unter Berücksichtigung des Photobleachings und Fluoreszenzquenchings

Transkript

1 Untrsuchung dr Bindungsintin von rominantm, humanm nochnmorphogntischn Protin mit Hilf dr totaln innrn Rflxionsfluorsznzsptrosopi untr Brücsichtigung ds Photolachings und Fluorsznzqunchings Dissrtation zur Erlangung ds aadmischn Grads doctorum rrum naturalium Dr. rr. nat. vorglgt von Dipl.-Chm. Michal Mißnr aus Orhausn (Rhinland) Institut für Physiologisch Chmi dr Univrsität Duisurg-Essn Univrsitätslinium Essn 2014

2 1 Di vorlignd Arit wurd im Zitraum von Januar 2009 is Juni 2014 im Aritsris von Prof. Dr. H. P. Jnnissn am Institut für Physiologisch Chmi dr Univrsität Duisurg- Essn angfrtigt. Tag dr Disputation: Gutachtr: Prof. Dr. H. P. Jnnissn Prof. Dr.. Barciowsi Vorsitzndr: Prof. Dr. G. Harhaur

3 Dis Arit ist gwidmt minr Tochtr Elija sono ancora confuso. Ma su livllo più lvato Enrico Frmi

4 1 Einlitung Grundlagn Protin Knochnmorphogntisch Protin (BMP) Fluorsznz Intrinsisch und xtrinsisch Fluorophor in Protinn Fluorsznzignschaftn von rhbmp Photolaching von Protinn (photochmisch Zrstörung) Fluorsznzqunching (Fluorsznzauslöschung) Totalrflxion und vansznt Wll Vrwndung dr vanszntn Wll zur Anrgung Brchnung dr Orflächnonzntration an Grnzflächn i TIRF-Exprimntn Massntransport Adsorption, Adsorptionshystrs und Glichgwichtszuständ Adsorptionsisothrmn Langmuir-Isothrmn Frundlich-Isothrmn Tmin-Isothrmn Witr Isothrmn Gittrstlln- und Ligandnindungsfuntionn - Kooprativität i Adsorptionn Das Corsl-Modll für di Protinadsorption Ausildung und Wirung inr anoschicht Randwinl Matrial, Grät und Mthodn Chmialin und Ragnzin Grät Mthodn Das TIRF-Rhomtr Rinigung dr Mßzll Hrstllung dr Puffrlösungn Rinigung und Funtionalisirung dr Quarzglasplattn Rinigung dr Quarzglasplattn mit Chromschwflsäur Bhandlung dr Quarzglasplattn mit thanolischr Kaliumhydroxidlösung.. 54

5 Bhandlung dr Quarzglasplattn mit (3-Aminopropyl)-trithoxysilan und mit Trichlorhxylsilan Bschichtung dr Quarzglasplattn mit Poly-DL-latid durch pincoating Aufau von wchslndn chichtn aus Polyglutamat und Poly-L-lysin Analytisch Mthodn Randwinlmssungn Bstimmung dr Extintionsoffizintn von 5-Hydroxy-L-tryptophan und rhbmp-2 sowi dr Gsamtfluorsznz von 5-Hydroxy-L-tryptophan Bstimmung ds Protinghalts in Lösungn nach Lowry Quantifizirung von rhbmp-2 mittls Radioiodmthod Rominants humans nochnmorphogntischs Protin (rhbmp-2) Vrwndt Orflächn Mssung von Anunfts-, Adsorptions- und Dsorptionsintin Vorritung dr Mßzll Allgmin Bdingungn zur Einstllung ds TIRF-Rhomtrarrangmnts und allgmin Vrfahrnswisn Mssung von Anunftsintin von 5-Hydroxy-L-tryptophan in dr TIRF-Mßzll Durchführung von Adsorptionn Durchführung von Dsorptionn Buffrflush Untrsuchung dr Fluorznz von adsorirtm rhbmp-2 nach inr Vrwildaur von 47 tundn auf dr Orfläch Photolachxprimnt Adsorption von radioativ marirtm rhbmp-2 am TIRF-Rhomtr zur Bstimmung dr Qunchfatorn Dsorption von radioativ marirtm rhbmp Rchnprogramm und statistisch Bhandlung dr Mßdatn Ergniss Anunftsintin Anunftsintin von 5-Hydroxy-L-tryptophan Bstimmung ds Initialpunts von Anunfts- und Adsorptionsintin Transportlimitirt Adsorption von rhbmp-2 an Quarzglas Adsorption von Protinn an untrschidlichn Orflächn Adsorption von rhbmp-2 an nativm Quarzglas Adsorption von rhbmp-2 an (3-Aminopropyl)-trithoxysilan (AP) Adsorption von rhbmp-2 an Trichlorhxylsilan (TH).. 85

6 4.2.4 Adsorption von rhbmp-2 an Poly-DL-latid (PDLLA) Adsorption von rhbmp-2 an Polyltrolytmultilayrn (PEMs) sthnd aus wchslndn chichtn von Polyglutamat (PGA) und Poly-L-lysin (PLL) Zusammnfassnd Ürsicht zu dn Adsorptionsxprimntn Photolaching und Fluorsznzqunching Photolaching von rhbmp-2 i Adsorptionn Orr und untrr Grnzrich ds Photolachings i Adsorptionn Fluorsznzqunching von rhbmp-2 i Adsorptionn Fluorznzvrhaltn von adsorirtm rhbmp-2 nach inr Vrwildaur von 47 tundn Untrsuchung dr Fluorsznz i Dsorptionn mit untrschidlichn Blichtungsratn und Kontrollxprimnt Brchnung dr Orflächnonzntration von rhbmp-2 aus dr Fluorsznz Brchnung ds vanszntn Antils dr Bulphasnfluorsznz von rhbmp-2-lösungn mit dm Buffrflush nach Hlady Brchnung ds vanszntn Antils dr Bulphasnfluorsznz von rhbmp-2-lösungn mit dr Kruzmthod (ohn Buffrflush) Vrglich von Adsorptionsintin nach Umrchnung dr Fluorsznzn in di Orflächnonzntrationn nach Hlady (Buffrflush) und nach dr Kruzmthod Einfluß ds vanszntn Antils dr Bulphasnfluorsznz aus vrschidnn Brchnungsmthodn auf di intischn Größn Bstimmung dr intischn Konstantn für di Adsorption von rhbmp-2 an ultrahydrophilm Quarzglas und an hydrophom PDLLA Bstimmung dr Bindungsonstantn für di Adsorption von rhbmp-2 an ultrahydrophilm Quarzglas Adsorption von rhbmp-2 an ultrahydrophilm Quarzglas Adsorptionsisothrmn für di Adsorption von rhbmp-2 an ultrahydrophilm Quarzglas Fluorsznzvrlust i dr Dsorption von rhbmp-2 in Ahängigit von dr Inuationsdaur Fluorsznzvrlust i dr Dsorption von rhbmp-2 in Ahängigit vom Elutionspuffr Bstimmung dr Bindungsonstantn für di Adsorption von rhbmp-2 an hydrophom PDLLA Adsorption von rhbmp-2 an hydrophom PDLLA Isohrm für di apparnt Adsorption von rhbmp-2 an hydrophom PDLLA am TIRF-Rhomtr Fluorsznzvrlust i dr apparntn Dsorption ds rhbmp-2 von hydrophom PDLLA 137

7 5 Disussion Ausildung von anoschichtn an vrschidnn Orflächn und xponntill vrlaufnd Adsorptionn Bstimmung ds Initialpunts i Adsorptionsintin Photolaching von rhbmp-2 i Adsorptionn Fluorsznzqunching von rhbmp-2 i Adsorptionn Einfluß ds UV-Lichts i Dsorptionn Vrglich von Adsorptionsintin für di Bindung von rhbmp-2 an Orflächn mit untrschidlichr Hydrophili Brchnung dr Orflächnonzntration von rhbmp Bindungsmodll für di Adsorption von rhbmp-2 an Quarzglas und PDLLA Bindungsmodll für di Adsorption von rhbmp-2 an ultrahydrophilm Quarzglas Bindungsmodll für di Adsorption von rhbmp-2 an hydrophom PDLLA Vrglich dr Bindungsonstantn von rhbmp-2 an Quarzglas und PDLLA mit Bindungsonstantn andrr Protin Vrglich von Adsorptionsstudin zwischn TIRF- und PR-ptrosopi Zusammnfassung Litratur Anhang Aürzungn Allgmin Aürzungn Formlzichn Puliationn Lnslauf Erlärung Dansagung

8 1 1 Einlitung In dr Mdizin findn Implantat in witrichnd Anwndung. Dai rstzn si in dr Rgl infach mchanisch und physialisch Aufgan [1], wlch dr Organismus wgn ins singulärn Dfts im Gw odr inr chronischn Erranung nicht mhr listn ann. Implantat müssn vil Vorausstzungn wi z. B. mchanisch und frtigungstchnisch Erfordrniss rfülln und ioompatil sin [2]. Di Bioompatiilität ist von ntschidndr Bdutung, da im Einringn ins Implantats in dn Organismus als rst Ration in Adsorption von Protinn an dr Implantatorfläch stattfindt [3-5] und hir di Vorntschidung fällt, o das Implantat ioompatil ist [6]. Aus dism Grund ist di Hrstllung von Orflächn, auf dr nur in odr wnig ausgsucht Protin mit gziltr Wirungswis gundn sind, damit in Lnung dr Gwration in Richtung ltivität und pzifität möglich wird, von großr Bdutung [7]. Implantat wrdn schichtt, um si als Drug Dlivry ystm, i dm Mdiamnt ür inn dfinirtn Zitraum frigstzt wrdn [2], zu vrwndn odr um in gzilts Wachstum von Gw auf dr Implantatorfläch zu induzirn. Di Knntnis ür di Vorgäng i dr Adsorption von Protinn an Orflächn und das Wissn ür Konformationsändrungn dr adsoirtn Protin sowi ihrr Affinitätn tragn zum Vrständnis i dr Ration von Zlln an in dn Körpr ingracht Implantat i. Bi hochaffinn Grnzflächn und i dr Adsorption von großn Molüln führt di Transportlimitirung dazu, daß di gmssnn Adsorptionsintin und di daraus rchntn Bindungsonstantn vrfälscht wrdn. Durch di Transportlimitirung wird zunächst nur dr Diffusionsvorgang gmssn und nicht di igntlich Adsorption. Für di Untrsuchung dr Adsorption von Protinn an Orflächn stht in Vilzahl von Mthodn [8,9], wi z. B. di Quarzristallmirowaag (Quartz Crystal Microalanc, QCM) [10], di Ellipsomtri [113], di agschwächt Totalrflxion (Attnuatd Total Rflction Infrard pctroscopy, ATR) [14], di Orflächnplasmonrsonanz (PR) [159] odr di Total Innr Rflxionsfluorsznzsptrosopi (TIRF) [20-22] zur Vrfügung. Bi disn Mßmthodn vrlaufn di transportlimitirtn Adsorptionn ür mhrr Minutn is hin zu tundn, sih z. B. [23-29]. Wgn dr Transportlimitirung vrlaufn di Kintin am Anfang linar und önnn dshal nicht an xponntill Funtionn angpaßt wrdn. Entsprchnd sind di Adsorptionsisothrmn aus Adsorptionsxprimntn mit dn o. a. Mthodn nur ingschränt für di Ermittlung dr Bindungsonstantn zu grauchn. Morton und Mysza ntwicltn für di PR in Gloal Fit [18,30], daß di Anpassung von transportlimitirtn Adsorptionsintin rmöglicht. Lin und Hlady [31] ntwicltn in Computrprogramm, das di Brchnung dr

9 2 Gschwindigitsonstantn aus transportlimitirtn Adsorptionsintin durch di Vrwndung von xprimntll stimmarn Paramtrn rmöglicht. Da di Bstimmung inigr Paramtr, wi z. B. di Intrationsonstantn [4,32,33], di Diffusionsoffizintn und di Dic dr rnstschn Diffusionsschicht [34] rcht mühslig ist, lag s nah, di Transportlimitirung zu influssn. Bi dr PR wird vrsucht, di Transportlimitirung durch di Optimirung dr Zllgomtri [35,36], di Erhöhung ds Volumnstroms [37,38] und di Vrringrung dr Konzntration dr Azptormolül auf dr Orfläch [39] zu rduzirn. Ein andrr Ansatz ght von dr Rdution dr rnstschn Diffusionsschicht aus. Di Rdution dr rnstschn Diffusionschicht durch di Erhöhung dr chrrat [34] wurd von andrs und Jnnissn am TIRF-Rhomtr untrsucht und führt zu inr Vrürzung dr Adsorptionsintin [21]. Zumrin und Jnnissn [40,41] rrichtn rstmals im Jahr 1998, nfalls am TIRF-Rhomtr, di Rdution dr rnstschn Diffusionsschicht von 10 µm auf 200 is 300 nm, indm si di Protinlösung mit inr voranghndn Luftlas in di Mßzll inglitt han. Dis führt zu inr drastischn Vrürzung dr Adsorptionsintin um dn Fator 10. Di Adsorptionn warn nach höchstns 50 s agschlossn und zigtn inn transportlimitirtn Antil. Dadurch onntn di rhaltnn Adsorptionsintin an xponntill Funtionn angpaßt wrdn, so daß rstmals di Bindungsonstantn für di initialn ulations-komplx stimmt wrdn onntn [22,40,42]. Bi Vorlign inr Transportlimitirung sind di Adsorptionsgschwindigitsonstantn von ulations- Komplxn nicht zugänglich, da durch di ingschränt Diffusion, di adsorirtn Protinmolül sofort di Anzahl dr Bindungn zur Orfläch rhöhn. Da i dr PR di Adsorptionsxprimnt agrochn wrdn, vor di maximal Orflächnonzntration rricht wird [18,19,43], önnn mit disr Mthod in Informationn ür nidraffin ulations-komplx rhaltn wrdn. Da drzit Implantat, di mit rhbmp-2 (rominants humans nochnmorphogntischs Protin) schichtt sind, zunhmnd rforscht wrdn, soll diss Protin hinsichtlich sins Vrhaltns auf Orflächn untrsucht wrdn. Es solln Ernntniss ür Konformationsändrungn auf dr Orfläch gwonnn wrdn. Für di Untrsuchungn wurd in TIRF- Rhomtr [22,40-42] vrwndt, i dm Quarzglas als Modllorfläch vrwndt wurd, da s aufgrund sinr optischn Eignschaftn für di TIRF-ptrosopi gignt ist [44]. Da di Boachtung dr Kintin ür di Mssung dr mit ultraviolttm Licht (UV) zur Fluorsznz angrgtn rhbmp-2-molül rfolgt, ann di gmssn Fluorsznz durch Photolaching und Fluorsznzqunching vrfälscht wrdn [45]. Aus dism Grund wurd dr Einfluß idr Fatorn untrsucht. Bi dr Brchnung dr Orflächnonzntrationn aus

10 3 dr Fluorsznz ist di Fluorsznz dr glöstn Protinmolül rfordrlich, wlch nur i hohn Konzntrationn ür inn Buffrflush zugänglich ist [20]. Bim Protin rhbmp-2 onnt wgn sinr gringn Löslichit dr Buffrflush nur i inr Konzntration durchgführt wrdn. Dshal wurd in Mthod ntwiclt, di inn Buffrlush mhr rfordrt. 2 Grundlagn 2.1 Protin Dr Bgriff Protin wurd rstmals von Brzlius im Jahr 1838 ingführt [46] und fand im Jahr 1840 dn Zugang in di Litratur [47]. In dr DA (Dsoxyrionulinsäur) ds Gnoms ist di Information ür dn Aufau dr Protin fstglgt. Man untrtilt di Protin nach ihrm Vorommn in dri Gruppn in, nämlich in wassrlöslich Protin (Vorommn z. B. in Cytoplasma), in Mmranprotin (Vorommn z. B. in Mmrann von Zlln und Mitochondrin) und in wassrunlöslich truturprotin (Vorommn z. B. in Haarn, Fdrn u.s.w.) [48]. Dr hirarchisch Aufau dr Protin wurd rstmals 1952 von Lindrstrøm-Lang vorgschlagn; r spannt sich in vir Enn auf, di Primär-, undär-, Trtiär- und Quartiärstrutur hißn [49]. Di Kondnsation von Aminosäurn führt zu Pptidn. Di Anordnung dr Aminosäurn im Pptid, als Aminosäursqunz zichnt, ildt di Primärstrutur. Durch di Pptidindungn dingt, rgn sich Wassrstoffrücnindungn zwischn dm Caronylohlnstoff und dm Wassrstoff nichtvicinalr Aminogruppn, so daß Til zwir paralll ligndr Pptidttn z. B. in in in sog. β-faltlattstrutur, häufigr ar noch in in schraunförmig trutur, dr α-hlix, gzwungn wrdn und als undärstrutur zichnt wrdn. Di trutur di sich ür di gsamt Pptidtt rtrct, ist di Trtiärstrutur und ann z. B. di Form ins Knäuls annhmn. Innrhal ins Protins önnn mhrr Trtiärstruturn zu inr Quartiärstrutur zusammnfindn. Ändrungn dr truturn wurdn von Anfinsn als Konformationsändrungn rannt [50,51]. Das größt ishr annt Protin, Titin, stht aus Aminosäurn [52]. Häufig wrdn rominant Protin ingstzt, wi z. B. in dr Mdizin das Insulin i dr Indiation von Diats [53]. Das Gn für in rominants Protin wird in inn Vtor lonirt und in inm Modllorganismus zu dm trffndn Protin xprimirt. Di Vrfahrnswis rlaut di Hrstllung großr Protinmngn [54]. In dr vorligndn Arit wurd das rominant human nochnmorphogntisch Protin (rhbmp-2) vrwndt.

11 4 2.2 Knochnmorphogntisch Protin (BMP) Erstmals wurd di Indution von Knochnnuildung im Jahr 1965 von Urist [55] nachgwisn. Zuvor gan schon Moss [56], Goldhar [57], axn und Taivonn [58] Hinwis auf di Bildung von Knochngw, di durch htrogn, diffundirar Fatorn stimmt wird. Wnig Jahr nach Urists Vröffntlichung onntn r und sin Mitaritr di rnut Indution ndochondrialr Ostogns, als Eignschaft inr dminralisirtn Knochnmatrix, auf inn Glycoprotinomplx zurücführn, dn si als nochnmorphogntischs Protin (on morphogntic protin, BMP) zichntn. BMPs sind nochninduzirnd Wachstumsfatorn dr TGF-β-uprfamili (Transforming Growth Factor-β) [59], wlch chlüsslfuntionn wi Chmotaxis, Mitos odr Diffrnzirung in Zlln ausün [60]. Di TGF-β-uprfamili stllt in Grupp multifuntionllr Mdiatorn dar, di maßglich an dr Kontroll dr Diffrnzirung und Prolifration dr Zlln tiligt sind [61]. Mitglidr disr mhr als 35 Protin umfassndn [62] uprfamili wurdn in viln tirischn pzis wi Mäusn, Zras, Fischn und Xnopus und auch in pzis wi Drosophila und Canorhaditis lgans idntifizirt [63-66]. Erst zwi Jahrzhnt nach Urists Pioniraritn onntn inzln Protinomponntn aus Komplxn isolirt wrdn [67-69], von wlchn di rstn dri als BMP, BMP-2A und BMP-3 zichnt wurdn [59,70]. Zur BMP-Famili ghörn nochnmorphogntisch Protin, ostogn Protin (ostognic protins, OP), norplmorphogntisch Protin (cartilag-drivd morphogntic protins, CDMP), Wachstums- und Diffrnzirungsfatorn (growth and diffrntiation factors, GDF), BMP-Homolog wi Dcapntaplgic (DPP) aus Drosophila (Tauflign) und glass ottom oat (GBB) aus Xnopus (afrianisch Krallnfrösch) [71,72]. Dn BMP-Molüln wurd ürdis in wichtig Roll in dr Bstimmung dr Entwiclung dr Msnchymzlln zugschrin [73]. o stimulirn si inrsits durch di Ostolastn di Diffrnzirung und andrrsits inhiirn si di Diffrnzirung dr Myolastn. BMP und auch andr TGF-β-Protin wrdn nicht nur im ltt sondrn auch im Wichgw xprimirt [74]. In A. 1 ist in phylogntischr Baum dr TGF-β-homologn Cytoin (Homo apins) dargstllt, wlchr ür di Aminosäurausrichtung onstruirt wurd [62]. Di BMPs rpräsntirn hirin ür in Drittl disr TGF-β-uprfamili und ildn damit di größt Untrgrupp. GDF1-3 und 5 sind am ngstn mit dn BMPs vrwandt und spigln widr, daß di physiologischn Funtionn nicht nur auf di Knochnildung schränt sind, sondrn auch auf di Prolifration und Diffrntiation in untrschidlichn Gwn. Ein witr Untrgrupp ildn di transformirndn Wachstumsfatorn TGF-β1 is 3, wlch wahrschinlich aus inm infachn Vorläufr gildt wrdn. Ein dritt Untrgrupp wird aus β-inhiinn

12 5 gildt. Entfrntr vrwandt pptidähnlich α-inhiinttn, wi das Anti-Müllr-Hormon (AMH) [75] und das LEFTY A und B [76], ildn in virt Untrgrupp. Di qunzähnlichit dr TGF-β-Protin im Vrglich zu BMP-2 ist in Klammrn hintangstllt. A. 1. Dndrogramm dr TGF-β-homologn Cytoin (Homo sapins). Di Längn dr horizontaln Linin ntsprchn dr Anzahl dr volutionärn Untrschid zwischn Protinn odr Protingruppn, aglitt von dr qunzhomologi. Di BMP-Grupp (rot) ntspricht ca. inm Drittl dr TGF-β-uprfamili und ildt somit di größt Untrgrupp. GDF1-3 und 5 sind nah dn BMP-Protinn angsidlt. Das spiglt dn Bfund widr, daß di physiologischn Funtionn dr BMP-Protin sich nicht nur auf di Knochnntwiclung rduzirn, sondrn auch di Zllprolifration und Zlldiffrnzirung mit inschlißn. (Aildung aus [62]). Für di Exprimnt wurd iologisch ativs rominants humans nochnmorphogntischs Protin-2 (rhbmp-2) ingstzt, dssn ynths s Wang rstmals aus chinsischn Hamstrovarialzlln glang [77]. pätr rfolgt di ynths ds nativn Protins mittls ds Baculovirus/f-9-Instnsystms durch Maruoa [78]. Im E. coli-ystm wurd rhbmp-2 von Rupprt [79] und von Jnnissn präparirt [80]. Aus wirtschaftlichn Erwägungn hat rhbmp-2 dn Vorzug ggnür dm aus dr Knochnmatrix gwonnnn phbmp-2 (p stht für purifid) im Einsatz in Klinin ommn. Chng [81] vrglich 14 human BMPs (BMP-2 is 15) und fand, daß BMP-2, BMP-6 und BMP-9 das höchst ostoindutiv Potntial aufwisn und

13 6 darür hinaus als inzig di Diffrnzirung von pluripotntn msnchymaln Vorläufrzlln dr Maus (C3H10T1/2) zu Ostolastn wirn. Exprimnt in Rattn, Hundn, Kaninchn und Affn han gzigt, daß in Artnspzifität vorligt [66,82,83]. BMP-2 wird gwöhnlich in dr Thrapi von Knochndftn in inm Vrsorgungssystm zusammn mit inm Implantat ingstzt. Dai wird s ispilswis an vrschidnn Kollagnformn [84-86], Hydroxylapatit [87,88], iphasischm Calciumphosphat [89], Tricalciumphosphat [90], Poly-DL-latid [91] odr an andrn Matrialin [92-94] adsorirt. Witrhin wird BMP-2 auf ultrahydrophiln Titanimplantatn und andrn Mtalln gundn [95,96]. Das rhbmp-2-monomr sitzt in anannförmigs Ausshn. Ein it ds Molüls ist onav, währnd di andr onvx ist. Bid Endn sitzn jwils inn hornähnlichn Vorsprung, dr ntlang dr Längsachs um 180 ggninandr vrdrht ist [62], sih A. 2 A. Das Monomr stht aus 114 Aminosäurn [79] und sitzt als Dimr in Molmass von twa 25,8 Kilodalton (Da) [59]. A. 2. Darstllung ins rhbmp-2-dimrs. A: Antihlial Furch (rotr chlauch) auf dr onavn it ins 3D-Rapid Prototyping Modlls von BMP-2. (Aildung aus [62]). B: Vrtilung hydrophilr (wiß) und hydrophor Aral (lau) auf dr Orfläch ins BMP-2- Molüls. Dr Astand dr Gittrlinin ntspricht 0,5 nm. (Aildung aus [95]). In A. 2 B ist di Orflächnstrutur ins rhbmp-2-dimrs agildt. Di hydrophiln Aral ds BMP-2-Dimrs sind wiß und di hydrophon Aral sind lau dargstllt [95]. rhbmp-2 sitzt inn isoltrischn Punt von IEP = 8,2 ± 0, 4 [97]. 2.3 Fluorsznz Di rstn, di das Phänomn oachttn, ohn ar slst dn Bgriff dr Fluorsznz zu nnn, warn Monards und Grimaldi in dn Jahrn 1575 und 1665 [98]. Umfangrich wurd di Fluorsznz im Jahr 1951 von to [99] schrin. Bi dr Anrgung von Molüln wrdn Photonn vom Grundzustand in höhr chwingungszuständ vrstzt. Jdr chwingungszustand stht aus mhrrn chwingungsnivaus. Dm drart angrgtn Molül

14 7 sthn mhrr Wg offn, in dn Grundzustand zu glangn. Dis Wg wurdn von Jałońsi [100] in inm Diagramm anschaulich zusammngfaßt. A. 3. Jałońsi-Diagramm zur Darstllung von trahlungsürgängn. Agildt sind ingulttzuständ ( 0 is 2 ) und Triplttzuständ (T 1 und T 2 ) mit ihrn chwingungsnivaus. A: Anrgung, IC: Intrnal Convrsion, IC: Intrsystm Crossing, VR: trahlungslos Ürgäng, F: Fluorsznz und P: Phosporsznz. (Aildung aus [101]). In A. 3 ist das lassisch Jałońsi-Diagramm dargstllt, anhand dssn di möglichn Wg ins Photons nachgzichnt wrdn solln. Zunächst wird in Photon vom ingultt- Grundzustand ( 0 ) in inn angrgtn ingulttzustand ( 1, 2 u.s.w.) promovirt (A). Von dort ann s in dn Grundzustand untr Astrahlung von Fluorsznz (F) zurücfalln. Di Lnsdaur ds angrgtn Zustands daurt twa 10 ns [102], ann ar, z. B. im Tryptophan, um dn Fator 100 variirn, da si star von dr Umgung influßt wird [103]. Das mittirt Fluorsznzlicht ist athochrom. Witrhin ann s strahlungsfri vom nidrigstn chwingungsnivau ins angrgtn ingulttzustands in das höchst chwingungsnivau ins nrgtisch nidrigr ligndn ingulttzustands odr in das höchst chwingungsnivau ds Grundzustands zurücfalln. Di Enrgi wird dai als Wärm zw. chwingungsnrgi in twa 1 fs aggn. Dr strahlungsfri Ürgang wird als Intrnal Convrsion (IC) zichnt [102]. Von inm chwingungsnivau ins angrgtn ingulttzustands ann das Photon untr pinumhr (Intrsystm Crossing, IC) in inn Triplttzustand (T 1, T 2 u.s.w.) glangn. Von dort ann das Photon in das untrst chwingungnivau ins Triplttzustands glangn, von dm aus s in dn Grundzustand untr Aga von Phosphorsznzlicht (P) zurücfällt. Das Phosphorsznzlicht ist noch witr in Richtung langwllign Lichts vrschon als das Fluorsznzlicht. Phosphorsznzprozss önnn is zu mhrrn tundn daurn. Vom Triplttzustand ann das Photon rnut in pinumhr

15 8 rfahrn, so daß s strahlungslos in dn Grundzustand zurücfällt. Innrhal ins ingultt- odr Triplttzustands ann das Photon strahlungsfri von höhr in nidrigr chwingungszuständ falln (VR) Intrinsisch und xtrinsisch Fluorophor in Protinn J nach Anrgungswllnläng, önnn innrhal ins Molüls nur stimmt Til angrgt wrdn, z. B. in Protinn di aromatischn ystm odr das Cystin. Intrinsisch Fluorophor stlln häufig natürlich Bstandtil von Protinn dar. olch Fluorophor sind Tryptophan, Tyrosin, Phnyalanin und Cystin [102,104,105]. In dr folgndn Tall sind inig wichtig sptrosopisch Eignschaftn disr Fluorophor zusammngstllt. Di Angan gltn für Wassr als Lösungsmittl i ph = 7,0 [103]. Ta. 1. ptrosopisch Eignschaftn intrinsischr Fluorophor [103]. Chromophor Anrgung max max λ ε x max λ m F Fluorsznz Tryptophan 280 nm 5600 M cm 348 nm 0,20 2,6 ns Tyrosin 274 nm 1400 M cm 303 nm 0,14 3,6 ns Phnylalanin 257 nm 200 M cm 282 nm 0,04 6,4 ns max λ x Cystin 280 nm* 120 M cm * in Angan in dr Litratur : Asorptionsmaximum, ε max : Extintionsoffizint, Φ τ F max λ m : Emissionsmaxi- : Rlaxationsdaur. * Kin mum, Φ F : Quantnausut dr Fluorsznz und τ F Anrgungsmaximum, ε gilt für λ = 280 nm. Angan für Cystin sih [106]. x Aus Ta. 1 ist rsichtlich, daß di Fluorsznzquantnausut Φ F vom Tryptophan zum Phnylalanin dutlich animmt, wswgn man i Fluorsznzmssungn von Protinn mistns di Anrgungswllnläng ds Tryptophanmolüls vrwndt. Di Fluorsznzquantnausut ist in Funtion dr Prozss, di di Entvölrung ds angrgtn Zustands wirn. olch Prozss sind spontan Emission, Qunching (Auslöschung) und Prädissoziation [107]. Da di Fluorsznz ahängig vom ph-wrt, Analytonzntration, Lösungsmittl und vicinaln Gruppn ist, ann man ür di Vrändrung dr intrinsischn Fluorsznz Informationn ür Konformationsändrungn von Protinn gwinnn [106]. Um Fluorsznzmssungn mit höhrn Fluorsznzquantnausutn und damit höhrn achwisgrnzn durchzuführn, ann man in Protin durch chmisch Ration Fluorophor inführn. In solchn Fälln lign xtrinsisch Fluorophor vor [102]. Durch solch Ratio-

16 9 nn önnn ar di Adsorptionsignschaftn von Protinn ggnür dnn unmodifizirtr Protin vrändrt wrdn [103]. Ta. 2. ptrosopisch Eignschaftn xtrinsischr Fluorophor [103].* Chromophor Anrgung max max λ ε x max m Fluorsznz λ Φ F τ F Ethidiniumromid 515 nm 3800 M cm 600 nm 1,00 26,5 ns 1-Anilinonaphthalin- 8-sulfonat 374 nm 6800 M cm 454 nm 0,98 16 ns Fluorscinthiocyanat 495 nm M cm 519 nm 0,30 4 ns * Zur Erläutrung dr ymol, sih Lgnd zur Ta. 1. Aus Ta. 2 ist zu rshn, daß di Fluorsznzquantnausut durch di Einführung xtrinsischr Fluorophor dutlich rhöht wird Fluorsznzignschaftn von rhbmp-2 Wi in Kap. 2.2 rwähnt, stht das rhbmp-2-monomr aus 114 Aminosäurn. Das Dimr sitzt 4 Tryptophanmolül, 10 Tyrosinmolül, 6 Phnylalaninmolül, 2 Cystinmolül und 6 Cystinrücn (Disulfidrücn) [108], di mit ultraviolttm (UV) Licht dr Wllnläng λ = 285 nm zur Fluorsznz angrgt wrdn önnn. Allrdings wird i x disr Wllnläng im Phnylalanin nur in shr gring Fluorsznz rzugt. lst im Anrgungsmaximum von λ = 257nm sitzt Phnylalanin in shr gring Quantnausut x (sih Ta. 1). In [106] sind für di o. a. Fluorophor di Extintionsoffizintn für in Anrgungswllnläng von x λ = 280 nm anggn. ach [106] stzt sich dr Extintionsoffizint ins Molüls aus dn Extintionsoffizintn dr inzlnn Molülstandtil additiv zusammn. Mit dm Lamrt-Br Gstz önnn i Knntnis dr stöchiomtrischn Antil dr Chromophorn im Protin sog. Asorptionsäquivalnt rchnt wrdn. Ein Asorptionsäquivalnt ist di Anzahl von Tyrosin- odr Cystinmolüln, di disl Asorption wi in Tryptophanmolül sitzt. Dmnach asorirn 4,445 Tyrosinmolül zw. 47,417 Cystinrücn disl Lichtmng wi in Tryptophanmolül. Entsprchnd nhmn 10 Tyrosinmolül das 2,250-fach und 6 Cystinrücn das 0,127-fach ds Anrgungslichts ins Tryptophanmolüls auf, so daß in rhbmp-2-dimr zusätzlich das Anrgungslicht von 2,377 Tryptophanmolüln aufnimmt.

17 Photolaching von Protinn (photochmisch Zrstörung) Bi Fluorsznzmssungn, inssondr wnn si ür in längr Zit durchgführt wrdn, tritt als unrwünschtr nfft das Photolaching auf, das zu inm Asinn dr Fluorsznz führt [109,110]. Für optimirt Fluorophor wurdn 10 5 is 10 6 Fluorsznzzyln (Anrgung und Emission) agschätzt [111,112], vor si irrvrsil photochmisch zrstört wrdn [113]. Bi dr FRAP-Mthod (Fluorscnc Rcovry Aftr Photo Blaching) [114,115] ist das Photolaching gwollt, im Ggnsatz zu dn in dr vorligndn Arit durchgführtn Fluorsznzmssungn am TIRF-Rhomtr. Für di Bindungsstudin ds Protins rhbmp-2, wurd UV-Licht dr Wllnläng λ = 280 nm ingstzt. Bi disr Wllnläng ntsthn rativ aurstoffspzis (RO) [116]. Zu dn RO ghörn z. B. nn dm ingulttsaurstoff und ticstoffmonoxid di Hydroxyl-, Prhydroxyl- und Aloxylradial [117,118], wlch Oxidationn hrvorrufn. Bsondrs mpfindlich ggnür Oxidationn ist das Tryptophanmolül [119]. Radial önnn ar auch zur Qurvrntzung und zur paltung von Pptidttn führn [120]. Man untrschidt zwi Artn von Blachprozssn, dm irrvrsiln und rvrsiln Photolaching. Bim irrvrsiln Photolaching führt das Anrgungslicht zu inm chmischn Prozß und trägt dafür org, daß in Molül nicht mhr zur Fluorsznz angrgt wrdn ann. Dis ann twa durch di Aufnahm mhrrr Photonn gschhn [121], so daß di Eltronn auf in höhrs ivau gracht wrdn. Drart angrgt Molül sind mpfänglichr für schnll photochmisch Rationn und Kopplungn mit polarn Lösungsmittln [122,123]. Zusätzlich wirn sich höhr Tmpraturn günstignd auf irrvrsils Blaching aus [123,124]. Bim rvrsiln, photophysialischn Blaching ann di ursprünglich Fluorsznz widr hrgstllt wrdn, wnn zwischn dr Bstrahlung dr Molül Blichtungspausn rfolgn [12527]. x Fluorsznzqunching (Fluorsznzauslöschung) Di Anahm dr Fluorsznz ann nicht nur durch irrvrsils Photolaching rfolgn, sondrn auch durch Fluorsznzqunching, i dm di Molül durch töß ihr Anrgungsnrgi strahlungslos agn. Bim Förstr-Rsonanznrgitransfr (FRET) [98] wird di durch Qunchvorgäng vrursacht Rdution dr Fluorsznz ür di Mssung ds Fluorsznzafalls stimmt [128]. Bim Fluorsznzqunching untrschidt man zwischn statischr und dynamischr Fluorsznzauslöschung. Bi dr statischn Fluorsznzauslöschung ildt sich zwischn dm Fluorophor F und dm Qunchr Q in nichtfluorszirndr Komplx FQ. Di Qunchonstant [129], ann ür das Massnwirungsgstz st K V, di als trn-volmr-konstant zichnt wird

18 11 = [ FQ] V [ F][ Q] (1) K st hrglitt wrdn. Vor dr Bildung ds Qunchomplxs FQ lign di Konzntrationn [ F ] 0 = [ F] + [ FQ] (2) und [ Q ] 0 = [ Q] + [ FQ] vor. (3) Glichung (Gl.) 2 in Gl. 1 ingstzt rgit dann [129] K st V [ F] 0 [ F] = (4) [ F][ Q] [ F] 0 st zw. = 1 + K V [ Q], (5) [ F] wlch di trn-volmr-glichung [129] für di statisch Fluorsznzauslöschung darstllt. ach Glichstzung dr Gl. 2 und Gl. 3 rgit sich mit Gl. 5 Q] [ Q] [ 0 1 Φ st = + K V Q =, (6) 1 [ ] F in wlchr Φ F di Quantnausut ist. Di Quantnausut ist propotional zur Konzntration dr Fluorophor. Bi dr dynamischn Fluorsznzauslöschung ollidirt das Fluorophor mit dm Qunchr und git sin Enrgi strahlungsfri a [130]. Di Hrlitung dr trn- Volmr-Glichung für di dynamisch Fluorsznzauslöschung führt zu [130] [ F] 0 dyn = 1+ K [ ] [ F] Q V. (7) Di Auftragung [F] 0 /[F] vs. [Q] lifrt in idn Fälln, nämlich i dr statischn und dr dynamischn Fluorsznzauslöschung, inn linarn Zusammnhang, dssn tigung (A und B in A. 4) di trn-volmr-konstant darstllt. Di Lnsdaur ds angrgtn Zustands ist ohn Kollision ( τ 0 ) größr als mit Kollision (τ ). Di Auftragung von τ 0 /τ vs. [Q] lifrt im statischn Qunching in waagrcht Lini i τ 0 /τ = 1 (C in A. 4) und im dynamischn Quching in Grad (D in A. 4), di mit drjnign dr Auftragung [F] 0 /[F] vs. [Q] zusammnfällt. Trtn id Qunchfft auf, so wird di tigung dr Auftragung [F] 0 /[F] vs. [Q] flachr (E in A. 4), währnd di Auftragung τ 0 /τ vs. [Q] inn nichtlinarn Vrlauf innimmt (F in A. 4).

19 12 A. 4. trn-volmr-auftragungn. chwarz Auftragungn: [F] 0 /[F] vs. [Q]. Rot Auftragungn: τ 0 /τ vs. [Q]. A und C: statischs (st) Qunching. B und D: dynamischs (dyn) Qunching. E und F: statischs und dynamischs Qunching. (Modifizirt Aildung aus [129,130]. Wi in Kap. 2.3 richtt, sthn angrgtn Molüln mhrr Möglichitn offn, strahlungslos ihr aufgnommn Enrgi azugn, z. B. ür Intrnal Convrsion (IC) odr Intrsystm Crossing (IC). Ein witr Möglichit dr Enrgiaga ist di Fluorsznzauslöschung (Qunching) durch töß. Bim Qunching trtn di Fluorophor in Wchslwirung mit ihrn acharn [131]. Das ann ar auch zu inm Fluorsznzanstig führn. Bi dr Anrgung ghn di Eltronn vom ingulttgrundzustand mistns in dn rstn, sltnr in höhr angrgt ingulttzuständ ür [131]. Ür Intromination odr Intrsystm Crossing glangn di Eltronn strahlungslos in dn rstn Triplttzustand, dssn dirtr Zugang aus dm Grundzustand vrotn ist. Dort vrlin di Eltronn dutlich längr als im rstn angrgtn ingulttzustand. Diss znario trifft in stimmt Population dr angrgtn Fluorophor. Aus dism Grund wird nur di Fluorsznz, di aus dm Rücspringn dr Eltronn in dn Grundzustand rsultirt, gmssn. Di Eltronn im Triplttzustand hrn rst nach längrr Zit in dn Grundzustand untr Astrahlung von Phosphorsznzlicht zurüc. Währnd sich das Eltron im rstn Triplttzustand aufhält, ann s durch Kollision mit Triplttqunchrn, wi z. B. dm im ormalzustand vorligndn Triplttsaurstoff, Enrgi agn, so daß das Fluorophor in sinn Grundzustand zurüchrt [132] und inm nun Fluorsznzzylus zur Vrfügung stht. Das dm aurstoff ürtragn Eltron, das sich jtzt im rstn Triplttzustand

20 13 findt, stht nun für inn ünftign Fluorsznzzylus zur Vrfügung. Dis führt ltztn Ends zu inm Anstig dr Fluorsznz. Ein witrs Phänomn stllt das lfqunching (lstauslöschung) dar [133], i dm dr Qunchvorgang mit glichartign Molüln rfolgt [134]. Häufig tritt s i inr hohn Fluorophorndicht auf [135]. Ar auch Prozss wi Protindimrisation [136] odr Protinfaltung [137] önnn zu inm lfqunching führn. 2.4 Totalrflxion und vansznt Wll Tritt in Lichtstrahl von inm optischn Mdium auf in andrs mit inm vrschidnn Brchungsindx, so wird disr in ihm grochn. Dai fand nllius, daß das Vrhältnis dr inus dr auf di Einfallsn zognn Brchungswinl, umghrt proportional dr Brchungsindizs ist [138,139]. Diss Vrhältnis ist das Gstz von nllius sinθ1 sinθ 2 = n n 2 1. (8) Aus dism Brchungsgstz folgt, daß Licht im Ürgang vom optisch dichtrn Mdium n 1 zum optisch dünnrn Mdium n 2 vom Einfallslot, das snrcht zur Phasngrnz ligt, wggrochn wird und umghrt [140]. Vrgrößrt man dn Einfallswinl ds Lichts, so wird in Til ds Lichts vom Einfallslot wggrochn und in andrr rfltirt. Bi noch witrr Vrgrößrung ds Einfallswinls wird in Licht mhr transmittirt; s ritt sich an dr Grnzfläch idr Mdin, also im Winl von 90 in zug auf das Einfallslot, aus. Disn Winl zichnt man als dn ritischn Winl θ rit. Bi Einfallswinln, di größr als dr ritisch Winl sind, rfolgt Totalrflxion. Dr ritisch Winl ist ür di Glichung n θ rit = arcsin 2 (9) n 1 ggn. Im optisch dichtrn Mdium ildt sich in sthnd Wll aus, di aus dr Intrfrnz von infallndm und rfltirtm Licht rsultirt. Di Ausritung dr aus Knotn und Wllnäuchn sthndn Wll ist ldiglich auf dn Intrfrnzrich loalisirt [141]. Das infallnd Licht wird ar nicht an dm Brich dr Grnzfläch rfltirt, an dm s auftrifft, sondrn, im Vrglich zur gomtrischn Rflxion, sitlich vrschon [142]. Disr Efft wird als Goos-Hänchn-Vrschiung zichnt und wurd von Goos und Hänchn im Jahr 1943 ntdct [143]. In das optisch dünnr Mdium, im Brich dr Goos-Hänchn-Vrschiung, tritt das ltromagntisch Fld in, was Goos und

21 14 Hänchn mit inm Prisma nachwisn. Di Eindringungstif ist ahängig von dn Brchungsindizs und dr Anrgungswllnläng und hängt ür di Glichung [144] d P = π λ n1 sin rit n2 0 θ (10) zusammn. Aus Gl. 10 ist zu ntnhmn, daß mit zunhmndr Wllnläng λ 0 di Eindringungstif größr wird. Dr Indx 0 zichnt di Wllnläng ds Anrgungslichts ( λ 2 ) im Vauum. Mit λ = n (11) 0 2 λ2 folgt für di Eindringtif im optisch dünnrn Mdium 2 d P = 2π 2 2 ( n / n ) sin θ λ 2 rit. (12) Für di Bindungsstudin von rhbmp-2 an Quarzglas und an modifizirtn Quarzglasorflächn, wurd mit λ 2 = 285 nm, n 1 = 1, 496, n 2 = 1, 353 und θ rit = 70 in Eindringtif von d P = 161 nm rchnt. Im witrn Vrlauf dr Arit wird di Anrgungswllnläng λ 2 als λ x zichnt. A. 5 zigt in sthnd Wll (A) im optisch dichtrn Mdium (n 1 ) und di xponntill (C) afallnd Grnzflächnamplitud (B) im optisch dünnrn Mdium (n 2 ). A. 5. Darstllung inr vanszntn Wll. Entsthung inr vanszntn Wll C mit dr Eindringtif d P durch dn xponntilln Afall dr transmittirtn Grnzflächnamplitud B im optisch dünnrn Mdium n 2. A: sthnd Wll im optisch dichtrn Mdium n 1. (Aildung aus [40]).

22 15 In [20] ist di ltrisch Fldamplitud ds snrcht polarisirtn vanszntn Flds E (B in A. 5) in Ahängigit von dr Eindringtif d P am Bispil ds snrcht polarisirtn Lichts schrin und führt dort zur Glichung [20] E E t z / d P = (0). (13) y Hirin ist y (0) di Richtung ds ltrischn Fldvtors t E dr snrcht polarisirtn ltromagntischn Wll, drn Fldamplitud in z-richtung afällt. Häufig wird dr Ausdruc E in sinr quadratischn Form vrwndt und schrit dann di Intnsität dr vanszntn Wll, wlch mit zunhmndr Wllnläng ds ingstrahltn Lichts, in dr Rgl das Anrgungslicht, witr in das optisch dünnr Mdium indringt, wi dis in A. 6 dargstllt ist. A. 6. Exponntill Anahm dr Lichtintnsität mit dr Distanz z. ( E ) 2 : Lichtintnsität. A: λ = 284 nm, n 1,496, x 1 = n 2 = 1,353, θ = 70. B: λ = 488 nm, n 1,467, rit x 1 = n 2 = 1,333, θ = 70. (Aildung aus [20]). rit A. 6 zigt di Intnsität dr vanszntn Wll, also das Quadrat dr ltrischn Fld- amplitud ( E ) 2, in Ahängigit von dr Einfallsnormaln z von dr Grnzfläch xy für zwi vrschidn Anrgungswllnlängn [20]. Bi inr Anrgungswll von 284 nm rfolgt in schnllrr Afall dr Intnsität dr vanszntn Wll als i 488 nm. Entsprchnd ist di Eindringtif d P i linrn Wllnlängn gringr. Das Auflösungsvrmögn ist i

23 16 linn Wllnlängn höhr, da infolg gringrr Eindringtif dr Hauptantil ds Anrgungslichts größtntils nur di adsorirtn und nicht di glöstn Molül rfaßt. Bi größrn Wllnlängn dringt das vansznt Fld witr in di Bulphas in, so daß mhr glöst Molül von ihm rfaßt wrdn. Frilich rlativirt sich disr Efft i zunhmnd gringr wrdndn Konzntrationn. 2.5 Vrwndung dr vanszntn Wll zur Anrgung [20] Di gmssn Fluorsznz ist proportional dm Produt von Asorptions- und Emissionswahrschinlichitn. Da di Asorption dr anrgndn, vanszntn Wll proportional zur Molülonzntration an dr Grnzfläch ist, stht di Möglichit, di Fluorsznz, di von dn adsorirtn Molüln ausght, zu quantifizirn. In dr Rgl wird di Fluorsznz ins Molüls influßt durch das Produt von f ( m ) a Φ λ. Darin ist Φ di Quantnausut, f ( λ m ) dr Antil dr gsamtn trahlung, di i dr Wllnläng λ m mittirt wird, und a dr Antil dr gsamtn trahlung, di i λ m gmssn wird. Im Fall inr innrhal dr TIRF-Zll homogn vrtiltn, fluorszirndn ustanz ist di Intnsität dr Fluorsznz ggn durch [20] ( λ m ) a ε c ( E ) 0 = 2,303 Φ f dz, (14) mit ε dm Extintionsoffizintn i dr Anrgungswllnläng λ x und c dr Konzntration. Dr Trm ( E ) dz ntspricht dm Produt dr Lichtintnsität ds infallndn Lichts mit dr Dic d dr Mßzll in dr onvntionlln ptrofluoromtri. Im Fall, daß das infallnd Licht snrcht polarisirt ist, folgt mit Gl. 13 [20] 2 z P ( E ) dz ( E ) d 2 / dz 0 t z / dp =. E = E (0). (15) 0 Adsorirt in toff an dr Grnzfläch, ght Gl. 14, untr Einzug von Gl. 15, ür in [20] y t ( m ) ( ) Φ ( z ) ( z ) c ( z ) E y ( 0 ) z / P ( d 2 ) dz = 2,303 a f λ ε. (16) 0 z Hirin sind f ( λ m ), Φ, ε und c ahängig vom Astand z von dr Grnzfläch. Für vrdünnt Lösungn ist di Fluorsznzintnsität dirt proportional dr Intnsität ds anrgndn vanszntn Flds [145] und dn Wahrschinlichitn von Asorption und Emission, solang in trulicht vorligt. Zur Quantifizirung dr adsorirtn Molül müssn di Fluorsznz a dr adsorirtn Protinmolül, di nach Ausspüln dr Prolösung mit

24 17 Puffr dirt gmssn wrdn ann, und dr vansznt Antil dr Fluorsznz dr glöstn Protinmolül, di aus dr Bulphasnfluorsznz dr Protinlösung rchnt wrdn muß, vrwndt wrdn. Bid Fluorsznzn rsultirn aus dr Anrgung durch das vansznt Fld (sih Kap. 2.6). Das Vrhältnis dr Fluorsznz ds asorirtn Protins (Indx a) zu dr Fluorsznz ds Protins in dr Bulphas (Indx ) ist ggn durch [20] a 2,303 a = 2,303 a 0 f f t ( λm ) ( ) Φ a ( z ) ε ( z ) c ( z ) E y ( 0 ) z ( λm ) ( ) Φ ( z ) ε ( z ) c ( z ) y ( 0 ) z z / d P ( ) t z / d P ( E ) Ligt di adsorirt Protinschicht mit dr Volumnonzntration 0 < z < und di Bulphas mit dr Protinonzntration P so ann Gl. 17 vrinfacht wrdn zu [20] a Φ a Γ = Φ c Vol p 0 t z / d P ( E y( 0) ) t z / dp ( E ) y ( 0) dz. (17) dz Γ Vol im Brich von c im Brich von < < ( d ) dz, (18) dz z, wnn di Einschränung gilt, daß f ( λ m ) und ε für di adsorirtn und glöstn Protinmolül glich sind. ist di Dic dr adsorirtn Protinschicht und d di Dic dr Mßzll, zogn auf di z-achs. immt man nun an, daß sich di Quantnausut dr adsorirtn und glöstn Protinmolül nicht ändrt und glich ist, also Φ / = 1 ist, so folgt aus Gl. 18 [20] a Γ = c Vol p 0 t z / dp ( E y( 0) ) t z / d P ( E ) y ( 0) 2 2 a Φ dz. (19) dz Dis Annahm ist allrdings nicht grchtfrtigt, wnn di Protinmolül nur in gring Anzahl intrinsischr fluorophorr Gruppn sitzn, da in Ggnwart inr Grnzfläch sowohl di Miroumgung dr fluorophorn Gruppn als auch dr Enrgitransfr von dn Tyrosin- zu dn Tryptophangruppn in adsorirtn Molüln influßt wrdn. Enso ann dr Grad dr Orflächndcung di Emissionswahrschinlichitn influssn. Bi inr größrn Anzahl intrinsischr Fluorophor in Protinmolüln ist davon auszughn, daß sich dr Efft dr Protinadsorption nur unwsndlich auf das Emissionsvrhältnis auswirt, so daß sich sligs ins nährt. In dism Fall ist mit dn Paramtrn a und di Brchnung von Γ Vol und daraus di Brchnung dr Orflächnonzntration (Bladung) ds

25 18 adsorirtn Protins Γ P möglich, woi di Dic dr adsorirtn Protinschicht annt sin muß. Γ P ist nur dann unwsntlich von dr chichtdic ahängig, solang dis dutlich linr als di Anrgungswllnläng λ x ist. Di gmssn Fluorsznz stzt sich aus dn Fluorsznzn zusammn, di aus dr Anrgung durch di vansznt Wll und aus dr Anrgung durch das trulicht folgn. Das gstrut Anrgungslicht rsultirt zum inn aus dm apparativn trulicht und zum andrn aus dm durch glöst Molül gstrutn Anrgungslichts. Das Hauptprolm in dr Auswrtung ist allrdings das apparativ trulicht, das durch ungnau optisch Bautil, schlcht foussirts Anrgungslicht und durch di Eignschaftn dr Kopplungsflüssigit stimmt wird. Jds trulicht, das von Molüln ausght und in dr TIRF-Zll gfundn wird, ist ar vrnachlässigar lin, solang das apparativ trulicht durch aurit und optimal Justirung dr optischn Komponntn witghnd rduzirt wird. Zur Kontroll ds trulichts wrdn ülichrwis nichtadsorirnd tandards wi z. B. Tryptophan odr sin Drivat ingstzt. 2.6 Brchnung dr Orflächnonzntration an Grnzflächn i TIRF-Exprimntn [20] Für di Intnsität dr gmssnn Fluorsznz wurd das von Hlady [20] vorgschlagn Formlzichn vrwndt. Für di Fluorsznz wrdn vrschidn Indizs vrwndt. Dis solln hir urz rlärt wrdn. * in Anwsnhit von adsorirtm Protin 0 rin Puffrlösung a s adsorirts Protin Protinlösung vanszntr Antil trulichtantil tandardlösung tot totalr (gsamtr) Antil, also + s Litt man in Lösung ins nichtadsorirndn tandards durch di TIRF-Mßzll, so mißt man di Fluorsznz tot, di nach dr Einlitung von Puffr rasch auf di Fluorsznz 0 asint. 0 ist di Fluorsznz, di gmssn wird, wnn in dr Mßzll in fluorszirndn Molül mhr vorlign (Grundrauschn). Im Fall inr Protinlösung wird di Fluorsznz tot * gmssn, sih A. 7. Di Vrdrängung dr Protinlösung durch Puffr-

26 19 lösung (Buffrflush), führt zu inm Asinn dr Fluorsznz nicht auf dn Wrt null, sondrn auf dn Wrt Fluorsznz a, da auf dr Orfläch adsorirt Protinmolül vrlin. Di tot * sint um di Fluorsznz glöstn Protinmolül in dr Bulphas, so daß [20] tot tot a tot. Ltztr rsultirt aus dr Fluorsznz dr * = +. (20) folgt. Allrdings findt man das Asinn dr Fluorsznz tot * auf dn Wrt a um dn Wrt tot nur i gnügnd hohn Protinonzntrationn. Dann nämlich wrdn so vil glöst Protinmolül angrgt, daß sich dis als zusätzlich Fluorsznz mrar machn ann. Fluorsznzintnsität tot tot * a 0 t A. 7. chmatisch Darstllung ds Fluorsznzvrlaufs i inm Buffrflush. Bi hohn Protinonzntrationn in dr Bulphas, wird di Fluorsznz ds adsorirtn Protins tot tot und dijnig dr Bulphas gminsam als Fluorsznz * gmssn. ach dm Ausspüln dr Bulphas mit Puffr (Buffrflush) wird nur noch di Fluorsznz ds adsorirtn Protins a gmssn. 0 ist das Grundrauschn, das vor dr Einlitung dr Protinlösung gmssn wird. Von jdr orptionsinti ist 0 zu sutrahirn. (Aildung aus [40]). Di Fluorsznzintnsität ds glöstn Protins in dr Bulphas vanszntn Antil tot tot stht aus dm und dm trulichtantil. Es gilt somit für di Bulphas [20] = +. (21) Di Fluorsznzintnsität s s tot ds tandards, dr sich ausschlißlich in dr Bulphas findt, da r nicht adsorirt, stzt sich nfalls aus inm vanszntn Antil inm trulichtantil zusammn, so daß s a und

27 20 = +. (22) tot s gilt. Analog zu dn Gl. 21 und 22 ist für di Fluorsznz ds adsorirtn Protins = + (23) tot a a zu formulirn. Di gmssn Fluorsznz s a zusammn. Di Fluorsznz s a trulicht ist jdoch ggnür dr gmssnn Fluorsznz tot a stzt sich aus dn Tilfluorsznzn a und s a ds adsorirtn Protins aus dr Anrgung durch tot a nur shr gring und ann vrnachlässigt wrdn, wil sich di adsorirtn Protinmolül nur in inm linn Volumnlmnt dr vanszntn Rgion findn und somit nur von inr zu vrnachlässigndn trulichtmng rfaßt wrdn önnn. Dmnach rsultirt di Fluorsznz dr adsorirtn Protinmolül nahzu vollständig aus dr Anrgung durch das vansznt Fld und wird vrinfacht mit di Fluorsznz dr tandardlösung a gnnzichnt. Im witrn Vrlauf dr vorligndn Arit soll tot, di sich aus dm vanszntn Fluorsznzantil und dm trulichtantil zusammnstzt (sih Gl. 22), als Gsamtfluorsznz dr tandardlösung zichnt wrdn. Analog handlt s sich i dr Fluorsznz dr Protinlösung (sih Gl. 21). Bi vrschidnn Exprimntn ist di Fluorsznz tot um di Gsamtfluorsznz a dr adsorirtn Protinmolül (i Anwndung von Protinlösungn glichr Konzntration) nahzu unvrändrt, währnd di Gsamtfluorsznz dr Bulphas tot, auch i shr vrdünntn Bulphasn, starn chwanungn untrlign ann. Dshal findt man für di glichn Vrsuch häufig variirnd Gsamtfluorsznzn. Ursächlich hirfür ist das Auftrtn von apparativm trulicht und in zu vrnachlässigndm Maß trulicht von glöstn Molüln. Gstruts Anrgungslicht sitzt im Ggnsatz zum vanszntn Fld in sich ausritnd atur. Disr Umstand rmöglicht s, di durch inn Buffrflush xprimntll rmittlt Gsamtfluorsznz dr Protinlösung Fluorsznz tot um dn aus trulicht rsultirndn Antil dr s zu rinign. Bi nichtadsorirndn tandards wird mit zunhmndr Konzntration i ggnr Dic d dr TIRF-Durchflußzll in Zustand rricht, i dm di Intnsität ds infallndn, gstrutn Anrgungslichts im gsamtn Volumn dr TIRF- Zll durch Asorption nahzu vollständig agschwächt wird. Di Fluorsznz, di aus dr Anrgung durch das asorirt trulicht folgt, stigt a inr Extintion von ε c d > 2 nicht mhr an, sondrn lit onstant, wi dis in A. 8 durch di gpuntt Kurv dargstllt ist. Bi dr Untrsuchung nichtadsorirndr tandards mit dm TIRF-Aufau

28 21 wrdn Gsamtfluorsznzn dr tandardlösungn tot oachtt, di a inr stimmtn Konzntration linar ahängig von dr Extintion wrdn, sih gstrichlt Kurv. Disr linar Antil ann nach ε c = 0 xtrapolirt und an dr Ordinat ntlang is in dn Ursprung vrschon wrdn, sih durchgzogn Grad. Dis Grad stllt nun di Fluorsznz dr tandardlösung dar, di nur aus dr Anrgung durch das vansznt Fld ntstht. Fluorsznzintnsität Gsamtfluorsznz tot Fluorsznz aus Anrgung durch vansznt Wll Fluorsznz aus Anrgung durch trulicht s Extintion von 5-Hydroxy-L-tryptophan A. 8. chma zur Zusammnstzung dr Fluorsznzstandtil ds in atriumactatpuffr (ph = 4,5) glöstn tandards 5-Hydroxy-L-tryptophan in Ahängigit von dr Extintion. Di gstrichlt Lini stllt di Gsamtfluorsznz, di durchgzogn Lini dn vanszntn Antil glöstn tandards dar. (Aildung aus [40]). und di gpuntt Lini dn trulichtantil Es ist zu achtn, daß di in A. 8 dargstlltn Fluorsznzn tot s dr Fluorsznz ds tot und s nur für dnsln Zllnaufau gltn. Bi rnutm Zusammnau dr Mßzll, önnn di Fluorsznzn Antil dr Fluorsznz s und damit tot tilwis shr star variirn, währnd dr vansznt unvrändrt lit. olln Gamtfluorsznzn xprimntll stimmt wrdn, mit dm Zil, si in ihr Bstandtil s und tot von tandards zu zrlgn, müssn all Fluorsznzmssungn in drsln Mßzll durchgführt wrdn. Wi im tandard, wrdn auch Protinmolül i glichn fluorophorn ustituntn und glichm ε c di glich Mng Anrgungslicht vom vanszntn Fld als auch trulicht asorirn. Wrdn tandard und Protin in drsln Zll vrmssn, so sind i glichm Fluorsznzantil glich, wswgn [20] = * tot * tot (24) ε c all

29 22 gschrin wrdn ann. Währnd das Vrhältnis Protinschicht rhaltn wird, folgt das Vrhältnis / aus dr Anwndung nichtadsorirndr tandards. Aus dism Grund ist 0 t z / d P ( E y( 0) ) t z / d P ( E ) y ( 0) zu orrigirn [20], so daß Gl. 19 ürght in a Γ = c vol p dz dz t z / d P ( E y( 0) ) t z / d P ( E ) y ( 0) 2 2 / in Anwsnhit inr adsorirtn tot * * tot * mit dm Fator (25) dz. (26) dz ist di Fluorsznz dr durch das vansznt Fld angrgtn Protinmolül in dr Bulphas mit dr Konzntration c P i Awsnhit adsorirtr Protinmolül. i ist in Bstandtil dr Gsamtfluorsznz, wlch aus inm Buffrflushxprimnt i hohn Protinonzntrationn (Gl. 20) rhaltn wird. Entsprchnd Gl. 24 gilt ohn Anwsnhit inr adsorirtn Protinschicht [20] =, (27) tot tot sofrn di Extintionn von Protin- und tandardlösungn glich sind, also E = E P (28) gilt und di Fluorsznzn in drsln Mßzll gmssn wrdn. Währnd di Fluorsznzn aus dr Anrgung durch trulicht i jdm rnutn Zusammnau variirn, lin di Fluorsznzn aus dr Anrgung durch das vansznt Fld glich. Andrad [20] und spätr andrs [146] formulirtn in Glichung, di nur di vanszntn Antil dr Fluorsznzn in dn Zusammnhang = = ( ε c) ( ε c) ( ε c) = (29) rachtn. Dis Glichung sagt, daß für in liig Konzntration inr Protinlösung und tandardlösung, für di Gl. 28 also ( ε c ), ( ε c ), ( ε c ) rfüllt ist, di Division von durch Korrturfator dn sln Fator rgit, wlchr in Kap und Kap als f K zichnt wird. Di Mssung dr Fluorsznz von tandards ann für jd Konzntration in drsln Mßzll durchgführt wrdn, da si nicht adsorirn. Bi

30 23 adsorirndn Protinn muß für jds Adsorptionsxprimnt di Zll rnut grinigt und widr zusammngfummlt wrdn. Hiri ann sich di Gomtri dr TIRF-Mßzll ändrn, währnd di Brchungsindizs n 1 und n 2, di Wllnläng ds Anrgungslichts λ 2 und di Eindringtif d P dr vanszntn Wll unvrändrt lin. In Anwsnhit von adsorirtn Protinmolüln wird di Gsamtfluorsznz tot * gmssn, di sich ntsprchnd dr Gl. 20 und 21 aus [20] = + + tot s * a (30) zusammnstzt. Di Fluorsznzn in dr Bulphas sind ggnür dr Fluorsznz s und a ds adsorirtn Protins vrnachlässigar lin, so daß [20] = tot * a (31) formulirt wrdn darf. Di Gültigit disr Glichung rgit sich auch xprimntll, da i Anwndung gringr Protinonzntrationn nach Durchführung ds Buffrflushs in Vrringrung dr Fluorsznz mßar ist. Zur Brchnung dr Protinladung ist di Fluorsznz notwndig. Für vrdünnt Protinonzntrationn, i dnn in Buffrflush nicht zu inm Fluorsznzafall führt, müssn di -Wrt durch Multipliation dr gmssnnn Extintionn mit dr tigung dr Gradn aus A. 8 xtrapolirt wrdn. Zur Brchnung dr Bladung ght man von Gl. 26 aus, drn Intgration [20] 2 d ( 1 P ) Γ = (32) a Vol / cp lifrt. Da das Protin auf dr Orfläch als inlagig chicht (Monolayr) adsorirt, ist di Dic disr chicht ggnür dr Eindringtif ds vanszntn Flds vrnachlässigar gring, so daß für dn xponntilln Trm nährungswis [20] 1 2 d P 2 d P (33) nidrgschrin wrdn ann. Damit ght di Gl. 32 ür in [20] a Γ 2 c d Vol =. (34) P P ach Umstllung folgt hiraus [20] Γ Vol a cpd P = (35) 2

31 24 und mit Γ P = Γ schlißlich [20] vol Γ P = a cpd 2 P cps µg cps cm 3 µg cm = cm 2. (36) Mit Gl. 36 ann di Mng ds adsorirtn Protins auf dr Orfläch (Orflächnonzntration) rchnt wrdn. 2.7 Massntransport Zur Btrachtung dr Kintin von Adsorptions- und Dsorptionsprozssn müssn di tofftransportdingungn achtt wrdn. Allgmin rfolgt dr Transport von Tilchn ür [147] 1. Wärmürtragung, 2. ondutivn tofftransport (Diffusion), 3. onvtivn tofftransport (trömung) odr 4. inr Komination aus ihnn. Durch in optimal Thrmostatisirung i dn Exprimntn wrdn di Tmpraturgradintn minimirt, so daß sich dr tofftransport durch Wärmürtragung fortht. Für in Volumnlmnt, z. B. in inr rchtwinlign Durchflußzll, ann di allgmin Transportglichung [148] c t c c c c c c = υ x + υ y + υ z + D (37) x y z x y z formulirt wrdn. Dis Glichung rücsichtigt di Diffusion D und dn onvtivn tofftransport in di Raumrichtungn x, y und z im Zitraum dt. υ ist di Transportgschwindigit durch Konvtion (trömungsgschwindigit) in ndis Raumrichtungn und c di Tilchnonzntration in dr Lösung. Btrachtt man zunächst zwi unndlich Plattn, di sich in x- und z-richtung aufspannn und in Lösung, di laminar in x-richtung durch di yz- En strömt, so falln di trömungstrm in y- und z-richtung fort, da in dis Richtungn in Konvtion rfolgt. Dswgn ght Gl. 37 ür in [149] c t c c c c = υ x + D (38) x x y z Bwgn sich nun Tilchn in y-richtung durch di xz-en, twa wil si adsorirn, so ann dis nur ür Diffusion rfolgn. Di Diffusion in x-richtung ist ggnür dr trömung in disl Richtung vrnachlässigar lin und ann vrnachlässigt wrdn. Di Diffusion in