Teil I. Rekombinante Überexpression von Proteinen

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1 Teil I Rekombinante Überexpression von Proteinen

2 Definition Unter dem Begriff rekombinante Überexpression werden die molekularbiologischen/biochemischen Verfahren zusammengefasst, bei denen: Codierende Nukleinsäureabschnitte (i.d.r. native Gene) gentechnisch unter Kontrolle eines starken Promotors/Aktivators gestellt wurden (Rekombination) UND diese Expressionseinheit in einem zellulären System funktionell aktiviert wurde (Überexpression)

3 Rekombinante Proteinexpression Präparativ Analytisch Bakterielle Expressionssysteme Hefe-Expressionssysteme virusvermittelte Expression (in Insektenzellen) v.a. Expressionssysteme in Säugerzellen Expressionsanalyse (z.b. Immunotags) Reportergene und -proteine

4 Induzierbare Systeme in E. coli

5 Natürliches Induktionssystem: lac-operon Lactose Isopropyl β Dthiogalactopyranosid (IPTG)

6 lac-/t7-expressionssystem

7 Fusionsarten C-terminale Fusion: Promotor Fusion Rek. Protein N-terminale Fusion: Promotor Rek. Protein Fusion Duale Affinitätsfusion Promotor Fusion 1 Rek. Protein Fusion 2

8 ÜE als Fusionsproteine Verhinderung von proteolytischem Abbau von Fremdproteinen Verhinderung von Aggregation bei hydrophoben Proteinen Reinigung durch Affinitätschromatographie

9 ÜE als inclusion bodies Anwenbar wenn Renaturierung der Aggregate zu nativen Proteinen möglich ist Vorteile: hohe Konzentrationen des rekombinaten Proteins (bis zu 50% des Gesamtzellproteins) leichte Isolierung der inclusion bodies durch Zentrifugation (Dichte bis zu 1,3 g/l)

10 Sekretion bei Prokaryoten Pro Disulfidbrückenbildung bei Toxizität des rekombinaten Proteins es müssen weniger Wirtsproteine als bei cytosolischer Expression entfernt werden Contra Transport über Plasmamembran als limitierender Faktor nicht bei allen Proteinen möglich gram+ sezernieren eine Reihe von Proteasen ins Medium

11 Expression in Hefen Merkmale eines Expressionssystems höherer Eukaryoten einfache Kultivierung authentische eukaryotische Proteine (posttranslationale Modifikationen) Cytosolische oder sekretorische Expression z.b. methylotrophe Hefen wie Pichia pastoris gut reprimierbarer starker Promotor der Methanol Oxidase wird durch MetOH induziert

12 Intein Expressionssystem in Saccharomyces cervisiae

13 Häufige Probleme bei der ÜE Toxizität Proteolyse Codon Auswahl posttranslationale Modifikationen, die essentiell für die Proteinfunktion sind keine korrekte Disulfidbrückenbildung bei extrazellulären Proteinen Aggregation

14 Teil III Proteincharakterisierung MALDI/ESI Massenspektroskopie UV/Vis Spektroskopie CD Spektroskopie N-terminale Sequenzierung

15 Massenspektrometrie Voraussetzungen: Moleküle müssen ionisiert vorliegen Moleküle müssen in die gas-/plasmaförmige Phase überführt werden Diese Molekülionen können im Hochvakuum in einem elektromagnetischen Feld beschleunigt und abgelenkt werden, abhängig von: MASSE kinetischer Energie Ladung der Molekülionen

16 Bestimmung von m/z a) Ablenkung im elektromagnetischen Feld b) Messung der Flugzeit time of flight (TOF) 1) Ionenquelle; 2) Hochspannungs-Beschleunigungssystem; 3)Ablenkund Fokussierungseinrichtung; 4) Detektor; 5) Ionenstrahl

17 ESI-MS = electrospray ionization sanfte Ionisierungsmethode positive [M+H] + und negative [M-H] - Ionisierung einfach und mehrfach geladene Ionen: [M+H] +, [M+H] 2+,..., [M+nH] n+

18 MALDI-TOF MS = matrix assisted laser-desorption ionization sanfte Ionisierungsmethode positive [M+H] + Ionisierung einfach und mehrfach geladene Ionen: [M+H] +, [M+H] 2+,..., [M+nH] n+

19 Massenspektrum von S100A2

20 Chromophore in Proteinen UV-Spektren aromatischer Aminosäuren b) a) a) Hbsu wt (kein Trp); b)hbsu [F79W]

21 Cofaktoren als Chromophore Absorptionsspektren von Hämoglobin Derivaten: a) Soret Bereich; b) Bereich der Q-Bande Oxyhämoglobin CO-Hämoglobin Desoxyhämoglobin

22 CD (Circular-Dichroismus) Vektorielle Überlagerung zweier phasengleicher Wellenzüge gleicher Wellenlänge und Amplitude, deren Polarisationsebenen senkrecht aufeineander stehen linear polarisierte Welle, deren Polarisationsebene um 45 geneigt ist Vektorielle Überlagerung zweier Wellenzüge gleicher Wellenlänge und Amplitude, deren Polarisationsebenen senkrecht aufeineander stehen. Die beiden interferierenden Wellenzüge sind um 90 gegeneinander verschoben circular polarisierte Welle

23 CD (Circular-Dichroismus) Vektorielle Überlagerung zweier phasengleicher Wellenzüge gleicher Wellenlänge aber unterschiedlicher Amplitude, deren Polarisationsebenen senkrecht aufeineander stehen linear polarisierte Welle, deren Polarisationsebene = 45 geneigt ist Vektorielle Überlagerung zweier Wellenzüge gleicher Wellenlänge aber unterschiedlicher Amplitude, deren Polarisationsebenen senkrecht aufeineander stehen. Die beiden interferierenden Wellenzüge sind um 90 gegeneinander verschoben elliptisch polarisierte Welle

24 CD-Messung Drehung der Polarisationsebene von linear polarisiertem Licht durch eine optisch aktive Substanz um den Winkel α optische Rotationsdispersion (ORD) Überlagerung von zwei circular polarisierten Wellenzügen mit unterschiedlich großen Amplituden E L und E R zu elliptisch polarisiertem Licht Circulardichroitische Absorption: A=A R -A L Elliptizität Θ =K*1000* A K=ln10*180/4π=32,980

25 Beispiele von CD-Spektren specific ellipticity / deg*cm 2 *dmol S100A2 3 apo S100A2 3 apo + Ca 2+ Poly-L-Lysin unter verschiedenen Bedingungen Wavelength / nm In der Ca 2+ -gebundenen Form erhöht sich der α-helicale Anteil von S100A2 3

26 N-terminale Sequenzierung CCC: coupling cleavage conversion

27 Beispiel einer Sequenzierung Abnahme der Ausbeuten an PTH-AS AS/Prozess Beispielpeptid: DTAEL RRRRV EVSVE b) Standard PTH-AS c) 1. Abbauzyklus d) 5. Abbauzyklus e) 13. Abbauzyklus

28 Automatisierte Sequenzierung Spaltung eines Peptids durch Endopeptidasen (in Lösung) oder chemische Spaltung (immobilisiert) Gas-Flüssigphasen- Sequenzierung

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