Block 9 Krankheit- Manifestation und Wahrnehmung, allg. Arzneimitteltherapie

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1 Block 9 Krankheit- Manifestation und Wahrnehmung, allg. Arzneimitteltherapie gelb (450 nm) TMB farblos H2O2 H2SO4 grün/blau WS 2005/2006 -> 3. Semester -> Block 9 -> Kapitel 4: Medizinisch-chemische Laboratoriumsdiagnostik 1 second Ak capture Ak 2. ELISA-Test für Dengue-Virus Dengue-Virus Hüllprotein Mag. Johann Ch. Holzmann

2 Viren sehr kleine, infektiöse und obligat intrazelluläre Parasiten (filtrierbar, nur im Elektronenmikroskop sichtbar) absolut Abhängig von einem Wirtsorganismus (Viren besitzen keine eigene Proteinsynthesemaschinerie - benützen die der Wirtszelle) Virus besteht aus Hülle und der Erbinformation (DNA oder RNA) Viren die Bakterien befallen werden als Bakteriophagen bezeichnet 2 Formen: in der Zelle infektiöse Partikel ausserhalb der Zelle (Virion)

3 Struktur nackte Viren bestehen nur aus der Nucleinsäure + Capsid => Nucleocapsid resistent gegenüber Umwelteinwirkungen töten meist ihre Wirtszelle akute Infektionen (zbsp. Hepatitis A) umhüllte Viren besitzen zusätzlich eine Doppelmembran (Bilayer) labil gegenüber Umwelteinwirkungen lösen meist chronische Infektionen aus (Hepatitis C, HIV, ) Proteine Envelope (Bilayer) Capsid (Proteinhülle) DNA oder RNA (ss oder ds) Nucleocapsid Nanometer

4 Verschiedene Virionstrukturen Helices Ikosaeder komplex

5 Virusklassifikation Typ der Nucleinsäure (ss oder ds, DNA oder RNA) Struktur (helikal, ikosaedrisch, komplex) nackt, umhüllt Grösse Baltimore Klassifizierung (klassifiziert Viren auf der Basis ihrer Nukleinsäure und ihrer mrna Produktion) => einteilung in 7 Gruppen 1. ds DNA Viren 2. ss DNA Viren 3. ds RNA Viren 4. sense (+) ss RNA Viren 5. antisense (-) RNA Viren 6. ss RNA mit DNA Intermediat während mrna Produktion (Retroviren!!) 7. ds DNA mit einem RNA Intermediat während mrna Produktion

6 Die Baltimore Klassifikation Hep. A FSME Gelbfieber Hep. C HIV Influenza Hep. B

7 Dengue (7 Tage Fieber/ breakbone fever) Weltweit grösstes arbovirus Problem Arboviren. "Arthropode-borne Viruses": - Übertragung durch Insekten, Milben, Zecken Virus wird durch die Tigermücke (Aedes aegypti) übertragen geschätzte 2,5 Mrd. Menschen leben in Gebieten wo Dengue endemisch ist 50 Mil. Erkrankungen jährlich 3 6 Prozent der Erkrankungen verlaufen tödlich Dengue ist ein Flavivirus es gibt 4 Serotypen (DEN 1-4) wiederholte Infektion (vom selben Serotyp bei schwacher primär-immunantwort) kann zum Dengue haemorrhagic fever führen (v.a. diese Infektionen tragen zur hohen Sterblichkeit bei)

8

9 ELISA (enzyme linked immunosorbant assay) o beruhen auf der spezifischen Wechselwirkung zwischen Antigen (Ag) und Antikörper (Ak) o der Nachweis erfolgt mit gekoppelten Enzymen o hohe Spezifität und Einfachkeit o zur quantitativen Erfassung von Proteinen (Ag) => Antigen capture Antikörpern (Ak) => Antibody capture o Nachweis entweder direkt oder indirekt (Sandwich) o Assay entweder kompetitiv (RIA) oder nicht kompetitiv unser Bsp: Dengue-IgG Nachweis ist ein nicht kompetitiver indirekter ELISA (Sandwich ELISA)

10 kompetitiv direkt (RIA Radio-Immun-Assay) 125 I Eine genau definierte Menge an gelabeltem Protein (tracer Ag - mit 125 I an Tyrosin gebunden) und das Patientenserum werden gleichzeitig aufgetragen. Das gelabelte Protein kompetitiert mit dem ungelabelten Protein um die Bindungsstellen am Ak. labeled (tracer) Ag (Bsp.: IL-6) Ziel Ag (selbes Protein wie tracer Ag!) Je mehr des bestimmten Ag (Bsp. IL-6) im Serum vorhanden ist, desto schwächer (!) wird das radioaktive Signal durch 125 I. spez. Ak gegen Ag

11 nicht kompetitiv - direkt direkter Antigen capture Assay direkter Antibody capture Assay Bedingung: Der Nachzuweisende Ak oder das Nachzuweisende Ag muss enzymgekoppelt vorliegen meist nicht der Fall => Sandwich ELISA

12 nicht kompetitiv - indirekt Antigen capture Sandwich ELISA Antibody capture Sandwich ELISA capture Ak (coat) Ziel Ag (Protein) Well Boden Ag (zbsp: Virales Protein) (coat) Ziel Ak (IgM bzw. IgG) second (detektions) Ak gekoppelt mit (horse radish peroxidase) second (detektions) Ak gekoppelt mit (horse radish peroxidase) Bsp.: Bestimmung von IL-6 im Serum Bsp.: Bestimmung von Dengue spez. IgG Wichtig: Schichten des ELISA!!

13 Antigen capture Sandwich ELISA Antibody capture Sandwich ELISA capture und second Ak binden an Unterschiedlichen Epitopen des Ag - sonst sterische Behinderung second Ak bindet an Fc-Region des capture Ak beim Dengue Beispiel ist der capture Ak humanes IgG, dh. der second muss gegen die Fc-Region dieses Ak reagieren second: Goat-αhuman-IgG- Source target Ak-Typ Detektion

14 Detektionssysteme Enzymatische Markierung Enzyme, die überwiegend zur Anwendung kommen, sind die alkalische Phosphatase, die Meerrettichperoxydase () und die Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase. Nach Zugabe des spezifischen Substrats wird dieses vom jeweiligen Enzym in ein Produkt umgewandelt, dessen Bildung kinetisch oder durch Endpunktmessung bestimmt wird. Fluoreszenz-Markierung Innerhalb dieser Gruppe sind die Liganden mit Fluorophoren verbunden. Fluorophore sind Moleküle, die Energie adsorbieren und in einem Zeitraum von 10-8 sec. als Photon wieder abgeben. Erfolgt die Energiezufuhr in Form von Strahlung, wird diese mit einer Wellenlängenverschiebung von nm wieder abgegeben. Luminiszenz-Label Antigen oder Antikörper sind mit einer luminiszierenden Substanz markiert. Diese Moleküle senden nach Energiezufuhr Strahlung aus. Je nach Anregung werden folgende Formen der Luminiszenz unterschieden: Chemiluminiszenz: Wird erzeugt von Substanzen, die durch chemische Oxydation Licht abgeben, z.b. Luminol, Acridiumester, Oxalate. Für den Start der Chemiluminiszenzreaktion sind Katalysatoren notwendig (z.b. Meerrettichperoxydase und Wasserstoffperoxid). Bioluminiszenz: wird erzeugt durch ein luminiszierendes System, dem eine energieliefernde Reaktion vorgeschaltet ist. Zur Luminiszenz wird das Luzeferin-Luzuferase-System eingesetzt.

15 als Detektionssystem TMB (tetramethylbenzidin base) farblos second Ak H2O2 gelb (450 nm) H2SO4 grün/blau Absorption 450 nm Kinetik der Reaktion linearer Bereich Sättigungsphase beginnt capture Ak Zugabe von TMB Zeit setzt das farblose Substrat TMB in ein grün/blaues Produkt um. Durch Zugabe von Säure wird die Reaktion gestoppt und es erfolgt ein Farbumschlag. Zu beachten ist, dass die Reaktion im linearen Bereich gestoppt werden muss!!

16 Antikörper IgG Struktur V variable region C constant region H, L heavy, light chain Antikörper bestehen aus 2 schweren und 2 leichten Ketten. Die C-terminale Fc Region ist konstant und dient zur Bindung an Zelloberflächen und zur Interaktion mit dem Komplementsystem. Die N-terminale Fab Region besteht aus 2 schweren und 2 leichten Ketten und dient zur Bindung an das Antigen.

17 Klassen der Immunglobuline IgG Mengenmässig die häufigste Klasse (~75% der Ig). Finden sich im Blut und in der interstitiellen Flüssigkeit. IgGs werden durch die Plazenta übertragen. IgA Zweithäufigste Klasse finden sich vorwiegend im Gastrointestinaltrakt und in Körpersektreten IgM primär Antwort frühe Formen sitzen auf B-Lymphocyten spätere Formen liegen als Pentamere vor IgD ungeklärte Funktion IgE wichtige Rolle bei allergischen Reaktionen

18 monoklonale / polyklonale Antikörper Antigene (Proteine) besitzen mehrere Regionen (Epitope) die potentiell von Antikörpern erkannt werden können (multivalent). Wird ein Antigen vom Immunsystem erkannt so werden mehrere Antikörper produziert die an die verschiedensten Epitope binden (polyklonale Antwort). Kann ein Ak-Gemisch mit mehrere Epitope eines Proteins interagieren nennt man dieses polyklonal. Eine Lösung von nur einem Ak der nur gegen ein Epitop reagiert nennt man monoklonal. multivalentes Antigen Epitop polyklonal unterschiedliche Ak binden an unterschiedlichen Epitopen eines Proteins monoklonal EIN Ak bindet an EIN Epitop des Proteins

19 Begriffbestimmung Proteine sind erst ab einer Grösse von ca. 10kDa potentiell antigen. ein kleines Molekül wird als Hapten bezeichnet, wenn es nach Bindung mit einem grossen Molekül (Trägermolekül) antigen wirkt Epitope sind 5 8 Aminosäuren lange Regionen an der Proteinoberfläche an die Ak binden Als Paratop wird die Region am Antikörper bezeichnet die an das Epitop bindet => Epitop und Paratop binden über schwache Welchselwirkungen miteinander Multivalente Antigene besitzen mehrere Epitope

20 Affinität / Avidität Affinität: die Fähigkeit von Antikörpern, reversibel und spezifisch an bestimmte Epitope von Antigenen zu binden. Berechnung der Affinität: Ak + Ag -> AkAg ; K=Affinität ; K = [AkAg]/([Ak] * [Ag]) Affinität ist somit die Kraft einer einzelnen Ag-Ak-Bindung. Ein Ak-Gemisch (polyklonal) kann aber auch an mehreren Epitopen eines Antigens binden, diese Avidität ist die Gesamtheit der Affinitäten und in der Regel sehr viel höher als die Affinität. Die Avidität spielt bei der Immunantwort eine entscheidende Rolle, da anfänglich zwar viele Ak an das Ag binden, jedoch mit geringer Affinität. Beispiel zur Affinität von IgG: Das Molekulargewicht eines IgG beträgt 150kDa. 1,5 µg/ml ist daher eine Lösung von 10-8 mol/l. Angenommen dieses IgG bindet ein Protein mit einer Affinität von K= /(mol/L), dann ist das Verhältnis gebundener/ungebundener Ak laut Massenwirkungsgesetz: [AkAg] / [Ag] = K [Ak] = 10 7 * 10-8 = 10-1 das heisst, der Antikörper bindet im Gleichgewicht ein Antigen und lässt 10 ungebunden das selbe Beispiel mit K = ergibt 100 gebundene zu 1 ungebundenen (hochaffin!)

21 Immunsystem

22 Bei der Erstinfektion kommt es durch die klonale Selektion (stimmulierte Vermehrung der B-Zellen die zum Erreger passende Antigen-Rezeptoren tragen) zuerst zu einer vermehrte Produktion der Immunglobuline der Klasse M (IgM). Erst zu einem späteren Zeitpunkt bzw. bei einer wiederholten Infektion kommt es zur Produktion von IgG s.

23 Produktion von monoklonalen Antikörpern B-Zellen der Milz Myelom Zellen (B-Zell Tumor) nur Hybridoma Zellen können in HAT-Medium überleben

24 Weitere molekularbiologische Methoden die auf der Ak-Ag Interaktion beruhen Western Blot

25 Weitere molekularbiologische Methoden die auf der Ak-Ag Interaktion beruhen Immunfluoreszenz Ak gerichtet gegen Proteine die zbsp. charakteristisch für bestimme Organellen sind zur Lokalisation von Proteinen

26 Weitere molekularbiologische Methoden die auf der Ak-Ag Interaktion beruhen Affinitätschromatographie zur Reinigung von Proteinen Ak mobilisiert an Matrix gesuchtes Protein bindet hochaffin an den Ak alle anderen Proteine werden runtergeschwaschen Zielprotein wird durch ph-sprung eluiert

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