Saubere Lösungen. Wasser zur Aufreinigung von Glutathion-S-transferase (GST) mittels Affinitätschromatographie. 59. Jahrgang Mai 2015 S.

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1 er nd So k uc dr 59. Jahrgang Mai 2015 S Saubere Lösungen Wasser zur Aufreinigung von Glutathion-S-transferase (GST) mittels Affinitätschromatographie J. Erwig und E. Herbig

2 Fachartikel Saubere Lösungen Wasser zur Aufreinigung von Glutathion-S-transferase (GST) mittels Affinitätschromatographie J. Erwig und E. Herbig D Arabidopsis thaliana Dawid Skalec ie Affinitätschromatographie ist ein chromatographisches Verfahren zur Isolation von Proteinen aus Lösungen. Das Grundprinzip der Affinitätschromatographie [1] wird schon seit längerer Zeit in Laboren angewandt. Durch Verwendung von Fast Protein Liquid Chromatographie-Systemen (FPLC) kann eine hohe Reinheit und Menge der Zielproteine erreicht werden. Außerdem ermöglichen solche Systeme eine Automatisierung des Prozesses.

3 Abb. 1: Der gesamte Zellextrakt, welcher das gewünschte rekombinante Protein enthält, wird auf die entprechende Säule gegeben. Unspezifisch gebundene Proteine werden ausgewaschen und das spezifisch gebundene Protein mit reduziertem Glutathion eluiert. (Zeichnung Jan Erwig in Anlehnung an Bende 1974 (1)). Im Rahmen der Arbeiten zur Funktionsbestimmung von Proteinen, welche in der Pflanze-Pathogen-Interaktion (Arabidopsis thaliana) eine Rolle spielen, werden in dieser Arbeit Versuche zur Aufreinigung des Proteins Glutathion-S-transferase (GST) beschrieben. GST wird als so genannter Anhang (Tag) an Proteine gefügt, um diese dann mittels Affinitätschromatographie aufzureinigen. Die natürliche Aufgabe von Glutathion- S-transferasen ist die Funktion bei der Entgiftung externer organischer Stoffe (sogenannter Xenobiotika) in Pflanzen. Detailiertere Angaben zur Funktion und Regulation von GSTs in Pflanzen können der Publikation von Marrs 1996 [2] entnommen werden. Bei der Aufreinigung dieses Proteins kommt es auf absolute Sauberkeit aller verwendeten Chemikalien und Lösungen an. Daher ist es nötig alle Chemikalien und Lösungen in Reinstwasser anzusetzen und aus diesem Grund werden hohe Anforderungen an das Lösungsmittel Reinstwasser für diese Untersuchungen gestellt. Grundlage der Affinitätschromatographie Um eine Aufreinigung eines bestimmten Proteins zu erreichen, verwendet man sogenannte Protein-Tags, einen zusätzlichen Anhang von Aminosäuren oder ganzen Proteinen mit bestimmter Funktion. Hierfür wird das gewünschte Protein mit molekularbiologischen Methoden (u. A. Klonierung und Transformation) insofern verändert, dass dieser Anhang mit dem eigentlichen Protein hergestellt wird und dadurch ein rekombinantes Protein entsteht. Das Ziel der Affinitätschromatographie ist es, eine möglichst große Menge des rekombinanten Proteins aufzureinigen. Das jeweilige Genkonstrukt wird dafür vorher häufig in bakterielle Systeme transformiert und dort überexprimiert. Als Wirtsorganismus bedient man sich meist dem Bakterium Escherichia coli, doch auch Bacillus-Stämme oder nicht-bakterielle Systeme wie Hefen, Insekten-, Säugetier- oder Pflanzenzellen finden hierbei Anwendung [3]. Die Aufreinigung beruht auf der spezifischen Wechselwirkung zwischen zwei Reaktionspartnern. Ein Reaktionspartner ist der Protein-Tag der andere ist ein kovalent an einer Matrix gebundener Ligand oder Antikörper. An diesen Liganden bindet das rekombinante Protein (bzw. der Tag) spezifisch. Nach dem Auswaschen unspezifischer Proteine kann das rekombinante Zielprotein durch einen Kompetitor spezifisch eluiert werden (beispielhaft siehe Abb. 1). Die Wahl der Säulenmatrix ist hierbei abhängig von dem gewählten Protein-Tag. Protein-Tags sollten verschiedene Anforderungen wie etwa hohe Spezifität zur Matrix, einfache Nachweisbarkeit, Elution mit niedermolekularen Substanzen und die Möglichkeit zu N- wie C-terminalen Fusionsproteinen erfüllen. Darüber hinaus sollten die Tags möglichst keinen Einfluss auf die Tertiärstruktur haben und die biologische Aktivität des Proteins nicht beeinflussen [4]. Bei dem hier gezeigten Beispiel wird die Glutathion-S-transferase (GST), über eine Glutathion-haltige Matrix aus einem Zel- lextrakt aufgereinigt. GST hat eine Größe von etwa 26 kda und ist damit um ein Vielfaches größer als, zum Beispiel ein Polyhistidin-Tag (1 kda). Die Vorteile größerer Protein-Tags sind potenziell bessere Löslichkeit des rekombinanten Proteins und eine spezifischere Aufreinigung. Viele kürzere Polypeptid-Tags werden über Matrices aufgereinigt, an die unspezifische Proteine im geringen Maß binden können. Damit ist die aufgereinigte Fraktion weniger rein, verglichen mit beispielsweise dem GST-Tag. Die Elution der gebundenen rekombinanten Proteine wird meistens durch kompetitive Bindung von freiem Liganden oder aber durch Änderung des ph-wertes oder der Salzkonzentration erreicht. Wie in vielen Bereichen, wird auch diese Methode weitgehend automatisiert. Im vorliegenden Beispiel wird die Aufreinigung der GST via Protein Liquid Chromatography unter Benutzung des ÄKTA purifier UPC10 Systems gezeigt (siehe Abb. 2). Diese Methode erlaubt schnelle und effiziente Aufreinigung von Proteinen. Durch den komplexen Aufbau des Systems, ist genaues und vor allem sauberes Arbeiten unerlässlich. So könnten z. B. schwankende ph Werte und wechselnde Salzkonzentrationen sich auf das Bindungs- und Eluierungsverhalten auswirken und damit die Ergebnisse verfälscht werden. Daher muss strikt auf saubere Lösungen geachtet und von vornherein die Lösungen zur Chromatographie in Reinstwasser angesetzt werden. Im hier gezeigten Beispiel wird die gebundene GST mit reduziertem Glutathion von der Säule eluiert und in unterschiedlichen Fraktionen aufgefangen. Diese Frak-

4 Abb. 2: Äkta purifier System zur Proteinaufreinigung im Schwann-Schleiden Forschungszentrum für Molekulare Zellbiologie, Abteilung Zellbiologie der Pflanze, Georg-August Universität Göttingen. Abb. 3: Reinstwassersystem arium pro DI (Foto: Sartorius) tionen werden anschließend auf ihre Reinheit untersucht. Alle Lösungen wurden zur Eliminierung störender Einflüsse im arium Reinstwasser angesetzt. Die Herstellung des verwendeten Reinstwassers wird im folgenden beschrieben. Herstellung des Reinstwassers für die Versuche Beschreibung des arium pro DI Reinstwasser Systems Das hier in den Versuchen verwendete arium pro DI Wandsystem (Abb. 3; Tischgerät) wurde zur Herstellung von Reinstwasser aus vorbehandeltem Trinkwasser konzipiert und entfernt aus diesem noch vorhandene Verunreinigungen. Die Reinstwasserproduktion erfordert kontinuierliche Rezirkulation und einen konstanten Wasserfluss, was durch ein Pumpensystem mit Druckregelung erreicht wird. Die Leitfähigkeit des Wassers wird am Speisewasser-Einlass und beim Produktwasser (Wasser-Auslass) gemessen. Das bei den hier dargestellten Untersuchungen verwendete System arium pro DI arbeitet mit zwei unterschiedlichen Kartuschen. Diese sind mit einem speziellen Aktivkohle-Adsorber und Mischbett-Ionenaustauscherharzen gefüllt, um hochreines Wasser bezüglich organischer und anorganischer Ionen (z. B. Salze) zu liefern. Abb. 4: Schematische Darstellung des Flussdiagramms beim Reinstwassersystem arium pro DI. Ein 0,2 µm Endfilter ist am Wasserauslass installiert und dient der Entfernung von Partikeln und Bakterien aus dem erzeugten Reinstwasser während der Dosierung. Der Prozess der gerätspezifischen Wasserreinigung ist in Abbildung 4 (Flussdiagramm arium pro DI) dargestellt. Die auf diese Weise hergestellte Wasserqualität wird unter anderem für sensible Fragestellungen im Rahmen der Proteinaufreinigung eingesetzt. Die erzielten Forschungsergebnisse werden im Folgenden beschrieben. Materialien und Methoden Für die Aufreinigung wurde eine 250 ml Flüssigkultur mit E. coli TOP10 Zellen, die mit dem pgex4t1 Expressionvektor transformiert wurden, beimpft. Die Zellen wurden bis zu einer OD 600 ~0.6 heran wachsen gelassen. Der Induktor (IPTG) wurde mit einer Endkonzentration von 0,2 mm zugegeben und die Kultur anschließend für 4 Stunden bei 28 C schüttelnd wachsen gelassen. Vor und nach der Induktion wurden je 1 ml Kultur als Kontrolle genommen. Die Flüssigkultur wurde dann bei 2000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in kaltem PBS-Puffer, der PMSF und Lysozym enthielt, resuspendiert. Die Zelllyse wurde durch Ultraschallbehandlung mit einem Bandelin Sonoplus Ultraschallgerät (Bandelin Electronic, Berlin) weiter erleichtert. Das Zelllysat wurde dann bei x g zentrifugiert. Nach jedem Schritt (Resuspendierung, Lyse und Zentrifugation) wurden Kontroll-Proben genommen. Der Überstand wurde dann überführt und in einem Ultraschallbad entgast. Die Auf-

5 Abb.5: SDS-Page eines 10%igen Acrylamidgels auf dem der totale SDS- Zellextrakt der uninduzierten (-) und induzierten (+) E. coli Zellen aufgetragen wurde. Colloidal Coomassie-Blau gefärbtes Gel. GST durch * gekennzeichnet Abb. 6: Das von der UNICORN 5.2 Software (GE Healthcare, München) erstellte Chromatogramm erlaubt eine direkte Analyse der einzelnen Parameter in Echtzeit. UV Absorption (blau), Konzentration des Elutionspuffers (grün) sowie der Start der Ladung der Probe auf die Säule sind eingezeichnet. Elutionspeak markiert durch *. reinigung wurde in einem ÄKTA purifier UPC10 (GE Lifescience, München) System (siehe Abb. 2) durchgeführt. Die UNICORN 5.2 Software (GE Lifescience, München) wurde für die Bestimmung der Flussparameter und der abschließenden Chromatogramm-Analysen verwendet. Für die selektive Bindung wurde die GSTrap FF 1 ml Säule (GE Healthcare, München) angeschlossen. Die Säule wurde zuerst mit arium pro DI Reinstwasser gewaschen und dann mit PBS equilibriert. Da das System auch die UV Absorption der Probe während der Aufreinigung misst, kann das Zielprotein durch einen Anstieg der UV Absorption bei der Elution mit reduziertem Glutathion identifiziert werden. Das aufgereinigte Protein wurde in 200 µl Fraktionen gesammelt. Für die weitere Analyse mittels SDS- PAGE wurden 20 µl von einzelnen oder zwei gepoolten Peakfraktionen mit 4x SDS- Ladepuffer gemischt und auf ein 10%iges Polyacrylamidgel geladen. Das Gel wurde dann mit colloidalem Coomassie gefärbt [5]. Alle Puffer, Lösungen und Medien wurden für die Versuche mit arium pro DI Reinstwasser angesetzt. Ergebnisse Um die Expression des Zielproteins zu untersuchen, wurden uninduzierte und induzierte E.coli-Zellen direkt in SDS aufgeschlossen und mittels SDS-PAGE in einem 10 % Polyacrylamidgel aufgetrennt (siehe Abb. 5). GST hat eine molekulare Masse von etwa 26 kda. Die induzierten Zellen zeigen hier eine eindeutige Zunahme eines Proteins in derselben Größe (vgl Abb. 5: *). Die induzierten Zellen wurden dann lysiert und das Zelllysat in unlösliche und lösliche Fraktionen mittels Zentrifugation getrennt (siehe Abb. 7). Die Aufreinigung eines Proteins mittels Affinitätschromatographie setzt voraus, dass das aufzureinigende Protein in wässriger Phase löslich ist. Die Löslichkeit des GST-Proteins wurde durch SDS-PAGE mit anschließender Coomassie-Färbung bestätigt (Abb. 7). Die lösliche Proteinfraktion wurde für die Affinitätschromatographie benutzt. Die UNI- CORN 5.2 Software (GE Healthcare, München) erlaubt eine Echtzeitanalyse während der Aufreinigung präsentiert als Chromatogramm (siehe Abb. 6). Die Beladung der Säule mit der Proteinprobe verursacht einen Anstieg der UV-Absorbtion (vgl. Abb 6 blaue Linie). Nach erfolgter Ladung sinkt folglich der UV Wert. GST ist im ersten Drittel der Elutionsfraktionen als eindeutiger Peak in der UV- Absorption zu erkennen (siehe Abb. 6 Stern). Nach der Aufreinigung wurden die jeweiligen Fraktionen bezogen auf ihren Proteingehalt und Reinheit mittels SDS-PAGE untersucht. Geladen wurden die jeweiligen Kontrollen (totaler Zellextrakt, Zellextrakt nach Lyse, Überstand und ungebundene Proteine), sowie Fraktionen innerhalb (A7-B7) und außerhalb (A4 und C4) des UV-Peaks. Es ist zu sehen, dass die Peakfraktionen das Zielprotein in hoher Menge und Reinheit enthalten (Abb. 7). Im Vergleich mit den Kontrollen ist eine eindeutige Proteinbande bei 26 kda zu erkennen, die in den Peakfraktionen A11- B12 den höchsten Proteingehalt aufweist. Gleichzeitig ist im Vergleich des eingesetzten Überstandes und dem ungebundenen Proteingehalt zu sehen, dass die exprimierte und lösliche GST nahezu komplett aufgereinigt werden konnte. Das deutet auf eine erfolgreiche und saubere Aufreinigung sowie Anreicherung des Proteins unter Verwendung von arium Reinstwasser hin. Unsauberes Wasser könnte bspw. durch veränderten Salzgehalt oder ph eine frühere oder spätere Elution von der Säulenmatrix zur Folge haben, wodurch vor allem die Reproduzierbarkeit des Experimentes beeinflusst werden würde. Diskussion Aufreinigung und Isolation spezifischer Proteine und die anschließende biochemische Analyse dieser ist eine wichtige Methode um die Funktion der Proteine besser verstehen zu können. Die Ergebnisse belegen, dass das gesuchte Protein eindeutig als differenzierbare Bande isoliert werden konnte. Eine solche distinkte Auftrennung lässt sich nur durch absolut saubere Lösungen erzielen. Als Grundlage der eingesetzten Lösungen diente das arium Reinstwasser, das problemlos für die Versuchsdurchführung verwendet werden konnte, weil es sich durch seine gleichbleibende hohe Qualität bezüglich aller geforderten Werte wie z. B. Leitfähigkeit, TOC, Salzgehalt auszeichnet. Die Identifizierung über Gelektrophorese zeigte keine störenden Schlieren, schlechte Fokussierung oder unspezifische Proteinbanden, wie es bei Anwesenheit von Salzen oder geladenen organischen Partikeln in den Lösungen geschehen kann [6]. Um reproduzierbare verlässliche Gelauswertungen zu bekommen, muss auf saubere Puffer und Färbelösungen geachtet werden. Da die hier beschriebene Versuchsdurchführung über Anzucht der Bakterien, Herstellung der Lösungen bis hin zu den

6 Abb. 7: Colloidal Coomassie gefärbtes 10% SDS-PAGE Gel welches die aufgereinigte GST in Nichtpeak- und Peakfraktionen zeigt. Kontrollen: Totaler Zellextrakt, nicht löslicher Teil nach Zelllyse (Zellextrakt nach Lyse), löslicher Teil der eingesetzt wurde für die Chromatographie (Überstand) und ungebundene Proteine. Chromatographie-Läufen und abschließender Gelelektrophorese arbeitsintensive, kostspielige und zeitaufwendige Arbeiten sind, schließt sich eine Verwendung von unsauberem Wasser/Chemikalien von vornherein aus. Ein direkter Vergleich unterschiedlicher Reinstwasserqualitäten konnte daher aus diesen Gründen nicht durchgeführt werden. Das in den beschriebenen Versuchen frisch aufbereitete Reinstwasser stellt eine kostengünstige Alternative zu käuflichem, abgefüllten Reinstwasser dar und soll nach Tarun et al., 2011 [6] auch zu erhöhter Anzahl und besserer Verteilung von Proteinspots in einem 2D-Gel im Vergleich zu Flaschenwasser führen. Danksagung Ein besonderer Dank der Autoren gilt Herrn Prof. Dr. Volker Lipka für die wissenschaftliche Betreuung der Arbeit sowie Frau Dr. Elena Petutschnig (beide Schwann-Schleiden Forschungszentrum für Molekulare Zellbiologie, Abteilung Zellbiologie der Pflanze, Georg-August Universität Göttingen) für die Durchsicht des Manuskriptes sowie für die konstruktive Diskussion zum Thema. Literatur 1.) Bende, Heinz: Affinitäts-Chromatographie, Chemie in unserer Zeit, 8. Jahrgang, Nr. 1 (1974) 2.) Marrs, Kathleen A.: The Functions and Regulation of Glutathione S-Transferases in Plants, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 47: (1996) 3.) Terpe, K.: Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72: , (2006) 4.) Terpe, Kay: Protein-Affinitäts-Tags, BIOspektrum, , 13. Jahrgang (2007) 5.) Dyballa, N.; Metzger, S.: Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels. JoVE. 30, (2009) doi: / ) Tarun, M.; Mabic, S. und Schrader, M.: Auf die Reinheit kommt es an Laborwasserqualität beeinflusst die Proteinauftrennung, Laborpraxis, Seiten 48-50, Okt Kontakt Jan Erwig, M.Sc. Schwann-Schleiden Forschungszentrum für Molekulare Zellbiologie Abteilung Zellbiologie der Pflanze, Georg-August Universität Göttingen Dr. Elmar Herbig Sartorius Lab Instruments GmbH & Co. KG Göttingen