NF-light (Neurofilament light) ELISA
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- Katarina Baumann
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1 Arbeitsanleitung NF-light (Neurofilament light) ELISA Enzymeimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von humanem Neurofilament light (NF-L) Protein in Liquor. UD For illustrative purposes only. To perform the assay the instructions for use provided with the kit have to be used. Distributed by: I B L I N T E R N A T I O N A L G M B Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)
2 Verwendungszweck Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von humanem Neurofilament light (NF-L) Protein in Liquor. Es erfolgt eine Kreuzreaktion der Antikörper mit mit Neurofilament light von Ratten, Rindern und Makaken und der Test kann zu Forschungszwecken bei den o. g. Tieren angewendet werden. Einleitung Die Analyse mit NF-light (Neurofilament light) ist ein enzymatischer Immunassay, der speziell für die quantitative Bestimmung von NF-light in humanem Liquor entwickelt wurde. Beim Test kommen zwei hochspezifische, nicht konkurrierende monoklonale Antikörper zum Einsatz (Norgren et al., 2002). Neurofilamente sind die Hauptbestandteile des Zytoskeletts neuronaler Zellen. Diese sind wichtig für die Erhaltung und Regulierung des axonalen Durchmessers und der morphologischen Integrität, die wiederum die Geschwindigkeit und Genauigkeit der neuronalen Transmission beeinflussen. Es existieren drei verschiedene Neurofilamentketten, die jeweils nach Ihrer Größe benannt sind. Dies sind respektive Neurofilament light, medium und heavy. Das Neurofilament light stellt das Rückgrat dar, an das sich die schwereren Ketten anheften und die Neurofilamentfasern bilden (Lee et al., 1993). Nach Verletzungen der Nervenzellen aufgrund eines direkten Traumas oder langsamen degenerativen Prozesses, wird der Zellinhalt in das umliegende Kompartment freigesetzt, wo eine quantitative Bestimmung der axonalen Proteine ermöglicht wird. Man stellte erhöhte Neurofilament light-konzentrationen bei verschiedenen degenerativen Erkrankungen, wie der amyotrophen Lateralsklerose, dem Morbus Alzheimer, der multiplen Sklerose und in Tiermodellen bei einer chronischen experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis fest (Rosengren et al., 1996; Norgren et al., 2003, 2004, 2005). Die Analyse ist ein beidseitiger Sandwich-ELISA mit Festphasen. Ein spezifischer monoklonaler Antikörper ist auf einer festen Oberfläche beschichtet und bindet sich an Neurofilament light. Die Erkennung erfolgt durch einen anderen spezifischen konjugierten monoklonalen Antikörper. Die quantitative Bestimmung erfolgt mittels enzymatischer Umwandlung von einem farblosen Substrat in ein farbiges Produkt, das der Neurofilament light-konzentration in der Probe entspricht. Messbereich: 100 pg/ml pg/ml Erkennungsgrenze: 32 pg/ml Präzision: Intra-Assay CV % < 5 Inter-Assay CV % < 9 Inkubationszeit: 2,5 Stunden Probengröße: 50 µl/parallelprobe Lagertemperatur: 2-8 C, vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen Haltbarkeit: 18 Monate ab Produktionsdatum Nach der Öffnung der NF-light Mikrotiterplatte sollte diese innerhalb von 4 Wochen aufgebraucht werden. Stellen Sie sicher, dass die geöffnete Mikrotiterplatte zur Vermeidung von Feuchtigkeit versiegelt ist. Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen 1. Nur zum in vitro Gebrauch. Nur für den professionellen Einsatz. 2. Vor der Analyse sollte die Arbeitsanleitung vollständig und sorgfältig gelesen werden und verstanden worden sein. Die gültige Version aus dem Kit verwenden. 3. Im Falle einer erheblichen Beschädigung der Testpackung ist der jeweilige Lieferant innerhalb einer Woche nach Erhalt der Ware schriftlich zu benachrichtigen. Beschädigte Komponenten dürfen nicht verwendet werden, sondern sollten solange aufbewahrt werden, bis der Transportschaden endgültig geregelt ist. 4. Es dürfen keine Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen gemischt werden. Abgelaufene Reagenzien dürfen nicht verwendet werden. 5. Bitte das mitgelieferte 15 ml Röhrchen von Sarstedt ( ) bei der Zubereitung der Konjugatlösung verwenden. 1 (7)
3 6. Es wird empfohlen, Proben, Kontrollen und Standards in doppelter Ausfertigung durchzuführen. Bei großen Abweichungen zwischen den Proben bitte erneut analysieren. 7. Gute Laborpraxis und Sicherheitsrichtlinien beachten. Je nach Bedarf sollten Laborkittel, Einmalhandschuhe und Schutzbrillen getragen werden. 8. Kontakt mit Stopplösung vermeiden. Kann Hautreizungen und Verätzungen hervorrufen. Das MSDS für dieses Produkt ist auf Anfrage direkt bei UmanDiagnostics erhältlich. 9. Chemikalien und einsatzbereite Reagenzien sind gemäß den nationalen Gefahrenstoffvorschriften oder Vorschriften als Sonderabfall zu behandeln. 10. ELISA-Orbitalschüttler bei 800 UpM verwenden. Komponenten des Kits: Inhalt Komponente Anzahl/Menge Plattenabdeckung 2 St. 15 ml Röhrchen für Konjugatlösung 2 St. PLATE vorbeschichte, vakuumversiegelte Anti NF-light-Mikrotiterplatte 12 x 8 Wannen STOP Stopplösung 1 x 6 ml TMB TMB-Substrat, gebrauchsfertig 1 x 12 ml SAMDIL Probenverdünnungspuffer 1 x 40 ml CONDIL Konjugatverdünnungspuffer 1 x 12 ml CONJ Streptavidin-HRP-Konjugatkonzentrat 1 x 260 µl 50xTRAC Biotin-markierter anti-nf-l mak-konzentrat (50 x) 1 x 260 µl STAND Rinder-NF-L-Konzentrat, lyophilisiert 2 Fläschchen 10xWASH Waschpufferkonzentrat (10 x) 2 x 40 ml Chromogen und Stopplösung Enzym: Meerrettichperoxidase Substrat: Tetramethylbenzidin, TMB Stopplösung: H2SO4 8% v/v (Achtung: ätzend) Nicht enthaltenes, erforderliches Material: Photometer 450 nm (Referenzwellenlänge nm) Mikropipetten: µl Vortex-Mischer ELISA-Orbitalplattenschüttler (800 UpM) entionisiertes Wasser Waschflasche, automatisches oder halbautomatisches Waschsystem für Mikrotiterplatten Papiertücher, Pipettenspitzen, Stoppuhr Polystyren- oder Polypropylen-Röhrchen für die Standard- und Probenverdünnung Achtung: Nur das mitgelieferte 15 ml Röhrchen bei der Zubereitung der Konjugatlösung verwenden. Testeigenschaften Probenart Der NF-light ELISA-Test wurde zur Analyse von Liquorproben entwickelt und kann in der hier vorliegenden Form nicht für die Analyse von Blutproben verwendet werden. Temperatur Die Analyse wurde für die Arbeit bei Raumtemperatur entwickelt (20-25 C). 2 (7)
4 Messbereich Die Standardkurve deckt den Intervall von pg/ml NF-L (siehe Kurve auf Seite 5) ab. Eine Extrapolation oberhalb der Kurve ist nicht zulässig. Proben außerhalb des Kurvenbereichs müssen weiter verdünnt und erneut gemessen werden. Vorbereitung der Reagenzien Waschpuffer Verdünnen Sie den Gesamtinhalt einer 10-fachen Waschpufferkonzentratflasche (40 ml) mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 400 ml. Ein verdünnter und nicht verwendeter Waschpuffer kann bei Raumtemperatur aufbewahrt und sollte innerhalb von zwei Monaten aufgebraucht werden. Das 10-fache Waschkonzentrat kann aufgrund des hohen Salzgehalts opalisierend erscheinen (dies hat keine Auswirkung auf die Analyse). Standards Die Rekonstitution und Herstellung einer Standardverdünnungsserie sollte erst direkt vor dem Gebrauch erfolgen. Den höchsten Standard ( pg/ml) erhält man, indem man den lyophilisierten Standard mit dem Volumen des auf dem Flaschenetikett angegebenen Probenverdünners rückverdünnt. Kurz etwas vorwirbeln und bei Raumtemperatur aufbewahren. 6 Mikroröhrchen beschriften, für jeden Standardpunkt eines (das sind 5000 pg/ml, 2500 pg/ml, 1000 pg/ml, 500 pg/ml, 100 pg/ml und 0 pg/ml) und den Standard gemäß nachfolgender Tabelle verdünnen. Standardverdünnung: Röhrchen Nr. Probenverdünner Standard aus Röhrchen Nr. Rekonstitution mit Probenverdünnungspuffer (SAMDIL) gemäß Etikett der fläschchen µl 300 µl (Fläschchen) µl 300 µl (1) µl 240 µl (2) µl 300 µl (3) µl 60 µl (4) µl 0 µl 0 Fläschchen Konzentration (pg/ml) Der rückverdünnte Standard ist sofort zu verwenden und darf nicht wiederverwendet werden. Tracer Direkt vor dem Gebrauch den konzentrierten Tracer (50 x TRAC; Biotin anti NF-L mab) 1:50 mit Probenverdünner verdünnen. Gründlich mischen durch Wenden des Röhrchens oder Vorwirbel. Konjugat Direkt vor dem Gebrauch das konzentrierte Konjugat (CONJ; Streptavidin-HRP-Konjugat-Konzentrat) gemäß Etikett der Ampulle mit Konjugatverdünner im mitgelieferten 15 ml Röhrchen von Sarstedt verdünnen. Gründlich mischen durch Wenden des Röhrchens oder Vorwirbel 3 (7)
5 Analyse Alle Analysereagenzien sollten vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur gebracht warden. Nach jedem Waschzyklus sollte die Mikrotiterplatte mit Papier trocken getupft werden. GANZ WICHTIG ist das Schütteln der Platte bei 800 UpM. 1. Liquorproben 1+1 mit gleicher Konzentration (1 + 1) des Probenverdünners zu einem Mindestvolumen von 210 µl verdünnen. Die rückverdünnten und gemäß der Standardverdünnungstabelle verdünnten Standards sind einsatzbereit (und müssen nicht weiter verdünnt werden). 2. Entsprechende zu verwendende Wannen mit Waschpuffer (3 x 300 µl) waschen. Den Waschpuffer entweder aspirieren oder entfernen, indem er kräftig vor dem nächsten Waschzyklus auf absorbierendem Material ausgeklopft wird µl von jedem Standard und duplizierter Probe hinzufügen und 1 Stunde bei Raumtemperatur (20-25 C) auf dem Orbitalschüttler (800 UpM) inkubieren. 4. Die Wanne mit 300 µl Waschpuffer waschen (3 x 300 µl), siehe Punkt µl des frisch verdünnten Tracer-Antikörpers in jede Wanne geben und dann 45 Minuten bei Raumtemperatur (20-25 C) auf dem Orbitalschüttler (800 UpM) inkubieren. 6. Wannen mit Waschpuffer waschen (3 x 300 µl), siehe Punkt µl des frisch verdünnten Konjugats (Streptavidin-HRP) in jede Wanne geben und dann 30 Minuten bei Raumtemperatur (20-25 C) auf dem Orbitalschüttler (800 UpM) inkubieren. 8. Wannen mit (3 x 300 µl) Waschpuffer waschen, siehe Punkt µl TMB in jede Wanne geben und dann 15 Minuten bei Raumtemperatur (20-25 C) auf dem Orbitalschüttler (800 UpM) inkubieren µl der Stopplösung in jede Wanne geben und anschließend die Absorption bei 450 nm (Referenz-Wellenlänge nm) ablesen. Die Stopplösung enthält verdünnte Schwefelsäure und ist ätzend. Änderungen der Analyseeigenschaften Sollten sich die Leistung und Eigenschaften der Analyse ändern, werden diese Änderungen in der beigefügten Arbeitsanleitung des jeweiligen Kits beschrieben. Proben Der Liquor sollte nicht mit Blut kontaminiert sein und alle Patientenproben sollten als potenziell infektiös behandelt werden. Nach der Lumbalpunktion sollten die Proben bei -80 C in Polypropylen-Röhrchen gelagert werden. Wiederholte Einfrier-/Auftauzyklen sollten vermieden werden. Probenstabilität Die Probenstabilität wurde mit 5 verschiedenen klinischen Proben ermittelt. Die Probenwerte nach den unterschiedlichen Vorbehandlungen wurden mit der gleichen bei -80 C gelagerten Probe verglichen. Mittel % der -80 C MW % Bereich Kontrolle Ein-/Auftauzyklen 4 Zyklen Lagerung 1 Woche bei 5-8 C 99, Std. bei RT (22 C) Monat bei -20 C 95, (7)
6 Ergebnisse Die Ergebnisse können automatisch mittels Immunassay-Softwarepaket berechnet werden. Die 4- Parameter-Marquardt-Transformation bietet die beste Kurvenanpassung (eine typische ist nachfolgend zu sehen). Sollte eine solche Immunassay-Software nicht zur Verfügung stehen, wird die NF-L-Konzentration aus dem Plottdurchschnitt OD ( 450 minus 620) gegenüber der bekannten Standardkonzentration berechnet. Alle Testwerte werden direkt aus dem Immunassay-Softwarepaket oder aus der manuell geplotteten Kurve erzielt. Proben mit Konzentrationen oberhalb des höchsten Standardpunktes müssen weiter verdünnt und erneut analysiert werden. Wenn Proben mit erwartetem Wert oberhalb der Standardkurve analysiert werden sollen, sollten diese gemäß Punkt 1 der Assayanleitung 1+1 mit einer entsprechenden Probenkonzentration verdünnt werden. Anschließend ist eine zweite entsprechende Verdünnung durchzuführen, damit die Konzentration den von der Standardkurve abgedeckten Wert erreicht. Die von der Standardkurve abgelesene Konzentration muss mit dem Verdünnungsfaktor des zweiten Schritts multipliziert werden. Die besten Ergebnisse lassen sich normalerweise durch Auslassen der Messung im Standardbereich ganz unten und oben erzielen. Die von der Standardkurve abgelesenen Werte entsprechend direkt der NF-Light- Konzentration. Standardkurve Durchschnitt OD Erwartete Werte 4-Parameter-Marquardt-Transformation Liquor von 50 augenscheinlich gesunden Personen mit keinerlei Zeichen neurologischer Erkrankungen wurden untersucht. Die Normwerte liegen zwischen 112 und 821 pg/ml. Die gesunden Personen wurden weiterhin in drei Altersgruppen unterteilt und die Referenzbereiche wurden definiert als Mittelwert der NF-LightKonzentration + 2 Standardabweichungen (SD). Alter Referenwert < 30 Jahre < 290 pg/ml (n = 17) Jahre < 380 pg/ml (n = 15) 40 - < 60 Jahre < 830 pg/ml (n = 18) 5 (7)
7 Die Ergebnisse des Tests sind nur dann als valide anzusehen, wenn gemäß Arbeitsanleitung gearbeitet wurde und sie müssen mit weiteren klinischen Beobachtungen und diagnostischen Tests korreliert werden. Der Anwender hat sich strikt an die Vorschriften der guten Laborpraxis (Good Laboratory Practice, GLP) oder an andere geltende Standards/Gesetze zu halten. Es wird empfohlen, dass jedes Labor seine eigenen Normwertbereiche ermittelt und im Rahmen interner Kontrollen Proben mit bekannten Neurofilament-Light-Konzentrationen verwendet. Leistung Analytische Empfindlichkeit (Nachweisgrenze) Präzision Intra-Assay Inter-Assay Wiederfindung (nach Aufstockung) Linearität 32 pg/ml LOB+1,645x SD (100 pg/ml Standard) Niedrig (250 pg/ml) 4,8 % CV 9,1 % CV 250 pg/ml 88,4 % Bereich pg/ml 500 pg/ml 91 % Serielle Verd. 1:128 Hoch (5000 pg/ml) 3 % CV 3 % CV 2500 pg/ml 98,7 % Bereich 93,4-109 % Mittlere Präzision 4 % CV 6 % CV Mittlere Wiederfindung 93 % Mittlere Wiederfindung 99,8 % Garantieerklärung Die hier dargestellten Leistungsdaten wurden mittels der angegebenen Verfahren erzielt. Jegliche Änderung oder Veränderung hinsichtlich der Verfahren, die nicht von UmanDiagnostics AB empfohlen wurden, können sich auf die Ergebnisse auswirken. In diesem Fall schließt UmanDiagnostics AB jegliche ausdrückliche, stillschweigende oder gesetzliche Gewährleistung, einschließlich der allgemeinen Gebrauchstauglichkeit und Eignung für einen bestimmten Zweck, aus. UmanDiagnostics AB und die zugelassenen Vertriebshändler übernehmen in einem solchen Fall keine Haftung für direkte, indirekte oder Folgeschäden. Literatur: Lee MK, Xu Z, Wong PC, Cleveland DW. Neurofilaments are obligate heteropolymers in vivo. J Cell Biol Sep;122(6): Norgren N, Karlsson JE, Rosengren L, Stigbrand T. Monoclonal antibodies selective for low molecular weight neurofilaments. Hybrid Hybridomics Feb; 21(1): 53-9 Norgren N, Rosengren L, Stigbrand T. Elevated neurofilament levels in neurological diseases. Brain Res Oct 10;987(1): Norgren N, Sundstrom P, Svenningsson A, Rosengren L, Stigbrand T, Gunnarsson M. Neurofilament and glial fibrillary acidic protein in multiple sclerosis. Neurology Nov 9;63(9): Norgren N, Edelstam A, Stigbrand T. Cerebrospinal fluid levels of neurofilament light in chronic experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain Res Bull Oct 30;67(4): Rosengren LE, Karlsson JE, Karlsson JO, Persson LI, Wikkelso C. Patients with amyotrophic lateral sclerosis and other neurodegenerative diseases have increased levels of neurofilament protein in CSF. J Neurochem Nov;67(5): (7)
8 Symbols / Symbole / Symboles / Simboli / Simbolos / Συ μβολα Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N. o Cat.: / N. Cat.: / Αριθμο ς-κατ.: Use by: / Verwendbar bis: / Utilisé a : / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιει ται απο : Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N. o : / Lotto n.: / Αριθμο ς -Παραγωγη : No. of Tests: / Kitgro ße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N. o de Testes: / Quantita dei tests: / Αριθμο ς εξετα σεων: In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagno stico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagno stico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρικη συσκευη για In-Vitro ια γνωση. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruc o es antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβα στε τις οδηγι ες πριν την χρη ση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schu tzen. / Garder a l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλα σσεται μακρια απο θερμο τητα και α μεση επαφη με το φως του ηλι ου. Store at: / Lagern bei: / Stocker a : / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθη κευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγο ς: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχη! 7 (7)
9 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro Διάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / Διαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer. Symbols Version 3.5 /
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