Evaluation von Schimmelpilzallergenextrakten in der Diagnostik Sabine Kespohl

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1 Evaluation von Schimmelpilzallergenextrakten in der Diagnostik Sabine Kespohl 20. Umwelttoxikologisches Kolloquium, LGA Stuttgart,

2 Schimmelpilze als Allergene Können alle Schimmelpilz Arten eine Allergie verursachen? - Ja, bisher sind etwa 100 Arten als Allergie-Auslöser beschrieben. Welche Bestandteile eines Schimmelpilzes enthalten Allergene? - Sowohl Sporen als auch Myzelstücke können Allergene enthalten. Können auch abgestorbene Schimmelpilzfragmente noch Allergien auslösen? - Ja, auch abgestorbene, nicht mehr keimfähige Sporen und Myzelfragmente enthalten noch Allergene. Gibt es ein universal Schimmelpilzallergen? - Nein, das Allergenspektrum ist abhängig von der Spezies sehr heterogen. Wie wird eine Schimmelpilzallergie diagnostiziert? 2

3 Allergiediagnostik bei Verdacht auf IgEvermittelte Schimmelpilzallergie! Spezifischer Provokationstest in - vitro - Tests Hauttest? Anamnese 3

4 Diagnostik Typ 1-Allergie Nachweis der Sensibilisierung Diagnose einer IgE-vermittelten Schimmelpilzsensibilisierung erfolgt entsprechend der DGAKI-Leitlinien mittels Hautpricktest und zusätzlicher sige-bestimmung Pricktest Intrakutantest sige-bestimmung 4

5 Schimmelpilzsensibilisierung Konkordanz* zwischen positiven Hauttestergebnissen und positivem sige-befund liegt je nach Schimmelpilzspezies und je nach Testextrakt zwischen 14% (Botrytis cinerea) und 56% (Alternaria alternata) bzw. 54% (Aspergillus fumigatus) Ursache dafür liegt oftmals in unterschiedlichem Ausgangsmaterial und Extraktionsverfahren begründet, daher wird seit langem eine Standardisierung der Testextrakte gefordert *O Driscoll BR et al., Clin Exp All: 39:

6 Ausgangsmaterial für Schimmelpilz Allergenextrakte Ist der Allergengehalt eines Schimmelpilzes immer gleich? Beispielsweise in Abhängigkeit der Wachstumsphase, der Wachstumsbedingungen und des Substrats? - Dies wurde bisher für die Hauptallergene Alt a 1 und Asp f 1 untersucht 6

7 Time-course characterisation of the production of Alt a 1 by Alternaria alternata Österberg M, Larsson A, Milsson AC Poster: EAACI

8 Extraktionsverfahren für Schimmelpilz Allergenextrakte Welches ist das optimale Extraktionsverfahren für Schimmelpilz Testextrakte? - Die Herstellung von Testextrakten ist sehr aufwändig und häufig sind keine dominanten Einzelallergene bekannt (wie bespielsweise für Penicillium chrysogenum), was die Qualitatsanalyse und Standardisierung der Testextrakte schwierig macht. 8

9 Extraktionsverfahren Precellys Homogenisator Zellaufschluss durch Zermahlen mittels hochbeschleunigter Kügelchen Stabhomogenisator Zellaufschluss durch Scherkräfte 9

10 Schimmelpilz Allergenextrakte Testen wir überhaupt die richtigen Materialien? - Von den ca. 100 Schimmelpilzen, die IgE-vermittelte Sensibilisierungen und Allergien auslösen können, sind nur ca. 20 als Hauttestallergene verfügbar, typische Innenraumpilze fehlen meist vollständig. Wie gut sind kommerzielle Testextrakte??? 10

11 Neues IPA-Projekt: Qualitätsprüfung von Schimmelpilz-Hauttestextrakten QuaSchi 11

12 Auswahl von Schimmelpilz Hautpricktestlösungen Außenluft -Pilze Alternaria alternata Aspergillus fumigatus Cladosporium herbarum Innenluft -Pilze Penicillium chrysogenum Aspergillus versicolor 12

13 Übersicht Hautpricktestlösungen im QuaSchi-Projekt Alternaria alternata Aspergillus fumigatus Cladosporium herbarum Penicillium chrysogenum Aspergillus versicolor 1 ALK x x x x - 2 Allergopharma x x x x - 3 Bencard x - x x - 4 Lofarma x x x x - 5 HAL x x - x - 6 Stallergen x x x (Mix) x - 7 Allerbio x x x (Mix) Allergon (Lyo) x 9 Greer (Lyo) x Stand Frühjahr

14 Validierungsparameter Proteingehalt Proteinprofil IgG-Antigenität IgE-Allergenität Fragebogen Hautpricktest spezifische IgE- Bestimmung Extraktanalyse Patienten Untersuchung 14

15 Entwicklung von Validierungstools für QuaSchi Herstellung einer standardisierten Hautpricktestlösung für Aspergillus versicolor Proteingehalt Quantitativ: Bradford-Assay Qualitativ: SDS-PAGE Silberfärbung IgE-Allergenität Quantitativ: sige-immunocap-inhibitionstest (Phadia) Qualitativ: sige-immunoblot mit humanem Serumpool 15

16 Entwicklung von Validierungstools für QuaSchi IgG-Antigenität Quantitativ: Sandwich-ELISA System (Indoor Technology) nur für Alternaria alternata (Alt a 1), Aspergillus fumigatus (Asp f 1) und Aspergillus versicolor (nicht identifiziertes Einzelallergen) Entwicklung sensitiver Sandwich-ELISAs zur Quantifizierung des gesamten Antigenen Spektrums in Hautpricktestlösungen: Aspergillus fumigatus - Cladosporium herbarum Penicillium chrysogenum - Aspergillus versicolor Qualitativ: sigg-immunoblot mit sigg-antikörpern 16

17 Herstellung von Immunogen Injektion der Schimmelpilz-Immunogen ca Wochen Gewinnung der Kaninchenseren mit polyklonalen Antikörpern (pak) gegen Schimmelpilz Antigene Isolierung der pak aus Kaninchenserum Fang-Antikörper (Protein-G-Reinigung) Detektionsantikörper (Antigenaffinitätsreinigung) Entwicklung von spezifischen Sandwich-ELISA Überprüfung der Testspezifität mit anderen Schimmelpilzantigenen Quantifizierung von Antigengehalten in Lösungen Nutzung der pak zur Qualitätsanlyse im Blot 17

18 Herstellung von Immunogenen Untersuchungsmaterial am Beispiel von P. chrysogenum: kommerzielles P. chrysogenum Lyophilisat (Allergon) 5 verschiedene P. chrysogenum Isolate aus Sanierungsproben (Sporenfraktion und Mycelfraktion) 18

19 Sandwich-ELISA-Messbereich P. chrysogenum Allergon P. chrysogenum Sporen P. chrysogenum Mycel 4 3 Messbereich 0,15-9 ng/ml 4 3 Messbereich 0,76-96 ng/ml 4 3 Messbereich 0,023-1,9 ng/ml OD 414 nm 2 1 OD 414 nm 2 1 OD 414 nm Konzentration [ng/ml] Konzentration [ng/ml] Konzentration [ng/ml] P. chrysogenum Immunogen Messbereich Allergon (Mycel/Sporen) Sporenfraktion Mycelfraktion 0,15 9 ng/ml 0,76 96 ng/ml 0,02 2 ng/ml 19

20 Insgesamt wurden 4 Sandwich-ELISA für folgende Schimmelpilze etabliert: Aspergillus fumigatus Cladosporium herbarum Penicillium chrysogenum Aspergillus versicolor Sander et al.: Development and application of mold antigen-specific enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) to quantify airborne antigen exposure. J Toxical Environ Health. 2012;75: Zahradnik et al.: A new immunoassay to quantify fungal antigens from the indoor mould Aspergillus versicolor. Environmental Science Processes & Impacts, in press 2013 Diese Tests können nicht nur zur Quantifizierung von IgG-Antigenen in Allergentestlösungen genutzt werden, sondern auch zur Quantifizierung der Allergenbelastung an exponierten Orten 20

21 Zusammenfassung Kommerzielle Schimmelpilz-Hautprickteste sind variabel in den Proteinprofilen aber vergleichbar in Proteingehalten Antigenmuster der Hautpricktestlösungen waren innerhalb einer Pilzspezies ähnlich, allerdings war der Antigengehalt unterschiedlich Hautpricktestlösungen von Schimmelpilzen mit dominanten Hauptallergenen, wie Alternaria alternata zeigten einheitlich hohe sige-inhibitionen (Median >80% = vollständige Inhibition) Hautpricktestlösungen von Schimmelpilzen ohne dominante Hauptallergene zeigten insgesamt geringere sige-inhibitionen (Median zwischen 36 % und 67%) 21

22 Ausblick Die klinische Relevanz der biochemischen Extraktanalysen wird zur Zeit verifiziert: in 17 allergologischen Praxen in Deutschland insgesamt werden 150 Patienten mit Verdacht auf Schimmelpilzsensibilisierung untersucht Daten zur Schimmelpilzexposition und dem Auftreten der schimmelpilzinduzierten Beschwerden werden in Fragebögen erhoben parallele Hautpricktestung mit 3 4 verschiedenen Testlösungen aller fünf Schimmelpilzspezies sige-bestimmung im ImmunoCAP-system 22

23 Faces behind the project: 23

24 24

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