IVD IMMUNOZYM TETANUS

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1 IMMUNOZYM TETANUS Enzymimmunoassay zur Bestimmung von Anti-Tetanus-Toxoid-Antikörpern in Humanserum, Citrat-, EDTA- und Heparin-Plasma PROGEN BIOTECHNIK GMBH Maaßstraße 30 D Heidelberg Telefon +49 (0) Telefax +49 (0) Internet Art.Nr.: Lagerung: 96 Tests 2 8 C IVD Instruction sheet / Gebrauchsanweisung / Carnet d instruction / instrucciones de uso / gebruiksaanwijzing / istruzioni per l'uso / σελίδα οδηγιών / bruksanvisning / modo de emprego: 1. Einleitung Die Zahl der Tetanuserkrankungen ist in Europa und den USA als Folge der breiten Durchimpfung deutlich rückläufig. Der Verlauf dieser vermeidbaren Infektionskrankheit ist aber so schwerwiegend (Todesrate 50 %), dass ein individueller Antikörperschutz durch prophylaktische Maßnahmen sichergestellt sein muss. Ein Impfschutz kann nur dann als gesichert angesehen werden, wenn er einwandfrei aus entsprechenden Dokumentationen im Impfausweis hervorgeht oder durch serologische Untersuchungen schützende Antikörper nachweisbar sind (siehe Abschnitt 9). Das ELISA-Verfahren eignet sich, die Indikation zur Grundimmunisierung und Auffrischungsimpfung zu objektivieren. Dadurch werden Impflücken erkannt und die Häufigkeit von unerwünschten Impfreaktionen vermindert. Da in der Praxis die korrekten Impfabstände nicht immer eingehalten werden bzw. Impfdokumente oft nicht zur Verfügung stehen, wird im Verletzungsfall der Betroffene in der Regel als ungeschützt betrachtet. Aus diesem Grund werden häufig unnötige Nachimpfungen durchgeführt, die hyperergische Reaktionen zur Folge haben können. Mit Hilfe der serologischen Anti-Tetanus-Toxoid- Antikörperbestimmung können individuelle Empfehlungen über die Notwendigkeit einer Grund- oder Auffrischungsimpfung gegeben werden. Der Arzt ist damit in der Lage, beim einzelnen Patienten Immunstatus und aktive Immunisierung aufeinander abzustimmen und so zu einer Verminderung der Häufigkeit von Nebenwirkungen und damit zu einer erhöhten Akzeptanz von Auffrischungsimpfungen beizutragen. 2. Indikationen des Tests Bei unklarem Impfstatus, fehlender Impfdokumentation oder nicht korrekten Impfabständen zur Entscheidung, ob eine Grundimmunisierung, eine Auffrischungsimpfung oder keine Impfung erforderlich ist. Zur Kontrolle der Immunantwort bei bestimmten Grundkrankheiten (z. B. Malignomen, AIDS, hämato-logischen Erkrankungen). Zur Kontrolle der Immunantwort bei bestimmten therapeutischen Maßnahmen (Immunsuppression, Zytostatika, Kortikosteroide, Röntgenbestrahlung). Zur Abklärung der Ursache von Impfreaktionen. 3. Testprinzip IMMUNOZYM TETANUS ist ein Zweischritt-ELISA nach dem Sandwich-Prinzip. Vertiefungen der ELISA- Teststreifen sind mit Tetanus-Toxoid beschichtet. Verdünnte Serum- bzw. Plasmaproben werden in den Vertiefungen der ELISA-Teststreifen inkubiert (Probeninkubation). Während der Inkubationszeit werden spezifische Tetanus-Toxoid-Antikörper an die Festphase gebunden. Unspezifische Probenbe-standteile werden in einem Waschschritt entfernt. Im zweiten Inkubationsschritt erfolgt die Konjugatreaktion. Das Tetanus- Toxoid-POD-Konjugat markiert spezifisch die gebundenen Anti-Tetanus-Toxoid-Antikörper. In einem weiteren Waschschritt wird ungebundenes Konjugat entfernt. Im dritten Inkubationsschritt erfolgt die Substratreaktion, wobei die Peroxidase des Konjugats das Substrat Tetramethylbenzidin (TMB) zu einer blau gefärbten Substanz umsetzt. Durch anschließende Zugabe von Schwefelsäure wird diese Reaktion gestoppt und es erfolgt ein Farbumschlag nach gelb. Die Farbintensität ist der Anti-Tetanus-Toxoid-Antikörper-konzentration der Probe direkt proportional. Bei einer Wellenlänge von 450 nm wird die Extinktion in einem ELISA-Reader gemessen. Über eine Bezugskurve oder die Einpunktkalibrierung wird die Anti-Tetanus-Toxoid- Antikörperkonzentration in der Probe quantitativ bestimmt. 4. Benötigte, nicht mitgelieferte Materialien Aqua dest. Röhrchen zur Probenverdünnung Messzylinder (1000 ml) Präzisionspipetten (5, 20, 100, 500 und 1000 µl) Pipetten (10 und 20 ml) Mehrkanal- bzw. Dispensierpipetten (50 und 200 µl) Probenmischer ELISA-Waschgerät oder Mehrkanalpipette Tetanus de_v8 1/5

2 Stoppuhr ELISA-Reader mit 450 nm Filter Software-Modul IMMUNOZYM Einpunktkalibrierung für die Auswertung mit Microsoft Excel 5.0 oder höher wird auf Anforderung kostenlos zur Verfügung gestellt. 5. Packungsinhalte MTP, 12 Streifen mit je 8 Mikrotitervertiefungen, beschichtet mit Tetanus-Toxoid, mit Trockenmittel im Aluminiumbeutel verpackt. Gebrauchsfertig! WASH 10x, Waschpufferkonzentrat (10x), 0,1 M Tris/HCl, ph 7,4, detergenshaltig, 0,01% (w/v) Thimerosal, 1 Flasche, 100 ml. Vor Gebrauch verdün-nen! DIL, Inkubationspuffer, 0,01 M Tris/HCl, ph 7,4, detergenshaltig, 0,005% (w/v) Thimerosal, rot gefärbt, 2 x 75 ml. Gebrauchsfertig! CAL 1, CAL 2, CAL 3, CAL 4, CAL 5, Kalibratoren 1-5, Humanseren mit Stabilisatoren und Konservierungsmittel, jeweils 1 Flasche, 0,35 ml. Die chargenabhängigen Antikörperkonzentrationen bitte den Flaschenetiketten entnehmen! Vor Gebrauch verdünnen! POS LL, POS HL, Positive Kontrollseren, LL, Low level, HL, High Level zur Richtigkeitskontrolle, Humanseren mit Stabilisatoren und Konser-vierungsmittel, jeweils 1 Flasche, 0,35 ml. Die chargenabhängigen Sollwerte bitte den Flaschen-etiketten entnehmen! Vor Gebrauch verdünnen! CON, Konjugat, Tetanus-Toxoid-Peroxidase, blau gefärbt, 1 Flasche, 0,6 ml. Vor Gebrauch verdünnen! S, Substrat, Tetramethylbenzidin (TMB) in Methylpyrrolidon, 2 x 12 ml. Gebrauchsfertig! STOP, Stopplösung, 0,5 M Schwefelsäure, 1 Flasche, 12 ml. Gebrauchsfertig! Abklebefolien für ELISA-Teststreifen, 2 Stück. Auswertebögen zur Erstellung der Bezugskurve, 2 Stück. Patientenprotokoll, 1 Stück. Patientenprotokoll für IMMUNOZYM Einpunktkalibrierung, chargenspezifisch, 1 Stück. Referenzbezugskurve für IMMUNOZYM Einpunktkalibrierung, chargenspezifisch, 1 Stück. 6. Testdurchführung 6.1. Untersuchungsmaterial, Probenlagerung Humanserum, Citrat-, EDTA- oder Heparin-Plasma. Proben können bis zu 6 Wochen im Kühlschrank aufbewahrt werden [8]. Bei 20 C können sie mehrere Monate aufbewahrt werden. Die Proben dürfen nicht mehrfach eingefroren und aufgetaut werden Vorbereitungen Testkit auf Raumtemperatur bringen (20-26 C). Verdünnen der Kalibratoren 1-5, positiven Kontrollseren und Proben, 1+100: z. B.: 5 µl µl Inkubationspuffer a) Für die Auswertung mittels Bezugskurve werden die Kalibratoren 1 bis 5 und Kontrollseren benötigt. b) Für die Einpunktkalibrierung nur Kalibrator 4 und Kontrollseren verwenden. Herstellen der Konjugat-Gebrauchslösung, 1+100: z. B. für 8 Testvertiefungen: 20 µl Konjugat µl Inkubationspuffer. Kurz vor Gebrauch ansetzen! Angesetzte Lösung bei Raumtemperatur (20-26 C) 60 Min. haltbar. Herstellen des Waschpuffers, 1+9: z. B. für 12 Streifen mit je 8 Mikrotitervertiefungen: 30 ml Waschpufferkonzentrat ml Aqua dest. verdünnen. Gut mischen! Angesetzte Lösung bei 2-8 C 2 Monate haltbar Stabilität Alle in der Packung enthaltenen Komponenten sind ungeöffnet bis zum aufgedruckten Verfallsdatum haltbar. Stabilität nach Anbruch: 6 Monate bei 2-8 C: WASH 10x, S, MTP, DIL (MTP im Plastikbeutel mit Trockenmittel) CAL 1, CAL 2, CAL 3, CAL 4, CAL 5, POS LL, POS HL, CON 6.4. Testablauf Probeninkubation: 200 µl verdünnte Kalibratoren / Kontrollen / Proben in Testvertiefungen pipettieren. Kalibratoren sollten in Teststreifen 1 und 2 pipettiert werden. Teststreifen mit Folie abdecken. Bei Raumtemperatur (20-26 C) 60 Min. inkubieren. Waschen: Mikrotiterstreifen entleeren und 250 µl gebrauchsfertigen Waschpuffer pro Testvertiefung einfüllen, absaugen, 2x wiederholen, auf saugfähiger Unterlage ausklopfen. Konjugatinkubation: 200 µl gebrauchsfertiges Konjugat pro Testvertiefung pipettieren. Teststreifen mit Folie abdecken. Bei Raumtemperatur 60 Min. inkubieren. Waschen: Mikrotiterstreifen entleeren und wie oben beschrieben waschen (3 x 250 µl pro Testvertiefung). Substratreaktion: 200 µl gebrauchsfertiges Substrat pro Testvertiefung pipettieren. Bei Raumtemperatur 30 Min. (BEP III 20 Min.) inkubieren. Stoppen: 50 µl Stopplösung pro Testvertiefung pipettieren. 10 s schütteln. Farbreaktion innerhalb von 10 Min. messen bei 450 nm (Referenzwellenlänge bei nm). 7. Hinweise Gebrauch nur durch Fachpersonal! Waschpuffer, Inkubationspuffer und Stopplösung sind mit folgenden IMMUNOZYM-Produkten austauschbar: FSME IgG, FSME IgM und Diphtherie. Wichtig für Präzision und Richtigkeit: Hämolytische, lipämische, ikterische oder mikrobiell kontaminierte Proben können zu falschen Ergebnissen führen. Inkubationstemperatur C einhalten. Einhaltung der Pipettierreihenfolge. Durchführung von Doppelbestimmungen Tetanus de_v8 2/5

3 Inkubationszeit ±10% einhalten. Sie beginnt nach dem Einpipettieren der letzten Probe. Einpipettieren der Proben: maximal 60 s pro ELISA- Teststreifen. Einpipettieren von Konjugat-, Substrat- sowie Stopplösung: maximal 10 s pro ELISA-Teststreifen. Sicherheitshinweise Stopplösung (Schwefelsäure) und Bestandteile des Substrats (Methylpyrrolidon) können zu Reizungen der Haut führen. Sollte Säure bzw. TMB in die Augen gelangen, sofort mit viel Wasser auswaschen und Arzt aufsuchen. Kalibratoren und Kontrollseren sind HBsAg-negativ, HIV- Antikörper- und HCV-Antikörper-negativ. Trotzdem sollten diese Komponenten wie die Proben als potenziell infektiös behandelt werden. Die Reagenzien enthalten teilweise Konservierungsmittel (z. B. Thimerosal). Nicht schlucken, Haut- und Schleimhautkontakt vermeiden! Sicherheitsdatenblatt wird auf Anfrage versendet. Entsorgungshinweise Bei der Beseitigung der Testpackung sind die nationalen gesetzlichen Bestimmungen in der jeweils aktuellen Fassung zu beachten. Chemikalien und Zubereitungen, die als Reststoffe anfallen, sind in der Regel Sonderabfälle. Besondere Hinweise zur Entsorgung sind zusätzlich im Sicherheitsdatenblatt aufgelistet. Maßnahmen bei Beschädigung Im Falle einer erheblichen Beschädigung der Testpackung ist der Hersteller zu benachrichtigen. Falls einzelne Komponenten erheblich beschädigt sind, dürfen diese nicht zur Testdurchführung verwendet werden. Sie sollten so lange aufbewahrt werden, bis der Transportschaden geregelt ist. Danach sollten sie ordnungsgemäß entsorgt werden. 8. Testauswertung Der IMMUNOZYM Tetanus kann wahlweise durch Erstellen einer Bezugskurve oder durch die Einpunktkalibrierung ausgewertet werden. Die für die positiven Kontrollen zu erwartenden Werte sind chargenabhängig auf den jeweiligen Etiketten vermerkt Konzentrationsbestimmung über Bezugskurve Erstellen der Bezugskurve Beiliegenden halblogarithmischen Auswertebogen verwenden: X-Achse (log.): Konzentration in [IU/ml] Y-Achse (lin.): Extinktion Mittelwerte der Messwerte von Kalibratoren, Kontrollseren bzw. Proben bilden. Mittelwerte der Kalibratoren in Auswertebogen eintragen und Punkte mit Kurvenlineal verbinden. Bei Verwendung einer Auswertesoftware wird ein Rechenprogramm mit multipler nichtlinearer Regression (z. B. 4-Parametrischer-Kurven-Fit [Glg. 1]) empfohlen. Glg. 1: Y = d + (a-d)/(1 + (x/c) b ) Validität des Tests bei Mitführung der Bezugskurve Die Extinktion des höchsten Kalibrators sollte zwischen 1,0 und 2,5 liegen. Die Extinktion des Kalibrators 1 darf 0,5 nicht überschreiten. Die Extinktionsdifferenz zwischen den Kalibratoren 5 und 1 sollte mindestens 1,0 betragen. Die Konzentrationen der Kontrollseren an der Bezugskurve ablesen. Die Auswertbarkeit des Tests wird anhand der ermittelten Kontrollwerte überprüft. 1 < OD Kalibrator 5 < 2,5 OD Kalibrator 1 < 0,5 (OD Kalibrator 5 OD Kalibrator 1) > 1 Werden die Validitätskriterien nicht erfüllt und eine Wiederholungsbestimmung schließt Fehler in der technischen Ausführung aus, so sind die Ergebnisse der Patientenproben ungültig. Die folgenden Fehlermöglichkeiten sind zu überprüfen: Verfallsdaten der Reagenzien und Aufbewahrung Pipetten Inkubationstemperaturen Stoppuhr Photometer Bei fehlerfreier Überprüfung der oben genannten Punkte ist der Hersteller direkt zu kontaktieren Konzentrationsbestimmung der Proben Konzentrationen der Proben an der erstellten Bezugskurve ablesen. Die Umrechnung von Citrat-Plasma- in Serumwerte erfolgt durch Multiplikation der abgelesenen Konzentrationen mit dem Faktor 1, Konzentrationsbestimmung über Einpunktkalibrierung Manuelle Konzentrationsbestimmung Mittelwerte der Messwerte von Kalibrator 4, Kontrollseren bzw. Proben bilden. Die Extinktion von Kalibrator 4 muss im angegebenen Toleranzbereich liegen (siehe Patientenprotokoll für Einpunktkalibrierung). Berechnung des testspezifischen Korrekturfaktors F für jeden Testansatz: Glg. 2: OD F = OD 450 nm 450 nm (Sollwert des Kalibrators 4) (Messwert des Kalibrators 4 ) OD-Sollwert Kalibrator 4 ist chargenspezifisch (s. Patientenprotokoll für Einpunktkalibrierung). Multiplikation der Extinktionen von Kontrollen und Proben mit Korrekturfaktor F. Konzentrationen der Kontrollen und Proben an der beiliegenden chargenspezifischen Referenzbezugskurve ablesen. Beispiel der Berechnung: OD-Sollwert Kalibrator 4 OD 450 nm = 0,790 Messwert Kalibrator 4 OD 450 nm = 0,670 Korrekturfaktor F = 1,180 Probenmesswert OD 450 nm = 0,500 korrigierter Probenmesswert OD 450 nm = 0,590 Ablesen der Probenkonzentration 1,41 IU/ml Tetanus de_v8 3/5

4 Automatische Konzentrationsbestimmung über Einpunktkalibrierung Das hierzu benötigte Software-Modul IMMUNOZYM Einpunktkalibrierung für die Auswertung mit Microsoft Excel 5.0 (oder höher) wird auf Anforderung kostenlos zur Verfügung gestellt. Vorgehen: Excel-Modul IMMUNOZYM Einpunktkalibrierung aufrufen und in die vorbereiteten Felder die Informationen aus der chargenspezifischen Kitbeilage Patientenprotokoll für Einpunktkalibrierung eintragen: Extinktions- Sollwert von Kalibrator 4 (Mittelwert), die OD- Toleranzgrenzen von Kalibrator 4 und die Bezugskurvenparameter A, B, C und D eingeben. Extinktions-Messwert von Kalibrator 4 eingeben: Die Extinktion von Kalibrator 4 muss im angegebenen Toleranzbereich liegen (siehe Kitbeilage Patientenprotokoll für Einpunktkalibrierung ). In die vorbereitete Tabelle werden die Identifikationen und Extinktionen der jeweiligen Kontrollseren und Proben eingegeben. OD-Korrektur und Konzentrationsberechnung erfolgen automatisch Validität des Tests bei Einpunktkalibrierung Die Extinktion von Kalibrator 4 muss im angegebenen Toleranzbereich liegen (siehe Patientenprotokoll für Einpunktkalibrierung). Die Validität der Ergebnisse aus der IMMUNOZYM Einpunktkalibrierung ist gegeben, wenn die Kontrollen innerhalb der chargenspezifischen Toleranzgrenzen liegen. Vorgehensweise bei nicht validen Ergebnissen: s. Abschn Auswertbarkeit der ermittelten Probenkonzentrationen Proben mit Extinktionen außerhalb der Referenzbezugskurve müssen mit Inkubationspuffer 1+4 vorverdünnt werden. Die ermittelte Konzentration wird mit dem Verdünnungsfaktor 5 multipliziert. Die Umrechnung von Citrat-Plasma- in Serumwerte erfolgt durch Multiplikation der abgelesenen Konzentrationen mit dem Faktor 1,1. 9. Interpretation der Testergebnisse Die Anti-Tetanus-Toxoid-Antikörperkonzentrationen nehmen im Laufe der Zeit ab. Nachfolgende Tabelle [7] enthält die Empfehlungen des Arbeitskreises Immunprophylaxe für die Beurteilung des Befundes. Das Testergebnis ist unter Einbeziehung der testspezifischen Präzision vom Arzt in jedem Einzelfall sorgfältig zu beurteilen. Wird nach der Impfung eine serologische Kontrolle durchgeführt, empfiehlt es sich, die ermittelte Anti- Tetanus-Toxoid-Antikörperkon-zentration im Impfausweis zu dokumentieren. IU/ml Interpretation / weiteres Vorgehen < 0,1 Kein Impfschutz Auffrischimpfung erforderlich serologische Kontrolle nach 4-8 Wochen 0,1-0,5 Auffrischimpfung empfohlen Auffrischimpfung führt zu langfristigem Impfschutz 0,51-1,0 Impfschutz vorhanden nach 3 Jahren empfohlen Hinweis: Impfungen bei Antikörperkonzentrationen > 0,5 IU/ml können zu unerwünschten Impfreaktionen führen! 1,1-5,0 langfristiger Impfschutz vorhanden nach frühestens 5 Jahren empfohlen 5,1-10,0 langfristiger Impfschutz vorhanden nach frühestens 8 Jahren empfohlen > 10,0 langfristiger Impfschutz vorhanden nach frühestens 10 Jahren empfohlen 10. Testkenndaten Wiederfindung von aufgestockten Serumproben: Die Abweichung vom theoretisch zu erwartenden Wert ist 8%. Bei der Intraassayvarianz (n=5-12) wurde ein Variationskoeffizient (VK) 12% bezogen auf die Konzentration bestimmt. Bei der Interassayvarianz wurde im Konzentrationsbereich von 0,1-0,5 IU/ml ein VK von <26% bestimmt. Darüber betrugt die Interassayvarianz <10% (n=3). Die untere Nachweisgrenze beträgt 0,09 IU/ml. Die Kalibratoren wurden am WHO Standard TE-3 abgeglichen. 11. Weiterführende Literatur 1. Ambrosch, F., Wiedermann, G., Müller, H.: Eine neue Mikro-ELISA-Methode zur Bestimmung der Tetanus-Antikörper. Zbl. Bakt. Hyg. A 258, 173 (1984) 2. Mai, K., Bartelheimer, H. K., Rosin, H.: Über den Stand und die Dauer des Impfschutzes gegen Tetanus bei Kindern. Dtsch. med. Wschr. 95, 1044 (1970) 3. Müller, H.E., Müller, M., Schiek, W.: Tetanus- Schutzimpfung - Indikation und Kontraindikation. Dtsch. med. Wschr. 113, 1326 (1988) 4. Pietsch, M.: Impfserologie zur Ergänzung von Impfungen. Allgemeinarzt 15, 1155 (1993) 5. Schröder, J. P., Kuhlmann, W. D.: Tetanus- Immunität bei Männern und Frauen in der Bundesrepublik Deutschland. Immun. Infekt. 19, 14 (1991) 6. Werner, G. T., Frühwein, N., Spiess, F., Ulm, K.: Tetanusimmunität im Alter. Zeitschr. Geront. 16, 130 (1983) 7. Arbeitskreis Immunprophylaxe: Tetanus-Impfung. Allgemeinarzt 10, 1018 (1996) 8. Togni, G. u. a.: Präanalytik. Schweiz. Med. Forum (2002) Tetanus de_v8 4/5

5 Hergestellt von: PROGEN Biotechnik GmbH Vertrieb durch: PROGEN Biotechnik GmbH Maaßstraße Heidelberg Deutschland Telefon +49 (0) 6221 / Telefax +49 (0) 6221 / Tetanus de_v8 5/5

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