Quantitative Allergen-Analytik als Voraussetzung für harmonisierte action-level (EU-VITAL)

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Otto Krause
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1 Quantitative Allergen-Analytik als Voraussetzung für harmonisierte action-level (EU-VITAL) Matthias Kuhn

2 Warum quantitative Allergen-Analytik? Wer benötigt die quantitative Information? EU: Allergen Nulltoleranz (technische Null; kleiner LOD) Codex: Gluten Free <20 ppm; low Gluten <100ppm Reicht größer bzw. kleiner 20 ppm als Information? Zukunft: Grenzwerte bzw. 'action levels' in Bezug auf Deklaration (Beispiel: EU-VITAL (basierend auf VITAL)) Verlässliche quantitative Analytik Referenzmaterial

<100ppm Reicht größer bzw. kleiner 20 ppm als Information? Zukunft: Grenzwerte bzw.

4 EU VITAL Initiative for harmonized action levels for the declaration of food allergens

EU- VITAL Konzept VITAL = Voluntary Incidental Trace Allergen Labelling Festlegung von Action levels (AL) Standardisierung für die Deklaration AL 1: keine Deklaration AL 2: kann Spuren von enthalten

5 EU- VITAL Konzept VITAL = Voluntary Incidental Trace Allergen Labelling Festlegung von Action levels (AL) Standardisierung für die Deklaration AL 1: keine Deklaration AL 2: kann Spuren von enthalten AL 3: enthält. als Zutat Dimensionierung mg Protein/ kg Lebensmittel EU-VITAL = Vorschlag europäische Umsetzung alle in Richtlinie 2007/68 genannten Allergene enthalten Dimensionierung mg allergener Bestandteil/ kg Lebensmittel

als Zutat Dimensionierung mg Protein/ kg Lebensmittel EU-VITAL = Vorschlag europäische Umsetzung alle in

6 Die Unterschiede (1) Das VITAL-Modell listet weniger/andere zu kennzeichnende Allergene als in der EU beschrieben Ein hier vorgestelltes EU-VITAL Modell enthält alle Allergene gemäß der europäischen Richtlinie (s.u.). (2) Die Grenzwerte sind im VITAL-Modell als allergenes Protein/Gesamtlebensmittel [ppm] dimensioniert. Das EU-VITAL Modell listet die Grenzwerte wie in Europa bereits normiert (DIN EN ) auf: mg allergene Bestandteile/kg Lebensmittel [ppm]

(2) Die Grenzwerte sind im VITAL-Modell als allergenes Protein/Gesamtlebensmittel [ppm] dimensioniert.

9 Problematik der praktischen Umsetzung Referenzmaterial kein standardisiertes Referenzmaterial Konsequenz: Uneinheitliche Herstellung interner Vergleichsmaterialien Uneinheitliche Dotierungsmaterialien (Samen, Blatt, Mehl, etc ) Grenzwerte Nulltoleranz laut EG Richtlinie Nachweis von Null nicht möglich ('technische Null') Konsequenz: Nachweisgrenzen variieren je Nachweissystem und Hersteller Positive Ergebnisse ohne Gehaltsbestimmung 1 ppm oder 1000 ppm (0,1%) kann Spuren von. Enthalten normierte Verfahren 64 LFGB/DIN 4 von 20 allergenen Bestandteilen (Soja, Erdnuss, Haselnuss, Sellerie) Konsequenz: Verwendung verschiedenster (quantitativer) Nachweismethoden, -verfahren

Konsequenz: Nachweisgrenzen variieren je Nachweissystem und Hersteller Positive Ergebnisse ohne Gehaltsbestimmung 1 ppm oder 1000 ppm (0,1%) kann Spuren von.

10 Quantitative Methoden ELISA real time PCR

11 Sandwich ELISA

12 Sandwich ELISA: The higher the conc. the higher is the absorbance.

13 Competitive ELISA

14 competitive ELISA: The higher the conc. the lower is the absorbance.

15 Quantitative Methoden ELISA real time PCR

16 Verbundprojekt QUALLITÄT Verbundvorhaben Allergenanalytik CVUA Freiburg, LGL Oberschleißheim, Congen Biotechnogie Teilprojekt I Vergleichsmaterialien ausgewählter Matrices Beispielhaft: Brühwurst, Kekse Teilprojekt II Simultaner Schnellnachweis (LPA-Technik) Teilprojekt III Quantifizierung mittels real-time PCR

ausgewählter Matrices Beispielhaft: Brühwurst, Kekse Teilprojekt II

17 Quantitativer Allergennachweis über die qpcr Voraussetzungen quantitatives Referenzmaterial 'process efficiency' Referenzmaterial Standard/Referenz DNA Korrelation mit 'ppm' Gehalt über Rerenzmaterial Food Beispiele GMO: relative Quantifizierung (% GMO) Pathogene: Absolute Quantifizierung (Zellzahl)

DNA Korrelation mit 'ppm' Gehalt über Rerenzmaterial Food Beispiele GMO:

18 standard with known copy numbers sample unknown concentration SureFood QUANTARD known concentration and expected copy number X 40 ppm fluorescence threshold C t C t C t C t C t 40 ppm C t X

and expected copy number 10 1 10 3 10 5 X 40 ppm

19 Teilprojekt III- Quantifizierung mittels real-time PCR Bestimmung der Nachweisgrenze am Beispiel Nuss in Brühwurst 40,0 38,0 36,0 10 ppm 20 ppm 100 ppm Cashew Erdnuss Haselnuss Ct-Wert 34,0 32,0 30,0 28,0 26,0 24,0 22,0 Macadamia Mandel Paranuss Walnuss Linear (Paranuss) Linear (Walnuss) Linear (Haselnuss) Linear (Cashew) Linear (Mandel) 20,0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 log ppm Linear (Erdnuss) nicht alle Verfahren für Quantifizierung im unteren ppm Bereich geeignet, Optimierung der Nachweissysteme erforderlich

Walnuss Linear (Paranuss) Linear (Walnuss) Linear (Haselnuss) Linear (Cashew) Linear (Mandel) 20,0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 log

20 Teilprojekt III- Quantifizierung mittels real-time PCR Quantitative Bestimmung am Beispiel Senf in Brühwurst Real-time P CR zum Nachweis von Senf M atrix: Brühwurst; mg Senf/ kg Ct 36,0 34,0 32,0 y = -3,1188x + 38,581 R 2 = 0, ,0 0,80 1,30 1,80 2,30 2,80 Log conc DNA Extraktion unproblematisch, 5-10 ppm detektierbar Linerarität gegeben quantitative Bestimmung von Proben mit unbekanntem Gehalt möglich

y = -3,1188x + 38,581 R 2 = 0,9841 30,0 0,80 1,30 1,80 2,30 2,80 Log conc DNA Extraktion

21 'Matrix adaptierte' Quantifizierung von allergenen Bestandteilen mittels real-time PCR Durchführung Extraktion von Probe und Referenzmaterial mit bekannten Gehalt an allergenem Bestandteil in einer Lebensmittelmatrix z.b. 4 mg Senf / kg LM 40 mg Senf / kg LM 400 mg Senf / kg LM real-time PCR mit Probe und Referenzmaterial, Referenzmaterialien definiert als Standards mit bekannten Konzentrationen Quantitatives Ergebnis des allergenen Bestandteils im LM

22 Quantifizierung von Senf in einer Gewürzmischung mittels SureFood Quantard Allergen Mustard SF Quantard 400 ppm SF Quantard 40 ppm SF Quantard 4 ppm

23 Quantifizierung von Senf in einer Gewürzmischung mittels SureFood Quantard Allergen Mustard SF Quantard 400 ppm Gewürzprobe SF Quantard 40 ppm

24 Teilprojekt III- Quantifizierung mittels real-time PCR Quantitative Bestimmung am Beispiel Senf in Brühwurst Real-time P CR zum Nachweis von Senf M atrix: Brühwurst; mg Senf/ kg Ct 36,0 34,0 32,0 y = -3,1188x + 38,581 R 2 = 0, ,0 0,80 1,30 1,80 2,30 2,80 Log conc DNA Extraktion unproblematisch, 5-10 ppm detektierbar Linerarität gegeben quantitative Bestimmung von Proben mit unbekanntem Gehalt möglich

25 Quantifizierung von Senf in einer Gewürzmischung mittels SureFood Quantard Allergen Mustard Ergebnis Abschätzung 40 ppm > Gewürzprobe < 400 ppm Quantitatives Ergebnis 89 mg allergener Bestandteil / kg Lebensmittel Zusammenfassung - einheitliche DNA Extraktion für Referenzmatrix und Probe - Quantifizierung über Referenzproben mittels real-time PCR möglich

26 standard with known copy numbers sample unknown concentration SureFood QUANTARD known concentration and expected copy number X 40 ppm fluorescence threshold C t C t C t C t C t 40 ppm C t X

27 Vorteile Berücksichtigt Effizienz der DNA Extraktion leicht adaptierbar (Schwellenwerte) einsetzbar für alle qpcr Systeme einsetzbar für alle Probenaufbereitungssysteme keine aufwendigen DNA Standard nötig Limitierungen Matrixeffekte könne unterschiedlich sein (Mischung!)

28 Vergleich immunologische Verfahren und PCR Anhang III a (Richtlinie 2003/89/EG) ELISA PCR PCR oder ELISA Glutenhaltiges Getreide (Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Dinkel, Kamut) Krebstiere Eier Fisch Erdnüsse Soja Milch (einschließlich Laktose) Schalenfrüchte, d. h. Mandel, Haselnuss, Walnuss, Cashewnuss, Pecannuss, Paranuss, Macadamianuss Sellerie Senf Sesamsamen Schwefeldioxid und Sulfite (bei mehr als 10 mg/kg od. 10 ml/l) Lupine Weichtiere (Schnecken, Muscheln, Kopffüßer)

29 Erfahrungen aus der Praxis Untersuchung einer Produktionsstrasse Herstellung von Haselnussschokolade im Anschluss Herstellung von Mandelschokolade Probennahme Ende Haselnussschokoladenproduktion bis Beginn Mandelschokoladenproduktion Punkt 0 Abschluss Haselnuss Punkt 1 Abschluss Ausschuss (Festlegung durch Hersteller) Punkt 2 Fertigung Mandelschokolade

30 Erfahrungen aus der Praxis- Verschleppung von Haselnuss in der Schokoladenproduktion DNA Kopien pro PCR-Ansatz ca. 5 ppm dunkle Haselnuss-Schokolade dunkle Mandel-Schokolade Ausschuss dunkle Mandel-Schokolade 1. Ware verpackt ca. 100 ppm Zeit der Probennahme [min]

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