fünfhundertfach konzentriert, Farblose Verschlusskappe) Aus Kaninchen, enthält NaN 3 6. Zusätzlich benötigte Reagenzien und erforderliches Zubehör Deionisiertes Wasser, Absaugsystem mit Desinfektionsfalle, Mikropipetten, Plastikpinzette, Schüttler, Messzylinder. 7. Hinweise zum Test und den Reagenzien 7.1. Vorsichtsmaßregeln Für die Herstellung der Kontrollseren wird Blut von Spendern verwendet, bei denen keine Antikörper gegen HIV 1/2, HCV und kein Hepatitis Bs-Antigen nachgewiesen wurden. Da trotzdem eine Infektion nicht mit Sicherheit ausgeschlossen werden kann, muss das Produkt mit der gleichen Sorgfalt behandelt werden wie die Patientenproben. Während des gesamten Testablaufs müssen geeignete Einmalhandschuhe getragen werden

4 recomblot EBV IgG IgM/IgA Gebrauchsinformation MIKROGEN Die Konjugate enthalten Natriumazid. Eine Berührung mit der Haut oder Schleimhaut ist zu vermeiden. Sämtliche Reagenzien und Materialien, die mit potentiell infektiösen Proben in Berührung kommen, müssen mit geeigneten Desinfektionsmitteln behandelt oder mindestens 1 Stunde bei 121 C autoklaviert werden. Inkubationsschalen nur einmal verwenden. Streifen vorsichtig mit einer Plastikpinzette handhaben Hinweise zur Handhabung Die Reagenzien vor und nach Gebrauch bei 2 C - 8 C lagern, nicht einfrieren. Vor Testbeginn sind alle Bestandteile für mindestens 30 Minuten auf 18 C - 25 C (Raumtemperatur) zu temperieren. Die Testdurchführung erfolgt ebenfalls bei Raumtemperatur. Vor Gebrauch die Kontrollseren sowie die konzentrierten Konjugate gut durchmischen. Die Patientenseren ebenfalls gut mischen. Das Röhrchen mit den Teststreifen ist erst unmittelbar vor Gebrauch zu öffnen, um eine Kondenswasserbildung zu vermeiden. Die nicht benötigten Streifen verbleiben im Röhrchen und werden weiterhin bei 2 C - 8 C gelagert (Röhrchen wieder gut verschließen, Teststreifen dürfen vor Versuchsbeginn nicht feucht werden!). Die Positiv Kontrolle bzw. die Schwachpositiv Kontrolle muss bei jedem Versuchsdurchgang unabhängig von der Anzahl der zu testenden Seren mitgeführt werden. Nur so ist die korrekte Testinterpretation möglich. Die Packungen tragen ein Verfallsdatum, nach dessen Erreichen keine Qualitätsgarantie mehr übernommen werden kann. Es dürfen nur Einzelreagenzien verwendet werden, deren Chargennummer mit der entsprechenden Chargennummer auf dem Etikett der Kitverpackung übereinstimmt. Der Test ist nur von geschultem und autorisiertem Fachpersonal durchzuführen. Bei substantiellen Änderungen am Produkt, bzw. der Anwendungsvorschrift kann die Anwendung außerhalb der von MIKROGEN vorgegebenen Zweckbestimmung liegen. Automatisierung ist möglich, nähere Informationen erhalten Sie von MIKROGEN Herstellung der Lösungen Herstellung des gebrauchsfertigen Waschpuffers Dieser Puffer wird für die Serum- und Konjugatverdünnung sowie die Waschschritte benötigt. Vor dem Verdünnen ist das Volumen des Waschpuffers für die entsprechende Anzahl der durchzuführenden Teste zu bestimmen. Der Waschpuffer ist direkt vor der Verwendung herzustellen. Das Waschpuffer-Konzentrat enthält eine lösliche Proteinkomponente. Das Aufschütteln des Puffers ist nicht notwendig. Ein Teil des Waschpuffer-Konzentrats wird mit vier Teilen deionisiertem Wasser verdünnt (Verdünnung 1 + 4). Die benötigten Mengen sind der Tabelle 2 zu entnehmen. Volumina für in der Tabelle nicht aufgeführte Streifen-Anzahlen sind rechnerisch zu ermitteln. Nicht benötigter, gebrauchsfertiger Waschpuffer muss verworfen werden

5 MIKROGEN Gebrauchsinformation recomblot EBV IgG IgM/IgA Tabelle 2: Waschpuffer pro eingesetzte Teststreifen eingesetzte Teststreifen Waschpuffer- Konzentrat Deionisiertes Wasser gebrauchsfertiger Waschpuffer 1 5 ml 20 ml 25 ml 2 10 ml 40 ml 50 ml 3 15 ml 60 ml 75 ml 5 25 ml 100 ml 125 ml ml 200 ml 250 ml ml 300 ml 375 ml ml 400 ml 500 ml Herstellung der Konjugatlösungen Die Konjugatlösung für die IgG-, IgM- bzw. IgA-Bestimmung ist unmittelbar vor Gebrauch herzustellen, eine Lagerung der gebrauchsfertigen Konjugatlösung ist nicht möglich. Ein Teil des IgG-Konjugat-Konzentrats wird mit 1000 Teilen gebrauchsfertigem Waschpuffer verdünnt ( ). Ein Teil des IgM- bzw. IgA-Konjugat-Konzentrats wird mit 500 Teilen gebrauchsfertigem Waschpuffer verdünnt ( ). Die benötigten Mengen sind der Tabelle 3 zu entnehmen. Volumina für in der Tabelle nicht aufgeführte Streifen-Anzahlen sind rechnerisch zu ermitteln. Tabelle 3: Volumina der Anti-human-IgG-, IgM- bzw. IgA-Konjugat-Verdünnung eingesetzte Teststreifen * IgG-Konjugat- Konzentrat IgM-Konjugat- Konzentrat IgA-Konjugat- Konzentrat gebrauchsfertiger Waschpuffer 1 2 µl 4 µl 4 µl 2 ml 2 4 µl 8 µl 8 µl 4 ml 3 6 µl 12 µl 12 µl 6 ml 5 10 µl 20 µl 20 µl 10 ml µl 40 µl 40 µl 20 ml µl 60 µl 60 µl 30 ml µl 80 µl 80 µl 40 ml * Die Mengen sind ohne Totvolumen berechnet. Je nach Abarbeitung (manuell bzw. an einem Gerät) bitte zusätzliche Konjugatlösung für 1 bis 3 Streifen ansetzen Substratlösung Das Substrat ist gebrauchsfertig! Vor Beginn der Färbung auf Raumtemperatur (18 C - 25 C) bringen. Eine Kontamination der nicht verwendeten Substratlösung durch unsterile Pipettenspitzen etc. muss unbedingt vermieden werden, da dadurch die Sensitivität des Testes beeinträchtigt werden kann Lagerung und Haltbarkeit Die Reagenzien vor und nach Gebrauch bei 2 C - 8 C lagern. Gebrauchsfertiger Waschpuffer kann nicht gelagert werden. Die Konjugatlösung muss immer frisch zubereitet werden

6 recomblot EBV IgG IgM/IgA Gebrauchsinformation MIKROGEN 8. Probenmaterial Das Probenmaterial kann Serum oder Plasma sein, das nach Entnahme möglichst rasch vom Blutkuchen getrennt wurde. Hitzeinaktivierte Proben können zu erhöhten Hintergrundreaktionen führen. Eine mikrobielle Kontamination der Probe ist unbedingt zu vermeiden. Unlösliche Stoffe sind vor der Inkubation durch Zentrifugation aus der Probe zu entfernen. Die Verwendung von lipämischen, hämolytischen oder trüben Proben kann einen dunklen Hintergrund im recomblot EBV ergeben. Diese Proben können darüber hinaus zu verfälschten Ergebnissen führen und sollten daher nicht verwendet werden. Achtung! Sollen die Bestimmungen nicht sofort erfolgen, kann das Probenmaterial bis zu 2 Wochen bei 2 C - 8 C aufbewahrt werden. Eine längere Lagerung der Proben ist durch Aufbewahrung bei - 20 C oder tiefer möglich. Ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben wird wegen der Gefahr fehlerhafter Resultate nicht empfohlen. 9. Testdurchführung 9.1. Allgemeines Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse hängt in starkem Maße vom gleichmäßigen Waschen der Streifen ab. Die unter 9.3 und 9.5 beschriebenen Waschfrequenzen sollen deshalb immer eingehalten werden Inkubation der Proben 1. Für jeden Testansatz wird eine Vertiefung einer Inkubationsschale benötigt. In die Vertiefungen werden je 2 ml des gebrauchsfertigen Waschpuffers pipettiert. In die mit gebrauchsfertigem Waschpuffer gefüllten Vertiefungen wird vorsichtig je ein Teststreifen mit Hilfe einer Plastikpinzette eingetaucht. Die Streifennummerierung zeigt nach oben. Achtung! Die Streifen müssen vollständig mit Waschpuffer benetzt und untergetaucht sein. Verwendete Röhrchennummer und Streifennummer im Auswertebogen notieren. 2. Probenzugabe IgG-, IgM- und IgA-Testdurchführung: 20 µl einer unverdünnten Probe (Humanserum oder Plasma) oder der entsprechenden Positiv bzw. Schwachpositiv Kontrolle werden in die dafür vorgesehenen Vertiefungen pipettiert (Verdünnung ). Bitte achten Sie darauf, die Probe an einem Ende des untergetauchten Streifens in den Waschpuffer einzupipettieren und schnellstmöglich durch vorsichtiges Schütteln der Inkubationswanne einzumischen. Probennummern und zu detektierende Immunglobulinklasse (IgG, IgM, oder IgA) im Auswertebogen notieren. Die Inkubationsschale wird mit dem Kunststoffdeckel abgedeckt und unter leichtem Schütteln 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Achtung! Es ist darauf zu achten, dass die Inkubationslösungen nicht in andere Vertiefungen verschleppt werden; insbesondere beim Öffnen und Schließen des Deckels sind Spritzer zu vermeiden (Gefahr der Kreuzkontamination). Falls sich Kondenswasser gebildet hat, soll dieses abgewischt werden

7 MIKROGEN Gebrauchsinformation recomblot EBV IgG IgM/IgA 9.3. Waschen 1. Nach der Inkubation werden die Kunststoffdeckel vorsichtig von den Inkubationsschalen abgenommen. 2. Die Serumverdünnung wird vorsichtig aus den einzelnen Vertiefungen abgesaugt. Achtung! Nach dem Absaugen der Lösungen aus einer Vertiefung sind die Pipettenspitzen zu wechseln oder nach jedem Absaugvorgang gut mit deionisiertem Wasser zu spülen, da die Gefahr einer Kreuzkontamination besteht. Bei maschineller Abarbeitung sind diesbezüglich die Hinweise des Geräteherstellers zu beachten. 3. In jede Vertiefung werden anschließend 2 ml des gebrauchsfertigen Waschpuffers gegeben und für 5 Minuten unter leichtem Schütteln auf dem Schüttler gewaschen. Nach dem Waschvorgang wird der Waschpuffer abgesaugt. 4. Der Waschschritt unter Punkt 3 wird insgesamt viermal durchgeführt Inkubation mit Peroxidase-Konjugat Nach dem Waschen der Streifen werden in jede Vertiefung 2 ml der entsprechend vorbereiteten Konjugatlösung (siehe Tabelle 3) gegeben und 1 Stunde unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Dabei wird die Inkubationsschale mit dem Kunststoffdeckel abgedeckt Waschen Die Konjugatlösungen werden aus den Vertiefungen abgesaugt und die Streifen erneut gewaschen (vergleiche 9.3) Substratreaktion In jede Vertiefung werden 1,5 ml Substratlösung gegeben und 5-15 Minuten unter leichtem Schütteln und unter Beobachtung bei Raumtemperatur inkubiert. Achtung! Den Färbeprozess beobachten, und alle Streifen so lange in der Substratlösung belassen, bis folgende Banden zu erkennen sind: bei der Positiv Kontrolle der IgG-Detektion alle Banden die auf dem kitspezifischen Kontrollstreifen zu sehen sind. bei der Schwachpositiv Kontrolle der IgM-Detektion schwaches r-p138. bei der Schwachpositiv Kontrolle der IgA-Detektion schwaches r-p138. Bei hochpositiven Seren kann es zu einer Überreaktion der Färbung kommen. Es wird empfohlen, bei solchen Streifen die Färbung vorzeitig zu beenden Abstoppen der Reaktion 1. Nach Absaugen der Substratlösung werden die Streifen dreimal kurz mit deionisiertem Wasser gewaschen. 2. Die Streifen werden vorsichtig mit einer Plastikpinzette aus dem Wasser entnommen und zum Trocknen für ca. 2 Stunden zwischen 2 Lagen saugfähigen Papiers gelegt. Anschließend können die Streifen auf dem beigelegten Auswertebogen aufgeklebt und die Ergebnisse protokolliert werden. 3. Die Streifen sollten vor Licht geschützt aufbewahrt werden

8 recomblot EBV IgG IgM/IgA Gebrauchsinformation MIKROGEN 10. Zusammenfassung der Testdurchführung 1. alle Reagenzien auf Raumtemperatur bringen 2. in 2 ml gebrauchsfertigem Waschpuffer die Streifen einlegen, die Streifen müssen komplett untergetaucht sein 3. jeweils 20 µl von der Kontrolle bzw. Probe einpipettieren 4. 3 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren 5. viermal je 5 Minuten, mit je 2 ml Waschpuffer, auf dem Schüttler waschen 6. 2 ml gebrauchsfertige Konjugatlösung hinzufügen 7. 1 Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren 8. viermal je 5 Minuten, mit je 2 ml Waschpuffer, auf dem Schüttler waschen 9. 1,5 ml der Substratlösung zugeben; 5-15 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren. Sollbanden siehe mindestens dreimal mit deionisiertem Wasser waschen Stunden zwischen 2 Lagen saugfähigen Papiers trocknen und das Ergebnis ablesen 11. Auswertung Bewertung der Bandenintensität 1. Bei jeder Testdurchführung muss unabhängig von der Anzahl der Proben die Positiv bzw. Schwachpositiv Serumkontrolle mitgeführt werden. Die Schwachpositiv Serumkontrolle dient zur Abgrenzung der Reaktivität von der Hintergrund-Reaktivität (Cutoff). 2. Notieren Sie im beigefügten Auswertebogen Datum, Chargen- und Röhrchen-Nummer, sowie die detektierte Antikörperklasse. 3. Tragen Sie die Proben-Identifizierungs-Nummern in das Protokollblatt ein. 4. Kleben Sie nun mit einem Klebestift die dazugehörigen Teststreifen in die entsprechenden Felder des Auswertebogens. Richten Sie dazu die Teststreifen mit der Reaktions-Kontrollbande an der eingezeichneten Markierungslinie aus. Kleben Sie dann mit einem durchsichtigen Klebeband die Teststreifen links von der Markierungslinie an. Flächiges Ankleben der ganzen Teststreifen mit Klebestift oder Klebeband kann zu Veränderungen der Färbung führen. 5. Den vorentwickelten Kontrollstreifen mit den markierten Antigenbanden zur Orientierung an die aufgeklebten Teststreifen legen, und die reagierenden Banden identifizieren. Der vorentwickelte Kontrollstreifen ist kitspezifisch und stammt aus demselben Nitrozellulose-Block wie die Teststreifen im Testkit. Die Molekulargewichte bzw. die Bezeichnungen der Antigenbanden sind markiert. 6. Die Bandenintensitäten auf dem Probenstreifen werden im Vergleich zur Schwachpositiv-Kontrolle gesondert für jede Immunglobulinklasse bewertet (s bzw. Tabelle 4) und in den Auswertebogen eingetragen

9 MIKROGEN Gebrauchsinformation recomblot EBV IgG IgM/IgA Kontrollergebnisse Das Mitführen der Kontrollen ist unerlässlich. Dabei sollen die Testbedingungen (Sensitivität) geprüft und die Reaktivität mit den einzelnen Antigenbanden bestätigt werden. Die Lokalisation der Banden muss mit dem beigefügten Kontrollstreifen übereinstimmen. Die Kontrollbande (Reaktions-Kontrolle) unterhalb der Streifennummer dient zur Überprüfung der Testdurchführung und muss in jedem Fall eine deutliche Färbung zeigen. Die mit den Kontrollen inkubierten Teststreifen sollen nachfolgende Bandenmuster aufzeigen. Positiv Kontrolle IgG: Alle auf dem vorentwickelten kitspezifischen Kontrollstreifen angegebenen Banden sollten sichtbar sein. Reaktions-Ktrl. r-gp250/350 r-p54 r-p72 r-p138 r-p23 r-p18 Schwachpositiv Kontrolle IgG: Für die IgG-Bestimmung steht keine Schwachpositiv Kontrolle zur Verfügung. Die Bandenintensitäten werden an Hand der absoluten Bandenreaktivitäten bewertet (siehe Tabelle 4) und in den Auswertebogen eintragen. Schwachpositiv Kontrolle IgM/IgA: Es sollten folgende Banden zu sehen sein: Reaktionskontrolle und r-p138 als schwach-reaktive Bande. Andere Banden können reagieren. Als Referenzbande für die Bewertung der Banden bei der IgM/IgA-Bestimmung dient die Bande der Schwachpositiv Kontrolle IgM/IgA (r-p138). Tabelle 4: Bewertung der Bandenintensität MA EA EBNA-1 EA VCA VCA Banden negativ sehr schwache Intensität schwache Intensität* gut sichtbare Intensität starke Intensität Intensität - +/ * recomblot EBV IgM/IgA: Vergleichen Sie hierzu die Reaktivitäten der Schwachpositiv Kontrolle IgM/IgA. Für den IgG- Nachweis steht kein Schwachpositiv Serum zur Verfügung. Achtung! Die Bandenmuster beim recomblot EBV IgG- und IgM/IgA-Nachweis können unterschiedliche Intensitäten aufweisen. Es ist möglich, dass der IgG Western-Blot kräftigere und dunklere Banden als der IgM/IgA Western-Blot zeigt. Die Intensität der Proteinbanden ist abhängig von der Konzentration der EBV-spezifischen Antikörper. Nehmen Sie anhand der Tabelle 4 die Bewertung der Intensität der auftretenden Banden gesondert für den IgG-, IgA- und IgM-Nachweis vor

10 recomblot EBV IgG IgM/IgA Gebrauchsinformation MIKROGEN Testergebnisse und Testinterpretation Ein Serum kann als EBV-reaktiv bezeichnet werden, sobald auf den Streifen mindestens eine Antigenbande in schwacher Intensität ( + ) sichtbar ist. (Ausnahme: isolierte + -Reaktivität von gp 250/350) Seren mit zwei oder mehreren sehr schwachen Banden ( +/- ) sind als fraglich reaktiv zu bewerten. Ein negatives Ergebnis liegt vor, wenn: keine Bande oder Banden an anderer Position als auf dem Kontrollstreifen angegeben, vorliegen. eine isolierte +/- Reaktivität vorliegt. eine isolierte + Reaktivität von gp 250/350 vorliegt. Für die Beurteilung des EBV-Immunstatus sollten immer die Ergebnisse des IgG-, IgM- und IgA- Nachweises zusammen betrachtet werden. Der IgG-Nachweis ist in jedem Fall erforderlich! Meist ist der EBV-Status durch Antikörper-Reaktivitäten gegen verschiedene Schlüsselantigene und das Auftreten von typischen Antigen-Bandenkonstellationen gekennzeichnet. Diese EBV-Antigene und ihre Bedeutung bei der Bestimmung des EBV-Infektionsstatus sind in der Tabelle 5 zusammengefasst. Allerdings ist bedingt durch die Biologie des EBV und die individuelle Immunantwort keine strikten Vorgabe an die zu fordernden Reaktivitätsmuster für alle Antigene bei der Stadieneinteilung zu machen. Häufig vorkommende Antigen-Bandenkonstellationen sind in Tabelle 6 aufgelistet. Tabelle 5: Schlüsselantigene der verschiedenen Infektionsstadien Name Klassifizierung Beurteilung des EBV-Status r-ebna-1 Epstein-Barr nukleäres Antigen IgG-Titer fehlt regelmäßig bei Frischinfektionen, zentraler Marker für zurückliegende Infektion. Bedeutung im IgM und IgA bisher nicht beschrieben. r-p138 und r-p54 EA, frühe Antigene Reaktivität in IgG, IgM und IgA in allen Stadien außer abgelaufener Infektion möglich; bei frischer Infektion in allen Antikörperklassen wahrscheinlich r-p23 VCA oft schon zu Beginn einer EBV Infektion im IgG und IgM nachweisbar; bleibt auch bei zurückliegender Infektion im IgG nachweisbar. r-p18 VCA IgG-Titer fehlt in den Regel bei Frischinfektionen; Marker für zurückliegende Infektion; Nachweis von IgM bereits im Frühstadium möglich. r-gp250/350 Membranantigen sehr oft IgM-Titer bei Erstinfektion, im IgG nicht regelmäßig nachweisbar

11 MIKROGEN Gebrauchsinformation recomblot EBV IgG IgM/IgA Tabelle 6: Interpretation der Reaktivitäten Typische Reaktionsmuster Keine EBV-spezifischen Banden in der IgG-, IgM- und IgA-Bestimmung. Isolierte +/- Reaktivität Eine isolierte + Reaktivität von gp 250/350 IgG: EBNA-1 und r-p18 negativ (p23 und EAs möglich) IgM: EA (r-p54 und/oder r-p138) positiv; VCA (r-p18, r-p23) möglich IgG: EBNA-1 und/oder r-p18 positiv, r-p23 und r-gp250/350 häufig positiv; schwache EA-Titer möglich IgM: negativ IgG: wie bei abgelaufener Infektion, zusätzlich schwache Reaktion mit EA- Antigenen IgM: schwache Reaktivität gegen EA und/oder VCA IgG: Starke Reaktionen mit allen Antigenen, in Ausnahmen anti-ebna-1- Verlust IgM: schwache Reaktivitäten mit EA und VCA möglich IgA: deutliche Reaktivitäten mit EA und/oder VCA EBV-negativ Erstinfektion Infektiöse Mononukleose Abgelaufene Infektion Sekundäre Reaktivierung (klinisch nicht relevant) Reaktivierung* Serologisches Bild wie bei Reaktivierung (hohe IgA-Titer!!) NPC und EBV-assoziierten Lymphome * Unter einer EBV-Reaktivierung ist die Wiederaufnahme einer lytischen Vermehrung in einer latent infizierten Person zu verstehen. Das Ausmaß dieser Vermehrung kann sehr gering und von kurzer Dauer sein, z.b. bei kurzzeitiger Störung des Immunsystems, durch andere Infektionen oder sonstige Ursachen; aber auch lang andauernd und massiv z.b. bei Patienten mit Immunstörung oder unter Immunsuppressiva; in diesen Fällen besteht die Gefahr von EBV-assoziierten Lymphomen. Alle Zwischenstadien sind möglich. Eine klinisch nicht relevante kurzzeitige EBV-Vermehrung wird in Tabelle 6 als sekundäre Reaktivierung bezeichnet Hinweise zur Interpretation Wie bereits erwähnt, zeichnet sich die serologische Antwort nach einer Virusinfektion durch ein hohes Maß an Variabilität aus. In der EBV-Serologie begegnet man diesem Problem durch die Kombination verschiedener Marker. Dabei kommt dem anti-ebna-1 eine zentrale Bedeutung zu: Positives anti- EBNA-1 schließt eine akute EBV-Infektion sicher aus, negatives anti-ebna-1 kann entweder eine frische Infektion anzeigen oder aber sekundär negativ sein (z.b. aufgrund eines anti-ebna-1 Verlustes bei Immunsuppression). Weiterhin ist bekannt, dass ca. 5% der Personen nach EBV-Infektion kein anti- EBNA-1 bilden und damit eine frische Infektion vorgetäuscht wird. Diese diagnostische Lücke kann durch einen zweiten Marker, das VCA-Antigen r-p18 geschlossen werden. Die Evaluierungsdaten zeigen, dass deutliche anti-r-p18 IgG Titer in der Regel eine frische Infektion ausschließen. Anti-r-p18 gleicht also der EBNA-1-Antwort, hat aber den entscheidenden Vorteil, dass Personen mit anti-ebna-1-verlust diesen späten Marker nicht verlieren und damit serologisch richtig beurteilt werden. Nach Erstinfektion findet man Antikörper gegen r-p18 im IgM häufig gleichzeitig mit Antikörpern gegen EAs und r-p23. Seren mit nicht interpretierbaren Bandenkonstellationen sollten nach 2-3 Wochen mit einer erneuten Blutentnahme überprüft werden. Ein negatives Western-Blot-Ergebnis kann eine frische EBV-Infektion nicht gänzlich ausschließen. Falsch negative Ergebnisse können auftreten, wenn die Serumproben sehr früh nach einer Infektion abgenommen werden. Eine Wiederholung des Tests mit einer erneuten Serumabnahme nach ein bis zwei Wochen sollte auch hier erfolgen. Alle Testergebnisse sollten als Ergänzung zum klinischen Bild betrachtet werden. Zur Festlegung der Diagnose EBV-Infektion und der Klassifizierung der einzelnen Stadien sind neben den Laborwerten in jedem Fall auch die klinischen Befunde und die zugehörige Anamnese mit einzubeziehen

12 recomblot EBV IgG IgM/IgA Gebrauchsinformation MIKROGEN Dunkle Teststreifen: Manche Seren von Patienten können auf dem gesamten Nitrozellulose-Streifen eine dunkle, durchgängige oder gemusterte Färbung erzeugen (z.b. bei Seren von Patienten mit Milcheiweiß-Allergien). Hierfür sind unterschiedliche Faktoren aus dem jeweiligen Patientenserum verantwortlich. Die Auswertung dieser Streifen ist in der Regel nur mit Einschränkungen möglich. So sind z.b. "inverse" Banden (weiße Banden auf dunklem Hintergrund) als negativ zu werten. Das entsprechende Serum sollte in jedem Fall mittels anderer serologischer Methoden überprüft werden. 12. Klinische Ergebnisse Für die Interpretation der Validität des r-p18 Antigens wurden umfangreiche neue Evaluierungen durchgeführt. Die Ergebnisse lassen sich folgendermaßen zusammenfassen: Eindeutig positive anti-p18 IgG-Antikörper können frühestens 3 Wochen nach Erkrankungsbeginn festgestellt werden. Durch den Nachweis von anti-ebna-1 und/oder anti-p18 IgG-Antikörpern lassen sich zurückliegende EBV-Infektionen eindeutig nachweisen (Tabelle 7). Über den Nachweis von anti-ebna-1- und/oder anti-p18-igg-antikörpern können Serumproben, die im Screeningbefund fälschlicherweise als Verdacht auf frische EBV-Infektion beurteilt wurden, richtig als abgelaufene EBV-Infektion identifiziert werden (Tabelle 8). Anti-p18-IgG ist neben anti-ebna-1-igg ein zweiter zentraler Marker in der EBV-Serologie. Sein entscheidender Vorteil besteht darin, dass Patienten mit fehlender anti-ebna-1-antikörper-bildung nach EBV-Infektion oder sekundärem anti-ebna-1-verlust diesen Marker aufweisen und damit richtig als postakute oder zurückliegende EBV-Infektion beurteilt werden. Diese Fälle wurden u.a. bei Patienten mit Immunsuppression und -defizienz beschrieben. Tabelle 7: Normalkollektiv (gesunde Studenten, n = 272) Serumgruppe Anzahl Beurteilung im recomblot EBV IgG I anti-ebna-1- und/oder anti-p18-igg-antikörper 232 (85 %) postakute oder zurückliegende EBV-Infektion II keine anti-ebna-1- oder anti-p18-igg-antikörper 15 (6 %) mögliche frische EBV-Infektion (Nachweis von anti-ebv-igm-antikörpern empfehlenswert!) III keine anti-ebv-igg-antikörper 25 (9 %) keine EBV-Antikörper nachweisbar (2. Serumprobe empfehlenswert!) Gruppe I r-gp250/350 (MA) r-p54 (EA) r-p72 (EBNA-1) r-p138 (EA) r-p23 (VCA) r-p18 (VCA) IgG 53 (23 %) 66 (28 %) 225 (97 %) 97 (42 %) 227 (98 %) 228 (98 %) Tabelle 8: Verdacht auf eine frische EBV-Infektion aufgrund der ELISA-Befunde (n = 199) Serumgruppe Anzahl Beurteilung im recomblot EBV IgG / IgM I keine anti-ebna-1- oder anti-p18-igg-antikörper anti-ea-igg- und/oder IgM-Antikörper 154 (77 %) frische EBV-Infektion II anti-ebna-1- und/oder anti-p18-igg-antikörper 38 (19 %) postakute oder zurückliegende EBV-Infektion III keine anti-ebna-1- oder anti-p18-igg-antikörper keine anti-ea-igg- und/oder IgM-Antikörper keine anti-ebv-igg- und IgM-Antikörper 7 (4 %) grenzwertige oder untypische Bandenmuster oder keine EBV- Antikörper nachweisbar (2. Serumprobe empfehlenswert!) Gruppe I r-gp250/350 (MA) r-p54 (EA) r-p72 (EBNA-1) r-p138 (EA) r-p23 (VCA) r-p18 (VCA) IgG 5 (3 %) 111 (72 %) (89 %) 83 (54 %) 0 IgM 99 (64 %) 97 (63 %) 2 (1 %) 118 (77 %) 54 (35 %) 91 (59 %)

13 MIKROGEN Gebrauchsinformation recomblot EBV IgG IgM/IgA 13. Literatur Die ausführliche Literaturliste finden Sie im englischen Teil der Gebrauchsinformation ab Seite 3. Auf Anforderung übersenden wir Ihnen gerne weiterführende Literatur zur EBV-Diagnostik zu. 14. Erklärung der Symbole Die Tabelle mit der Erklärung der Symbole finden Sie im englischen Teil der Gebrauchsinformation auf Seite

14 recomblot EBV IgG IgM/IgA Instructions for use MIKROGEN recomblot EBV IgG recomblot EBV IgM/IgA Immunoblot test, with recombinant antigens separated by gelelectrophoresis, for the determination of IgG, IgM and IgA antibodies against Epstein-Barr Virus (EBV) in human serum and plasma. 1. General aspects The recomblot EBV IgG is a qualitative in-vitro test to detect and to identify IgG antibodies (Article-No. 4502) and IgM resp. IgA antibodies (Article-No. 4503) against Epstein-Barr Virus (EBV) in human serum or plasma. In contrast to EIAs or spot tests, the recomblot EBV, by means of the electrophoretical separation of antigens, gives information at a glance on the specific antibodies which are assigned to the various stages of infection. 2. Epstein-Barr Virus The Epstein-Barr Virus (EBV), described for the first time in 1964 in patients with Burkitt-Lymphoma is one of the most widespread viruses in humans. It belongs to the group of Herpes viruses, which contains a number of other human pathogenic viruses (e. g. Herpes Simplex Virus, Varizella-Zoster Virus and Cytomegalo virus). After the primary infection, EBV remains for the lifetime in B-lymphocytes and epithelia of the nose and throat. When transmitted in saliva, EBV leads to infections in infants which are however often asymptomatic or subclinical. In young people between 14 and 20 years of age there is a second peak of contagion. In 2/3 of the cases the disease infectious mononucleosis (Pfeiffer s glandular fever, "kissing disease") can develop. Clinical symptoms are loss of appetite and fatigue, fever, rash, pharyngitis, tonsillitis, lymphangitis, leucocytis, headache and rheumatic pains and hepatic disorders. These can be attributed to the infection and the lytic life cycle of the virus in B-lymphocytes and the subsequent immune response. In rare cases there can arise serious complications such as haemolytic anaemia, pneumonia, neurological occurrences or cardiological disorders. Over 90 % of adults are sero-positive and are virus carriers, since EBV persists throughout lifetime in B-lymphocytes in certain epithelium cells. As in the case of other herpes viruses, reactivation can occur in patients with immune defects or when immune suppressives are given; here again IgG/M/A antibody titer can rise against early EBV antigens. B-lymphocytes infected by EBV immortalise, i. e. they can proliferate infinitely. This property, normally controlled or suppressed by the immune system can result in a series of malignant illnesses: Lymphoproliferative illnesses due to immune deficiencies caused by illness (e. g. AIDS) or by the giving of immune suppressives (polyclonal lymphoma) or the Burkitt lymphoma together with chromosomal changes. Together with further cofactors, EBV causes nasopharyngeal carcinoma, which has a very high incidence in southern provinces of China. During the lytic life cycle of the virus, there is a cascade-like formation of various regulating proteins in the early phase ("immediate early; early antigens", EA) and later of structure proteins ("Virus capsid antigens"; VCA and membrane proteins; MA). In the latent status, only a few antigens are formed, including EBNA 1-6 (Epstein-Barr nuclear antigens). 3. Diagnosis In the serological EBV diagnostics by means of immune fluorescence tests with infected and EBV producing cells, antibodies are mainly differentiated against three antigen classes: EA - early antigens, VCA capsid/structure antigens and EBNA nuclear antigens, which are expressed during the latent phase. After infection IgM and IgA antibodies against the early antigens can be found, a little later VCA-IgM. Anti-EA- and anti-vca-p23-igg also can be detected after primary infection, while typically anti-ebna-1 is not to be found until weeks or months after infection. This applies also to anti-vca-p18-igg. This permits the differentiation of primary infection to persistence or EBV reactivation. Up to now no effective cell culture system is available for the virus, the antigen extraction for serological tests is not very effective. For this reason over the last few years recombinant antigens have been

15 MIKROGEN Instructions for use recomblot EBV IgG IgM/IgA developed, which now permit targeted application of relevant epitopes for the posing of diagnostic questions. The recomblot is based on recombinant EBV antigens which contain the two members of the early antigens (EA), two virus capsid antigens, a late membrane antigen and a nuclear antigen, which is formed in latently infected cells (Table 1). Table 1: Relevant EBV antigens and recombinant analogues EBV antigens abbreviation recombinant antigens Early antigens EA r-p54, r-p138* Virus capsid / structure antigens VCA r-p23, r-p18 Nuclear antigen EBNA-1 r-p72* Membrane antigen MA r-gp250/350* * For the recombinant antigens r-p138, r-p72 and r-gp250/350 only immuno-reactive segments are included, therefore they have lower molecular weights compared to their authentic EBV analogues. These antigens employed in the Western blot technique facilitate at a glance the evidence of information and identification of IgG, IgM or IgA antibodies, which are specifically for key proteins of EBV. In only one test run, the reactivities of the antibodies can be seen against the most important antigen classes. Furthermore, the Western blot serves to confirm the results of enzyme immuno assay (EIA) and indirect immuno-fluorescence test (IFT). This leads to more certainty in the making of a diagnosis in the laboratory and indications of the phase of the illness are given. 4. Test principle For the recomblot EBV, the specific EBV antigens (see Table 1) are produced with the help of recombinant E. coli cells. The purified recombinant antigens used are separated according to their molecular weights using SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The EBV proteins are then transferred to a nitrocellulose membrane by electrophoresis (Western Blotting). The membrane is then incubated with a protein solution to block the free binding sites, washed, cut into strips and packed in tubes. For the detection of EBV-specific antibodies, the strips are incubated with the diluted serum or plasma sample, whereby the antibodies bind to the antigens on the strips. Unbound antibodies are then washed away and the strips are incubated in a second step with anti-human IgG, IgM or IgA coupled with horse radish peroxidase. Specifically bound antibodies are detected by a colour reaction catalysed by the peroxidase. If an antigen-antibody reaction has taken place, a dark band appears at the corresponding locus on the strip. As a control for proper serum incubation, anti-human immunoglobulin is applied approx. 2-6 mm below the identification number of each strip

16 recomblot EBV IgG IgM/IgA Instructions for use MIKROGEN 5. Package contents The reagents in a pack are sufficient for 20 determinations. Each reagent set contains: 100 ml Wash buffer (five times the concentration) Contains Tris buffer, NaCl, detergent, preservative and protein 45 ml Substrate solution Tetramethylbenzidin (TMB, ready-to-use)) 2 pieces Incubation trays with 10 wells each 1 Predeveloped control strip (kit specific) 1 Instructions for use 1 Evaluation form 5.1. recomblot EBV IgG Additionally to the components listed under Point 5 each reagent set contains: 5.2. recomblot EBV IgM/IgA 2 pieces Test tubes with 10 consecutively numbered western blot test strips coated with EBV antigens 80µl Positive serum control (red screw cap) Human origin, anti HIV-1/2, anti-hcv and HBs-Ag negative 60 µl Anti-human IgG conjugate (green screw cap, thousand times the concentration) from rabbit, contains NaN 3 Additionally to the components listed under Point 5 each reagent set contains: 2 pieces Test tubes with 10 consecutively numbered western blot test strips coated with EBV antigens 80 µl Weak positive IgM and IgA serum control (blue screw cap) Human origin, anti HIV-1/2, anti-hcv and HBs-Ag negative 100 µl Anti-human IgM conjugate (lilac screw cap, five hundred times the concentration) from rabbit, contains NaN µl Anti-human IgA conjugate (colourless screw cap, five hundred times the concentration) from rabbit, contains NaN 3 6. Additional reagents and accessory equipment required Deionised water, vacuum extraction system with disinfection trap, micro pipettes, plastic forceps, shaker, metric cylinder with graduations. 7. Information on test and reagents 7.1. Precautions Control sera are from blood donors verified for the absence of antibodies to HIV 1/2, HCV and no Hepatitis Bs-antigen. Since an infection cannot be excluded with absolute certainty despite this precaution, the product must be treated with the same care as the patient samples. Suitable single-use gloves must be worn during the entire test procedure

17 MIKROGEN Instructions for use recomblot EBV IgG IgM/IgA The conjugates contain sodium azide. Avoid contact with skin or mucosa. All reagents and materials contaminated with potentially infectious samples must be treated with suitable disinfectants or autoclaved at 121 C for at least 1 hour. Use incubation trays once only. Handle strips carefully with a plastic forceps Handling information Store reagents before and after use at 2 C - 8 C, do not freeze. Temper all components before starting the test for at least 30 minutes to 18 C - 25 C (room temperature). Both the test and incubation procedures are carried out at room temperature. Mix the control sera and concentrated conjugates well before use. Mix the patient sera well before use as well. Do not open the tube containing the test strips until just before use to avoid condensation of water. The strips that are not used must be left in the tube and stored further at 2 C - 8 C (reclose tube tightly, test strips must not become moist before testing!). Positive control resp. weak positive control must always be run parallel to the sera being tested, regardless of how many sera are tested. This is the only way to ensure correct test interpretation. A quality guarantee can only be given up to the expiry date on the packages. Only reagents with lot numbers corresponding to the respective lot number on the label of the kit package may be used. The test must be performed by well-trained and authorised qualified personnel. In case of substantial modifications of the product or the instructions for use, the application of the test might differ from the purpose intended by MIKROGEN. Automation is possible, please refer to MIKROGEN for details Preparation of solutions Preparation of ready-to-use wash buffer This buffer is required for serum and conjugate incubation as well as for the washing steps. Before preparing the dilutions, determine the volume of wash buffer required for the corresponding number of tests to be performed. Prepare the ready-to-use wash buffer immediately prior to use. The wash buffer concentrate contains a soluble protein component. It is not necessary to shake up the buffer. One part of wash buffer concentrate is diluted with four parts of deionised water (dilution 1 + 4). See Table 2 for the amounts required. Volumes for numbers of test strips not listed in the table have to be determined by calculation. Ready-to-use wash buffer not needed has to be discarded

18 recomblot EBV IgG IgM/IgA Instructions for use MIKROGEN Table 2: Wash buffer per test strip used Test strips used Wash buffer concentrate Deionised water Ready-to-use wash buffer 1 5 ml 20 ml 25 ml 2 10 ml 40 ml 50 ml 3 15 ml 60 ml 75 ml 5 25 ml 100 ml 125 ml ml 200 ml 250 ml ml 300 ml 375 ml ml 400 ml 500 ml Preparation of the conjugate solutions The conjugate solution for the IgG, IgM resp. IgA test has to be prepared immediately before use. It is not possible to store the ready-to-use conjugate solution. One part of IgG conjugate concentrate is diluted with 1000 parts of ready-to-use wash buffer ( ). One part of IgM resp. IgA conjugate concentrate is diluted with 500 parts ready-to-use wash buffer ( ). The amounts used are listed in Table 3. Volumes for numbers of test strips not listed in the table have to be determined by calculation. Table 3: Volumes for anti-human IgG, IgM resp. IgA conjugate dilution Test strips used * IgG conjugate concentrate IgM conjugate concentrate IgA conjugate concentrate Ready-to-use wash buffer 1 2 µl 4 µl 4 µl 2 ml 2 4 µl 8 µl 8 µl 4 ml 3 6 µl 12 µl 12 µl 6 ml 5 10 µl 20 µl 20 µl 10 ml µl 40 µl 40 µl 20 ml µl 60 µl 60 µl 30 ml µl 80 µl 80 µl 40 ml * The volumes have been calculated without dead volume. Depending on handling (manually or by machine processing) please prepare conjugate solution for additional 1 to 3 strips Substrate solution The substrate is ready for use! Bring to room temperature (18 C - 25 C) before starting the colour reaction. Avoid contamination of the unused substrate solution by nonsterile pipette tips, etc. at all costs since this may affect test sensitivity Storage and stability Store reagents at 2 C - 8 C before and after use. Ready-to-use wash buffer cannot be stored. The conjugate solution is to be prepared always freshly

19 MIKROGEN Instructions for use recomblot EBV IgG IgM/IgA 8. Sample material The sample material can be serum or plasma that is separated from the coagulum as soon as possible after sampling. Heat-inactivated samples may result in raised background reaction levels. A microbial contamination of the sample has to be avoided at all costs. Insoluble substances have to be removed from the sample prior to incubation by centrifugation. Use of lipaemic, haemolytic or turbid samples may result in a dark background in the recomblot EBV. These samples may also result in false results and should therefore not be used. Important! If the tests are not carried out immediately, the samples can be stored for up to 2 weeks at 2 C - 8 C. Longer storage of the samples is possible at -20 C or below. Repeated freezing and thawing of the samples is not recommended because this may affect the quality of the results. 9. Test Procedure 9.1. General The reproducibility of the results depends to a great extent on consistent washing of the strips. The washing frequencies described under 9.3 and 9.5 should therefore always be maintained Incubation of samples 1. One well in the incubation tray is required per serum to be tested. 2 ml of ready-to-use wash buffer is pipetted into each well. Then one test strip is carefully dipped into each of the wells filled with wash buffer using a plastic forceps. The strip number must face upwards. Important! The strip must be completely wet and immersed in the wash buffer. Record the tube and strip numbers used on the evaluation sheet. 2. Adding the samples IgG, IgM and IgA test procedure: 20 µl of an undiluted sample (human serum or plasma) respectively of the corresponding positive control or weak positive control are pipetted into the proper wells (dilution ). Please be sure to add the sample at one end of the immersed strips into the wash buffer and mix as soon as possible by shaking the tray carefully. Record the sample numbers and the immunoglobulin class (IgG, IgM or IgA) on the evaluation sheet. Cover the incubation tray with the plastic lid and incubate 3 hours at room temperature while shaking gently. Important! Make sure the incubation solutions are not carried over into other wells; be particularly careful to avoid splashing when opening and closing the lid (risk of cross-contamination). In case condensation water has formed inside the lid, please wipe dry Washing 1. Following incubation, the plastic lids are carefully removed from the incubation trays. 2. The serum dilution is carefully aspirated from the individual wells. Important! When the solutions have been aspirated from a well, the pipette tip has to be changed or rinsed well with deionised water after each aspiration procedure to prevent crosscontamination. In the case of machine processing the references of the equipment manufacturer have to be considered. 3. Then add 2 ml of the ready-to-use wash buffer in each well and wash in the shaker while shaking gently for 5 minutes. The wash buffer is aspirated after the washing procedure

20 recomblot EBV IgG IgM/IgA Instructions for use MIKROGEN 4. Carry out the washing step under 3 a total of four times Incubation with peroxidase conjugate After washing the strips, add 2 ml of the appropriately prepared conjugate solution (see Table 3) into each well and incubate for 1 hour while shaking gently at room temperature, whereby the incubation tray is covered with the plastic lid Washing The conjugate solutions are aspirated from the wells and the strips are washed again (see 9.3) Substrate reaction Add 1.5 ml substrate solution into each well and incubate for 5-15 minutes, shaking gently and under observation, at room temperature. Important! Observe the colour reaction process and leave all strips in the substrate solution until the strips show the following bands: IgG positive serum control: all bands should be visible, which are also seen on the predeveloped control strip (kit specific). IgM weak positive serum control: r-p138 should be visible weakly. IgA weak positive serum control: r-p138 should be visible weakly. The colour reaction may be excessive with highly positive sera. Recommendation: Stop the colour reaction in such strips earlier Stopping the reaction 1. After the solution is aspirated, wash the strips briefly three times with deionised water. 2. Use a plastic forceps to remove the strips carefully from the water and place them between 2 layers of absorbent paper to dry for about 2 hours. The strips may be adhesively attached to the enclosed evaluation sheet and the results may be entered in the protocol. 3. The strips should be stored protected from exposure to light. 10. Summary of the test procedure 1. bring all reagents to room temperature 2 deposit the strips in 2 ml ready-to-use wash buffer and take care that they are completely immersed in the ready-to-use wash buffer 3. add 20 µl of sample resp. control serum 4. incubate for 3 hours at room temperature while shaking gently 5. wash on the shaker four times with 2 ml ready-to-use wash buffer for 5 minutes each time 6. add 2 ml appropriately prepared conjugate solution 7. incubate at room temperature for 1 hour while shaking gently 8. wash on the shaker four times with 2 ml ready-to-use wash buffer for 5 minutes each time 9. add 1.5 ml of the substrate solution, incubate while shaking at room temperature for 5 15 minutes. Bands see wash the strips at least three times with deionised water 11. dry the strips between 2 layers of absorbent paper for 2 hours and read off the result