Packungsbeilage. Alpha-1-Antitrypsin IVD MAIER. analytik. Löhergasse Sinsheim. Germany

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1 MAIER analytik g m b h Packungsbeilage Alpha-1-Antitrypsin IVD MAIER analytik g m b h Löhergasse Sinsheim Germany Tel.: 07261/ Fax.: 07261/ <8 C,; -12 C

2 EINLEITUNG Das Alpha-1-Antitrypsin stellt einen primären Inhibitor der Elastase von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN) dar, welches bei inflammatorischen Prozessen freigesetzt wird um die proteolytische Aktivität der PMN-Elastase im Entzündungsbereich zu begrenzen. Des weiteren inhibiert es durch Komplexbildung unter anderem Proteinasen des Gerinnungssystems, Trypsin, Chymotrypsin etc. Das Alpha-1-Antitrypsin besitzt somit eine wichtige regulatorische bzw. antiinflammatorische Rolle. Das Alpha-1-Antitrypsin ist ein lineares Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von ca. 52 kda (394 Aminosäurereste), einem freien Cysteinrest und drei Kohlenhydratseitenketten. Es wird hauptsächlich in der Leber bzw. von intestinalen Makrophagen, Monozyten und Darmepithelzellen synthetisiert. Obwohl das Alpha- 1-Antitrypsin den überwiegenden Anteil der Serinproteinaseinhibitoren im humanen Serum darstellt, gilt sein fäkaler Nachweis als Marker für den intestinalen Eiweißverlust und eine erhöhte Schleimhautpermeabilität, da es aufgrund seiner antiproteolytischen Aktivität nur einem geringen intestinalen Abbau unterliegt und nahezu unverändert im Stuhl ausgeschieden wird. Darüber hinaus wird die Bestimmung der fäkalen Alpha-1-Antitrypsin -Konzentration zur Beurteilung der Aktivität chronischentzündlicher Darmerkrankungen herangezogen. Neben der Messung der einfachen 24h-Alpha-1-Antitrypsin-Ausscheidung in Stuhlproben hat sich auch die Alpha-1-Antitrypsin-Clearence-Bestimmung (Quotient aus den Alpha-1-Antitrypsin- ELISA- Werten von Stuhl- und Serumproben) im klinischen Alltag durchgesetzt. So zeigte die Gruppe um J. S. Fordtran (Strygler et al. 1990), dass im Vergleich zur Alpha-1-Antitrypsin-Clearence die alleinige Bestimmung der Alpha-1-Antitrypsin-Stuhlkonzentration in 21% der Fälle ein falsch positives oder falsch negatives Ergebnis erbrachte. Der von Maier Anayltik entwickelte Alpha-1-Antitrypsin-ELISA zeigte in einer Vergleichsstudie mit der bisher in der Routinediagnostik angewandten radialen Immundiffusion (RID) deutliche Vorteile. Die Ergebnisse von Faust et al 2001 belegen eindeutig, dass der Alpha-1-Antitrypsin-ELISA- Test wesentlich empfindlicher ist als andere gebräuchliche Methoden und dass er nicht nur hepatische sondern auch enterale Alpha-1-Antitrypsin-Formen erkennt. Der von uns entwickelte Alpha-1-Antitrypsin-ELISA stellt eine erfolgversprechende Alternative für die breite Routineanwendung dar. Besonders bei extrem hohen enteralen Eiweißverlusten ist er der radialen Immundiffusion deutlich überlegen. Die Kombination zweier spezifischer Antikörper in unserem Alpha-1-Antitrypsin-ELISA schließt die Möglichkeit falsch negativer Befunde weitgehend aus und gewährleistet damit eine zuverlässige Diagnostik. Indikationen Verdacht auf enteralen Eiweißverlust Morbus Crohn Nekrotisierende Enterokolitis Chronische mesenteriale Ischämie Virale, bakterielle, allergische, autoimmun-verursachte Entzündungen Literatur Arndt et al., 1993, Crohn; Klin. Lab. 11: Stein, J., 1996, 3. Post-graduiertenkurs der DGVS Arndt et al., 1992, The Lancet, Vol 340: OCT, 24 Karbach et al., 1989, Gastroenterol. 27: 362 Strygler B et al., 1990, Gastroenterol. 99(5): Faust D et al., 2001, Gastroenterol. 39(9): Faust D et al., 2002, Clin Exp Immunol. 128(2):279-84

3 Testprinzip Der Test basiert auf der Sandwich -ELISA Technik. Es werden zwei ausgewählte polyklonale Antikörper, die humanes Alpha-1-Antitrypsin erkennen, verwendet. Standards, Kontrollen und verdünnte Patientenproben, die auf Alpha-1-Antitrypsin zu untersuchen sind, werden in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte pipettiert, welche mit einem hochaffinen polyklonalen Kaninchen anti-á-1-antitrypsin Antikörper beschichtet sind. In diesem ersten Inkubationsschritt wird das á- 1-Antitrypsin aus der Probe von dem gekoppelten Fängerantikörper gebunden. Dann wird das Konjugat, ein Peroxidase-markierter Schaf anti-á-1-antitrypsin Antikörper, zugegeben und es bildet sich folgender Komplex an der Wand der Mikrotiterplatte: Fängerantikörper - humanes á- 1-Antitrypsin Peroxidase-Konjugat. Als Peroxidasesubstrat wird Tetramethylbenzidin (TMB) eingesetzt. Die Enzymreaktion wird durch Zugabe von Säure abgestoppt. Dadurch erfolgt ein Farbumschlag von blau nach gelb. Die entstandene chromogene Verbindung wird photometrisch bei 450 nm gemessen. Die Intensität der Farbe ist dem á-1-antitrypsin-gehalt direkt proportional. Parallel dazu wird eine Standardkurve Optische Dichte (Absorption bei 450 nm) versus Standardkonzentration - erstellt, aus der die Konzentrationen der Proben ermittelt werden. Anti-Alpha-1-Antitrypsin ist an die Polystyrenwand gebunden. Die zu bestimmenden Stuhlverdünnungen werden in die Vertiefungen pipettiert. Während der Inkubationszeit bindet das spezifische Antigen an den fixierten Antikörper. Ungebundenes Material wird weggewaschen und ein HRP gekoppelter Antikörper zugegeben. Nach einer weiteren Inkubation mit nachfolgendem Waschschritt wird die Färbereaktion durch Zugabe von TMB gestartet. Nach einer weiteren Inkubation wird die Färbereaktion durch Schwefelsäure gestoppt und in einem Photometer bei 450 nm gegen 620nm gemessen. AT 1 STOP Anti-AT Anti-AT

4 Was wird benötigt? Benötigte Geräte: Vortex-Mixer Platereader Waage Multipette oder 8-Kanal Pipette 100 µl und 10 µl Pipette Zentrifuge Mikrotiterplattenphotometer mit Filter 450 nm (Referenzfilter 620 oder 690 nm) Zentrifuge 3000 x g Benötigte Materialen: Einwegröhrchen zum Einwiegen der Proben Laborübliche Glas- oder Plastikröhrchen (Einmalartikel) Meßzylinder (500 ml) 2 x 500 ml Becher oder Flaschen vorzugsweise aus Glas Bidestilliertes Wasser (aqua bidest.) ml 500 ml 500 Zentrifuge

5 Was ist im Kit? Menge Artikel gebrauchsfertig 12 x 8 Vertiefungen Mikrotitterplatte (Mit Rabbit Anti Alpha-1-Antitrypsin beschichtet) gebrauchsfertig 5 x 1 ml 5 Standards (in wäßriger Lösung mit Thimerosal). gebrauchsfertig 2 x 1 ml Kontrollen Level 1 und 2 (in wäßriger Lösung mit Thimerosal.) gebrauchsfertig 15 ml Konjugat (HRP markierter Antikörper in proteinhaltigem Phosphatpuffer mit Thimerosal) gebrauchsfertig 12 ml Substrat (TMB) gebrauchsfertig 15 ml Assaypuffer (Phosphatpuffer mit Thimerosal und Proteinzusatz ph 7,4) gebrauchsfertig 15 ml Stopplösung (0,5 M Schwefelsäure) in 500 ml entionisiertem Wasser lösen. 30 ml Konzentrat für den Waschpufferpuffer (Phosphatpuffer mit Thimerosal und Detergenz ph 7,4) in 500 ml entionisiertem Wasser lösen. 35 ml Konzentrat für den Probenverdünnungspuffer (Phosphatpuffer mit Natriumazid und Proteinzusatz ph 7,4) Kon Sub Stop AP Konjugat P W Kontrollen Standards

6 Was muss vor dem Testansatz gemacht werden? Bitte achten Sie bei mehrfachem Einsatz der Platte darauf, dass die Reagenzien, wie in der Vorschrift beschrieben, gelagert und nur die für den jeweiligen Ansatz benötigten Reagenzienmengen frisch angesetzt werden. Der Kit kann so bis zu 4 x je nach Probenaufkommen bis zum angegebenen Haltbarkeitsdatum verwendet werden. Reagenzien mit einem Volumen kleiner als 100 µl sollten vor Gebrauch zentrifugiert werden um Volumenverluste zu vermeiden. 1. Alle Reagenzien müssen auf Raumtemperatur (18-26 C) gebracht werden. Dies geschieht am besten, in dem man mindestens eine Stunde vor dem Testansatz die Reagenzien aus dem Kühlschrank nimmt. 2. Konzentrate werden gelöst Probenverdünnungspufferkonzentrat und Waschpufferkonzentrat werden erhitzt bis die Lösung klar ist. Aufgrund der hohen Salzkonzentration in den Konzentraten kann es zu Kristallbildungen kommen. Das Röhrchen mit dem Probenverdünnungspufferkonzentrat und dem Waschpufferkonzentrat werden in einem Wasserbad bei 37 C so lange erhitzt bis die Lösung klar ist. Die Kristalle lösen sich im Wasserbad bei 37 C auf. 3. Verdünnungsmedium muss aufgelöst werden: Das Probenverdünnungspufferkonzentrat (35 ml) wird in 500 ml entionisiertem Wasser gelöst und gut gemischt. P 500 ml 4. Waschpuffer muss aufgelöst werden: Der gesamte Inhalt des Waschpufferkonzentrats (30 ml) wird in 500 ml entionisiertem Wasser gelöst und gut gemischt W 500 ml Das Pufferkonzentrat kann bei 2-8 C bis zum angegebenen Haltbarkeitsdatum aufbewahrt werden. Die verdünnte Pufferlösung ist bei 2-8 C einen Monat in einem geschlossenen Gefäß haltbar.

7 Vorbereitung der Stuhlproben: 4.1 Einwiegen Stuhlproben werden eingewogen. 4.2 Verdünnen Stuhlproben werden 1/50 (Gewicht zu Volumen) mit dem Probenverdünnungspuffer verdünnt (Zu 0,1 g Stuhl werden 5 ml Puffer zugegeben). 4.3 Mischen Die Proben werden so lange gemischt bis die Lösung homogen ist. 4.4 Zentrifugieren Die Röhrchen werden 15 min bei 3000 g zentrifugiert. 4.5 Verdünnen Der klare Überstand wird 1/40 nachverdünnt. 10 µl µl Probenverdünnungspuffer (Endverdünnung 1/2000). 4.6 Die Endverdünnung wird im Assay eingesetzt. 4.7 Lagerung der Proben Werden die Proben nach der Extraktion nicht sofort angesetzt, so müssen sie gelagert werden. Jede Lagerung unterliegt einem Abbau. Deshalb sollten die Prozeduren für alle Proben gleich sein, damit ein hausinterner Normalwert ermittelt werden kann. (z.b. alle Proben nach der Extraktion einfrieren) Die Haltbarkeit der Proben beträgt 5 Tage bei 2-8 C oder 12 Monate in tiefgefrorenem Zustand. 0,1 g Stuhl Probenverdün nungs 500 puffer ml 5 ml Probenpuffer 10 µl 390 µl

8 100 µl Standards, Kontrollen in Platte pipettieren. Keinen Assaypuffer zugeben!!!!!! 10 µl Proben in Platte pipettieren Pipettierschema 100 µl Assaypuffer den Testansatz 60 min bei Raumtemperatur inkubieren Waschen mit 3 * 250 µl Waschpuffer 3 x 100 µl Konjugat in alle Vertiefungen den Testansatz 60 min bei Raumtemperatur inkubieren Waschen mit 3 * 250 µl Waschpuffer 3 x 100 µl Substrat in alle Vertiefungen den Testansatz 30 min bei Raumtemperatur inkubieren 100 µl Stopplösung in alle Vertiefungen Die Färbung bei 450 nm gegen 620 nm messen.

9 Auswertung Bei der Auswertung ist darauf zu achten, dass die folgenden Konzentrationen Verwendung finden. Standard Konzentration [mg/dl]: 12, Konzentration [µg/g]: Die Konzentrationsangaben der Standards sind Nominalwerte und beziehen sich auf die Verdünnung der Proben (1/2000). Damit kann die Konzentration pro Gramm Stuhl ermittelt werden. Bei der Verwendung anderer Verdünnungen muß die reale Standardkonzentration angenommen werden. Konzentration [ng/ml]: 62, Auswertung: Beispiel einer Standardkurve Die unten beschriebenen mathematischen Modelle können alternativ zur Auswertung benutzt werden. Wir empfehlen die Punkt zu Punkt Auswertung : Punkt-zu-Punkt-Auswertung Für die optische Dichte und für die Konzentration empfehlen wir eine lineare Ordinate bzw. Abszisse. 4-Parameter-Funktion Für die optische Dichte empfehlen wir eine lineare Ordinate und für die Konzentration eine logarithmische Abszisse (bei einer logarithmischen Abszisse muss für den Standard mit der Konzentration 0 ein Wert kleiner 1 eingegeben werden z. B. 0.01). Gewichtete Spline-Funktion Für die optische Dichte empfehlen wir eine lineare Ordinate und für die Konzentration eine logarithmische Abszisse (bei einer logarithmischen Abszisse muss für den Standard mit der Konzentration 0 ein Wert kleiner 1 eingegeben werden z. B. 0.01). Optische Dichte 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrolle 1 Kontroll 12, Konzentration [mg/dl]

10 Validierung Vor jeder automatischen Auswertung sollte stets eine Kontrolle der Doppelwerte auf Plausibilität ( Ausreißerkontrolle ) durchgeführt werden; falls dies nicht durch das verwendete Programm erfolgt, sollte die Kontrolle manuell durchgeführt werden. Die mitbestimmten Kontrollen sollten im folgenden Vertrauensbereich liegen: Kontrolle 1: Kontrolle 2: 50 ± 15 mg/dl 100 ± 25 mg/dl Normalwert Wir empfehlen jedem Labor einen hauseigenen Normbereich zu erstellen, da es aufgrund der Präanalytik anderen Ergebnissen kommen kann. zu wie Probentransport und Lagerung. Der von uns ermittelte Normalbereich ist anhand von Normalproben erfolgt. Die Proben wurden vor dem Testanzatz in extrahiertem Zustand eingefroren gelagert. Der von uns ermitteltet Normbereich liegt bei < 60 mg/dl

11 Allgemeine Hinweise Dieser Kit wurde nach der IVD Richtlinie 98/79/EG hergestellt und in den Verkehr gebracht. Dieser Testkit und alle darin enthaltenen Komponenten dürfen ausschließlich zu wissenschaftlichen Zwecken oder, wenn vermerkt zur in vitro-diagnostik verwendet werden. Reagenzien aus unterschiedlichen Kit-Chargen dürfen nicht verwendet werden. Für die Qualitätskontrolle sind die, für medizinischen Laboratorien erstellten Richtlinien zu beachten. Qualitätskontrollen sollten immer mit gemessen werden. Die charakteristischen Testdaten wie Inkubationszeiten, Inkubationstemperaturen und Pipettiervolumina der verschiedenen Komponenten wurden firmenintern festgelegt. Nicht mit dem Hersteller abgesprochene Veränderungen in der Testdurchführung können die Resultate beeinflussen. Der Hersteller übernimmt für die hierdurch entstandenen Schäden und Folgeschäden keine Haftung. Bei Gewährleistungsansprüchen ist das beanstandete Material mit schriftlicher Erklärung innerhalb von 14 Tagen zum Hersteller, der Firma Maier Analytik GmbH, zurück zu senden. Der Testkit ist nach Ablauf des auf die Packung aufgedruckten Verfalldatums nicht mehr zu verwenden. Hinweise zur Arbeitssicherheit Alle mitgelieferten Testkomponenten enthalten Thimerosal und Natruiumazid zum Schutz vor bakterieller Kontamination. Bitte alle Sicherheitsmaßnahmen ergreifen. Die Berührung mit der Haut sollte vermieden werden. Substrate für enzymatische Farbreaktionen sind als giftig und Karzinogen beschrieben. Jeder Kontakt mit der Haut und den Schleimhäuten sind zu vermeiden. Es sollte unter keinen Umständen mit dem Mund pipettiert werden. Während der Testdurchführung Einmalhandschuhe tragen. Die Stopplösung besteht aus H 2 SO 4 und muß mit Vorsicht behandelt werden. Sie verursacht bei Kontakt mit der Haut Verätzungen. Es sollte daher mit Schutzhandschuhen und Schutzbrille gearbeitet werden. Bei Kontakt mit der Säure muß die verätzte Stelle sofort mit viel Wasser gespült werden. Das für Kitkomponenten verwendete humane Material wurde auf HIV, Hepatitis B und Hepatitis C getestet und für negativ befundet. Dennoch wird empfohlen, die Kitkomponenten als Vorsichtsmaßnahme immer wie potentiell infektiöses Material zu behandeln. Entsorgung Für den Fall, dass der Kit beschädigt ist und Reagenzien ausgelaufen sind, sollten alle Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden, die bei einem Umgang mit infektiösem, kanzerogenem und reizendem Material nötig sind. Bei der Entsorgung von nicht verwendeten Testkomponenten sollte die für klinische Laboratorien gültigen Richtlinien beachtet werden.

12 Lagerung, Haltbarkeit Aufbewahrung der Testkomponenten: Artikel wo Lagern? Wie lange? Mikrotitterplatte Kühlschrank Siehe Etikett 5 Standards Gefriertruhe Siehe Etikett Kontrollen Level 1 und 2 Gefriertruhe Siehe Etikett Konjugat Kühlschrank Siehe Etikett Substrat Kühlschrank Siehe Etikett Assaypuffer Kühlschrank Siehe Etikett Stopplösung Kühlschrank Siehe Etikett Konzentrat für den Waschpufferpuffer Kühlschrank Siehe Etikett Konzentrat für den Probenverdünnungspuffer Kühlschrank Siehe Etikett Aufgelöster Waschpufferpuffer Kühlschrank 4 Wochen nach auflösen Aufgelöster Probenverdünnungspuffer Kühlschrank 4 Wochen nach auflösen Die Standards und Kontrollen sind bei -20 C bis zum angegebenen Haltbarkeitsdatum stabil. In aufgetautem Zustand sind die Standards und Kontrollen 5 Tage bei 2-8 C stabil Die Mikrotiterplatte ist in verschlossenem Plastikbeutel 30 Tage bei Raumtemperatur und bei 2-8 C bis zum angegebenen Verfallsdatum (siehe Etikett) verwendbar. Alle anderen Testreagenzien sind bei 2-8 C zu lagern und bei entsprechender Lagerung bis zum angegebenen- Verfallsdatum (siehe Etikett) verwendbar. Probenmaterial und Probenhaltbarkeit: Die Stuhlproben werden vor der Bestimmung extrahiert und verdünnt. Die Haltbarkeit der Proben beträgt 5 Tage bei 4 C oder 12 Monate in tiefgefrorenem Zustand. Es ist zu bedenken, das das erstmalige Einfrieren einen Aktivitätsverlust von ca. 20 % in sich birgt. Technische Merkmale Die Reagenzien dürfen nach Ablauf des Mindesthaltbarkeitsdatums nicht mehr verwendet werden. Substratlösung muss vor Gebrauch farblos sein. Schaumbildung beim Mischen der Reagenzien sollte vermieden werden. Die Bestimmung ist immer nach der im Kit beigefügten Arbeitsanleitung durchzuführen.

13 Assay Parameter 1. Antikörper an der Platte: Rabbit-Anti-human-a 1 -Antitrypsin Konjugat Anti-a 1 -Antitrypsin mit HRP markiert Probenmaterial: Stuhl 1/2000 in Probenpuffer Probenvolumen 10 µl Sensitivität (untere Nachweisgrenze): 4,8 mg/dl Recovery : % Linearität (r= Korrelationskoeffizient): r = 0,89 Intraassayvarienz: < 6,1 % Kreuzreaktivität Es wurde keine Kreuzreaktivität zu anderen Plasmaproteinen im Stuhl gefunden. Interassayvarianz: < 10 % Meßbereich: mg/dl Normbereich Cut off-wert für Gesunde (Stuhl): < 60 mg/dl Wir empfehlen jedem Labor einen eigenen Normwertbereich zu etablieren. Abkürzungen/ Ikonen Lagertemperatur Lot Nummer Invitro Diagnostika Verfalldatum Katalognummer Inhalt Lese die Packungsbeilage Hersteller Lichtgeschützt lagern EXP Verfalldatum Vertrieb durch: Anzahl der Teste

14 Assay: Protokollvordruck Kit Charge/ Lot: Bemerkungen: Datum: Platte /Riegel Soll Es wurde folgendes zugegeben: Stk Lot: 100 µl Standards, Kontrollen keinen Assaypuffer zugeben 10 µ Probenverdünnung 1/ µl Asssaypuffer Den Testansatz mindestens 1h bei Raumtemperatur inkubieren Waschen mit 3 x 0,25 ml Waschpuffer Start (Uhrzeit):......x...ml Ende (Uhrzeit) µl Konjugat µl Den Testansatz mindestens 1 h bei Raumtemperatur inkubieren Waschen mit 3 x 0,25 ml Waschpuffer Start (Uhrzeit):......x...ml Ende (Uhrzeit) µl Substrat µl Den Testansatz 30 min bei Raumtemperatur inkubieren 100 µl Stopplösung Messen bei 450 nm gegen 620 nm Start (Uhrzeit):... µl Ende (Uhrzeit) A B C D E F G H

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